Summary
Birincil acinar hücre izolasyon, protein ifade veya etkinlik modülasyon, kültür ve aşağı akış uygulamaları eski bol yararlı vivo çalışmada acinar-için-duktal metaplazi (ADM), pankreas kanseri gelişimi erken bir durumda.
Abstract
Duktal hücreler acinar hücrelere farklılaşma pankreatit sırasında ve pankreas kanseri erken gelişiminde daha fazla çalışma gerektirir anahtar bir süreçtir. Düzenleyen acinar-için-duktal metaplazi (ADM), ex vivo 3D kültür ve duktal hücreler birincil acinar hücrelere farklılaşma mekanizmaları anlamak için diğer sistemleri birçok avantaj sunar. İle burada, modülasyon protein ifade basit ve hızlı, ayırma, teşvik veya virally bulaştırmak ve ADM sürecini araştırmak için birincil acinar hücre kültürü çalışmalarının başlaması için sadece bir gün gerektiren bir tekniktir. Tohum kollajen acinar hücre kümelerinin ben hücre dışı matriks, membran matrisi kullanarak aksine manipülasyon önce acinar kimliklerini korumak acinar hücreleri sağlar. Bu adm indüksiyon için çeşitli bileşenleri katkısını sınarken önemlidir Sadece etkileri sitokinler veya ectopically yönetilen diğer faktörler bu tekniği ile test edilebilir, ancak ortak mutasyonlar, artan protein ifade veya nakavt protein ifade viral enfeksiyon test edilebilir birincil acinar hücreleri kullanarak Adenoviral veya lentiviral vektörel çizimler. Ayrıca, hücreleri kollajen veya membran matris uç noktada yeniden ayrılmış olabilir ve protein ifade için analiz edilebilir.
Introduction
Acinar duktal metaplazi (ADM) pankreatit ve bir anahtar oluşum daha fazla mekanik kavrama gerektirir pankreas kanseri geliştirme1 sürüş sırasında koruyucu bir mekanizmadır. İltihap kaynaklı ADM tersinir2olmakla birlikte, pankreas kanseri durumlarda%390 mevcut, oncogenic KRAS mutasyonlar farklılaşma başa bir acinar fenotip4,5, önlemek 6. Culturing ve 3D kültür duktal hücre içine birincil acinar hücreleri ayırt sağlar içinde vivo çalışma zordur ADM süreci düzenleyen moleküler mekanizmaları çalışma için. Böyle ex vivo çalışmalar ADM, sürücülerinin ve onun regülatörleri gerçek zamanlı görselleştirme etkinleştirin. Çeşitli sürücüleri Mekanik kavrama üstünde onların aşağı akım sinyal yolları yanı sıra ADM işlemi tanımladığınızda veya doğrulanmış burada kullanarak yöntemi açıklanır. Bu ADM indüksiyon TGF-α (dönüştürme büyüme faktörü alfa) tarafından içerir-ifade MMP-7 (matriks metalloproteinaz-7) ve çentik7, hem de RANTES (harekete geçirmek üstünde normal T ifade ve salgılanan; Ayrıca bilinen hücre düzenlenir aktivasyonu aracılı kemokin ligand 5 veya CCL5) olarak ve TNFα (tümör nekrozis faktör alfa)-ADM NF-κB (nükleer faktör-κB)8aktivasyonu ile indüklenen. ADM ek bir arabulucu artırır artan ifade EGFR (epidermal büyüme faktörü reseptörü) ADM sürecinde ve ligandlar, EGF (oksidatif stres bir artış neden oncogenic KRas9,10, bu Epidermal büyüme faktörü) ve TGF-α11.
