Summary
Aislamiento primario de la célula acinar, la modulación de actividad o expresión de la proteína, cultura y últimas aplicaciones son muy útiles en el ex estudio vivo de metaplasia acinar ductal (ADM), un evento temprano en el desarrollo de cáncer de páncreas.
Abstract
La diferenciación de las células acinares a células ductales durante pancreatitis y en el desarrollo temprano del cáncer de páncreas es un proceso clave que requiere mayor estudio. Para entender los mecanismos de regulación metaplasia acinar ductal (ADM), ex cultura 3D vivo y diferenciación de las células acinares primarias a células ductales ofrece muchas ventajas sobre otros sistemas. Con la técnica aquí, modulación de la expresión de la proteína es simple y rápida, requiere solamente de un día para aislar, estimular o virus infectar y comenzar el cultivo de las células acinares primarias para investigar el proceso ADM. En contraste con utilizando la matriz de la membrana basal, la siembra de racimos de células acinares en colágeno I matriz extracelular, permite a las células acinares conservan su identidad acinar antes de manipulación. Esto es vital cuando la contribución de los diversos componentes para la inducción de la ADM. No sólo son los efectos de citoquinas u otros factores ectopically administrados comprobable a través de esta técnica, pero la contribución de común mutaciones, expresión de la proteína aumento o caída de expresión de la proteína es comprobable a través de la infección viral del primario las células acinares, uso de vectores lentivirales o adenoviral. Además, las células se puede volver a aisladas de colágeno o matriz de la membrana del sótano en el extremo y analizan para la expresión de la proteína.
Introduction
La metaplasia acinar-ductal (ADM) es un mecanismo de protección durante la pancreatitis y un proceso clave de desarrollo de cáncer de páncreas1 que requiere aún más la visión mecanicista de la conducción. Mientras ADM inducida por la inflamación es reversible2, las mutaciones oncogénicas KRAS , que están presentes en el 90% de los casos de cáncer de páncreas3, evitan la diferenciación hacia un fenotipo acinar4,5, 6. cultivo y diferenciando las células acinares primarias en células ductales en cultura 3D permite el estudio de los mecanismos moleculares que regulan el proceso de ADM, que es difícil estudiar en vivo. Tales ex vivo estudios permiten la visualización en tiempo real de ADM, sus conductores y sus reguladores. Se han identificado varios conductores del proceso ADM, así como la visión mecanicista de sus vías de señalización corriente abajo, o verificado usando el aquí descrito método. Estos incluyen inducción de ADM por TGF-α (alfa del factor de crecimiento transformador)-mediada por la expresión de MMP-7 (matriz metaloproteinasa-7) y la activación de ranura7, así como RANTES (regulado en la activación, célula T normal expresado y secretado; también conocido como quimiocina ligando 5 o CCL5) y TNFα (factor de necrosis tumoral alfa)-inducida por ADM a través de la activación de NF-κB (factor nuclear-κB)8. Un mediador adicional de ADM es oncogénico KRas9,10, que provoca un aumento en el estrés oxidativo que mejora el proceso ADM a través del aumento de la expresión de EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) y sus ligandos, EGF ( factor de crecimiento epidérmico) y TGF-α11.
Mientras que el uso de líneas celulares de cáncer de páncreas es común que en estudios in vitro, cultivos de células primarias ofrecen muchas ventajas. Por ejemplo, las células acinares primarias de ratones no transgénicos o ratones que mutaciones iniciadoras, como KrasG12D, son el modelo más apropiado para estudiar el evento temprano de ADM porque las células tienen pocos y controladas las mutaciones, que se sabe que estar presente temprano en el desarrollo de cáncer de páncreas. Esto es a diferencia de muchas líneas celulares de cáncer de páncreas que tienen mutaciones múltiples y variadas de expresión basado en paso número12. Además, las vías de señalización identificadas por estos medios han sido verificadas por estudios en animales. Una advertencia del uso de las células acinares primarias es que no pueden ser transfectadas como líneas celulares de cáncer típica pueden.
