Summary
주 포상 세포 격리, 단백질 식 또는 활동 변조, 문화, 및 다운 스트림 응용 프로그램은 전에 다량 유용한 vivo 연구 포상-ductal metaplasia (ADM), 췌장암의 개발에는 초기 이벤트.
Abstract
동안 췌 장 염 및 췌장암의 초기 개발에 ductal 세포 포상 세포의 분화 추가 연구를 필요로 하는 핵심 과정 이다. 메커니즘을 이해 하기 ex vivo 3D 문화 그리고 ductal 세포 주 포상 세포의 분화 조절 포상-ductal metaplasia (ADM), 다른 시스템에 비해 많은 장점을 제공 합니다. 본 기술로, 단백질 식의 변조는 간단 하 고 신속 하 게, 분리, 자극 또는 virally 감염 및 ADM 과정 조사를 기본 포상 세포 배양 시작만 1 일 요구. 뿌리기 콜라겐에서 포상 세포 클러스터 나 기질, 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 달리 조작 하기 전에 포상 그들의 정체성을 유지 하기 위해 포상 셀 수 있습니다. 이 때 중요 한 해군 제 독의 유도에 다양 한 부품의 기여를 테스트 뿐만 아니라이 기술을 통해 쓸만한 cytokines 또는 다른 ectopically 관리 요인의 효과 하지만 일반적인 돌연변이, 증가 단백질 표정, 또는 단백질 식의 최저 기여의 바이러스 감염을 통해 쓸만한 주요 포상 세포, adenoviral 또는 lentiviral 벡터를 사용 하 여. 또한, 셀 콜라겐 또는 끝점에서 지하실 멤브레인 매트릭스에서 다시 고립 될 수 있다 고 단백질 식에 대 한 분석.
Introduction
포상-ductal metaplasia (ADM)는 췌 장 염과 췌장암 개발1 기계 통찰력 더 필요한 운전 키 프로세스 동안 보호 메커니즘입니다. 염증 유발 ADM은 가역2, 종양 KRA 돌연변이, 췌장암의 경우3의 90%에 존재는 하는 동안 방지 한 포상 형4,5, 등을 맞댄 차별화 6. Culturing와 3D 문화에 ductal 세포로 기본 포상 세포 차별화 vivo에서 공부 하기가 ADM 과정을 규제 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 수 있습니다. Ex vivo 연구 같은 ADM, 드라이버와 그 레 귤 레이 터의 실시간 시각화 가능 ADM 과정 뿐만 아니라 그들의 다운스트림 신호 경로에 기계적 통찰력의 몇 가지 드라이버 확인 되었습니다 또는 메서드를 설명 하는 여기를 사용 하 여 확인 된. ADM 유도 TGF-α (변형 성장 인자 알파)에 의해 포함 됩니다-MMP-7 (매트릭스 metalloproteinase-7) 라는 표현과 활성화 노치7, RANTES (활성화, 정상적인 T 세포와 분 비; 또한 알려진 표현에 통제의 중재 chemokine ligand 5 또는 CCL5) 및 TNFα (종양 괴 사 인자 알파)-NF-κB (핵 요인-κB)8의 활성화를 통해 ADM을 유도. ADM의 추가 중재자 종양 Kra9,10, EGFR (표 피 성장 인자 수용 체)의 증가 표현을 통해 ADM 프로세스와 ligands, EGF (향상 된 산화 스트레스에서 증가 일으키는 원인이 되는 표 피 성장 인자)와 TGF-α11.
췌장암 세포 라인의 사용은 체 외 연구에 대 한 일반적인, 1 차 셀 문화는 많은 이점을 제공 합니다. 예를 들어, 비-유전자 변형 쥐 또는 쥐 KraG12D와 같은 시작 돌연변이, 은닉에서 기본 포상 세포는 ADM의 초기 이벤트 셀 몇 및 제어 돌연변이 때문에 공부에 대 한 가장 적절 한 모델을 췌장암 개발 초기에 알려져 있습니다. 이것은 반대로 여러 돌연변이 많은 췌장암 세포 라인 식 통로 번호12에 따라 다양 하 고. 또한, 이러한 방법으로 식별 신호 경로 동물 연구에 의해 확인 되었습니다. 주 포상 세포를 사용 하 여 한 경고는 일반적인 암 세포 선 할 수 있는 그들은 페 수 수 없습니다.