Pankreas kanseri hücre hatları kullanımı için tüp bebek çalışmalar ortak olmakla birlikte, birincil hücre kültürleri birçok avantaj sunar. Örneğin, birincil acinar sigara transgenik fareler veya KrasG12Dgibi Başlatan mutasyonlar yataklık fareler hücreleri kaç ve kontrollü mutasyonlar, çünkü ADM erken olay eğitim için en uygun modeli hücrelerdir hangi erken pankreas kanseri gelişiminde mevcut olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak birden çok mutasyonlar var birçok pankreas kanseri hücre satırlar için bu ve çeşitli geçiş sayı12tarihinde temel ifade. Ayrıca, bu tür yöntemlerle tespit sinyal yolları hayvan çalışmaları tarafından doğrulanmıştır. Birincil acinar hücreleri kullanarak bir uyarı tipik kanser hücre hatları gibi onlar transfected değil mi.
Burada yöntemi acinar hücre izolasyon, ADM uyarıcılar ekleyerek veya protein ifade yolu ile adenoviral ya da lentiviral hastalık, hem hem daha fazla analizleri için uç noktada hücrelerinin yeniden yalıtım oransal taklit eden 3D kültür teknikleri ayrıntıları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan iş Mayo Kliniği IACUC tarafından kabul edildi.
1. hazırlık malzemeleri, çözümleri ve 3 boyutlu matris bazlar
- 500 µm ve 105 µm Polipropilen kafesler içine 76 mm tarafından 76 mm kareler kesin. Her kareye iki kez katlanmış bir daha küçük kare oluşturmak için ikiye katlayın. Yer bir 500 µm ve bir 105 µm kare bir autoclavable kese kafes.
- Otoklav polipropilen mesh kareler yanı sıra iki çift makas ve forseps.
-
10 Waymouth'ın çözüm x 100 mL olun. Waymouth'ın tozu 1 flakon (14 g) 50 mL deiyonize (DI) su karıştırın ve çözünmüş zaman 30 mL % 7,5 (75 g/L) sodyum bikarbonat ekleyin. Son hacim DI kullanarak 100 mL su getirin ve filtre sterilize.
- Mağaza 10 x Waymouth'ın medya 4 ° C ve kollajen jelleri hazırlamak için kullanın ve 1 x Waymouth'ın medya. Ne zaman precipitates formu, atmak.
- 50 mL 1 x Waymouth'ın tam medya pankreas başı 40 mg/mL soya tripsin inhibitörü 125 µL, 4 mg/mL deksametazon 12.5 µL ve fetal Sığır serum (FBS) 500 µL ekleyerek olun. Filtrasyon tarafından sterilize ve 48 saat içinde kullanın.
-
Kollajen veya membran matrisi kullanarak 3 boyutlu matris üsleri hazırlamak (malzemeler tablo ürün bilgi için bakın). Ne zaman Bankası pipetting, plaka buza koyun, kabarcıklar önlemek ve hemen her kuyu birim tam kapsama sağlamak için pipetting sonra plaka döndürmek.
- Buz bir doku kültürü başlıklı aşağıdaki bileşenler karıştırılarak kollajen üsleri oluşturun: Ben fare türü 5.5 mL kuyruk kollajen, 10 Waymouth'ın medya x 550 µL ve 366.6 µL 0,34 M NaOH (filtre).
Not: Kollajen üsleri bir 24-şey, 12-şey veya 6-şey plaka için yapmak için yeterli bir çözüm bu. Bir tabak bir pankreas acinar izolasyonu için yeterlidir. - Kollajen Bankası plaka için aşağıdaki birimler kullanın: 80 µL (8-şey cam slayt), 200 µL (24-şey plaka), 400 µL (12-şey plaka) veya 800 µL (6-şey plaka).
- Membran için matris üsleri, damlalıklı matris diğer ek bileşenleri olmadan. Her şey için aşağıdaki birimler kullanın: 50 µL (8-şey cam slayt), 120 µL (24-şey plaka), 240 µL (12-şey plaka) veya 600 µL (6-şey plaka).
- Üstünde tepe-in bu üslerin (adım 4) katıştırılmış hücrelerle matris ikinci tabakası oluşturmadan önce en az 30 dakika bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) için kuvvetlendirmek üsleri izin.
