Summary
Здесь мы представляем гранулярных протокол потока для определения CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки, клетки и моноцитов в периферической крови человека с помощью только двух флуорохромов вместо семи. С этим подходом пять дополнительных маркеров могут быть записаны на большинстве цитофлуориметрами потока.
Abstract
Характеристика иммунных клеток сильно полагается на многоцветный проточной цитометрии для выявления субпопуляции, на основе дифференциальных выражения поверхностных маркеров. Настройки классической многоцветные панели требует мощных инструментов, пользовательские обозначенные антитела и тщательного изучения дизайна для сведения к минимуму спектрального наложения. Мы разработали многопараметрических анализ для выявления основных человеческих популяций иммунных (CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки B, НК-клетки и моноцитов) в периферической крови, объединив семь lineage маркеров, используя только два флуорохромов. Наша стратегия основывается на том наблюдении, что lineage маркеров постоянно выражаются в уникальное сочетание каждой популяции клеток. Сочетая эту информацию с тщательного титрования антител позволяет следователям для записи пять дополнительных маркеров, расширение оптических предел большинства потока цитофлуориметрами. Голова к голове сравнения показали, что подавляющее большинство населения иммунных клеток в периферической крови можно охарактеризовать с сопоставимой точности между нашего метода и классические «один маркер флюрохром один подход», хотя последняя все еще более точные для выявления групп населения, таких как NKT клетки и клетки γδ T. Сочетая семь маркеры с помощью двух флуорохромов позволяет для анализа сложных иммунных клеток населения и клинических образцов на цитофлуориметрами расхода флюрохром доступной 6-10 и даже на 2-3 флюрохром области инструментов в областях с ограниченными ресурсами. Высококачественные инструменты также могут воспользоваться такой подход с использованием дополнительных флуорохромов выполнить более глубокий анализ потока цитометрии. Этот подход также очень хорошо подходит для проверки несколько клеточных популяций в случае клинических образцов с ограниченным числом ячеек.
Introduction
Проточной цитометрии — это метод, который был разработан для анализа нескольких параметров на одной частицы со скоростью несколько тысяч событий на втором1. Примеры образцов анализируемой проточной цитометрии включают, но не ограничиваются, клетки, бусы, бактерии, везикул и хромосом. Аэрогидродинамических системы направляет частиц на допрос точки, где каждая частица пересекает пути с одним или несколькими лазерами, и несколько параметров записаны для дальнейшего анализа. Вперед и боковых рассеивается, порожденных рассеяния чисто лазерного света, используются для выявления целевых групп населения и извлечения сведений о относительный размер и внутренней сложности/гранулярности частиц, соответственно. Все остальные параметры, которые составляют большую часть данных в анализе гранулярных потока, являются производными от флюрохром меченых зондами, которые узнают и связывают для конкретных целей на частицы интерес.
Проточной цитометрии является основным инструментом для иммунологических исследований для выявления и характеристики популяции клеток. Для того чтобы рассечь сложности иммунной системы, многоцветные панели постоянно совершенствуются расширить количество маркеров одновременно записан для глубоких Иммунофенотипирование клеток населения1. Это приводит к развитию более способными инструментов и флуорохромов, с недавних high-end потока цитофлуориметрами, превышающий 20 люминесцентных параметров. Это приводит в сложные исследования дизайн благодаря флюрохром спектрального наложения и более высокие расходы, связанные с пользовательских антитела маркировки и квалифицированных операторов. В ряде случаев сложность и затраты снижаются с помощью отдельных панелей маркеров для различных клеточных популяций. Этот подход, однако, является ошибка склонными, уменьшает информация в каждой панели и может быть трудно применять образцы с ограниченное количество клеток. Кроме того увеличивая количество маркеров не исключает глубокую Иммунофенотипирование на инструментах с меньшим числом люминесцентных параметров. Ранее мы разработали окрашивание протокол для выявления основных человеческих популяций иммунной (CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки B, НК-клетки и моноцитов) в мононуклеаров периферической крови (получения), объединив семь lineage маркеров с помощью только два флуорохромов вместо семи требуется, с помощью традиционных «один флюрохром один маркер» подход (www.hcdm.org)2,3. Наш первоначальный доклад изучены и проверены понятие объединения семи маркеров в двух флуорохромов для глубокой Иммунофенотипирование. В настоящем докладе мы представляем шаг за шагом протокол для изоляции и выведение клеток периферической крови, сосредоточив внимание на практическом аспекте и устранение неисправностей шаги для достижения успешного пятнать.