여기 방법 포상 세포 격리, 각성제를 추가 하거나 adenoviral 또는 lentiviral 감염 뿐만 아니라 다시 격리 추가 분석에 대 한 끝점에서 세포의 단백질 발현을 조절 하 여 ADM을 3D 문화의 기법을 자세히 설명 합니다.
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Protocol
모든 동물 일 메이 요 클리닉 IACUC에 의해 승인 되었다.
1. 준비 재료, 솔루션, 및 3 차원 매트릭스의 기초
- 500 µ m와 76 m m로 105 µ m 폴 리 프로필 렌 메시 76 m m 사각형으로 잘라. 두 번 접힌된 작은 사각형을 만들 절반 접어 각 광장. 장소 한 500 µ m 및 1 105 µ m 멸 주머니에 사각형을 메쉬.
- 오토 클레이 브 폴 리 프로필 렌 메쉬 정사각형으로 두 쌍의가 위와 집게.
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Waymouth의 솔루션 x 10의 100 mL를 확인 합니다. 이온된 (DI) 물 50 mL에 Waymouth의 분말의 1 유리병 (14 g)를 저으, 해산, 추가 7.5% (75 g/L) 나트륨 중 탄산염의 30 mL. 마지막 볼륨 디를 사용 하 여 100 mL에 물을 가져오고 필터를 소독.
- 4 ° C와 콜라겐 젤 준비를 사용 하 여 저장소 10 x Waymouth의 미디어와 1 x Waymouth의 미디어. 때 양식, 침전 물 폐기.
- 당 췌 장 Waymouth의 완전 한 미디어 x 1의 50 mL 40 mg/mL 콩 트립 신 억제제의 125 µ L, 4 mg/mL dexamethasone의 12.5 µ L 소 태아 혈 청 (FBS)의 500 µ L을 추가 하 여 확인 합니다. 48 시간 이내 사용 하 여과 의해 살 균 하십시오.
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지하실 막 또는 콜라겐 매트릭스를 사용 하 여 3 차원 매트릭스 기초 준비 (제품 정보에 대 한 재료의 표 참조). 기본 pipetting 때 얼음에 접시를 놓고, 거품을 방지 하 고 전체 범위를 보장 하기 위해 각 잘 볼륨 pipetting 직후 접시를 회전.
- 조직 문화 후드에 얼음에 다음 구성 요소를 혼합 하 여 콜라겐 기지를 만들기: 콜라겐, Waymouth의 미디어, x 10의 550 µ L과 0.34 M NaOH (필터링 됨)의 366.6 µ L 5.5 mL 유형 나 쥐의 꼬리.
참고: 이것은 한 24-글쎄, 12-글쎄, 또는 6 잘 플레이트에 대 한 콜라겐 기지를 만들기 위해 충분 한 솔루션 이다. 한 접시 한 췌 장 acinar 절연에 대 한 충분 하다. - 다음 볼륨을 사용 하 여 콜라겐 베이스 플레이트: 80 µ L (8-잘 유리 슬라이드), 200 µ L (24-잘 접시), 400 µ L (12-잘 접시), 또는 800 µ L (6 잘 플레이트).
- 지하실 멤브레인에 대 한 매트릭스 기지, 피펫으로 모든 추가 구성 요소 없이 매트릭스. 다음 볼륨을 사용 하 여 각 잘: 50 µ L (8-잘 유리 슬라이드), 120 µ L (24-잘 접시), 240 µ L (12-잘 접시), 또는 600 µ L (6 잘 플레이트).
- 이러한 기지 (4 단계) 위에 포함 된 셀과 매트릭스의 두 번째 레이어를 만들기 전에 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에서 적어도 30 분 응고 하는 기지를 하자.
- 조직 문화 후드에 얼음에 다음 구성 요소를 혼합 하 여 콜라겐 기지를 만들기: 콜라겐, Waymouth의 미디어, x 10의 550 µ L과 0.34 M NaOH (필터링 됨)의 366.6 µ L 5.5 mL 유형 나 쥐의 꼬리.