- Buz bir doku kültürü başlıklı aşağıdaki bileşenler karıştırılarak kollajen üsleri oluşturun: Ben fare türü 5.5 mL kuyruk kollajen, 10 Waymouth'ın medya x 550 µL ve 366.6 µL 0,34 M NaOH (filtre).
- Acinar yalıtım için hazırlık bir 600 mL kabı, üç 50 mL tüpler, makas, pens autoclaved bir çifti ve nedense odamızda buz kovası üç tartmak tekne ile örtünün altına autoclaved bir çifti tutun. Sonra HBSS 30 mL 100 x penisilin-streptomisin 10 mL her iki tartmak tekne içine koyarak ve son 10 mL (kullanılmak üzere adım 1.8.2 ve 2.1.4) 50 mL tüp içinde tutmak, 300 µL ile yapın.
- HBSS + 5 40 mL olun % FBS, HBSS 20 mL + %30 FBS ve 5 mL 2 mg/mL collagenase HBSS içinde de. Collagenase filtrasyon (0,22 µm gözenek) tarafından sterilize ve oda sıcaklığında tutmak. Her HBSS çözüm buz üzerinde tutun.
-
Bir laboratuvar tezgah üzerinde yapılabilir pankreas diseksiyon için bir çalışma alanı oluşturun.
- Yer bir emici Ped masada, polistren bir kapak ile birlikte folyo kaplı. Sonra bir kağıt havlu ile 4 PIN folyo üzerine yerleştirin.
- Aşağıdaki öğeler diseksiyon çalışma alanı ulaşmak içinde tutmak: bir ölü yakma çanta, bir dizi autoclaved makas ve forseps, bir sprey şişesinde % 70 etanol ile ve nedense odamızda buz kovası (ile penisilin-streptomisin adım 1.6 içeren HBSS 50 mL tüp).
- Bir santrifüj 4 ° C ve bir shaker ile 37 ° c olarak ayarlayın
2. acinar hücre izolasyon
-
Fareyi CO2 indüksiyon yoluyla kurban ve servikal çıkığı gerçekleştirin. Hemen pankreas incelemek. Pankreas, ilk PIN incelemek için belgili tanımlık paws polistren kapağı, fare kuyruğu araştırmacı karşı karşıya olduğu gibi fare gelecek şekilde yönlendirin ve karın % 70 etanol ile sprey.
Not: C57BL/6 arka plan olan 12 - hafta eski bir transgenik olmayan dişi temsilcisi sonuçlarında kullanılan fare oldu. Fare seçimi daha fazla tartışma bölümünde açıklanır.- Birtakım autoclaved makas ve forseps kullanarak, orta hat, forseps ile kürk/cilt kaldırın ve makas kürk ve diyafram/göğüs kafesi alanına üretral açılış deri yoluyla bir kesi yapmak için kullanın.
- Öyle ki kürk/deriyi kesme ek insizyon sol ve sağ olun uzak karın boşluğu açık bir görünümünü oluşturmak için. O zaman, periton astar (orta aşağı ve sağa ve sola) kesilmiş ve kürk/deri ile olduğu gibi uzak organlara, çekin.
- Bağırsak forseps ile Asansör ve pankreas görmek için alan oluşturma fare sol tarafına koymak, hangi ışık rengi pembe ve koyu kırmızı oval dalak için bağlı. Pankreas dokusu onun yumuşak, süngerimsi doku tarafından ayırt edilir. Hangi koşmak mide ve bağırsak ile iç içe pankreas kesip.
- Dalak, pankreas ayırın. O zaman, pankreas HBSS 10 mL 1 x penisilin-streptomisin ile içeren bir 50 mL tüp koymak ve bu laminar akış hood için getirdin.
Not: Protokol kalan adımları kullanarak steril tekniği laminar akış başlıklı yapılmalıdır.
- Pankreas dökün ve boş bir içine (ile penisilin-streptomisin) HBSS tekne tartmak ve forseps, kullanarak pankreas dönen tarafından yıkayın. Sonra bir saniye için forseps ile pankreas tartmak HBSS (penisilin-streptomisin) içeren tekne hareket. Yine, pankreas dönen tarafından yıkayın.
