Summary
Primära acinar cell isolering, protein uttryck eller aktivitet modulering, kultur och nedströms tillämpningar är rikligt användbara i ex vivo studie av acinar-till-duktal metaplasi (ADM), en tidig händelse i utvecklingen av cancer i bukspottskörteln.
Abstract
Differentiering av acinar celler till duktal celler under pankreatit och i den tidiga utvecklingen av cancer i bukspottskörteln är en viktig process som kräver vidare studier. För att förstå mekanismerna som erbjuder reglerar acinar-till-duktal metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur och differentiering av primära acinar celler till duktal celler många fördelar jämfört med andra system. Med tekniken häri är modulering av proteinuttryck enkel och snabb, kräver bara en dag att isolera, stimulera eller viralt infektera och börja odla primära acinar celler för att undersöka ADM processen. I motsats till med basalmembranet matris, odling av acinar cell kluster i kollagen jag extracellulärmatrix, tillåter acinar celler för att behålla deras acinar identitet innan manipulation. Detta är mycket viktigt när du testar olika komponenter till induktion av ADM. bidrag Inte bara är effekterna av cytokiner eller andra ectopically administrerade faktorer testbara genom denna teknik, men bidraget från vanliga mutationer, ökat proteinuttryck eller Nedslagning av proteinuttryck är testbara via virusinfektion primära acinar celler, med hjälp av lentiviral eller adenovirala vektorer. Dessutom celler åter kan isoleras från kollagen eller basalmembranet matris på slutpunkten och analyseras för proteinuttryck.
Introduction
Acinar-till-duktal metaplasi (ADM) är en skyddande mekanism under pankreatit och en viktig process som kör pankreascancer utveckling1 som kräver ytterligare mekanistiska insikter. Även inflammation-inducerad ADM är vändbar2, förhindra onkogena KRAS -mutationer, som är närvarande i 90% av cancer i bukspottskörteln fall3, differentiering tillbaka till ett acinar fenotyp4,5, 6. Culturing och differentiera primära acinar celler i duktal celler i 3D kultur möjliggör studiet av de molekylära mekanismer som reglerar ADM processen, vilket är svårt att studera invivo. Sådan ex vivo studier aktivera realtid visualisering av ADM, dess förare och dess tillsynsmyndigheter. Flera förare av de ADM process som mekanistisk insikt om deras nedströms signalvägar, har identifierats eller verifierade med hjälp av här beskrivna metoden. Dessa inkluderar ADM-induktion av TGF-α (omvandla tillväxtfaktor alpha)-medierade uttryck av MMP-7 (matrix metalloproteinas-7) och aktivering av Notch7, liksom RANTES (reglerat på aktivering, normala T-cell uttryckt och utsöndras; också känt som chemokine ligand 5 eller CCL5) och TNFα (tumörnekrosfaktor alfa)-inducerad ADM genom aktivering av NF-κB (nuclear factor-κB)8. En ytterligare medlare av ADM är onkogena KRas9,10, vilket orsakar en ökning av oxidativ stress som förbättrar ADM processen via ökat uttryck av EGFR (epidermal tillväxtfaktor receptor) och dess ligander, EGF ( Epidermal tillväxtfaktor) och TGF-α11.
Även användning av pankreas cancer cellinjer är vanligt för in vitro-studier, erbjuder primära cellkulturer många fördelar. Exempelvis primära acinar celler från icke-transgena möss eller möss härbärgerat initierande mutationer, såsom KrasG12D, är den lämpligaste modellen för att studera tidiga händelsen av ADM eftersom cellerna har några och kontrollerad mutationer, som är kända för att vara närvarande tidigt i cancer i bukspottskörteln utveckling. Detta är i kontrast till många bukspottskörteln cancer cellinjer som har flera mutationer och varierade uttryck baserat på passagen nummer12. Dessutom har de signalvägar som identifierats av sådana medel verifierats av djurstudier. En varning för att använda primära acinar celler är att de inte kan vara transfekterade typiska cancer cellinjer kan.