Этот протокол основывается на том наблюдении, что lineage маркеров константное выражение на поверхности клетки и что каждой популяции клеток имеет исключительное сочетание lineage маркеров. В репликацию, CD3 выражение подразделяет иммунные клетки на две основные категории: CD3-положительных Т-лимфоцитов и клеток CD3-отрицательные. В рамках подгруппы позитивные CD3, CD4+, CD8+ и γδ T клетки могут быть разделены с помощью антител, ориентированные исключительно на CD4 и CD8 γδ рецептора. Подобным образом, в рамках подгруппы негативные CD3 B клетки, клетки и моноциты могли быть однозначно идентифицированы с помощью антител против CD19, CD56 и CD14, соответственно. В стандартный один маркер флюрохром один подход анти CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 и - TCR γδ антитела обнаруживаются с семи различных флуорохромов. Наш подход сочетает в себе анти CD3, - CD56 и - TCR γδ антител в одном флюрохром (с пометкой для удобства флюрохром A) и анти CD4,-CD8, - CD14 и - CD19 антител в различных флюрохром (флюрохром B). Это возможно сочетанием антитела титрования и дифференциального антигена выражения. Обе CD4+ и CD8+ T клетки являются позитивными на антитела анти CD3, в флюрохром A, но они могут быть разделены в флюрохром B максимальное выражение CD8 сигнала при размещении, с ad hoc титрования, CD4 сигнала между CD8 и CD3 двойное отрицание положительные CD4/CD8 клетки. Т-клетки γδ выражает высокий уровень CD3 чем CD4 и CD8, и поэтому они могут быть определены как CD3 высокой4. Этот сигнал далее повышено маркировки γδ Т-клеток в флюрохром A с анти TCR γδ антител, улучшая таким образом разделение между CD3 низкая Т-клетки и клетки высокой γδ T CD3. B клетки могут быть определены как CD3– в A флюрохром и CD19+ в флюрохром б. Чтобы отделить CD3 негативные НК-клетки из клетки B, антитела анти CD56 использовался в флюрохром А как анти CD3. Это возможно потому, что CD56 выразил на NK клеток на гораздо более низком уровне, чем CD3 T клетки5. Наконец моноциты могут быть определены через комбинацию вперед стороне разброс свойств и выражение CD14 в флюрохром б.
Идея объединения до четырех маркеров с помощью двух флуорохромов уже успешно предпринята до6,7,8и был использован в клинический протокол для выявления злокачественных лимфоцитарный населения9 . Предыдущий доклад также комбинированные семь маркеры (с различными специфика от маркеров чем мы использовали в наших протокол) с помощью двух флуорохромов, но этот подход опирался на комплекс маркировки каждого антитела с различным количеством флюрохром10. Это отличается наш метод, который использует коммерчески доступных антител и может быть адаптирована к инструмент конфигурации и могут воспользоваться преимуществами нового поколения флуорохромов полимера.
Общая цель этой методологии является расширение оптических пределы большинства потока цитофлуориметрами, позволяя для записи пяти дополнительных маркеров допросить комплекс клеточных популяций. Как следствие расширенный Иммунологический анализ может быть выполнена на цитофлуориметрами расхода флюрохром доступной 6-10, и 2-3 флюрохром области инструментов можно добиться замечательных результатов в областях с ограниченными ресурсами. Высококачественные инструменты также могут воспользоваться такой подход с использованием дополнительных флуорохромов выполнить более глубокий анализ цитометрия потоков и для создания модульной потока гранулярных панели ориентации несколько линий на же время11. Это потенциально может уменьшить количество панелей, используемых в модульных Иммунофенотипирование проточной цитометрии и снизить затраты, ошибки и время обработки. Этот подход также очень хорошо подходит в случае клинических образцов с ограниченным числом ячеек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования человека материалов были утверждены Джонса Хопкинса институциональных Наблюдательный Совет под медицинское страхование портативности и акт об ответственности. Пациента и управления образцы были обезличенных. Получения и кровь от здоровых элементов были получены путем обоснованного согласия.
Примечание: Этот протокол протестированы на свежие или замороженные изолированных клеток периферической крови и цельной крови.
1. Подготовка клетки
-
Изоляции клеток периферической крови (КСДОР) из цельной крови
- Нарисуйте кровь в трубу Грин Топ 10 мл, содержащих гепарин натрия. Сразу же после того, как был заполнен трубка с кровью, Инвертируйте трубки несколько раз для предотвращения свертывания крови.
Примечание: Трубы, содержащие другие антикоагулянт Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или цитрат натрия может использоваться с сопоставимые результаты. Если собирается различное количество крови, следующие шаги в протоколе должен быть масштабируется соответственно. - Тщательно перенесите Рисованные крови в 50 мл Конические трубки. Разбавьте кровь с равным количеством фосфатный буфер (PBS) без кальция и магния.
- Добавить 15 мл градиент средней плотности (например, Ficoll) в нижней части нового 50 мл Конические трубки и тщательно оверлея разбавленной крови на вершине градиент средней плотности, избегая любого смешивания между градиент средней плотности и разбавленной крови.
Примечание: Это важный шаг для надлежащего разделения получения от красных клеток. - Центрифуга на 400 x г за 30 мин при комнатной температуре (RT), с не тормоз, чтобы избежать срыва интерфейса.
- После центрифугирования тщательно удалить верхний слой с помощью пипетки и сбросить ее, уделяя внимание не удалить клетки на стыке между плазмы и плотность градиента среднего, который является, где территории репликацию. Соберите как много клеток можно из интерфейса без касатьться Пелле эритроцитов в нижней части 50 мл Конические трубки и передачи новых 50 мл Конические трубки.
- Добавление PBS окончательный объем 25 мл и инвертировать несколько раз перемешать. Центрифуга на 300 x g 10 мин на RT с тормозом на удалить любое загрязнение среднего градиента плотности из суспензии клеток.
- Тщательно удалить супернатант без тревожных клеток Пелле. Добавление PBS окончательный объем 25 мл и инвертировать несколько раз перемешать. Центрифуга на 200 x g 10 мин на RT с тормозом на удаление тромбоцитов.