- 포상 격리에 대 한 준비에서 한 600 mL 비이 커, 3 50 mL 튜브가 위, 집게의 압력가 쌍 및 3 개의 무게 보트와 후드 아래 얼음 양동이 압력가 쌍을 유지 합니다. 그런 다음, HBSS의 30 mL 300 µ L의 100 x 페니실린 스, 10 mL에 각각 2 개의 무게 배 고과 (1.8.2 및 2.1.4 단계에서 용) 50 mL 튜브에 최종 10 mL를 유지와 함께 확인 합니다.
- HBSS + 5의 40 mL 확인 %FBS, HBSS의 20 mL + 30 %FBS, 그리고 HBSS에서 2 mg/mL 콜라의 5 mL. 여 (0.22 μ m 기 공)과 여는 콜라를 소독 하 고 실내 온도에 유지. 얼음에 HBSS 솔루션의 각을 유지 합니다.
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실험실 벤치에 할 수 있는 췌 장 해 부에 대 한 작업 영역을 조립 한다.
- 호 일에 장소는 폴리스 티 렌 뚜껑 함께 테이블에는 흡수 성 패드 적용. 다음에 호 위에 4 핀 종이 타월 장소.
- 절 개 작업 영역 도달 다음 항목을 계속: 소 각 가방, 압력가 마로 소독가 위, 집게의 1 세트, 70% 에탄올 스프레이 병 및는 얼음 양동이 (HBSS 페니실린-스 단계 1.6에서에서 포함의 50 mL 튜브).
- 37 ° c 통을 4 ° C 원심 분리기를 설정
2. 포상 세포 격리
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CO2 유도 통해 마우스를 희생 하 고 자 궁 경부 전위를 수행 합니다. 즉시 췌 장 해 부. 췌 장, 첫 번째 핀을 해 부를 폴리스 티 렌 뚜껑을 마우스의 발 꼬리 연구원, 직면 하 고 되도록 마우스를 방향을 하 고 70% 에탄올으로 복 부를 살포.
참고: 대표 결과에 사용 하는 마우스 C57BL/6 배경 12 주 오래 된 비-유전자 변형 여성 이었다. 마우스 선택 추가 토론 섹션에 설명 되어 있습니다.- 압력가 마로 소독가 위, 집게의 집합을 사용 하 여, 모피/피부는 중간에 집게와 들어올린 모피와 흉 곽의 횡 경 막 지역에 요도 개통에서 피부를 통해 절 개를 위를 사용 하 여.
- 게 추가 incisions 왼쪽과 오른쪽 모피/피부를 잘라 되도록 멀리 복 부 구멍의 명확한 보기를 만들 수. 그리고 복 막 안 감 (중간에서 내려와 오른쪽 및 왼쪽)으로 잡아당겨, 장기에서 모피/피부와 함께 일을 했다.
- 창 자는 집게와 들어올린 공간 췌 볼을 만드는 마우스의 왼쪽에 그것을 넣어, 빛 색, 분홍색 그리고 어두운 붉은 타원은 비장에 연결 된. 췌 장 조직 그것의 부드러운, 해 면 질 짜임새에 의해 구별 된다. 췌 장 위를 따라 실행 하 고 내장으로 꼬이는 그만.
- 췌에서 비장을 구분 합니다. 다음, 췌 장 1 x 페니실린-스와 HBSS의 10 mL를 포함 하는 50 mL 튜브에 넣고 층 흐름 후드에 이것을 가져.
참고: 프로토콜의 나머지 단계는 층 류 두건에 활용 메 마른 기술을 수행 되어야 합니다.
- 췌 부 어와 빈에 (페니실린-스)와 HBSS 보트 무게, 그것을 소용돌이 여 췌 세척 겸 자를 사용 하 여. 그런 다음 두 번째에 집게와 췌 무게 HBSS (페니실린-스)와 포함 하는 보트 이동 합니다. 다시, 소용돌이 의해 췌 장 세척.
