Summary
השיטה המוצגת יוצרת הרביוור טבעי הנזק רקמת הצמח באמצעות היישום של מנדוקה הזחלים סקסטה להתנתק עלים של תפוחי אדמה. רקמת הצמח הוא הבעה ביטוי של שישה שעתוק גורם הומויומני מעורב בתגובות מוקדמות לחרקים העשב.
Abstract
הטבע הmultitrophic של לימודי גנים של העשב המאלף חרקים דורש מספר רב של משכפל ביולוגי, היוצר את הצורך לפרוטוקולים פשוטים ויעילים יותר של העשב. רטבאליות של חרקים לעיסה לומדים בדרך כלל במערכות צמחים שלמות. בעוד שאסטרטגיית האורגניזם הזאת פופולרית, אין בכך צורך אם ניתן לשכפל תצפיות דומות בעלה מנותק אחד. ההנחה היא שאלמנטים בסיסיים הנדרשים להתמרה של אותות נמצאים בתוך העלה עצמו. במקרה של אירועים מוקדמים של התמרה אותות, התאים צריכים רק כדי לקבל את האות מתוך הפרטורציה ולשדר את האות לתאים השכנים אשר מחכים לביטוי גנים.
השיטה המוצעת פשוט משנה את התזמון של הניתוק. בניסויים צמחיים שלמים, הזחלים מוגבלים לעלה בודד אשר מנותקת בסופו של דבר מן הצמח ומרותק לביטוי גנים. אם הסדר של כריתה מתהפך, מאחרון בלימודי המפעל כולו, לראשונה במחקר הפרטי, ניסוי ההזנה הוא פשוט.
. סולנום טובראוסום באר קנאו מופץ על ידי העברה קטרי במדיום תרבות פשוטה בינונית והועברה קרקע לצמיחה נוספת אם תרצה. העלים מוגשים ממפעל ההורים והועברו למנות פטרי שבהן מתנהל שיטת ההזנה עם שלבי הזחל של מדיום. רקמת עלה פגומה הינה לביטוי של אירועים מוקדמים יחסית של התמרה אותות. ניתוח ביטויים גנטיים זיהה התפשטות Cys2-His2 (C2H2) גורמים שעתוק, המאשרת את ההצלחה של שימוש בעלים מנותקים במחקרים מוקדמים של התגובה. השיטה היא קלה יותר לבצע מאשר הצמח שלמות התחנות והוא משתמש פחות שטח.
Introduction
הרבורי מגדיר בתנועה סדרה של אירועים מולקולריים שבהם צמח יכול לזהות את המתקפה ולטעון תגובה מתאימה להישרדותה. צמח מקבל שני רמזים בסיסיים מלעיסת חרקים; אחד מהנזק הפיזי לרקמה ולשני מחומרים ספציפיים לחרקים. תבניות מולקולריות משויכות לנזקים (DAMPs) שוחררו בתגובה לנזק שנוצר על-ידי חלקי הזחל ומפעיל תגובת פציעה מוגדרת היטב הנובעת מגידול בחומצה ההורמון לימונית ותמלול גנים הביטחון1. אחד מהדואמפר הידועים ביותר הוא מערכת, פוליפפטיד הנוצרת על ידי המחשוף של החלבון prosystemin גדול יותר לאחר עלה נפצע2,3. התגובה הפצע החומצה הממונית הוא עוד מאופנן על ידי דפוסי מולקולרי הרביוור-הקשורים (HAMPs), אשר יכול להיות נגזר רוק זחל, תוכן המעיים (regurgitant) וצואה (frass)4. חרקים להשתמש בחומרים אלה כדי להגביר או להתחמק תגובת ההגנה5. גורמים שעתוק ולאחר מכן ממסר את ההודעה מפני אותות הורמונים בתגובה הביטחון באמצעות רגולציה של גנים הביטחון במורד הזרם6,7,8.