- Тщательно аспирационная супернатант не нарушая Пелле ячейки. Ресуспензируйте репликацию в 1 мл PBS/0.1% азид натрия. Азид натрия снижает укупорки, пролить, интернализации антител, и рост клеток восстановления, но его токсичности, может ухудшить жизнеспособность клеток. По этой причине азид натрия следует избегать во всех шагах, если будет культивируемых клеток для последующих экспериментов. Изоляция клетки и окрашивание без азид натрия дали аналогичные результаты окрашивания осуществляется в присутствии азид натрия.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Азид натрия может вызвать смерть, воздействуя на центральную нервную систему. Контакт может вызвать ожоги кожи и глаз. - Разбавьте клетки для подсчета передачи 30 мкл репликацию в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Затем добавьте 120 мкл PBS и 150 мкл Трипановый синий для определения количества клеток и жизнеспособности (клетки разведении 1:10). Ресуспензируйте тщательно.
- Передача 10 мкл Горяева, Фото клетки соответственно используется подсчета камеры и определить количество жизнеспособных клеток. Жизнеспособных клеток = количество Трипановый синий отрицательные клетки всего x 10 (коэффициент разрежения, используемые в настоящем протоколе) x 104.
Примечание: В среднем, 7-15 х 106 получения должны быть собраны из 10 мл крови. - Ресуспензируйте клетки на6 10 x 10 мл PBS/0.1% азид натрия
Примечание: КСДОР можно замороженные и сохраняющихся в жидком азоте для длительного периода времени. Однако выражение маркеров, например хемокиновых рецепторов могут быть изменены в этой процедуре.
- Нарисуйте кровь в трубу Грин Топ 10 мл, содержащих гепарин натрия. Сразу же после того, как был заполнен трубка с кровью, Инвертируйте трубки несколько раз для предотвращения свертывания крови.
-
Подготовка клетки из замороженных КСДОР
Примечание: различные процедуры замораживания может повлиять на восстановление и жизнеспособности клеток12. Репликацию для этих экспериментов были заморожены специально разработанных замораживания средств массовой информации или плода бычьим сывороточным (FBS)/10% диметилсульфоксида (ДМСО) с аналогичными результатами.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: ДМСО может быть слегка опасных ингаляции (раздражение легких), кожи контакт (раздражитель, мембранным), контакт глаз (раздражающие), при приеме внутрь.- Удаление замороженных КСДОР из жидкого азота и место на льду. Передача cryovial от льда непосредственно в ванну воды 37 ° C. Сохранить cryovial на поверхности воды и осторожно встряхните флакон, до тех пор, пока остаются небольшие льда Пелле. Передача cryovial обратно на льду.
- Удалите все воды салфеткой 70% этанол распыляется. Медленно добавьте 1 mL PBS/0.1% азид натрия при температуре 4 ° C и тщательно передать ячейки 15 мл Конические трубки. Медленно добавьте холодной азид натрия PBS/0.1% на 4 ° C до достижения окончательного объемом 15 мл.
- Центрифуги на 300 x g 10 мин тщательно удалить супернатант, Ресуспензируйте клетки в 1 мл PBS/0.1% азид натрия.
Примечание: Клетки могут также быть высокомобильна в RPMI 10% FBS с аналогичными результатами. - Разбавьте ячейку для подсчета передачи 30 мкл репликацию в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Затем добавьте 120 мкл PBS и 150 мкл Трипановый синий для определения количества клеток и жизнеспособности (клетки разведении 1:10). Ресуспензируйте тщательно.
- Передача 10 мкл Горяева, Фото клетки соответственно используется подсчета камеры и определить количество жизнеспособных клеток. Жизнеспособных клеток = количество Трипановый синий отрицательные клетки всего x 10 (коэффициент разрежения, используемые в настоящем протоколе) x 104.
- Ресуспензируйте клетки на6 10 x 10 мл в PBS/0.1% азид натрия.
-
Подготовка клетки из цельной крови
- Нарисуйте кровь в трубу Грин Топ 10 мл, содержащих гепарин натрия. Сразу же после того, как был заполнен трубка с кровью, Инвертируйте трубки несколько раз для предотвращения свертывания крови.
Примечание: Пробирки, содержащие другие антикоагулянт, такие как ЭДТА или цитрат натрия может быть использован с сопоставимые результаты. Если собирается различное количество крови, следующие шаги в протоколе должен быть масштабируется соответственно. - Передать трубку 12 мм x 75 мм максимум 200 мкл цельной крови, 2 мкл азид натрия и вихревой мягко для 2 s.
- Нарисуйте кровь в трубу Грин Топ 10 мл, содержащих гепарин натрия. Сразу же после того, как был заполнен трубка с кровью, Инвертируйте трубки несколько раз для предотвращения свертывания крови.
2. ячейки пятнать
Примечание: Выбор пары флуорохромов с практически нет спектрального наложения имеет важное значение для уменьшения распространения данных из-за высокого распространения флюрохром в другой детектор флюрохром. Для достижения оптимального идентификации Аль подмножества ячеек, флуорохромов с высокой квантовой урожайности должны использоваться такие антитела пар PE-BV421 и PE-APC.
-
Окрашивание свежих и замороженных КСДОР
- Передавать 100 мкл КСДОР (1 х 106 клеток) 96-луночных V-днище.
Примечание: Может использоваться любое количество клеток ниже, чем 1 x 10-6 с аналогичными результаты2. - Центрифуга на 350 x g 3 мин в RT и тщательно удалить супернатант не нарушая Пелле ячейки. Добавьте в каждый хорошо 100 мкл PBS, содержащий жить/мертвые поправимо красителя, который реагирует с бесплатным Амин на белки 10 мин на этикетке мертвые клетки.