El método en el presente documento detalla las técnicas de aislamiento de células acinares, cultura 3D que imita el ADM por adición de estimulantes o modulación de expresión de la proteína vía infección adenoviral o lentivirales, así como la aislamiento de las células en el extremo de mayores análisis.
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Protocol
Todos los trabajos de animales fue aprobado por el IACUC de Clínica Mayo.
1. preparación de materiales, soluciones y 3-dimensional matriz Bases
- Plazas de 76 mm corte 105 μm polipropileno mallas en 76 mm y 500 μm. Doblar cada cuadrado por la mitad dos veces para crear un cuadrado más pequeño doblado. Lugar uno 500 μm y un 105 de malla cuadrado dentro de una bolsa de autoclave.
- Malla de polipropileno de autoclave para plazas, así como dos pares de tijeras y fórceps.
-
Hacer 100 mL de 10 x solución de Waymouth. Revuelva 1 frasco (14 g) de polvo de Waymouth con 50 mL de agua desionizada (DI) y, cuando está disuelta, Añadir 30 mL de bicarbonato de sodio 7.5% (75 g/L). Llevar el volumen final a 100 mL usando DI agua y filtro de esterilizar.
- De tienda 10 x Waymouth a 4 º C y uso para preparar geles de colágeno y de 1 x Waymouth. Cuando precipita forma, desechar.
- Hacer 50 mL de 1 x medios completo de Waymouth por páncreas añadiendo 125 μl de inhibidor de tripsina de soya 40 mg/mL, 12,5 μl de dexametasona de 4 mg/mL y 500 μl de suero bovino fetal (FBS). Esterilizar por filtración y usar dentro de 48 h.
-
Preparar bases de 3 dimensiones de la matriz utilizando la matriz de colágeno o la membrana del sótano (véase tabla de materiales para obtener información). Cuando uso la base, coloque la placa de hielo, evitar burbujas y gire la placa inmediatamente después de su uso de volumen de cada bien para asegurar una cobertura completa.
- Crear bases de colágeno mediante la mezcla de los siguientes componentes en el hielo en una campana de cultivo de tejidos: 5,5 mL de tipo rata de cola colágeno, 550 μl de 10 x medios de Waymouth y 366.6 μl de NaOH de M 0.34 (filtrado).
Nota: Esto es suficiente solución para hacer bases de colágeno para una placa de 24 pocillos, 12-bien o bien 6. Una placa es suficiente para aislamiento acinar del uno páncreas. - Utilizar los siguientes volúmenes de la base de colágeno de la placa: 80 μl (bien 8 portaobjeto), 200 μl (placa de 24 pocillos), 400 μL (placa de 12 pozos) o 800 μl (placa de 6 pozos).
- De la membrana del sótano matriz bases, pipeta de la matriz sin ningún componente adicional. Utilizar los siguientes volúmenes para cada bien: 50 μl (bien 8 portaobjeto), 120 μl (placa de 24 pocillos), 240 μl (placa de 12 pozos) o 600 μl (placa de 6 pozos).
- Que las bases solidifique durante al menos 30 minutos en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2) antes de crear una segunda capa de matriz con células incrustadas en la cima de estas bases (paso 4).
- Crear bases de colágeno mediante la mezcla de los siguientes componentes en el hielo en una campana de cultivo de tejidos: 5,5 mL de tipo rata de cola colágeno, 550 μl de 10 x medios de Waymouth y 366.6 μl de NaOH de M 0.34 (filtrado).
- En preparación para acinar aislamiento mantenga un vaso de precipitados de 600 mL, tres tubos de 50 mL, un autoclave par de tijeras, un autoclave par de pinzas y un cubo de hielo debajo de la campana con tres barcos de pesaje. Luego, realizar 30 mL de HBSS con 300 μL de 100 x penicilina-estreptomicina, poner 10 mL en cada uno de los dos barcos de peso y mantener el final 10 mL en un tubo de 50 mL (para uso en pasos 1.8.2 y 2.1.4).
- Completar 40 mL de HBSS + 5% FBS, 20 mL de HBSS + 30% FBS y 5 mL de colagenasa de 2 mg/mL en HBSS. Esterilizar la colagenasa por filtración (poros de 0.22 μm) y mantener a temperatura ambiente. Mantenga cada una de las soluciones HBSS en hielo.