חלק ממחקרי האינטראקציה עם חרקים מהמפעל המשמשים במסגרות מעבדה הם מסוג הסימולציה, עם מטרה לקירוב השיטה הטבעית של האכלה על ידי החרק. העשב מדומה מושגת בדרך כלל על ידי יצירת נזק מלאכותי לרקמות הצמח עם כלים שונים המחקים את המנגנון הספציפי של חלקי החרקים מספיק כדי לגרום לשחרור של DAMPs ולהפעיל את הייצור של גנים הביטחון. רכיבים אחרים ספציפיים לחרקים כגון הפרשות אוראלי או regurgitant מתווספים לעתים קרובות כדי לשכפל את התרומה של hamps9,10,11. הקמתה של גודל מסוים וסוג של פצע ואת היישום של כמויות מדויקות של HAMPs הוא אחד היתרונות לסוגים אלה של מחקרים והוא יכול להציע תוצאות שניתן להפיק יותר. טבעי לימודי העשב, היכן נזק לרקמת הצמח מושגת על ידי יישום של חרקים נרכש או מעבדה-הגדלים המעבדה, הם לעתים קרובות יותר מאתגרת בגלל הפצע בגודל וכמויות hamp נשלטים על ידי התנהגות החרק ולהוסיף שינויים ב נתונים. השיטות הטבעיות לעומת מדומה והיתרונות והחסרונות שלהם הינם לדיון היטב בספרות12,13,14.
כדי ללמוד אירועים איתות מוקדם כגון גורמי שעתוק, אחוז מסוים של העלה חייב להיות נצרך בפרק זמן קצר יחסית, כך הזחלים חייבים להתחיל ללעוס מיד לשמור על צריכת עד העלה קפוא לניתוח. M. סקסטה הוא ממזין משוכן על מספר צמחים solanאכאאוס במהלך רבים של שלבי הזחל שלה, מה שהופך אותו אידיאלי לקבלת נזק מקסימלי בפרק זמן קצר יחסית של15. זה נוח כאשר לומדים האירועים איתות מוקדם, כמו תגובת הצמח מתרחשת כמעט מיד לאחר שחרק מקשר את פני העלה16,17. שיטת הבלימה הנפוצה ביותר בשימוש בכלוב מוכיחה מגושמת, משום שכלובים מרובים ידרשו התאמות מתמיד במהלך הניסוי כדי לאפשר הסרה או הוספה של הזחלים. העלים חייבים גם להיות גדולים מספיק וחזקים מספיק כדי לתמוך בחרקים מרובים האכלה באותו זמן. סוגים אלה של צמחי תפוחי אדמה דורשים כמות גדולה של שטח להתבונן האכלה. הזחלים מפרידים לעתים קרובות אל החלק התחתון של משטח העלה אשר גם עושה תצפיות האכלה די קשה. באמצעות צמחים שלמים לבצע ניסויים אלה הוא מסורבל בבירור.
המחקר הנוכחי משתמש בעלים מבודדים בצלחות פטרי במקום צמחים שלמים כדי לייעל ולפשט את הגישה המפעל כולו כדי ללמוד העשב vory. היישום של הפרוטוקול במחקר זה מוגבל להתבוננות של קבוצה של הגורמים C2H2 המושרה מוקדם בעלי תפוחי אדמה לאחר נזק העשב על ידי הזחלים מ. סקסטה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול הבא מיועד להגדרה של אדם אחד, לבצע תצפיות ולאסוף דגימות. ניתן לשלב רצפים מרובים של אותה התקנה כדי להגביר את השכפול הביולוגי. כל חזרות נוספות של הניסוי יש להגדיר באותו זמן ביום כדי למנוע השפעות יומי אפשרי על הביטוי גנים. הפרוטוקול נועד ליצור 3 "שורץ" עלים עבור 5 נקודות זמן הקציר נפרד. שליטה בהתאמה עוזב עבור כל נקודת זמן ליצור סך של 30 דגימות. ניתן לבצע את הניסוי במגוון גדלים של עלים ושלבי זחל, אך מומלץ כי גודל העלה, הזחל וזמן התפשטות יהיו עקביים במהלך התהליך.
1. הכנת צמחי תפוחי אדמה
הערה: יש לבצע את כל השלבים המחייבים טכניקה סטרילית במכסה של תרבות הרקמה18,19.
- בסדר.
- הכן אמצעי הפצה.
- הוסף 4.43 g של מורראשיג ו Skoog (MS) עם אבקת ויטמינים, 20 גרם של סוכרוז ו 2 גרם של אגר תחליף 1 L של אוסמוזה הפוכה (RO)-מים מטוהרים ב 2 L בקבוקון עם פס ספין. העבר בקבוקון לצלחת מהומה לערבב. להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות NaOH תוך המשך לערבב.
הערה: אגר לא יימס עד לתיקון האוטוקלפה. - הוסף 1 מ ל של חומר משמר/ביוסייד ואוטוקלב על מחזור נוזלי עבור 20 דקות (121 ° c, 101.3 kPa). להסיר בינוני מ אוטוקלב מיד לאחר המחזור הוא סיים ולצנן אותו 50 ° c. העברת 100 mL של בינונית הפצה סטרילית ומקורר לכלי תרבות סטרילית (למשל, מגנטה או פלנטקון) באמצעות טכניקה סטרילית במכסה של תרבות רקמה.