- Подготовить для каждого образца 30 мкл смеси, содержащие все антитела (анти-CD3.-CD56, TCRγδ в fluorchrome A и анти CD4, CD8, CD19, CD14 в fluorchrome B). Концентрация антител, указаны в таблице 1 и Table2. На данном этапе, могут быть также добавлены титруемая антител против разных целевых молекулы и в различных флуорохромов (например, Таблица 3).
Примечание: Концентрация антител может варьироваться в зависимости от производителя и номер партии. Таким образом предварительные испытания должно быть сделано для достижения оптимального сигнала. PBS, PBS/0.5% BSA, азид натрия PBS/0.2% или PBS/0.5% BSA/0.1% азид натрия использовались аналогичные результаты для разбавления антитела2. Клетки также могут быть окрашены в томах отличается от 30 мкл легко интегрировать эту методологию к уже существующим пятная протоколы. - Центрифуга на 350 x g 3 мин в RT и тщательно удалить супернатант не нарушая Пелле ячейки. Добавьте коктейль антитела к каждой скважины и Ресуспензируйте тщательно без формирования пузырьков. Инкубируйте 30 мин на RT в темноте.
Примечание: Это позволяет пятно образцы на 4 ° C с аналогичными результатами. - 150 мкл окрашивание буфера и центрифуги на 350 x g 3 мин в RT и тщательно удалить супернатант не нарушая Пелле ячейки. Ресуспензируйте клетки в 200 мкл PBS и получения данных на проточный цитометр. Если изменяются окрашивание томов, пожалуйста обеспечить по крайней мере кратной разрежения оригинальный микс антитела, используется для стирки избыток антител.
Примечание: Окрашенные клетки могут фиксированной с в PBS/2% параформальдегида, хранится в холодильнике при температуре 4 ° C на ночь и затем приобрел проточный цитометр следующий день.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Параформальдегида вред при проглатывании и может вызвать раздражение кожи
- Передавать 100 мкл КСДОР (1 х 106 клеток) 96-луночных V-днище.
-
Пятнать цельной крови
- Каждая трубка 12 мм x 75 мм максимум, добавьте коктейль антител (анти-CD3.-CD56, TCRγδ в A флюрохром и анти CD4, CD8, CD19, CD14 в флюрохром B) и Инкубируйте на RT 30 мин на RT в темноте. Концентрация антител, указаны в таблице 4. На данном этапе титруют антител против разных целевых молекулы и в различных флуорохромов может быть добавлена также. Концентрация антител может варьироваться в зависимости от производителя и номер партии. Таким образом предварительные испытания должно быть сделано для достижения оптимального сигнала.
Примечание: Это позволяет пятно образцы на 4 ° C с аналогичными результатами. - Центрифуга на 350 x g 3 мин в RT и тщательно удалить супернатант не нарушая Пелле ячейки. Сделайте раствор 1 x буфера lysis красных кровяных клеток, следуя инструкциям производителя.
Примечание: Лизис решение должно быть на RT перед использованием. - Добавить 2.0 мл 1 x буфера lysis красных кровяных клеток в каждой трубе, крышка хорошо и инвертировать несколько раз перемешать. Накрыть фольгой и пусть сидят в течение 15 мин.
- Спина на 300 x g за 5 мин тщательно аспирационная супернатант не нарушая Пелле ячейки.
- Добавьте 2 мл PBS и центрифуги на 300 x g за 5 мин.
Примечание: на данный момент, Пелле ячейки должны иметь бледно белой окраски, указанием лизис успешный красных кровяных клеток. Тщательно удалить супернатант не беспокоить Пелле клеток и нежно ресуспензируйте клетки в 200 мкл PBS. - Деформации клетки через 12 мм x 75 мм трубы с 40 мкм фильтр крышки для удаления клеток агрегатов и получения данных на проточный цитометр.
- Каждая трубка 12 мм x 75 мм максимум, добавьте коктейль антител (анти-CD3.-CD56, TCRγδ в A флюрохром и анти CD4, CD8, CD19, CD14 в флюрохром B) и Инкубируйте на RT 30 мин на RT в темноте. Концентрация антител, указаны в таблице 4. На данном этапе титруют антител против разных целевых молекулы и в различных флуорохромов может быть добавлена также. Концентрация антител может варьироваться в зависимости от производителя и номер партии. Таким образом предварительные испытания должно быть сделано для достижения оптимального сигнала.
3. антитела титрования
Примечание: Антитела титрования является наиболее важным этапом для получения высокого качества, воспроизводимые данные. Титрование анти CD3,-CD8,-CD14, - CD19 и - TCR γδ следует стандартная процедура, в которой концентрация антител для оптимального разделения положительных и отрицательных пиков является производным от максимума, окрашивание индекс13,14. Разведений на пик или ближе к пик на стороне рост кривой пятно индекс должен быть выбран (Рис. 1A-C). Антитела анти CD4 титруют поставить пик CD4 позитивные населения между CD3 один положительный населения и CD3 +/ CD8 + T клетки, ближе к CD3 один позитивный сигнал лучше различать CD8dim населения (CD8 + γδ Т-клеток и NK Т-клетки). По той же линии, CD56 титрования стремится позиции NK CD56+ клетки между CD3+ и CD3– населения.