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췌 (페니실린-스)와 세 번째 HBSS 이동-보트 무게를 포함 하 고 췌 5mm 이하의 작은 조각으로 절단 시작. 다음에 부 어 췌 조각과 HBSS는 빈 50 mL 튜브.
- 이렇게 하려면 무게 배 밀고 되 고 액체에 췌 조각을 이동 하는 집게를 사용 합니다. 일단 모든 조각 이상 무게 보트에 연결 된 거 라. 집게와 모든 나머지 부분을 선택 하 고 포함 된 페니실린-스와 HBSS에 췌 50 mL 튜브에는 집게를 세척.
- 4 ° C에서 2 분 동안 931 x g 에서 centrifuge 고는 HBSS (및 부동은 어떤 지방) 5 mL 피 펫과 떨어져 pipetting으로 제거.
- 췌 장에 콜라 (단계 1.7에서에서 HBSS에 희석)의 5 mL를 추가 합니다. 플라스틱 파라핀 영화에서 50 mL 튜브를 감싸서 밀폐 뚜껑을 확인 하 고 37 ° c.에 20 분 220 rpm에서 떨고는 인큐베이터에 배치
참고: 토론에서 언급 한 대로 콜라 소화 시간이 달라질 수 있습니다. 외피의 끝에, 조직의 더 큰 조각을 유지 해야 합니다. - 분리 막을 포함 하는 췌 관에 얼음 놓고 차가운 HBSS + 5%의 5 mL을 추가 FBS. 2 분 4 ° C 그리고 5 mL를 피펫으로 사용 하 여 상쾌한을 피펫으로 931 x g 에서 원심.
- 10 ml HBSS + 5 %FBS 4 ° c.에 2 분 동안 931 x g 에서 원심 분리기 resuspend 피펫으로 5ml 피펫으로 사용 하 여 상쾌한 고 HBSS + 5%의 또 다른 10 mL와 함께이 단계를 반복 FBS.
- HBSS + 5%의 5 ml에서 resuspend FBS, P1000를 사용 하 여 전송 1 mL 500 µ m 메쉬를 통해 한 번에 50 mL 튜브에. HBSS + 5%의 추가 5 mL을 추가 메쉬를 통해 메시를 통해 모든 나머지 췌 장 세포를 씻어 P1000와 FBS.
- 세포 현 탁 액 500 µ m 메쉬에서 105 µ m 메쉬를 통해 여 넣어 pipetting 1 mL는 P1000 사용 하 여 한 번에. 다음, 부드럽게 HBSS + 30% 포함 된 튜브에 세포 현 탁 액을 피펫으로 FBS. 세포 현 탁 액의 레이어 상단;에 형성할 것 이다 원심 분리, 시 포상 세포는 펠 릿을 형성 싱크대 것입니다.
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4 ° c.에 2 분 동안 233 x g 에서 원심 분리기 상쾌한을 제거 하 고 Waymouth의 완전 한 미디어 x 1에는 펠 릿을 resuspend.
- 콜라겐 또는 지하실 멤브레인 행렬 셀의 임베디드를 직접 진행 하는 경우 췌 장 당 7 mL의 볼륨에 resuspend. Adenoviral 또는 lentiviral 감염으로 진행 하는 경우 4 ml 당 췌 장 resuspend.
3. 바이러스 감염
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1 췌 두 바이러스 감염에 대 한 충분 한로 (제어 및 실험, 예를 들어, null 및 cre), 두 35mm 접시의 뚜껑 사이 세포 현 탁 액을 분할. 접시의 뚜껑을 사용 하 여 최종 기판 나중에 따라서 쉽게 운동과 정지에 감염 수 있습니다.
- 바이러스를 작업할 때 15 분 이상에 대 한 모든 사용된 피 펫 팁 10% 표 백제에 담가.
참고: 35mm 판과 4 mL 볼륨 활용 셀 사이 8 및 16 주 오래 된 비-유전자 변형 쥐에서 잘 작동합니다. 접시 크기와 볼륨은 작은 또는 큰 pancreata와 동물에 대 한 조정 될 필요가 있습니다.
- 바이러스를 작업할 때 15 분 이상에 대 한 모든 사용된 피 펫 팁 10% 표 백제에 담가.