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Montar un espacio de trabajo para la disección del páncreas, que puede hacerse en un banco de laboratorio.
- Lugar una almohadilla absorbente sobre la mesa, junto con una tapa de poliestireno cubiertos en papel de aluminio. Luego coloque una toalla de papel con 4 pernos en la parte superior del papel.
- Mantener los siguientes elementos al alcance del espacio de trabajo de disección: un bolso de incineración, un sistema de autoclave tijeras y pinzas, una botella de spray con etanol al 70% y un cubo de hielo (con el tubo de 50 mL de HBSS conteniendo penicilina-estreptomicina de paso 1.6).
- Establecer una centrifugadora a 4 ° C y una coctelera a 37 ° C.
2. acinar de la célula aislamiento
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Sacrificar el ratón mediante la inducción de CO2 y realizar la dislocación cervical. Inmediatamente diseccionar el páncreas. Para disecar el páncreas, el primer pin las patas del ratón a la tapa de poliestireno, orientar el ratón que la cola enfrenta el investigador y rociar el abdomen con etanol al 70%.
Nota: el ratón utilizado en los resultados representativos era una hembra no transgénicas 12 semana de edad con antecedentes de C57BL/6. Selección de ratón es discutida en la sección de discusión.- Usando un sistema de autoclave tijeras y pinzas, levantar la piel, piel con las pinzas en la línea media y utilizar las tijeras para hacer una incisión a través de la piel y la piel de la abertura uretral a la zona del diafragma/caja torácica.
- Hacer incisiones adicionales a la izquierda y derecha que se corta la piel/piel para crear una visión clara de la cavidad abdominal. Luego, cortar el revestimiento peritoneal (por la mitad y a la derecha e izquierda) y sepárelo de los órganos, como se hizo con la piel, piel.
- Levante los intestinos con el fórceps y ponerlo al lado izquierdo del ratón, creando espacio para ver el páncreas, que es luz rosa en color y en el bazo, que es un óvalo rojo oscuro. El tejido pancreático se distingue por su textura suave y esponjosa. Corte el páncreas que recorren el estómago y se entrelazan con los intestinos.
- Separar el bazo y el páncreas. Después, el páncreas en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de HBSS con x 1 penicilina-estreptomicina y llevar esto a la campana de flujo laminar.
Nota: Los pasos restantes del protocolo deben realizarse utilizando una técnica estéril en una campana de flujo laminar.
- Vierta el páncreas y HBSS (con penicilina-estreptomicina) en un vacío pesa barco y con unas pinzas, lave el páncreas agitando lo. Después, mueve el páncreas con el fórceps para un segundo peso barco con HBSS (con penicilina-estreptomicina). Una vez más, lavar el páncreas agitando.
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El páncreas hacia el tercer HBSS (con penicilina-estreptomicina)-peso del barco y comenzar cortando el páncreas en pequeños pedazos de 5 mm o menos. A continuación, vierta los trozos de páncreas y HBSS en un tubo de vacío 50 mL.
- Para ello, utilice las pinzas para mover las piezas del páncreas en el líquido como el barco pesa es que en la punta. Vierta una vez que todas las piezas ya no están conectadas al barco de pesaje. Recoger los pedazos restantes con las pinzas y lavar las pinzas en el tubo de 50 mL que contiene el páncreas en HBSS con penicilina-estreptomicina.
- Centrifugue a 931 x g durante 2 min a 4 ° C y luego retire la HBSS (y ningún tipo de grasa que flota) mediante pipeteo apagado con una pipeta de 5 mL.
- Añadir 5 mL de colagenasa (diluido en HBSS paso 1.7) en el páncreas. Asegurar una sellado tapa envolviendo el tubo de 50 mL en la película de parafina plástica y colocarla en un incubador de agitación a 220 rpm por 20 min a 37 ° C.