-
Максимальное пятно индекс кривой
Примечание: титрование анти CD3,-CD8,-CD14, - CD19 и - TCR γδ следует стандартная процедура, в которой концентрация антител для оптимального разделения положительных и отрицательных пиков является производным от пятнать индекс кривой15максимум. Если антитела против других маркеров добавляются к группе, они также должны титруют с максимальной окрашивание индекс кривой.- Готовить 2 раза антитела разрежения, заполнив 10 скважин 96-луночных плиты с 40 мкл окрашивания буфера. В первой скважины увеличение окончательный объем 80 мкл окрашивание буфера и добавьте антитела интерес при концентрации 4 раза концентрацию предложил заводом-изготовителем.
- Хорошо перемешайте и передачи 40 мкл на второй хорошо. Хорошо перемешайте и повторите этот шаг для всех других скважин.
- Пятно 10 образцов с 30 мкл 10 различных разведениях 2 раза антител после протокол описано ранее КСДОР или цельной крови.
- Получение данных с проточный цитометр и сюжет сигнал от каждого разрежения (рис. 1A).
- Ворота на негативные и позитивные населения для каждой концентрации антител. Увеличение концентрации антител может привести к выше фона. Таким образом соответственно изменить негативные ворота.
- Для каждого концентрации антитела извлечь информацию о медиана и стандартное отклонение для интенсивности флуоресценции негативные населения и медиана интенсивности флуоресценции положительных населения. Рассчитать для каждого антитела концентрации индекс пятно с этой формулой: (средней интенсивности флуоресценции положительных населения — средней интенсивности флуоресценции негативные населения) ÷ (2 x стандартное отклонение люминесцентная интенсивности отрицательный населения) (рис. 1B).
- Заговор против индекс пятно. концентрации антитела, выраженное в виде дроби разбавления антитела (например, 1:10 разрежения = 0.1) и определить концентрацию антител с максимальной пятно значения индекса (рис. 1 c).
-
Анти-CD4 и - CD56 антитела титрования
Примечание: титрование антител анти-CD4 и - CD56 опирается на предыдущие титрования других маркеров в панели двух флюрохром. Для антитела анти CD4, титрование направлена на размещение анти CD4 сигнала между двойной CD8+/CD3+ сигнал и CD3 одного позитивного населения (рис. 1 d).- Титруйте анти CD4 и CD56 антител с стратегию 2 раза разрежения, как описано ранее, добавив дополнительные концентрации между ними, чтобы точно определить диапазон концентрации, которые позволяют отделить CD4+ T клеток и NK клеток из другой ячейки населения.
- Титруйте антитела анти CD4, поместив анти CD4 сигнала между двойной CD8+/CD3+ сигнал и CD3 одного позитивного населения (рис. 1 d).
Примечание: Особое внимание должно быть сделано, чтобы четко отделить CD4 CD8 клетки+ T+ тусклом населения. - Титруйте антитела анти CD56 после стратегия похож на титрование антител анти CD4, размещая НК-клеток между CD3-отрицательных и CD3-положительных населением.
4. стробирования стратегия
-
Определить лимфоцитарный и monocytic клеточных популяций и удалить отмершие клетки и большинство остаточных красных кровяных клеток из анализа.
- Выберите все население, содержащие лимфоцитов и моноцитов, основанные на вперед против точечной Сиде (FSC-A против SSC-A). Удалите ячейку агрегатов из анализа через вперед разброс высота против вперед разброс ширина (FSC-H против FSC-W) и ширина бокового разброс для точечной высота стороне против (SSC-H против SSC-W).
- Используйте маркер жить/мертвые дискриминации исключить из анализа яркие позитивные отмершие клетки и остаточного красные кровяные клетки. Ворота на лимфоциты и моноциты, на основе различных FSC- и SSC профиля.
-
Двух флюрохром семь маркер стробирования стратегия лимфоцитарный населения.
Примечание: в рамках подгруппы позитивные CD3, CD4+, CD8+ и γδ T клетки могут быть разделены с помощью антител, ориентированные исключительно на CD4 и CD8 γδ рецептора. Подобным образом, в рамках подгруппы негативные CD3 B клетки, клетки и моноциты могли быть однозначно идентифицированы с помощью антител против CD19, CD56 и CD14, соответственно.- Выберите ворота лимфоцитов и создайте точку участок с на каждой оси, один из двух флуорохромов, используемые в настоящем Протоколе (рис. 2B).
- Ворота на CD8+ T клетки, определены как CD3+/CD8+ двойной положительный клетки в правом верхнем углу участка точка (рис. 2B). Исключите Дим CD8 населения, которое может содержать NKT клетки. Ворота на CD4+ T определены как населения между CD8 клетки+ T клеток и CD3 одного позитивного населения. Ворота на γδ Т-клетки определены как высокая CD3 клетки. Разделите γδ Т-клеток в CD8 положительные и отрицательные CD8.
- Ворота на НК-клеток, определены как населения между CD3-позитивных и CD3-отрицательные клетки. Разделите НК-клеток в CD8 положительные и отрицательные CD8. Ворота на клетки B определены как CD3-отрицательных CD19+ населения в правом нижнем углу участка точка.
- Выберите Моноцит ворота и создайте точку участок с на каждой оси, один из двух флуорохромов, используемые в настоящем Протоколе (рис. 2 c). Ворота на CD3–/CD14+ населения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Настройка и анализ потока цитометрии эксперимента человеческих клеток периферической крови окрашивали семь lineage маркеров (анти CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 и - TCR γδ антитела) с использованием только двух флуорохромов представлены.