- Adenoviral 감염에 대 한 추가 바이러스 (적어도 10의 titer와7 자인 TU/mL) 각각의 뚜껑에 1:1,000 희석에 접시와 소용돌이 (그림 2, GFP 아 데 노 바이러스). 판 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 고 추가 2 h 1 h. 계속 부 화에 대 일 분 마다 소용돌이 놓고 지하실 막 또는 콜라겐 매트릭스 셀의 임베디드 진행 합니다.
- 후드에 바이러스 작업을 완료 한 후 적어도 15 분 동안 10% 표 백제와 후드에 모든 구성 요소를 흡수 하 고 70% 에탄올을 사용 하 여 표 백제를 철저 하 게 청소.
4. 콜라겐 또는 지하실 멤브레인 행렬 셀의 임베디드
- 7 mL을 결합 하 여 얼음에 게 콜라겐 젤 타입 쥐 꼬리 콜라겐 (3.3 mg/mL), Waymouth의 미디어, x 10의 700 µ L과 0.34의 466.6 µ L M NaOH.
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부드럽게 혼합 콜라겐 젤 및 셀 서 스 펜 션의 동일한 볼륨을 복용. 자극 또는 억제제를 추가 하는 경우 콜라겐 세포 현 탁 액 결합이. (후판 단계 1.5.3); 한 번에 하나의 잘 플레이트 얼음에 플레이트를 유지, 균일 하 게 배포 콜라겐 셀 레이어 소용돌이 친다.
- 에 각 잘 피펫으로 다음 양의 콜라겐 세포 현 탁 액: 200 µ L (8-잘 유리 슬라이드), 500 µ L (24-잘 접시), 1000 µ L (12-잘 접시), 또는 2000 µ L (6 잘 플레이트). 참고 ADM TGF-α와 자극을 통해 유도 된다 (50 ng/mL) 그림2에서.
- 지하실 막 매트릭스 셀의 임베디드에 대 한 혼합 한 부분 지하실 멤브레인 매트릭스 2-부분과 세포 현 탁 액. 콜라겐과 마찬가지로 행렬 셀 서 스 펜 션 뿐만 아니라 얼음에 플레이트를 유지. 하나 피펫으로 4.2.1과 분배에 대 한 소용돌이 동일한 볼륨을 사용 하 여 한 번에 잘.
- 30 분을 공고히 한 다음 Waymouth의 완전 한 미디어 어떤 자극 또는 억제제 (그림 2 사용 TGF-α에서 50 ng/mL) x 1을 추가 (37 ° C, 5% CO2) 셀 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 날과 다음 매일 (자극 또는 억제 물)와 미디어를 변경 합니다. 자극에 따라 ADM 3 일과 5 일 사이의 관찰할 수 있습니다.
5. 수확 콜라겐 또는 지하실 멤브레인 행렬에서 셀
- 콜라겐 세포를 수확에 필요한 다음과 같은 자료를 수집: 콜라 1 mg/mL의 30 mL에에서 희석 HBSS, 차가운 HBSS, 40 mL PBS, 2 개의 주걱, 두 50 mL 튜브, 춥고 얼음의 31 mL. 두 개 이상의 문화 조건 (각 상태는 접시의 ½)를 비교 하는 경우 주걱, 튜브 및 솔루션의 수를 조정 합니다. 4 ° c에서 원심 분리기를 설정 하 고 37 ° c 떨고 인큐베이터를 설정
- 미디어를 제거 하 고 주걱을 사용 하 여 포함 된 셀과 콜라겐 디스크를 제거 합니다. 별도 디스크를 넣고 각 조건에 대해 50 mL 튜브 빈.
- HBSS에 각 50 mL 튜브 1 mg/mL 콜라의 10 mL를 추가 합니다. 플라스틱 파라핀 영화 튜브 포장을 225 rpm에서 최대 45 분 동안 인큐베이터를 떨고 37 ° C에. 소화를 모니터링 하 고 더 이상 볼 수 콜라겐 때 튜브를 제거 합니다.