Metoden häri Detaljer tekniker för acinar cell isolering, 3D kultur som härmar ADM genom att lägga till stimulantia eller modulerande proteinuttryck via adenovirala eller lentiviral infektion, samt ny isolering av celler vid slutpunkten för ytterligare analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbetet godkändes av de Mayo Clinic IACUC.
1. beredning av material, lösningar och 3-dimensionella matris baser
- Skär 500 µm och 105 µm polypropylen maskor till 76 mm av 76 mm rutor. Vik varje kvadrat på mitten två gånger för att skapa en mindre vikta kvadrat. Plats en 500 µm och en 105 µm mesh torget till ett autoklaverbart påse.
- Autoklav polypropylen mesh torg, samt två par sax och pincett.
-
Gör 100 mL 10 x Waymouths lösning. Rör ner 1 injektionsflaska (14 g) Waymouths pulver i 50 mL avjoniserat vatten (DI) vatten och när löst, tillsätt 30 mL natriumbikarbonat som 7,5% (75 g/L). Ta den slutliga volymen till 100 mL med DI vatten och filter sterilisera.
- Store 10 x Waymouth's media vid 4 ° C och användning att förbereda kollagen geler och 1 x Waymouth's media. När påskyndar form, kassera.
- Gör 50 mL 1 x Waymouths komplett media per bukspottkörteln genom att lägga till 125 µL av 40 mg/mL sojabönor trypsin hämmare, 12,5 µL av dexametason 4 mg/mL och 500 µL fetalt bovint serum (FBS). Sterilisera genom filtrering och Använd inom 48 h.
-
Förbered 3-dimensionell matris baser med antingen kollagen eller basalmembranet-matris (se tabell av material för produktinformation). När pipettering basen, placera plattan på is, undvika bubblor och rotera plattan omedelbart efter pipettering varje brunns volym för att säkerställa fullständig täckning.
- Skapa kollagen baser genom att blanda följande komponenter på is i vävnadsodling huva: 5,5 mL av typ jag råtta svans kollagen, 550 µL 10 x Waymouth's Media och 366,6 µL 0,34 M NaOH (filtrerat).
Obs: Detta är tillräckligt lösning att göra kollagen baser för en 24-well, 12-väl eller 6-bra platta. En platta är tillräckligt acinar isolering från en bukspottkörteln. - Använd följande volymer för att plattan kollagen basen: 80 µL (8-väl glasskiva), 200 µL (24-väl pläterar), 400 µL (12-well platta) eller 800 µL (6-well platta).
- För basalmembranet baser matrix, Pipettera matrisen utan någon ytterligare komponenter. Använd följande volymer för varje brunn: 50 µL (8-väl glasskiva), 120 µL (24-väl pläterar), 240 µL (12-well platta) eller 600 µL (6-well platta).
- Låt baserna stelna i minst 30 min i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) innan du skapar ett andra lager av matris med inbäddade celler ovanpå dessa baser (steg 4).
- Skapa kollagen baser genom att blanda följande komponenter på is i vävnadsodling huva: 5,5 mL av typ jag råtta svans kollagen, 550 µL 10 x Waymouth's Media och 366,6 µL 0,34 M NaOH (filtrerat).
- Förberedelse för acinar isolering hålla en 600 mL-bägare, tre 50 mL rör, en Ånghärdad par sax, en Ånghärdad par pincett och en ishink under huven med tre väga båtar. Gör därefter 30 mL HBSS med 300 µL av 100 x penicillin-streptomycin, sätta 10 mL i varje två väga båtar och att hålla den slutliga 10 mL i en 50 mL tub (för användning i steg 1.8.2 och 2.1.4).
- Gör 40 mL HBSS + 5% FBS, 20 mL HBSS + 30% FBS och 5 mL 2 mg/mL kollagenas i HBSS. Sterilisera kollagenas genom filtrering (0,22 µm porstorlek) och förvara i rumstemperatur. Hålla varje HBSS lösningarna på isen.