Представитель результаты описаны для анти CD8 и - CD56 антитела титрования. Для каждого антитела (в этом примере, анти CD8), данные из десяти последовательных 2 раза разведений были записаны для расчета пятно индекс кривой (Рис. 1A-C). Оптимальное антитела концентрация определяется максимальное пятно индекс сигнал13,14. Разведений на пик или ближе к пик на стороне рост кривой пятно индекс должен быть выбран. Анти-CD4 и - CD56 антитела были титруют путем пятнать периферийные клетки крови вместе с другими маркеры на панели двух флюрохром (ранее титруют). Для антитела анти CD4, титрование должны быть направлены на размещение анти CD4 сигнала между двойной CD8+/CD3+ сигнал и CD3 одного позитивного населения (рис. 1 d). Особое внимание должно быть сделано, чтобы четко отделить CD4 CD8 клетки+ T+ тусклом населения. Получения окрашивали с оптимальной концентрации указанных маркеров и разные концентрации анти CD4. Цветовой код концентрации: зеленый цвет обозначает концентрации, которые приводят к оптимального разделения CD4+ T клеток от других CD3+населения; оранжевый показывает концентрации, которые приводят к приемлемым, но не идеальное разделение; красный цвет означает концентрации, которые приводят к бедным разделение CD4 клеток+ T от dim CD8 клетки или CD4/CD8 двойное отрицание населения. Анти CD56 титрования было сделано аналогичным образом как антитела анти CD4, размещая НК-клеток между CD3 отрицательной–и CD3-положительных населения.
Представитель стробирования стратегия показывает, как определить лимфоцитарный и monocytic клеточных популяций и удалить из анализа отмершие клетки и большинство остаточных красных кровяных клеток (рис. 2A). Все последующие анализ был основан на этой шлюзовой стратегии. Представитель стробирования стратегия используется для определения CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки, клетки и моноцитов в двух флюрохром семь маркер окрашивание (Рисунок 2B-C).
Представитель отрицательные результаты вытекающих из неправильной пробоподготовки и титрования и анти CD4 - CD56 антител. Невозможность надлежащего Титруйте CD4 результаты в бедных разделение CD4 клеток+ T от CD8+ T-клеток (Рисунок 3А), в то время как бедных CD56 титрование может привести к плохой разделение НК из B клеток и клеток негативные для всех маркеров в окрашивание (Группа Рисунок 3B). Бедные лизис РБК может произойти с цельной крови пятнать. Если основная цель протокола заключается в том, чтобы вычислить процент населения различных клеток (например, % CD4+ T клетки), загрязнение с РБК двойное отрицание клетки, которые появятся в точка сюжет как двойное отрицание населения, должны быть исключены из анализ (рис. 3 c). Основываясь на нашем опыте с настоящим Протоколом, мы заметили, что точное разделение между B-клеток и NK CD8+ клетки могут быть проверены с помощью других маркеров. В качестве примера НК-клетки являются двойной негативный для HLA-DR и CCR6, в то время как клетки B являются двойной положительный (рис. 3D).
Протокола, представленные в этой рукописи должен быть частью многоцветной окраски группы опросить несколько иммунитета населения в образцах с ограниченное количество клеток. Используя этот подход, мы исследовали динамику популяции иммунной продольных образцов от доноров с множественной миеломой, получения пересадку стволовых клеток (Clinicaltrials.gov NCT0056609816). Замороженные КСДОР были собраны и проанализированы проточной цитометрии в день 0, 14, 28, 60, 180, 360 после пересадки. Используя этот подход, мы смогли опросить несколько популяций лимфоцитов, упором на их наивными и памяти профиля (CD45RA, CCR7), истощения статус активации и клеток (HLA-DR, CD57, CD45RA + эффекторных памяти, CD16) и T эффекторных фенотип (CCR4, CCR6, CXCR3) в едином пятнать группа17,18,19,20,21,,2223,24,25 , 26. это было особенно полезным, учитывая, что количество собранных клеток для некоторых пациентов и моменты времени едва хватает для только одного окрашивания панели. Представитель стробирования стратегии (Рисунок 4) и динамика населения (рис. 5) выбранной ячейки рецидивирующего пациента с течением времени. В множественной миеломы B клетки можно выразить НК маркер CD56. Чтобы исключить эту возможность, мы использовали HLA-DR и CCR6 различать далее B клетки от НК-клеток (рис. 4В). CD8+ памяти и наивные Т-клетки были определены выражением CD45RA и CCR7: наивные (CD45RA+/CCR7+), Центральный память (CM, CD45RA–/CCR7+), эффекторные памяти (EM, CD45RA–/CCR7- ) и эффекторных памяти CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (рис. 4 c). Выражение HLA-DR и CD57 в CD8+ наивно, общий объем памяти T клетки (которые составляют см, EM и EMRA), см, EM и EMRA (рис. 4 d). CD4+ памяти и наивные Т-клетки были определены выражением CD45RA и CCR7: наивные (CD45RA+/CCR7+), Центральный память (CM, CD45RA–/CCR7+), эффекторные памяти (EM, CD45RA–/CCR7- ) и эффекторных памяти CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (Рисунок 4E). HLA-DR и CD57 выражение в CD4+ наивно и памяти населения (которые составляют см, EM и EMRA), см, EM и EMRA (Рисунок 4F). CCR4 и CCR6 были использованы в качестве маркеров для идентификации в памяти населения Th9 CD4+ Т-клеток (рис. 4 g). Th1, Th2 и Th1/17, Th17 CD4+ T вспомогательный субпопуляций были определены выражением CCR4, CCR6 и CXCR3 (рис. 4 H). CD16 и CD57 выражение в НК-клеток (Рисунок 4I). Трансплантация стволовых клеток привели к устойчивой CD4+ и CD8+ активация Т-клеток как показано увеличение выражение HLA-DR и CD57 и отклонение T помощнику Th1 фенотип. В день 60 процент клеток B резко увеличивается, прогнозирования рецидивов пациента (рис. 5).