- 최소 감속으로 2 분 동안 4 ° C에서 233 x g 에서 원심. 오프는 상쾌한 고 튜브 당 5 mL 콜라 솔루션에서 resuspend. 37 ° c 225 rpm 10 분 동안 또는 없습니다 볼 수 콜라겐 때까지 인큐베이터를 떨고 소화.
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차가운 HBSS의 5 mL을 추가 하 고 이후 최소 감속으로 4 ° C에서 2 분 동안 233 x g 에서 centrifuging 여 소화를 중지 합니다.
- 차가운 HBSS 15 mL에 resuspend 하 고 다시 최소 감속으로 4 ° C에서 2 분 동안 233 x g 에서 원심. 반복 합니다.
- PBS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 1.5 mL 튜브로 이동. 233 x g 최소 감속으로 4 ° C에서 2 분 동안에 스윙 양동이에 원심. 표면에 뜨는 및 스냅-동결 액체 질소 나 드라이 아이스를 제거 합니다.
참고: 셀 펠 릿-70 ° C에 저장 하거나 다운스트림 응용 프로그램에 즉시 사용할 수 있습니다. - 지하실 막 매트릭스에 포함 된 셀을 수확, 50 mL에 각 우물에서 피펫으로 미디어 얼음에 튜브. 다음, 각 잘 하 지하실 멤브레인 매트릭스 복구 솔루션을 추가 하 고 50 mL 튜브에 셀 젤 혼합물을 다쳤어요.
참고: 각 잘은 다음과 같습니다 추가 지하실 멤브레인 매트릭스 복구 솔루션의 볼륨: 150 µ L (8-잘 유리 슬라이드), 420 µ L (24-잘 접시), 845 µ L (12-잘 접시), 그리고 2000 µ L (6 잘 플레이트). - 각각 50 mL 튜브에는 린스를 추가 지하실 멤브레인 매트릭스 복구 솔루션, 두 번 잘 헹 구 십시오.
참고: 각 린스 지하실 멤브레인 매트릭스 복구 솔루션의 볼륨은 다음과 같습니다: 150 µ L (8-잘 유리 슬라이드), 420 µ L (24-잘 접시), 845 µ L (12-잘 접시), 그리고 2000 µ L (6 잘 플레이트). - 지하실 막 매트릭스 녹이 고 때까지 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리에 따라 1 시간 또는 얼음에 튜브를 두고 상쾌한을 제거 하 고 차가운 PBS (양도할 수 있습니다 1.5 mL 튜브에 펠 릿 셀 원하는 경우) 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 4 ° c.에 3 분 동안 3500 x g 에서 원심 분리기 제거는 상쾌한 고 중 스냅 고정 셀 펠 릿 또는 세포의 용 해 버퍼를 추가 다운스트림 응용 프로그램에 직접 진행.
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Representative Results
본 프로토콜의 완료 1 일 안에 발생 하 고 자극, 시 ADM은 3-5 일에서 볼 수 있습니다. 그림 1 첫날에 1-4 단계는 완료 하는 그것에 의하여 방법의 순서를 보여 줍니다. 이 콜라겐 또는 지하실 멤브레인 매트릭스 준비, 포상 절연, 바이러스 성 감염 및 임베디드 포함 됩니다. 지하실 막 매트릭스 ADM 유도, 콜라겐 내 포상 세포 나 필요 받아야 TGF-α와 같은 자극, ductal 세포 감 별 법. 하루에 1, 지하실 막 또는 콜라겐 매트릭스 셀 포도 같은 둥근 모양 있고 형광 단백질을 표현 하는 벡터와 바이러스 감염을 활용 하는 경우 감염 효율성을 확인할 수 있습니다. 임베디드의 시간과 1, 3, 그리고 5 일에 변경 되는 미디어에 보충 교재로에 자극을 주어 하는 경우 하루 5, 셀 콜라겐에 덕트를 형성할 것 이다. 지하실 막 매트릭스에 포함 된 세포는 자극의 부재에서 덕트를 형성할 것 이다 하지만 자극 시 큰 덕트 형성할 것 이다, 그림 2에서 볼 수 있듯이.