-
Üçüncü HBSS (ile penisilin-streptomisin) pankreas taşımak-tartmak içeren tekne ve 5 mm veya daha az küçük parçalara pankreas kesme başlar. Ardından, pankreas parçalar ve HBSS bir boş 50 mL tüp içine dökün.
- Bunu yapmak için forseps tartmak tekne uçlu olarak pankreas adet sıvı içine taşımak için kullanın. Tüm parçaları artık tartmak tekneye iliştirildikten sonra dökün. Forseps ile herhangi bir kalan parçaları toplamak ve HBSS pankreasta penisilin-streptomisin ile içeren 50 mL tüp forseps yıkayın.
- Vasıl 931 x g 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi ve o kapalı 5 mL pipet ile pipetting tarafından HBSS (ve kayıp gidiyor gözlerimden herhangi bir yağ) kaldırın.
- Collagenase (HBSS içinde adım 1.7 seyreltilmiş) 5 mL pankreas için ekleyin. 50 mL tüp Plastik parafin filmde sarma tarafından mühürlü kapak emin olun ve sonra 37 ° C'de 20 dk için 220 rpm'de sallayarak bir kuluçka yerleştirin
Not: Tartışmada belirtildiği gibi collagenase sindirim zaman değişebilir. İnkübasyon sonunda, doku yok büyük parça kalması gerekir. - Ayrılma durdurmak için pankreas içeren tüp buza koyun ve soğuk HBSS + %5 5 mL ekleyin FBS. Vasıl 931 x g 4 ° C, sonra damlalıklı 5 mL damlalıklı kullanarak süpernatant kapalı 2 dk santrifüj kapasitesi.
- HBSS + %5 FBS ve vasıl 931 x g santrifüj 4 ° C'de 2 min için 10 ml resuspend Damlalıklı 5 mL damlalıklı kullanarak süpernatant kapalı ve başka bir 10 mL HBSS + % 5 ile bu işlemi tekrarlayın FBS.
- 5 mL HBSS + % 5 resuspend FBS, bir P1000 kullanarak transfer ve 1 mL 500 µm mesh ile bir seferde 50 mL tüp içine. HBSS + % 5 ek bir 5 mL ekleyin FBS üzerinden mesh mesh ile kalan herhangi bir pankreas hücreleri yıkamayı P1000 ile.
- Hücre süspansiyon 500 µm kafes 105 µm kafes bir P1000 kullanarak bir zamanda tarafından pipetting 1 mL koymak. İleri, yavaşça damlalıklı hücre süspansiyon içeren HBSS + % 30 bir tüp içine FBS. Hücre süspansiyon tabakası üstünde oluşturacak; Santrifüjü acinar hücreleri bir Pelet oluşturmak için lavabo olacaktır.
-
4 ° C'de 2 min için 233 x g , santrifüj Süpernatant çıkarın ve 1 x Waymouth'ın tam medya Pelet resuspend.
- Eğer doğrudan sıkıştırılma kollajen veya membran matris hücre için devam, pankreas başı 7 mL hacminde resuspend. Adenoviral ya da lentiviral hastalık devam Eğer pankreas başı 4 ml resuspend.
3. viral enfeksiyon
-
Bir pankreas iki viral enfeksiyonlar için yeterli olduğu gibi (denetim ve deneysel, örneğin, null ve cre), hücre süspansiyon iki 35 mm tabak kapakları arasında bölünmüş. Plakaların kapak kullanarak enfeksiyon süspansiyon ve daha sonra final substrat üzerine bu nedenle kolay hareket sağlar.
- Virüs ile çalışırken, tüm kullanılan pipet ipuçları % 10 çamaşır suyu içinde en az 15 dakika boyunca bekletin.
Not: 35 mm plakalar ve 4 mL cilt hücrelerinden 8 ve 16 haftalık arasında sigara transgenik fareler için iyi çalışıyor. Plaka boyutu ve birim daha küçük veya daha büyük pancreata ile hayvanlar için ayarlanması gerekebilir.