Рисунок 1: представитель антитела титрования. (A) точка сюжет показывает выражение CD8 на свежие КСДОР витражи с указанной концентрации антитела. (B) таблицы составляют медианное значение и стандартное отклонение люминесцентная интенсивности CD8+, средней интенсивности флуоресценции CD8– населения и производные пятно индекс для каждой концентрации испытания. (C) график, как показано на деривата оптимальная концентрация антител в зависимости от индекса пятно. (D) представитель титрования антител CD4. Группа D был изменен от Буэн et al. 20172. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель стробирования стратегия и результаты дискриминации субпопуляции. (A) схематическое представление Дуплет отчуждения, живые клетки дискриминации и на основе размера стробирования лимфоцитов и моноцитов. (B) субпопуляций лимфоцитов, отождествляется с двумя флюрохром подход. (C) моноциты отождествляется с двумя флюрохром подход. Рисунок был изменен от Буэн et al. 20172. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель результаты, полученные от ненадлежащего пример разделения и неправильно антитела титрования. (A) неверно титрования CD4 антител приводит к плохой резолюции между CD4+ и CD8+ населения. (B) бедных CD56 титрование может привести к плохой отделение Нагорного Карабаха от клетки B. (C) влияние РБК неполной лизиса на дискриминации субпопуляции. (D) пример использования других маркеров, чтобы проверить точное разделение между B-клеток и NK клеток: клетки B являются HLA-DR и CCR6 двойной положительный, тогда как клетки являются двойное отрицание. Группа D был изменен от Буэн et al. 20172. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: стробирования стратегия для анализа образцы от пациентов с множественной миеломой. (A) лимфоцитов были закрытого типа на основе их FSC-A, и показано SSC-области и их поток гранулярных профиль с двух флюрохром окрашивания клеток иммунной. (B) разделение НК и B клеток, используя CCR6 и HLA-доктор (C) стробирование стратегии для идентификации CD8+ памяти и наивные Т-клеток. (D) выражение HLA-DR и CD57 в CD8+ памяти и наивные Т-клеток. (E) стробирование стратегии для определения CD4+ памяти и наивные Т-клеток. (F) HLA-DR и CD57 выражение в CD4+ памяти и наивные Т-клеток. (G) определение Th9 CD4+ T клеток (H) идентификация цитокина CD4+ Т-клеток субпопуляций (я) CD16 и CD57 выражение в НК-клеток. Этот показатель был адаптирован от Буэн et al. 20172. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: динамика популяции клеток у пациентов с множественной миеломой. (A) динамика популяций крупных лимфоцитов в КСДОР изолированы и замораживают в указанный день после трансплантации стволовых клеток (SCT). (B) Характеристика CD8 субпопуляциям с течением времени. (C) Характеристика субпопуляций CD4 с течением времени. (D) анализ НК подмножеств. Данные были нанесены с GraphPad призму. Этот показатель был адаптирован от Буэн et al. 20172. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Цель | Клон | Флюрохром | Поставщик | Концентрация | Цель |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | Родословная |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Биография | 1/30 | |
| CD4 | РПА T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | РПА T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Мертвые клетки | Синяя L/D | LT | 1/300 | Живой/мертвые дискриминации | |
| BD = BD Biosciences, био = BioLegend, LT = жизнь технологий | |||||
Таблица 1: Антитела группа используется для двух флюрохром иммунной клетки возможно окрашивание КСДОР (BV421-PE сочетание).
| Цель | Клон | Флюрохром | Поставщик | Концентрация | Цель |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | Родословная |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | APC | Биография | 1/30 | |
| CD4 | РПА T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | РПА T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Мертвые клетки | Синяя L/D | LT | 1/300 | Живой/мертвые дискриминации | |
| BD = BD Biosciences, био = BioLegend, LT = жизнь технологий | |||||
Таблица 2: Антитела группа используется для двух флюрохром иммунной клетки возможно окрашивание КСДОР (APC-PE комбинации).
| Цель | Клон | Флюрохром | Каталог | Поставщик | Концентрация | Цель |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | Родословная |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | Биография | 1/30 | |
| CD4 | РПА T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | РПА T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | Биография | 1/30 | Дифференциация |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1 G 1 | PE-Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | Й подмножеств |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | Биография | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 | НК-1 | PE-CF594 | 562488 | BD | 1/900 | Активация/истощения |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 8 3 G | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK, Моноцит активации |
| Мертвые клетки | Синяя L/D | L-23105 | LT | 1/300 | Живой/мертвые дискриминации | |
| BD = BD Biosciences, био = BioLegend, LT = жизнь технологий | ||||||
Таблица 3: Группа антител используемых пятна замороженных КСДОР от пациентов с множественной миеломой.