-
Montera en arbetsyta för bukspottkörteln dissektion, vilket kan göras på en lab-bänk.
- Plats en absorberande pad på bordet, tillsammans med polystyren lock omfattas i folie. Placera sedan en pappershandduk med 4 pins ovanpå folien.
- Hålla följande produkter inom räckhåll arbetsytan dissektion: en förbränning väska, en uppsättning Ånghärdad sax och pincett, en sprayflaska med 70% etanol och en ishink (med 50 mL tub HBSS som innehåller penicillin-streptomycin från steg 1,6).
- Ange en centrifug till 4 ° C och en shaker till 37 ° C.
2. acinar Cell isolering
-
Offra musen via CO2 induktion, och utföra cervikal dislokation. Omedelbart dissekera bukspottkörteln. För att dissekera bukspottkörteln, första pin tassar av musen i polystyren locket, rikta musen så att svansen står inför forskaren, och spraya buken med 70% etanol.
Obs: musen används i de representativa resultat var en 12 - veckor gamla icke-transgena hona med C57BL/6 bakgrund. Mus-urval diskuteras ytterligare i diskussionsavsnittet.- Använda en uppsättning Ånghärdad sax och pincett, lyft pälsen/huden med hjälp av tången vid mittlinjen och använda saxen för att göra ett snitt genom päls och hud från urinrörets till området membran/bröstkorg.
- Göra ytterligare snitt till vänster och höger så att pälsen/huden skärs bort för att skapa en tydlig bild av bukhålan. Sedan skär i peritoneal slemhinnan (i mitten och till höger och vänster) och dra den bort från organ, såsom skedde med päls/hud.
- Lyft tarmarna med tången och lägga den till vänster sida av musen för att skapa utrymme för att se bukspottkörteln, som är ljus rosa i färg, och bifogas mjälte, vilket är en mörk röd oval. Bukspottskörteln vävnaden kännetecknas av dess mjuk, svampig konsistens. Klipp ut bukspottkörteln som kommer att köra längs magen och flätas samman med tarmarna.
- Separata mjälte från bukspottkörteln. Sedan sätta bukspottkörteln i en 50 mL tub innehållande 10 mL HBSS med 1 x penicillin-streptomycin och ta detta till LAF.
Obs: De återstående stegen i protokollet bör göras utnyttja steril teknik i en LAF.
- Häll bukspottkörteln och HBSS (med penicillin-streptomycin) in i en tom väger båten och, med hjälp av tången, tvätta bukspottkörteln genom omskakning det. Flytta sedan bukspottkörteln med tången till en andra väger båten som innehåller HBSS (med penicillin-streptomycin). Tvätta igen, bukspottkörteln genom omskakning.
-
Flytta bukspottkörteln till den tredje HBSS (med penicillin-streptomycin)-innehållande väga båt och börjar såga bukspottkörteln i små bitar av 5 mm eller mindre. Därefter Häll bukspottkörteln bitarna och HBSS i en tom 50 mL tub.
- Att göra detta, använda tången för att flytta bukspottkörteln bitar i vätskan som väger båten som tippas. Häll när alla bitar är inte längre kopplade till väga båten. Plocka upp eventuella återstående bitarna med tången och tvätta tången i 50 mL röret som innehåller bukspottkörteln i HBSS med penicillin-streptomycin.
- Centrifugera 931 x g under 2 minuter vid 4 ° C och ta sedan bort HBSS (och något fett som flyter) genom pipettering det med 5 mL pipett.
- Tillsätt 5 mL av kollagenas (utspädd i HBSS i steg 1,7) till bukspottkörteln. Säkerställa ett tillslutet lock genom att linda den 50 mL tub i plast paraffin filma och placera det i en inkubator som skakar vid 220 rpm under 20 minuter vid 37 ° C.