그림 1 : Murine 기본 포상 세포를 분리, 단백질 발현을 조절 하 고 및 포상-ductal metaplasia를 자극 하 고 콜라겐 또는 지하실 멤브레인 행렬 셀을 포함 하는 절차의 도식. 워크플로 췌 장, 소화, 그리고 셀의 여과의 절 개를 포함 하는 포상 세포의 절연을 포함 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 기본 포상 세포 adenoviral 감염 및 TGF-α와 자극 후 콜라겐 또는 지하실 멤브레인 매트릭스 내에서 도금의 대표적인 결과. 비-유전자 변형 마우스에서 기본 포상 셀 GFP-아 데 노 바이러스에 감염 되었습니다, 나는 지하실 멤브레인 매트릭스, 콜라겐에 포함 된 및 TGF-α의 유무에 관계 없이 자극 (50 ng/mL). 24 시간 GFP 아 데 노 바이러스와 감염 된 후, 이미지 감염 효율을 보여 체포 되었다. 5 일 후 감염에서 이미지 자극된 또는 TGF-α 없이 콜라겐 또는 지하실 멤브레인 매트릭스 셀에 차이 나타냅니다. 덕트-같은 구조 백색 화살촉으로 표시 됩니다 하 고 바 대표 50 µ m. 이미지 EC 계획-Neofluar 10 x / 0.3 M27 목표 confocal 현미경을 사용 하 여 가져온 확장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
격리, 감염, 그리고 기본 포상 세포 도금에 대 한 시간의 상대적으로 짧은 시간이이 방법의 장점이 다. 반면, explant 파생물에서 포상 세포 배양 실습 시간이 좀 필요 하지만 포상 세포13의 파생물에 대 한 일 걸립니다. 포상 격리14 에 대 한 대체 프로토콜 노트 포상 세포;을 얻기 위해 매우 짧은 방법 그러나, EGF 살려 포상 세포 해당 프로토콜을 사용 하 여 격리 하는 때에 필수적인 구성 요소입니다. EGF ductal 세포 포상 세포의 분화를 자극, 이후 여기에, 문화에 대 한 자극 하는 ADM 구성 요소를 요구 하지 않는, 방법은 유도 메커니즘 또는 해군 제 독의 공부에 대 한 더 나은 이 방법에서는, 포상 세포 정체성 ductal 세포로 분화를 자극 하지 않는 콜라겐에 경작 하는 동안 유지 됩니다. 또한, transfecting 1 차 셀에 어려움은 바이러스 성 감염에 의해 단백질 표정 조작 통해 극복 됩니다.
이 절차는 ADM, ductal 구조를 시각화 하 여 유도 명시 하거나 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 통해 발생할 수 있습니다 직접 연구를 제공 합니다. 이미징 응용 프로그램에 대 한 챔버 슬라이드 ( 테이블의 자료에 명시 된)이 가장 좋습니다. 4 %paraformaldehyde 37 ° C에서 15 분 동안 고정 세포 방해 ductal 구조 없이 지하실 멤브레인 매트릭스에 포함 된 해결 됩니다. 이 부 화 하는 동안 지하실 멤브레인 매트릭스 유동화 것 이다 하 고 수 수 부드럽게 pipetted 오프는 paraformaldehyde로. 포함 된 콜라겐 세포에 면역 형광 추가 프로토콜15,16에서 자세히 설명 되어 있습니다. 실험의 끝점에 관련 된 신호 메커니즘의 분석에 대 한 더 응용 프로그램 포함 서쪽 오 점, 정량, 그리고 형광 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬 합니다. 1-6는 췌의 서쪽 오 점 또는 정량 한 샘플 분석에 대 한 충분 한 자료입니다.
이 프로토콜의 한계는 어디 각각 자신의 장점과 단점 있다 지하실 막 또는 콜라겐 매트릭스의 사용에서 발생 한다. 만 셀 콜라겐에서의 임베디드는 자극이 주어진 경우 덕트를 생산할 예정 이다, 하는 동안 지하실 멤브레인 매트릭스 임베디드 추가 자극 없이 덕트를 생산할 예정 이다. 그러나, 지하실 멤브레인 매트릭스에 ductal 크기 측정 가능한 출력입니다. 추가 제한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 5 단계에서 수확 절차에 관련 된 시간 이다. 이 한계는 면역 형광 검사, 있는 고정 시간은 상당히 정량 또는 서쪽 오 점 분석에 대 한 수확 시간 보다는 더 적은으로 서 부 럽에서 얻은 결과 확인 하 여 완화할 수 있습니다.