- הוסף 4.43 g של מורראשיג ו Skoog (MS) עם אבקת ויטמינים, 20 גרם של סוכרוז ו 2 גרם של אגר תחליף 1 L של אוסמוזה הפוכה (RO)-מים מטוהרים ב 2 L בקבוקון עם פס ספין. העבר בקבוקון לצלחת מהומה לערבב. להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות NaOH תוך המשך לערבב.
- . הכן את חומר ההסבר
- להשיג את מקור ההסבר כמו תפוחי אדמה הזרע קנאני ולהסיר את כל העקבות של הקרקע על ידי כביסה עם ברז H2O. להסיר נבטי לחתוך לתוך 2 ס מ חתיכות עם אזמל סטרילי.
- לחטא את חתיכות נבט על ידי הטבילה עבור 15 s ב 70% אתנול, ואחריו 13 דקות ב 1:1 אקונומיקה (1 חלק RO-מים: 1 חלק מרוכז מרוכזת germרידקים/מסחרי כיתה אקונומיקה). לשטוף 5 פעמים ב-H סטרילי2O.
- העברת חומר לחקור את כלי התרבות רקמה סטרילית עם בינוני התפשטות במכסה התרבות רקמה באמצעות טכניקה סטרילית. העברת ספינות לחדר התרבות רקמת הצמח ולגדול עבור 2 \ u20123 שבועות או עד הטופס שתילי ב 24 ° c, 16 h אור (140 μ:00 m-2· s-1)/8 h photoperiod כהה.
- הכן אמצעי הפצה.
- הכינו מפעלי תפוחי אדמה מעור.
- הכן מדיום העברה קטרי.
הערה: זה יהיה 10 כלי התרבות רקמה אשר עשוי לשמש באותו יום או עשוי להיות מראש הזמן ומאוחסן ב 4 ° c עד העברה קטרי.- הוסף 36.43 g של תערובת מזינים אגר ל 1 L של המים RO-מטוהרים ב 2 L בקבוקון עם פס ספין. העבר בקבוקון לצלחת מהומה לערבב. להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות KOH תוך המשך לערבב.
הערה: אגר לא יימס עד לתיקון האוטוקלפה. - אוטוקלב על מחזור נוזלי עבור 20 דקות (121 ° c, 101.3 kPa). להסיר בינוני מ אוטוקלב מיד לאחר המחזור הוא סיים ולצנן אותו 50 ° c. העברת 100 mL של בינוני סטרילי מקורר קטרי מדיום כלי התרבות סטרילי (לראות את הטבלה של חומרים) באמצעות טכניקה סטרילית בשכונה תרבות רקמה.
- הוסף 36.43 g של תערובת מזינים אגר ל 1 L של המים RO-מטוהרים ב 2 L בקבוקון עם פס ספין. העבר בקבוקון לצלחת מהומה לערבב. להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות KOH תוך המשך לערבב.
- להכין גזרי קטרי.
- להשיג שתילי קנאני גדל מחומר ההסבר (המיוצר בשלב 1.1.2). שתילי צריכה להיות לפחות 3 עד 4 צמתים (נקודות הסתעפות). להסיר עלים באמצעות מספריים סטרילי או אזמל. חותכים ענפים קרוב הגבעול הראשי, עוזב כ 2 מ"מ של רקמת הענף.
- הסר סעיפים קטרי מן הגבעול על ידי חיתוך כ 2 מ"מ מעל ומתחת לכל נקודת הסתעפות או צומת. לסדר גזרי קטרי בספינה סטרילית תרבות רקמה המכילה קטרי בינונית העברה (המיוצר בשלב 1.2.1.2) באותו כיוון כמו בכלי הקודם (הענף מצביע למעלה).
- העברת ספינות עם גזרי קטרי לחדר התרבות רקמת הצמח ולצמוח עבור 2 \ u20123 שבועות ב 24 ° c, 16 h אור (140 μ:00 m-2· s-1)/8 h photoperiod כהה.
הערה: כל חיתוך קטרי יגדל לתוך שתילי חדש. מספר גזרי בכל כלי קובע את גודל העלה. גזרי פחות הועברו לכל ספינה תגרום עלים גדולים. שלושה צמחים לכל כלי יהיה 15 מ"מ x 20 מ"מ עלים ב 2 \ u20123 שבועות.