- Virüs ile çalışırken, tüm kullanılan pipet ipuçları % 10 çamaşır suyu içinde en az 15 dakika boyunca bekletin.
- Adenoviral enfeksiyon için virüs ekleyin (en az 10 titresi ile7 TU/mL) her kapak için bir 1:1,000 seyreltme, plaka ve (Şekil 2, GFP adenovirus) girdap. Tabakları (37 ° C, % 5 CO2) bir hücre kültür kuluçka makinesine koyun ve 1 h. devam kuluçka için her 15 dakikada bir ek 2 h için girdap ve sıkıştırılma kollajen veya membran matris hücre için devam edin.
- Kapüşonlu viral çalışma işlemini tamamladıktan sonra tüm bileşenleri başlıklı % 10 çamaşır suyu ile en az 15 dakika boyunca ıslatın ve % 70 etanol kullanarak kapalı çamaşır suyu iyice temizleyin.
4. sıkıştırılma kollajen veya membran matris hücre
- 7 mL birleştirerek buz üzerinde olun kollajen jel tip ı sıçan kuyruk kollajen (3.3 mg/mL), 10 Waymouth'ın medya x 700 µL ve 466.6 µL 0,34 M NaOH.
-
Karışımı eşit miktarda kolajen jel ve hücre süspansiyon alarak, yavaşça. Eğer bir uyarıcı veya inhibitörü ekleyerek, bu kollajen-hücre süspansiyon ile birleştirin. Bir şey bir anda adım 1.5.3 (tabak); plaka plaka buz üzerinde tutarak, kollajen-hücre katmanı olarak dağıtabilmenizi girdap.
- Her iyi, damlalıklı aşağıdaki miktarda kolajen-hücre süspansiyon: 200 µL (8-şey cam slayt), 500 µL (24-şey plaka), 1000 µL (12-şey plaka) veya 2000 µL (6-şey plaka). ADM stimülasyon ile TGF-α ile indüklenen Not (50 ng/mL) Şekil2.
- İçin sıkıştırılma hücre membran matris tek parça membran matris hücre süspansiyon iki-parçalar ile karıştırın. Kollajen gibi matris hücre süspansiyon yanı sıra plaka buz üzerinde tutun. Damlalıklı biri de bir anda 4.2.1 ve hatta dağıtım için girdap kaydetti aynı birimleri kullanma.
- Bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) plaka kuvvetlendirmek ve 1 x herhangi bir uyarıcı veya inhibitörü (Şekil 2 kullanır TGF-α, 50 ng/mL) ile Waymouth'ın tam ortam eklemek için 30 dk yerleştirin. Medya (uyarıcı veya engelleyici ile) ertesi gün ve daha sonra her gün değiştirin. Uyarıcı bağlı olarak ADM gün 3 ile 5 gün arasında görülebilir.
5. hasat hücreleri kollajen veya membran matris
- Kollajen hücrelerden hasat için gerekli aşağıdaki malzeme toplamak: 1 mg/mL collagenase 30 mL soğuk PBS, iki spatula, iki 50 mL tüpler ve buz 31 mL soğuk HBSS, 40 mL HBSS içinde seyreltilmiş. Eğer ikiden fazla kültür koşulları (burada her koşul ½ plaka adıdır) karşılaştırma spatula, tüpler ve çözümleri miktarı sayısını ayarlayın. 4 ° C-santrifüj ayarlayabilirsiniz ve sallayarak kuluçka 37 ° C'ye
- Medyayı çıkarın ve katıştırılmış hücreleri kollajen disklerle kaldırmak için spatula kullanın. Diskler ayrı bir koymak her koşul için 50 mL tüp boş.
- 1 mg/mL collagenase 10 mL HBSS içinde her 50 mL tüp ekleyin. Tüpler plastik parafin film ile sarın ve 37 ° C kuluçka 225 devir / dakikada 45 dakika kadar sallayarak koymak. Sindirim izlemek ve daha fazla görünür kollajen tüpler kaldırın.