Nota: El tiempo de digestión de colagenasa puede variar, como se señaló en la discusión. Al final de la incubación, no deben permanecer pedazos grandes de tejido. - Para detener la disociación, coloque el tubo que contiene el páncreas en el hielo y agregar 5 mL de frío HBSS + 5% FBS. Centrifugue a 931 x g durante 2 min a 4 ° C y luego pipetee apagado el sobrenadante con una pipeta de 5 mL.
- Resuspender en 10 mL de HBSS + 5% FBS y centrifugue a 931 x g durante 2 min a 4 ° C. Pipeta del sobrenadante con una pipeta de 5 mL y repetir la operación con otro 10 mL de HBSS + 5% FBS.
- Resuspender en 5 mL de HBSS + 5% FBS y utilizando P1000, transfiera 1 mL a la vez a través de una malla de 500 μm en un tubo de 50 mL. Añadir un adicional 5 mL de HBSS + 5% FBS a través de la malla con una P1000 para lavar cualquier resto de las células pancreáticas a través de la malla.
- Poner la suspensión de células de la malla de 500 μm a través de la malla 105 μm por Pipetear 1 mL a la vez utilizando una P1000. Siguiente, pipetee suavemente la suspensión de células en un tubo que contiene HBSS + 30% FBS. Una capa de la suspensión celular se forma en la parte superior; Tras la centrifugación, las células acinares se hundirán para formar un pellet.
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Centrifugar a 233 x g durante 2 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 x medios completo de Waymouth.
- Si procediendo directamente a la incrustación de células de colágeno o matriz de la membrana del sótano, vuelva a suspender en un volumen de 7 mL por páncreas. Si proceder a infección adenoviral o lentivirales, resuspender en 4 mL por páncreas.
3. viral infección
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Como un páncreas son suficiente para dos infecciones virales (control y experimental, por ejemplo, null y cre), partido de la suspensión de células entre las tapas de dos placas de 35 mm. Usando la tapa de las placas permite la infección en suspensión y por lo tanto fácil movimiento sobre el sustrato final más adelante.
- Cuando se trabaja con el virus, tomar todas las puntas de pipeta usadas en 10% de lejía durante al menos 15 minutos.
Nota: Utilización de las placas de 35 mm y el volumen de 4 mL funciona bien para las células de ratones no transgénicos entre 8 y 16 semanas de edad. El tamaño de la placa y el volumen pueden necesitar ser ajustado para los animales con pancreata más o menos grande.
- Cuando se trabaja con el virus, tomar todas las puntas de pipeta usadas en 10% de lejía durante al menos 15 minutos.
- Para la infección adenoviral, añadir el virus (con un título de por lo menos 107 TU/mL) a una dilución de 1:1,000 a la tapa de cada placa y remolino (figura 2, adenovirus GFP). Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2) y agitar cada 15 minutos para 1 h. continuar incubación por un adicional 2 h y luego proceder al empotramiento de las células en la matriz de colágeno o membrana basal.
- Después de completar el trabajo viral en la campana, sumerja todos los componentes en la campana con 10% de lejía durante al menos 15 minutos y luego limpiar la lejía de utilizar etanol al 70%.
4. incrustación de células de colágeno o matriz de la membrana del sótano
- Hacer gel de colágeno en el hielo combinando 7 mL tipo I colágeno cola de rata (3,3 mg/mL) y 700 μl de 10 x medios de Waymouth 466.6 μl de 0.34 M de NaOH.
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Tomar volúmenes iguales de la suspensión de gel y células de colágeno, mezclar suavemente. Si agrega un estímulo o un inhibidor, combinar esto con la suspensión de células de colágeno. Un pozo de la placa a la vez (placas de paso 1.5.3); mantener la placa de hielo, agitar para distribuir uniformemente la capa de células de colágeno.
- En cada pozo, pipeta los siguientes volúmenes de la suspensión celular de colágeno: 200 μl (bien 8 portaobjeto), 500 μl (placa de 24 pocillos), 1000 μl (placa de 12 pozos) o 2000 μl (placa de 6 pozos). Tenga en cuenta que el ADM se induce mediante la estimulación con TGF-α (50 ng/mL) en la figura 2.