- הכן מדיום העברה קטרי.
- אופציונלי הכינו את צמחי תפוחי האדמה. הגדולים בקנאלה
הערה: כדי לייצר עלים גדולים יותר, ניתן להעביר שתילי תפוחי אדמה לקרקע.- העברת שתילי תפוחי אדמה גדל בינוני העברה קטרי לקרקע על ידי משיכת בעדינות את הצמח מן המדיום עד כל רקמת השורש משתחרר אגר.
- העברה לאדמה בדיוק מעל הצומת הראשון מהשורש ובקלות לארוז את הקרקע סביב ההשתלה. המים בעדינות כדי להבטיח מגע הקרקע עם מערכת השורש.
- מקום בחדר הגידול עם האור 16 h (140 μ:00 m-2· s-1)/8 h photoperiod כהה ו 25/20 ° c יום/לילה טמפרטורות.
הערה: הצמחים מוכנים כאשר שני עלים מורחבים למעלה לגמרי הגיעו לגודל המתאים לצורך הצורך.
- אופציונלי הכינו צמחי תפוח אדמה מגודלים.
הערה: צמחי תפוחי אדמה הגדלים מפקעות הינם גדולים יותר וחזקים יותר ויכולים להיות שימושיים אם הזחלים של גידול על צמחים או אם יש צורך בהאכלת הזחל לילה.- המקום פקעת תפוח אדמה 6 עמוק בתוך 10 בסיר המכיל תערובת הקרקע בתוספת עם 10 מ"ל מרחוק דשן שחרור איטי.
- מקום בחדר הגידול עם האור 16 h (140 μ:00 m-2· s-1)/8 h photoperiod כהה ו 25/20 ° c יום/לילה טמפרטורה. הצמחים מוכנים כ 30 \ u201240 ימים מנטיעת פקעת.
הערה: אין להשתמש בצמחים שהחלו פרח.
2. הכנת חרקים להזנה
- להשיג את הזחל הרצוי השלב של M. סקסטה.
הערה: הזחלים למחקר זה הוגדלו על תזונה מלאכותית באמצעות המבנה החמישי20 ומבוים על ידי אדם מנוסה מתוך הבית הזחלים. הזחלים יכולים גם להיות מתרומם באופן חלקי או לגמרי על רקמת הצמח. הזחלים לא אוכלים מיד לפני נשירה וסביר ביותר לאכול מיד אחרי נשירה, כך ההיערכות המתאימה היא חשובה21. - העברת הזחלים לכלי בלימה מתאים (למשל, 6-, 12, 24-היטב העור הצלחת הרקמה) בהתאם לגודל זחל. צריך להיות זחל אחד לבאר בצלחת.
הערה: הזחלים יכולים להציג התנהגות טריטוריאלית או קניבאלי ללא מקור מזון ועלול להיפגע אם שוכנו יחד. - אופציונלי הזחלים מרעיבות עד 2 מעלות כמו זה עשוי לשפר את האכלה זחל.
הערה: הזחלים צריכים להיות בתוך כלי הבלימה המאוחסן בחדר הגידול במהלך הזמן הזה.
3. הגדרת רכיבים לניסוי התפשטות
הערה: עיין בתקציר הסכימטי באיור 1.
- הפוך תבניות מיקום עבור כל נקודת זמן הקציר.
הערה: מומלץ להגדיר 5 מגשים שונים עבור כל נקודת זמן הקציר. זה שומר על הדגימות מאורגן ומאפשר להעביר את הכלים ביעילות רבה יותר כמו סט מבלי לשנות את ההסדר שלהם. אם החישובים של אחוז הנזק יבוצעו, זה חיוני כמו לפני ואחרי התפשטות תמונות חייב להילכד באותו אורך מוקד.- להשיג 5 מגשים חסון מסוגל להחזיק סט של שישה מנות פטרי בגודל הראוי קו עם נייר לבן.
הערה: גודל צלחת פטרי מתבסס על גודל העלה שנבחר לצורך האכלה. העלה צריך להתאים בקלות בצלחת מבלי לגעת בצדדים. לדוגמה, צלחת 60 מ"מ x 15 מ"מ מתאים לעלים עד 50 מ"מ באורך או ברוחב. - מעקב אחר קבוצה של שישה עיגולים באמצעות צלחת פטרי בגודל הראוי על הנייר בכל מגש. סמן קבוצה אחת של ' שליטה במעגלים ' A, B ו-C והשני ' הנגועים ', B ו-C. כמו כן לתייג כל תבנית מיקום עם זמן הקציר המתאים.