- Vasıl 233 x g 4 ° c en az yavaşlama ile 2 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant almak ve 5 mL collagenase çözüm tüp başına resuspend. Kuluçka makinesi 10 dk ya kadar hiçbir görünür kollajen 225 devir / dakikada sallayarak 37 ° C olarak sindirmek.
-
5 mL soğuk HBSS de ekleyerek ve sonradan vasıl 233 x g için en az yavaşlama ile 4 ° C'de 2 dk centrifuging sindirimi durdurmak.
- 15 mL soğuk HBSS resuspend ve daha vasıl 233 x g için en az yavaşlama ile 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi. Tekrar ediyorum.
- Pelet 1 mL PBS resuspend ve 1,5 mL tüp taşıyın. Bir salıncak kova vasıl 233 x g için en az yavaşlama ile 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant ve ek-freeze sıvı azot veya kuru buzda kaldırın.
Not: Hücre Pelet-70 ° C'de depolanan veya hemen aşağı akışı uygulamalarında kullanılan. - Membran matris gömülü hücreleri, buz üzerinde 50 mL tüp her kuyuya medyadan damlalıklı hasat için. Daha sonra her şey için membran matris kurtarma çözümü ekleyin ve hücre-jel karışımı 50 mL tüp kazımak.
Not: Membran matris kurtarma çözümü için her şey aşağıdaki gibi eklemek hacmi: 150 µL (8-şey cam slayt), 420 µL (24-şey plaka), 845 µL (12-şey plaka) ve 2.000 µL (6-şey plaka). - Her biri 50 mL tüp durular ekleyerek de iki kez membran matris kurtarma çözümü, durulayın.
Not: Birimin her durulama için membran matris kurtarma çözümü aşağıdaki gibidir: 150 µL (8-şey cam slayt), 420 µL (24-şey plaka), 845 µL (12-şey plaka) ve 2.000 µL (6-şey plaka). - Membran matris çözülür ve 300 x g 4 ° C'de 5 min için de aralıklarla takip kadar tüp veya 1 h için buza terk Süpernatant kaldırmak ve pelet 1 mL soğuk PBS (hücre Pelet isterseniz 1.5 mL tüp transferi) resuspend.
- 4 ° C'de 3 min için 3.500 x g , santrifüj Süpernatant kaldırmak ve her iki ek hücre Pelet dondurmak veya lizis arabellek ekleyin ve doğrudan aşağı akım uygulamaya devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İletişim kuralı burada tamamlanması 1 gün içinde oluşur ve stimülasyon, ADM 3-5 gün içinde görülür. Şekil 1 sayede 1-4 arası adımları ilk gün tamamlandı yöntemi, dizi gösteriyor. Bu hazırlık, acinar yalıtım, viral enfeksiyon ve sıkıştırılma kollajen veya membran matris içerir. Kollajen acinar hücrelerde membran matris ADM neden olmaktadır, ben geçmesi bir uyarıcı, TGF-α gibi gerektirir duktal hücrelere farklılaşma. Günde 1, kollajen veya membran Matris hücrelerinde bir üzüm gibi yuvarlak görünümü vardır ve viral enfeksiyon ile bir vektör floresan bir protein ifade kullanan varsa, enfeksiyon verimlilik kontrol edilebilir. Gün 5, kollajen hücrelerde bir uyarıcı bir özel sayı: 1, 3 ve 5 gün değişti medya olarak sıkıştırılma ve zaman verilirse kanalları oluşturacak. Hücre membran matris içinde gömülü bir uyarıcı yokluğunda kanalları oluşturacak ama stimülasyon büyük kanalları, Şekil 2' de görüldüğü gibi oluşturacak.