| Цель | Клон | Флюрохром | Поставщик | Концентрация | Цель |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | Родословная |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Биография | 1/200 | |
| CD4 | РПА T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | РПА T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Мертвые клетки | Синяя L/D | LT | 1/300 | Живой/мертвые дискриминации | |
| BD = BD Biosciences, био = BioLegend, LT = жизнь технологий | |||||
Таблица 4: Антитела группа используется для окрашивания клеток иммунной двух флюрохром из цельной крови (BV421-PE комбинации).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокола, представленные здесь было показано, быть достаточно гибкими и нечувствительным к изменениям в окрашивание буфер, температуры и подготовка клеток периферической крови из-за высокой выражение lineage маркеров на поверхности клеток. Наиболее важным этапом для получения высокого качества, воспроизводимость данных является антитела титрования. Следует отметить поскольку титрования антител должны всегда быть выполнены во время установки панели гранулярных потока, этот шаг не добавить дополнительные скамейки время для наших двух флюрохром подход. Титрование анти CD3,-CD8,-CD14, - CD19 и - TCR γδ следует стандартная процедура, в которой концентрация антител для оптимального разделения положительных и отрицательных пиков является производным от максимума, окрашивание индекс13,14. Разведений на пик или ближе к пик на стороне рост кривой пятно индекс должен быть выбран (рис. 1A-C). С другой стороны специальная титрования антител анти CD4 и анти CD56 необходимо выполнить. Антитела анти CD4 титруют поставить пик CD4 позитивные населения между CD3 один положительный населения и CD3+/CD8+ T клетки, ближе к CD3 один позитивный сигнал лучше различать CD8 (тусклый населения CD8+ γδ T клеток и NK Т-клетки). По той же линии, CD56 титрования стремится позиции NK CD56+ клетки между CD3+ и CD3 населения. С концентрацией использовать недалеко от значения, полученного в кривой насыщения естественно ниже выражение CD56 облегчает титрования этой антител. Использование высокой квантовой доходность флуорохромов является еще одним важнейшим фактором для оптимального разделения нескольких маркеров/населения на том же детектор. Мы получили успешные результаты с APC, BV421 и PE, но другие флуорохромов, таких как новое поколение полимерная краска, должны дать сопоставимые результаты. Чтобы уменьшить возможность появления артефактов за счет компенсации, это также важно выбрать пару флуорохромов с мало, если таковые имеются, спектральные перекрытия, например PE и APC, или PE и BV421. Выбор пары флуорохромов практически без компенсации имеет важное значение для уменьшения распространения данных из-за высокого распространения флюрохром в другой детектор флюрохром. Распространение сокращения облегчает стробирования иммунной субпопуляций путем минимизации искажения сигнала и позволяет использовать эту методологию, если только два флуорохромов, без необходимости компенсации элементов управления.
Сочетание маркеров, которые мы предложили высоко настраиваемый на основании требования следователя. Действительно некоторые из маркеров могут быть исключены из анализа, если они не относятся к населению интерес. Например, можно удалить антител анти CD19 исключить клетки B, или антител анти CD4 сосредоточиться только на CD8+ T клетки. Следует отметить, антитела анти CD8 имеет важное значение для выявления CD8+ НК клеток и клеток γδ T и поэтому не должны быть удалены из панели. Чтобы улучшить разделение редких клеточных популяций, другие флуорохромов/детекторы может использоваться для некоторых из маркеров двух флюрохром окраски. Как, например CD56 могут перемещаться к другой детектор для обнаружения NKT клетки, что невозможно с помощью панели двух флюрохром. Хотя это позволяет сократить количество маркеров из панели, осторожность должны быть приложены в добавление, изменение или переключение маркеров.
Если необходимый набор приборов, антител и мастерство, Стандартный маркер один флюрохром один подход по-прежнему наиболее точный способ определения нескольких иммунитета населения и дискриминации редко субпопуляций, например NKT или γδ Т-клеток. Однако основная цель данного метода является не заменой классический подход, а скорее для достижения глубоких Иммунофенотипирование при работе с инструменты с низкой количество детекторов, или образцов с ограниченным количеством клеток, при одновременном снижении сложности и стоимость в создании экспериментальной системы. Мы сделали обширные скрининга клинических образцов от пациентов с множественной миеломой, системная склеродермия, дерматомиозит и болезни Лайма, показаны, что эта процедура окрашивание может улучшить одновременно допроса нескольких населения с ограниченным количество ячеек. Наши результаты пока показали, что эта процедура является нечувствительным к хронической иммунной активации или инфекционные заболевания, но предварительные испытания должны проводиться для оценки точности этого протокола в разных стадиях болезни.
Будущие направления деятельности по дальнейшему укреплению потенциала этого протокола включают исследования характеризовать инфильтрирующие лимфоцитов в основной ткани из клинических образцов. Это актуально для опухоли и аутоиммунные заболевания иммунологии, где этот подход может обеспечить ценную информацию для анализа образцов с ограниченным материалом. Мы планируем для тестирования этой группы на permeabilized клетки, чтобы расширить потенциал обнаружения выражение cytokine и сигнальных молекул на же клинических образцов. Наконец следует отметить, что аналогичные подходы, направленные на расширение числа записываемых маркеров, также могут быть разработаны с использованием различных наборов маркеров и может также быть животных моделей развитых fordifferent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано национального института артрита и Musculoskeletal и кожных заболеваний, < https://www.niams.nih.gov/>, премия номер P30-AR053503; Стейблер фонд, www.stablerfoundation.org; Национальный институт аллергии и инфекционных болезней, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Нина Ирландии программа для здоровья легких (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , Wiley. (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, Blackwell Science. (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