- Para incrustación de células en la matriz de la membrana del sótano, mezcla matriz de la membrana del sótano de una sola pieza con dos piezas suspensión de células. Como con el colágeno, mantener la suspensión de células de la matriz, así como la placa de hielo. Pipeta de un bien a la vez utilizando los mismos volúmenes en 4.2.1 y remolino para distribuirla.
- Coloque la placa en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2) por 30 min, para solidificar y luego añadir 1 x medios completo de Waymouth con cualquier estímulo o inhibidor (figura 2 usos TGF-α 50 ng/ml). Cambiar los medios de comunicación (con estímulo o inhibidor) al día siguiente y luego cada dos días. Según el estímulo, ADM puede observarse entre el día 3 y día 5.
5. recolección de las células de colágeno o matriz de la membrana del sótano
- Recoger los materiales necesarios para la recolección de las células de colágeno: 30 mL de colagenasa 1 mg/mL diluido en HBSS, 40 mL de frío HBSS, 31 mL de PBS frío, dos espátulas, dos tubos de 50 mL y hielo. Ajustar el número de espátulas, tubos y cantidad de soluciones si comparar más de dos condiciones de cultivo (donde cada condición es 1/2 de una placa). La centrifugadora a 4 ° C y la agitación incubadora a 37 ° C.
- Retire los medios de comunicación y Utilice espátulas para retirar los discos de colágeno con células incrustadas. Para cada condición, poner los discos en un separado, vaciar el tubo de 50 mL.
- Añadir 10 mL de colagenasa 1 mg/mL en HBSS a cada tubo de 50 mL. Envolver los tubos con película de plástico de la parafina y en un 37 º C agitando incubadora a 225 rpm durante 45 minutos. Vigilar la digestión y quitar los tubos cuando hay colágeno no más visible.
- Centrifugue a 233 x g a 4 ° C por 2 min con la desaceleración mínima. Quite el sobrenadante y resuspender en 5 mL de solución de colagenasa por tubo. Digest en un 37 º C agitando incubadora a 225 rpm por 10 min o hasta que no haya colágeno visible.
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Detener la digestión agregando 5 mL de frío HBSS y posteriormente centrifugar a 233 x g durante 2 min a 4 ° C con mínima desaceleración.
- Resuspender en 15 mL de HBSS frío y centrifugar nuevamente a 233 x g durante 2 min a 4 ° C con mínima desaceleración. Repetir.
- Resuspender el precipitado en 1 mL de PBS y pasar a tubos de 1,5 mL. Centrifugar en una cubeta de swing en 233 x g durante 2 min a 4 ° C con mínima desaceleración. Eliminar el sobrenadante y snap-congelación en nitrógeno líquido o hielo seco.
Nota: El precipitado de células puede ser almacenado a-70 ° C o utilizar inmediatamente en las últimas aplicaciones. - Para cosechar células de membrana basal embebido en matriz, media pipeta de cada pozo en un tubo de 50 mL en hielo. Luego, añadir solución de recuperación de la matriz de la membrana basal a cada pocillo y raspe la mezcla de gel de célula en el tubo de 50 mL.
Nota: El volumen de solución de recuperación de matriz membrana del sótano para agregar a cada pozo es la siguiente: 150 μL (bien 8 portaobjeto), 420 μl (placa de 24 pocillos), 845 μl (placa de 12 pozos) y 2.000 μl (placa de 6 pozos). - Enjuague bien dos veces con la solución de la recuperación de la matriz de la membrana del sótano, agregando las aclaraciones que el tubo de 50 mL.
Nota: El volumen de solución de recuperación de matriz de la membrana del sótano para cada enjuague es el siguiente: 150 μL (bien 8 portaobjeto), 420 μl (placa de 24 pocillos), 845 μl (placa de 12 pozos) y 2.000 μl (placa de 6 pozos). - Dejar el tubo en hielo durante 1 hora o hasta que la matriz de la membrana basal se disuelva y siga con centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de PBS frío (puede transferir a tubo de 1,5 mL si se desea el precipitado de células).