Obs: Kollagenas koktiden kan variera, som nämnts i diskussionen. I slutet av inkubation, bör inga stora bitar av vävnad förbli. - För att stoppa dissociation, placera bukspottkörteln-innehållande röret på is och tillsätt 5 mL kall HBSS + 5% FBS. Centrifugera 931 x g under 2 minuter vid 4 ° C och sedan Pipettera av supernatanten med hjälp av en 5 mL Pipettera.
- Blandas i 10 mL HBSS + 5% FBS och centrifugera vid 931 x g under 2 minuter vid 4 ° C. Pipettera av supernatanten med hjälp av en 5 mL Pipettera och upprepa detta steg med en annan 10 mL HBSS + 5% FBS.
- Återsuspendera i 5 mL HBSS + 5% FBS och, med hjälp av en P1000, överför 1 mL i taget genom en 500 µm mesh i en 50 mL tub. Lägga till ytterligare 5 mL HBSS + 5% FBS genom maskorna med en P1000 att tvätta alla återstående bukspottkörtelns celler genom maskan.
- Sätta cellsuspensionen från 500 µm maskan genom 105 µm mesh av spruta 1 mL i taget med en P1000. Nästa, försiktigt Pipettera cellsuspensionen i ett rör som innehåller HBSS + 30% FBS. Ett lager av cellsuspensionen kommer bilda i toppen; Vid centrifugering, kommer att acinar cellerna sjunka för att bilda en pellet.
-
Centrifugera vid 233 x g under 2 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 x Waymouths komplett media.
- Om går direkt till ingjutning av celler i kollagen eller basalmembranet matris, blandas i en volym om 7 mL per bukspottkörteln. Om vidare till adenovirala eller lentiviral infektion, Återsuspendera i 4 mL per bukspottkörteln.
3. virusinfektion
-
Som en bukspottkörteln räcker för två virusinfektioner (kontroll och experimentell, t.ex., null och cre), split cellsuspensionen mellan locken på två 35 mm plattor. Med locket på plattorna ger infektion i suspension och därför lätt rörelse på slutliga substratet senare.
- När du arbetar med virus, Blötlägg alla begagnade pipettspetsar i 10% blekmedel i minst 15 minuter.
Obs: Utnyttjande av 35 mm plattorna och volymen 4 mL fungerar bra för cellerna från icke-transgena möss mellan 8 och 16 veckor gamla. Plattan storlek och volym kan behöva justeras för djur med mindre eller större pancreata.
- När du arbetar med virus, Blötlägg alla begagnade pipettspetsar i 10% blekmedel i minst 15 minuter.
- För adenovirala infektion, lägga till viruset (med en titer på minst 107 TU/mL) vid en 1:1,000 spädning i locket på varje tallrik och snurra (figur 2, GFP adenovirus). Lägg plattorna i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) och snurra varje 15 minuter för 1 h. Fortsätt inkubation för en ytterligare 2 h och sedan vidare till ingjutning av celler i kollagen eller basalmembranet matris.
- Efter avslutad viral arbete i huven, Blötlägg alla komponenter i huven med 10% blekmedel i minst 15 minuter och sedan rengör noggrant blekmedel med 70% etanol.
4. ingjutning av celler i kollagen eller basalmembranet matris
- Gör kollagen gel på is genom att kombinera 7 mL typ I rat tail kollagen (3,3 mg/mL), 700 µL 10 x Waymouth's media och 466,6 µL av 0,34 M NaOH.
-
Tar lika stora volymer av kollagen gel och cell suspension, blanda försiktigt. Om du lägger till en stimulans eller hämmare, kombinera detta med kollagen-cellsuspension. Plåt en brunn i taget (plåtar från steg 1.5.3). att hålla plattan på is, snurra för att jämnt fördela det kollagen-cell-lagret.
- I varje brunn, Pipettera följande volymer av kollagen-cellsuspension: 200 µL (8-väl glasskiva), 500 µL (24-väl pläterar), 1000 µL (12-well platta) eller 2000 µL (6-well platta). Observera att ADM induceras via stimulering med TGF-α (50 ng/mL) i figur 2.