Resim 1 : Fare birincil acinar hücreleri ayırma, protein ifade modüle ve/veya acinar-için-duktal metaplazi teşvik ve hücreleri kollajen veya membran matrisinde katıştırmak için yordam şematik. İş akışı pankreas, sindirim ve filtrasyon hücrelerin diseksiyon içeren yalıtım acinar hücrelerinin içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Kollajen veya membran matris içinde adenoviral enfeksiyon ve TGF-α ile stimülasyon sonra kaplama birincil acinar hücrelerinin temsilcisi sonuçları. Transgenik olmayan bir fare birincil acinar hücrelerden GFP-adenovirus ile enfekte, gömülü kolajen ben veya membran matris ve ile ya da ezelî TGF-α uyarılmış (50 ng/mL). 24 saat sonrası enfeksiyon ile GFP adenovirus enfeksiyonu verimliliği göstermek için görüntüleri ele geçirildi. Beş gün sonrası enfeksiyon, görüntüleri hücreleri ile ya da ezelî TGF-α kollajen veya membran matris uyarılmış farklılıkları gösterir. Kanal benzeri yapılar tarafından beyaz ok uçları gösterilir ve 50 µm. resimler EC planı-Neofluar 10 x / 0.3 M27 amacı ile confocal bir mikroskop kullanarak elde edildi barlar temsil ölçek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yalıtım, enfeksiyon ve birincil acinar hücreleri kaplama için nispeten kısa süreyi bu yöntemin bir avantajı var. Buna ek olarak, bir explant sonucu acinar hücrelerden kültür küçük eller zaman gerektirir, ama acinar hücreleri13akıbet için yedi gün alır. Acinar yalıtım14 için alternatif bir protokol acinar hücreleri elde etmek için çok kısa bir yöntem notları; Ancak, EGF acinar hücreleri hayatta ne zaman o protokolü kullanılarak izole tutmak önemli bir bileşenidir. EGF duktal hücreler acinar hücrelere farklılaşma uyarır beri ADM uyarıcı bileşenleri için kültür gerektirmeyen, burada, mekanizmaları indüksiyon ya da İdari Yönetmeliği eğitim için daha iyi bir yöntemdir Bu yöntemde, acinar hücre kimliğini duktal hücre içine ayırt etmek için uyarılmış sürece kolajen kültür sırasında korunur. Ayrıca, transfecting primer hücre zorluklar protein ifade manipüle üzerinden viral enfeksiyon tarafından üstesinden vardır.
Bu yordamı ADM, duktal yapısı hangi görselleştirme tarafından aydınlık alan ve/veya ayirt mikroskobu indüksiyon oluşabilir doğrudan çalışma sunar. İçin görüntüleme uygulamalarında, odası slaytlar ( Tablo reçetesikaydetti) en iyisidir. Fiksasyon ile %4 paraformaldehyde 37 ° C'de 15 dakika hücre membran matris rahatsız edici duktal yapıları olmadan katıştırılmış çözecektir. Bu kuluçka sırasında membran matris Sıvılaştır ve yavaşça kapalı paraformaldehyde ile pipetted. Ayirt gömülü kollajen hücreleri üzerinde ek protokolleri15,16içinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Daha fazla analizleri için deneme uç noktada dahil sinyal mekanizmaları Western blot, qPCR ve floresan aktif hücre (FACS) sıralama uygulamaları. Bir altıncı bir pankreas, Western blot veya qPCR üzerinden bir örnek analiz için yeterli malzemedir.
Bu iletişim kuralı sınırlamaları nerede her avantaj ve dezavantajları vardır, kollajen veya membran matris kullanımından ortaya çıkmaktadır. Uyaranlara verilirse sıkıştırılma kolajen hücrelerinin sadece kanalları üretecek iken, membran matris sıkıştırılma kanalları ek bir çekim gücü olmadan üretecek. Ancak, duktal membran matris ölçülebilir bir çıkış boyutudur. Zaman içinde gen ekspresyonu etkileyebilecek adım 5, hasat yordamlarda yer ek bir kısıtlamadır. Bu sınırlama ile ayirt fiksasyon saat önemli ölçüde daha az qPCR veya Western blot analizi için hasat zaman olduğu, Batı kurutma üzerinden elde edilen sonuçları teyit ederek azaltılabilir.