Adenoviral 감염 뿐만 아니라 lentiviral 감염 1 차 셀에 사용할 수 있습니다. Lentiviral 감염에 대 한 추가 6 µ g/mL 바이러스 감염 증강 시 약 (재료의 표 참조) 셀을 부드럽게 소용돌이 격판덮개. 그 후, 추가 lentivirus (적어도 10의 titer와7 화/mL) 1:1,000 희석에 다시 부드럽게 소용돌이 고. (37 ° C, 5% CO2) 3-5 h incubate 고 지하실 막 또는 콜라겐 매트릭스 셀의 임베디드 다음 계속 합니다. 관심의 플라스 미드와 lentivirus를 생성 하려면 lentiviral 포장 혼합 재료의 표에 설명 된 사용 합니다.
추가 수정 KraG12D을 표현 하는 쥐에서 세포의 절연을 포함할 수 있습니다. ADM 및 PanIN 병 변과 거리 영역을가지고 이미,이 쥐에 콜라 소화 시간이 더 걸립니다. 주의 중요 한 단계에서 설명한 대로 콜라 소화의 모니터링 및 문제 해결이 필요 합니다. 더 이상 조직 마우스, 더 이상 소화 (약 12 주 오래 된 p48Cre;에 대 한 시간 걸릴 것입니다. LSL-KrasG12D 마우스). 같은 나이의 쥐 사이의 엄청난 변화를 있을 수 있습니다, 이후 우리 LSL-KraG12D 마우스에서 포상 세포 격리 adenoviral 또는 lentiviral 감염 cre 종양 Kra 식을 활용 하 여 수행을 조언 한다. 그것은 또한 주목 해야한다 우리의 프로토콜 ADM 과정 조사 포상 세포의 분리에 적합. KraG12D에서 ADM 및 PanIN 셀의 절연-프로토콜 변경 organoid 문화 필요 쥐를 표현.
하나의 중요 한 단계는 다진된 췌 콜라에 지출 시간. 마우스와 같은 회사에서 콜라 많이 사이 이상적인 콜라 소화 시간 마우스에서 달라질 수 있습니다. 프로토콜에 명시 된 시간은 pancreata 0.250에 대 한 무게에 대 한 적절 한 g. 너무 많은 시간을 손상 하 고 죽 일 세포, 너무 시간이 좀 불완전 한 소화 되며 따라서 적은 세포 동안에 필터링 과정을 통해 그것을 만들 것입니다는 마지막 접시입니다. 다진 업 췌 조각의 고장에 대 한 보고 분리를 시각적으로 확인 솔루션은 흐린 설정 해야 합니다. 또한, 차가운 HBSS와 콜라 반응 중지 하기 전에 솔루션 반입할 수 있습니다 5 mL 피펫으로와 어디 있는 솔루션 채택 될 수 있다 쉽게 적절 한 반응을 중지 하는 경우 표시 됩니다. 추가 고려 pancreata 수확의 수입니다. 이상의 1 개의 췌 장 동시에, 최고의 절차 작품은 pancreata 별도 유지 때 격리 됩니다.
주요 포상 세포의 건강 한 문화를 위해 또 다른 중요 한 점은 그 주의 해야 포상 세포 솔루션 pipetting 때입니다. 활기찬 pipetting 세포 손상 하 고 TGF-α와 같은 알려진된 ADM inducers의 추가 가진 조차 덕트 형성의 부족에 발생할 수 있습니다. 또한, 생존 문제가 있을 경우, 2.4, 2.6, 2.7 단계에서 원심 취해질 수 있다 300 x g 아래로 부드럽게 펠 릿을 생산 하.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품 추 하는 NIH에서 R01 보조금 (CA200572)에 의해 지원 되었다 내용과 전적으로 저자의 책임은 반드시 국립 암 연구소의 공식 견해를 대표 하지 않는다 또는 funders에 역할을 했다 Health.The의 국가 학회 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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