- För ingjutning av celler i basalmembranet matris, blanda en del basalmembranet matris med två-delar cellsuspension. Som med kollagen, hålla matrix-cellsuspensionen samt plattan på is. Pipettera en väl i taget med samma volym i 4.2.1 och virvel för jämn fördelning.
- Placera plattan i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) under 30 minuter för att stelna och sedan lägga till 1 x Waymouths komplett media med stimulans eller hämmare (figur 2 använder TGF-α vid 50 ng/mL). Ändra media (med stimulans eller hämmare) nästa dag och sedan varannan dag. Beroende på stimulansen, kan ADM observeras mellan dag 3 och dag 5.
5. avverkning celler från kollagen eller basalmembranet matris
- Samla in följande material behövs för skörd celler från kollagen: 30 mL av 1 mg/mL kollagenas utspätt i HBSS, 40 mL kall HBSS, 31 mL kall PBS, två spatlar, två 50 mL rör och is. Justera antalet spatlar, rör och mängden lösningar om jämföra mer än två odlingsbetingelser (där varje tillstånd är ½ av en platta). Ange centrifugen för 4 ° C och ange skakningar inkubatorn till 37 ° C.
- Ta bort materialet och använda spatlar ta bort kollagen diskarna med inbäddade celler. För varje villkor, sätta diskarna i en separat, Töm 50 mL tub.
- Tillsätt 10 mL av 1 mg/mL kollagenas i HBSS till varje 50 mL tub. Linda rören med plast paraffin film och sätta i en 37 ° C skakar inkubator vid 225 rpm upp till 45 minuter. Övervaka matsmältningen och ta bort rören när det finns ingen mer synliga kollagen.
- Centrifugera vid 233 x g vid 4 ° C i 2 min med minsta retardation. Ta bort supernatanten och återsuspendera i 5 mL kollagenas lösning per rör. Smälta i en 37 ° C skakar inkubator vid 225 rpm i 10 min eller tills det finns inga synliga kollagen.
-
Stoppa matsmältningen genom att tillsätta 5 mL kall HBSS och därefter centrifugering på 233 x g under 2 minuter vid 4 ° C med minsta retardation.
- Återsuspendera i 15 mL kall HBSS och igen Centrifugera 233 x g under 2 minuter vid 4 ° C med minsta retardation. Upprepa.
- Återsuspendera pelleten i 1 mL PBS och flytta till 1,5 mL tub. Centrifugera i en gunga hink på 233 x g under 2 minuter vid 4 ° C med minsta retardation. Ta bort supernatanten och snapin-frysa i flytande kväve eller på torris.
Obs: Cellpelleten kan lagras vid-70 ° C eller användas omedelbart i nedströms tillämpningar. - Att skörda basalmembranet matrix-embedded celler, Pipettera media från varje brunn till en 50 mL tub på is. Sedan lägga till basalmembranet matrix återhämtning lösning till varje brunn och skrapa cell-gel blandningen i 50 mL röret.
Obs: Volymen av basalmembranet matrix återhämtning lösning att lägga till varje brunn är följande: 150 µL (8-väl glasskiva), 420 µL (24-väl pläterar), 845 µL (12-väl plattan) och 2 000 µL (6-well platta). - Skölj väl två gånger med basalmembranet återhämtning modellösning, lägga sköljningar till 50 mL röret.
Obs: Volymen av basalmembranet matrix återställningslösning för varje sköljning är följande: 150 µL (8-väl glasskiva), 420 µL (24-väl pläterar), 845 µL (12-väl plattan) och 2 000 µL (6-well platta). - Lämna röret på is för 1 tim eller tills matrisen basalmembranet upplöser och följ med centrifugering vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL kall PBS (kan överföra till 1,5 mL tub om cellpelleten önskas).