Adenoviral enfeksiyon yanı sıra lentiviral enfeksiyon primer hücre içinde kullanılabilir. Lentiviral enfeksiyon için 6 µg/mL viral enfeksiyon artırıcı reaktif ekleyin (malzemelerin tabloya bakın) hücreleri ve yavaşça plakaları girdap. Daha sonra lentivirus ekler (en az 10 titresi ile7 TU/mL) adlı bir 1:1,000 seyreltme ve yavaşça tekrar, girdap. 3-5 h (37 ° C, % 5 CO2) için kuluçkaya ve sıkıştırılma kollajen veya membran matris hücre için devam edin. Lentivirus ile bir plazmid ilgi oluşturmak için malzemeleri tablosunda listelenen lentiviral ambalaj karışımı kullanın.
Daha fazla değişiklik yalıtım KrasG12Difade fareler hücre içerebilir. ADM ve PanIN lezyonlar ile fibrotik alanları zaten, bu farelerde collagenase sindirimi uzun sürer. Dikkatli kritik adımlarda açıklandığı gibi collagenase hazım, izleme ve sorun giderme, gereklidir. Farenin daha anormal doku vardır, uzun sindirim (yaklaşık bir on iki-hafta-yaşlı p48Cre; bir saat sürer LSL-KrasG12D fare). Fareler aynı yaş arasında büyük değişim olabilir beri bir LSI -KrasG12D fare acinar hücrelerden yalıtmak ve adenoviral ya da lentiviral hastalık cre oncogenic KRas ifade elde etmek için kullanarak gerçekleştirmek için tavsiye ediyoruz. Ayrıca bizim protokol ADM sürecini araştırmak için acinar hücre izolasyon için optimize edilmiş olduğu unutulmamalıdır. KrasG12DADM ve PanIN hücrelerden yalıtım-organoid kültür gerektirir için fareler ifade iletişim kuralları değişmiş.
Bir kritik adım kıyılmış pankreas collagenase içinde geçirdiği süre miktarıdır. İdeal collagenase sindirim zaman fare fare ve collagenase aynı şirkete ait bir sürü arasında değişebilir. İletişim kuralında belirtildiği zaman 0,250 hakkında tartım pancreata için uygun olan g. çok fazla zaman zarar verebilir ve öldürmek hücreler, çok az zaman eksik sindirim neden olur ve bu nedenle daha az bu hücreleri ise bu filtre uygulama işlemi aracılığıyla yapacak Son plaka. Ayrılma görsel olarak doğranmış pankreas parçalar dökümü için bakarak kontrol edin; çözüm bulutlu açmalısınız. Ayrıca, soğuk HBSS ile collagenase reaksiyonu durdurmadan önce çözüm ile 5 mL damlalıklı, nereye belgili tanımlık eriyik hangi ile alınabilir kadar kolay reaksiyonu durdurmak uygun olup olmadığını gösterecektir alınabilir. Bir ek dikkate hasat pancreata sayısıdır. Birden fazla bir pankreas ne zaman pancreata ayrı tutulur aynı anda, en iyi yordamı çalışır izole edilmiştir.
Birincil acinar hücrelerinin sağlıklı kültür emin olmak için başka bir önemli nokta acinar hücre çözümü pipetting zaman bakım alınmalıdır olduğunu. Dinç pipetting hücre hasarı neden olabilir ve koli oluşumu, bir eksikliği bile TGF-α gibi bilinen ADM indükleyicileri ilavesi ile sonuçlanır. Canlılığı sorunlar varsa, Ayrıca, adım 2.4, 2.6 ve 2.7 Santrifüjü 300 x g aşağı yumuşak Pelet üretmek için alınabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser PS NIH R01 grant (CA200572) tarafından desteklenen İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmez veya tasarım, veri toplama ve analizi, karar için fon herhangi bir rolü yoktu Health.The ulusal kurumları çalışma yayımlamak, veya hazırlık şekilde alt alta yazılmalıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