- Centrifugar a 3.500 x g durante 3 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y cualquier complemento congelar el precipitado de células o añadir tampón de lisis y proceder directamente a aplicaciones posteriores.
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Representative Results
Finalización del protocolo aquí ocurre dentro de un día y sobre el estímulo, el ADM se ve en 3-5 días. La figura 1 muestra la secuencia del método, por el que se completan los pasos 1 a 4 en el primer día. Esto incluye preparación, aislamiento acinar, infección viral y empotramiento en colágeno o matriz de la membrana del sótano. Mientras que la matriz de la membrana del sótano induce ADM, células acinares en colágeno requieren un estímulo, como el TGF-α, a someterse a la diferenciación a células ductales. El día 1, las células en la matriz de colágeno o membrana basal tienen una apariencia redonda de uva y si utilizando infección viral con un vector de expresión de una proteína fluorescente, puede comprobarse la eficiencia de la infección. Día 5, las células de colágeno formarán conductos si se les da un estímulo en el momento de empotramiento y como complemento en los medios de comunicación, que se cambiaron en los días 1, 3 y 5. Células incrustadas en matriz de la membrana basal forman conductos en ausencia de un estímulo, pero sobre el estímulo se forman conductos mayores, como se ve en la figura 2.
Figura 1 : Esquema del procedimiento para aislar las células acinares primarias murinas, modulan la expresión de la proteína o estimular metaplasia acinar ductal e incrustar las células en la matriz de colágeno o la membrana del sótano de. El flujo de trabajo incluye el aislamiento de células acinares, que incluye la disección del páncreas, digestión y la filtración de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Resultados representativos de las células acinares primarias plateadas dentro de matriz de colágeno o membrana basal después de infección adenoviral y estimulación con TGF-α. Las células acinares primarias de un ratón no transgénico estaban infectadas con adenovirus GFP incrustado en colágeno I o matriz de la membrana basal y estimulado con o sin TGF-α (50 ng/mL). 24 horas post infección con adenovirus GFP, imágenes fueron capturadas para mostrar la eficiencia de la infección. En cinco días post-infección, las imágenes denotan las diferencias en las células estimuladas con o sin TGF-α en colágeno o matriz de la membrana del sótano. Conducto-como las estructuras se indican mediante puntas de flecha blancas y escalan representan barras que 50 μm. las imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal con el objetivo de CE Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El relativamente corto período de tiempo de aislamiento, infección y revestimiento primarias células acinares es una ventaja de este método. Por el contrario, cultivo de células acinares de explante consecuencia requiere poco tiempo práctica, pero tarda siete días para la derivación de células acinares13. Un protocolo alternativo para acinar aislamiento14 notas de un método muy corto para la obtención de células acinares; sin embargo, el EGF es un componente esencial en mantener las células acinares vivo cuando están aisladas mediante ese protocolo. Dado que el EGF estimula la diferenciación de las células acinares a células ductales, el método, que no requiere de componentes estimulantes de ADM para la cultura, es mejor para estudiar mecanismos de inducción o reglamento de ADM. En este método, se mantiene la identidad de células acinares durante el cultivo en colágeno a menos estimulado a diferenciarse en células ductales. Por otra parte, dificultades para transfectar células de primarias se superan a través de manipular la expresión de la proteína por infección viral.
Este procedimiento ofrece el estudio directo de ADM, por que visualización de la estructura ductal de inducción puede ocurrir a través de microscopía brightfield o inmunofluorescencia. Para aplicaciones de imagen, cámara (mencionado en la Tabla de materiales) son mejores. Fijación durante 15 min a 37 ° C con paraformaldehído al 4% será fijar células incrustadas en matriz de la membrana del sótano sin estructuras ductales inquietantes. Durante la incubación, la matriz de la membrana basal se licuar y puede pipetearse suavemente apagado con el paraformaldehído. Inmunofluorescencia en las células de colágeno embebido se describe en detalle en protocolos adicionales15,16. Otras aplicaciones para el análisis de mecanismos de señalización involucrados en el punto final del experimento incluyen Western blot, qPCR y celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación. Una sexta parte de un páncreas es suficiente material para el análisis de una muestra mediante Western blot o la qPCR.