- Centrifugera vid 3 500 x g under 3 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och antingen snapin frysa cellpelleten eller lägga lyseringsbuffert och direkt vidare till nedströms tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slutförande av protokollet häri uppstår inom ett dygn och vid stimulering, ADM ses i 3-5 dagar. Figur 1 illustrerar sekvensen av metoden, whereby steg 1 till 4 är slutfört den första dagen. Detta inkluderar förberedelse, acinar isolering, virusinfektion och ingjutning i kollagen eller basalmembranet matris. Medan basalmembranet matrisen framkallar ADM, acinar celler inom kollagen jag kräver ett stimulus, såsom TGF-α, genomgå differentiering till duktal celler. Dag 1, celler i kollagen eller basalmembranet matris har en rund druva-utseende och om utnyttja viral infektion med en vektor som uttrycker ett fluorescerande protein, infektion effektivitet kan kontrolleras. Dag 5 bildar celler i kollagen kanaler om ges stimulans vid tiden för ingjutning och som ett komplement i medierna som ändras på dag 1, 3 och 5. Celler inbäddade i basalmembranet matris bildar kanaler i avsaknad av ett stimulus, men vid stimulering större kanaler att bilda, som kan ses i figur 2.
Figur 1 : Schematisk av förfarandet för att isolera murina primära acinar celler, modulera proteinuttryck och/eller stimulera acinar-till-duktal metaplasi och bädda in celler i kollagen eller basalmembranet matris. Arbetsflödet innehåller isolering av acinar celler, vilket inkluderar dissektion av bukspottkörteln, matsmältningen och filtrering av cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa resultat av primära acinar celler pläterade i kollagen eller basalmembranet matris efter adenovirala infektion och stimulering med TGF-α. Primära acinar celler från en icke-transgen mus som var infekterade med GFP-adenovirus, inbäddade i kollagen jag eller basalmembranet matris och stimuleras med eller utan TGF-α (50 ng/mL). Tjugofyra timmar efter infektion med GFP adenovirus, bilder fångades för att Visa infektion effektivitet. På fem dagar efter infektion beteckna bilder skillnaderna i celler stimuleras med eller utan TGF-α i kollagen eller basalmembranet matris. Kanal-liknande strukturer indikeras med vita pilspetsar och skala barer representera 50 µm. bilder erhölls med confocal Mikroskop med målsättningen EG Plan-Neofluar 10 x / 0.3 M27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den relativt korta tid för isolering, infektion och plätering primära acinar celler är en fördel med denna metod. Däremot odlingsskålar acinar celler från en explant utväxt kräver lite hands-on tid, men det tar sju dagar för utväxten acinar celler13. Ett alternativt protokoll för acinar isolering14 noterar en mycket kort metod för att erhålla acinar celler; EGF är dock en viktig komponent i att hålla acinar celler levande vid isolerade använder protokollet. Eftersom EGF stimulerar differentiering av acinar celler till duktal celler, är metoden häri, som inte kräver ADM-stimulerande komponenter för kultur, bättre för att studera mekanismer för induktion eller reglering av ADM. Den här metoden bibehålls acinar cell identitet under odling i kollagen såvida inte stimuleras för att differentieras till duktal celler. Dessutom är svårigheter i transfecting primära celler övervinna via manipulera proteinuttryck av virusinfektion.
Detta förfarande erbjuder direkta studie av ADM, av vilka visualisering av duktal struktur induktion kan ske via brightfield eller immunofluorescens mikroskopi. För bildhantering program, är kammare diabilder (konstaterade i Tabellen för material) bästa. Fixering för 15 min vid 37 ° C med 4% PARAFORMALDEHYD kommer fixa celler inbäddade i basalmembranet matris utan störande duktal strukturer. Under denna inkubation, basalmembranet matrisen kommer att kondensera och kan vara försiktigt pipetteras med PARAFORMALDEHYD. Immunofluorescens på kollagen inbäddade celler beskrivs i detalj inom ytterligare protokoll15,16. Ytterligare ansökningar om analyser av inblandade signalering mekanismer vid slutpunkten av experimentet är Western blot, qPCR och fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS). En sjättedel av en bukspottkörtel är tillräckligt underlag för ett provanalys via Western blot eller qPCR.