Limitaciones de este protocolo se presentan por el uso de matriz de colágeno o la membrana del sótano, donde cada uno tiene sus ventajas y desventajas. Incrustación de células de colágeno solamente producirá conductos si se dan estímulos, incrustación de matriz de la membrana del sótano produce conductos sin estímulos adicionales. Sin embargo, tamaño ductal en la matriz de la membrana basal es una salida mensurable. Una limitación adicional es el tiempo que en los procedimientos de captura en el paso 5, que podría afectar la expresión génica. Esta limitación puede ser mitigada por confirmar resultados de Western Blot con inmunofluorescencia, en el que el tiempo de fijación es considerablemente menor que el tiempo de cosechando para qPCR o análisis de Western blot.
Además de infección adenoviral, lentivirales infección puede utilizarse en células primarias. Para infección lentivirales, añadir 6 μg/mL infección viral potenciador de reactivo (véase tabla de materiales) a las células y suavemente las placas del remolino. Posteriormente, añadir los lentivirus (con un título de por lo menos 107 TU/mL) a una dilución de 1:1,000 y otra vez, agitar suavemente. Incubar durante 3-5 h (37 ° C, 5% CO2) y luego continuar la incrustación de células en la matriz de colágeno o membrana basal. Para generar el lentivirus con un plásmido de interés, utilice la combinación de embalaje lentivirales indica en la tabla de materiales.
Modificación adicional puede incluir el aislamiento de las células de los ratones que expresaban KrasG12D. En estos ratones, que ya cuentan con áreas fibróticas con lesiones ADM y PanIN, digestión de colagenasa toma más tiempo. Cuidadoso control de la digestión de la colagenasa, como se describe en los pasos críticos y resolución de problemas, es necesario. El tejido más anormal tiene un ratón, más la digestión tomará (alrededor de una hora para un p48Cre de de doce semanas de edad; LSL-KrasG12D ratón). Ya que puede haber enorme variación entre los ratones de la misma edad, se aconseja aislar células acinares de un ratón de LSL -KrasG12D y realizar la infección adenoviral o lentivirales utilizando cre para obtener la expresión oncogénica de KRas. También cabe señalar que nuestro protocolo está optimizado para el aislamiento de células acinares para investigar el proceso ADM. El aislamiento de células ADM y PanIN de KrasG12D-expresando ratones para organoide cultura requiere modificar protocolos.
Un paso crítico es la cantidad de tiempo que el páncreas picado pasa en colagenasa. El tiempo de digestión de colagenasa ideal puede variar de ratón a ratón y entre un montón de colagenasa de la misma empresa. El tiempo en el protocolo es apropiado para pancreata pesa sobre 0,250 g. demasiado mucho tiempo pueden dañar y matar células, mientras que muy poco tiempo dará lugar a la digestión incompleta y por lo tanto menos células que lo hará a través del proceso de filtrado en el placa final. Comprobar visualmente la disociación buscando el desglose de las piezas del páncreas tajados-para arriba; la solución debe resultar turbia. Además, antes de parar la reacción de colagenasa con HBSS frío, la solución puede ser tomada con una pipeta de 5 mL, donde indicará la facilidad con que la solución se puede tomar si es apropiado detener la reacción. Una consideración adicional es el número de pancreata cosechado. Si más de un páncreas se aísla al mismo tiempo, el procedimiento funciona mejor cuando lo pancreata se mantienen separados.
Otro punto importante para asegurar la cultura sana de las células acinares primarias es que debe tener cuidado al pipetear la solución acinar de la célula. Pipeteo vigoroso puede causar daño celular y resultar en una falta de formación del conducto, incluso con adición de inductores conocidos de ADM, como el TGF-α. Además, si hay problemas de viabilidad, la centrifugación en pasos 2.4, 2.6 y 2.7 puede tomarse hasta 300 x g para producir una pelotilla más suave.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención R01 (CA200572) de los NIH a PS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional del cáncer o los institutos nacionales de Health.The donantes no tenían ningún papel en estudiar diseño, recopilación de datos y análisis, decisión publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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