Begränsningar i detta protokoll uppstår från användningen av kollagen eller basalmembranet matris, där alla har sina fördelar och nackdelar. Medan ingjutning av celler i kollagen kommer endast producerar kanaler om stimuli ges, kommer basalmembranet matrix förankring producera kanaler utan ytterligare stimuli. Duktal storlek i basalmembranet matris är dock en mätbar effekt. En ytterligare begränsning är tiden inblandade i skörd procedurerna i steg 5, som kan påverka genuttryck. Denna begränsning kan mildras genom att bekräfta resultat som erhållits från Western blotting med immunofluorescens, där fixering tiden är betydligt mindre än för skörd tiden för qPCR eller Western blot analys.
Förutom adenovirala infektion, kan lentiviral infektion användas i primära celler. För lentiviral infektion, tillsätt 6 µg/mL virusinfektion enhancer reagens (se tabell material) celler och försiktigt snurra plattorna. Lägg därefter till lentivirus (med en titer på minst 107 TU/mL) vid en 1:1,000 spädning och snurra igen, försiktigt. Inkubera under 3-5 h (37 ° C, 5% CO2) och fortsätter sedan till ingjutning av celler i kollagen eller basalmembranet matris. För att generera lentivirus med en plasmid sevärdheter, Använd den lentiviral förpackning mix noterade i tabellen av material.
Ytterligare modifiering kan omfatta isolering av celler från möss som uttrycker KrasG12D. I dessa möss, som redan har fibrotiska områden med lesioner ADM och PanIN, tar kollagenas matsmältningen längre tid. Krävs noggrann övervakning av kollagenas matsmältning, som beskrivs i de kritiska steg och felsökning. Mer onormala vävnaden en mus har, desto längre tid matsmältningen tar (runt en timme för en tolv veckor gamla p48Cre; LSL-KrasG12D mus). Eftersom det kan finnas enorma variation mellan möss i samma ålder, råder vi att isolera acinar celler från en LSL -KrasG12D mus och utföra adenovirala eller lentiviral infektion utnyttja cre Erhåll onkogena KRas uttryck. Det bör också noteras att våra protokoll är optimerad för isolering av acinar cell att undersöka ADM processen. Isolering av ADM och PanIN celler från KrasG12D-uttrycker möss för organoid kultur kräver ändras protokoll.
Ett kritiskt steg är mängden tid som hackad bukspottkörteln tillbringar i kollagenas. Perfekt kollagenas koktiden kan variera från mus till mus och mellan massor av kollagenas från samma företag. Tiden i protokollet antecknas är anslår för pancreata väger om 0,250 g. alltför mycket tid kan skada och döda celler, medan för lite tid kommer att resultera i ofullständig matsmältning och därför färre celler som kommer att göra det genom filtreringsprocessen på den sista plattan. Kontrollera dissociation visuellt genom att titta för fördelning av de hackade upp bukspottkörteln bitarna; lösningen ska vända grumlig. Dessutom, innan du stoppar kollagenas reaktionen med kall HBSS, kan lösningen tas upp med en 5 mL Pipettera, där den lätthet med vilken lösningen kan tas upp indikerar om det är lämpligt att stoppa reaktionen. En ytterligare faktor är antalet pancreata som skördas. Om mer än är en bukspottkörteln isolerade på samma gång, de förfarande som fungerar bäst när pancreata hålls åtskilda.
En annan viktig punkt att säkerställa sund kultur av primära acinar celler är att försiktighet bör iakttas vid pipettering acinar cell lösningen. Kraftig pipettering kan orsaka cellskador och resultera i brist på kanalen bildandet, även med tillsats av kända ADM-inducerare, såsom TGF-α. Ytterligare, om det finns lönsamhet frågor, så kan centrifugeringen i steg 2.4, 2.6 och 2.7 tas ner till 300 x g att producera en mjukare pellet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en R01 grant (CA200572) från NIH till PS. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Cancer Institute eller den nationella institut av Health.The finansiärer hade ingen roll i studera design, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