- להשיג 5 מגשים חסון מסוגל להחזיק סט של שישה מנות פטרי בגודל הראוי קו עם נייר לבן.
- אופציונלי להגדיר מצלמה עבור ' לפני התפשטות ' ו ' לאחר התפשטות תמונה לכידת.
- מאבטח מצלמה על דוכן באורך המוקד המתאים ללכידת התמונה של כל מנות פטרי בתבנית המיקום.
- סמן את צינורות הזמן הקציר.
- תווית קבוצה של 30, 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות המתאימים לכל עיגול בתבנית המיקום. סמן את הצינורות כדי לזהות כראוי את הפרטורציה (בקרה/שורץ), את אות השכפול של הצמח (A, B או C) ואת נקודת זמן הקציר (מספר דקות לאחר התפשטות התקופה).
- הכינו מנות פטרי שנבחרו בשלב 3.1.1.
- מניחים דיסק נייר מסנן סטרילי בכל אחד מ -30 מנות פטרי משלב 3.1.1. הוסף מים סטרילי כדי להרטיב את הדיסקים; אין לאפשר מים עודפים לבריכה במנה. מניחים כל מנה בכל אחד מששת המעגלים בכל תבנית מיקום.
- הצב שלושה צמחי תפוחי אדמה לצד כל תבנית מיקום. ודא כי צמחים הם באותו גיל ובגודל יחסי.
4. ביצוע התפשטות
הערה: נקודת זמן של קציר אחת/תבנית מיקום מוגדרת בכל פעם.
- הסירו את שתי המידות המובילות מהמפעל עם מספריים סטריליים ומניחים עלה אחד בצלחת פטרי ואחד בצלחת פטרי הנגועה לכל צמח (A, B ו-C). ביצוע תהליך זה במהירות האפשרית.
- אופציונלי העבר את תבנית המיקום למעמד המצלמה כדי ללכוד תמונת ' לפני הדבקה '.
- העבר הזחלים לכל מנה שורץ באמצעות מלקחיים לגעת רך מהר ככל האפשר. הגדר את שעון העצר עבור הזמן הנדרש ' הדבקה '.
הערה: פרק הזמן שבו הזחלים צורכים את רקמת העלה הוא ' זמן התפשטות '. זה משהו שיכול להיקבע בשיטה מדעית באמצעות כמה עלי בדיקות/הזחלים לפני תחילת התפשטות בפועל. זמן התפשטות הנבחרת צריך להיות עקבי לכל העלים הנגועים.
הערה: הזחלים צריכים להיות מטופלים עם טיפול על ידי מלקחיים מגע רך. ניתן להבין בעדינות את השני עד התור הרביעי באמצעות הצופר או המותניים. - שים לב להזנה כדי לוודא. שכל הזחלים אוכלים יש להוסיף/להסיר את הזחלים על בסיס התנהגות האכלה. שמרו על מכסים על מנות פטרי ככל האפשר.
הערה: ניתן להשתמש ברימות מרובות בכל עלה. - להסיר את הזחלים מעלים בסוף זמן הפלישה. הפעל את שעון העצר לזמן הקציר.
- אופציונלי העבר את תבנית המיקום למעמד המצלמה כדי ללכוד את תמונת ' אחרי הדבקה '.
הערה: כל ששת העלים בתבנית המיקום נקצרו בזמן הקציר המסוים.
5. קציר עלים
- העבר כל עלה לצינור המקביל בתווית בסוף כל נקודת זמן הקציר ולהקפיא מיד על ידי שחרור הצינור לתוך N נוזלי2. לאחסן את רקמת הצמח שנקטפו ב-80 ° צ' עד הבידוד של RNA.
- חזור על שלבים 4 \ u 20125.1 עבור כל נקודת זמן של קציר.
6. מעבד רקמת עלים לניתוח ביטוי גנים
- לטחון את רקמת העלים הקפואים לאבקה עם מיקרופסל.
- בודד RNA סה כ ותהליך לביטוי גנים כמתואר בעבר22.
7. (אופציונאלי) אומדן נזקי עלה
- הערכת חזותית אחוזים של נזק עלה או לחשב את אזור העלה בתמונות לפני ואחרי התפשטות.
- למדוד את אזור העלה עם כלי תוכנה (למשל, פנפיט)23.
- ממדידות באזור העלה, חישוב אחוז הנזק כ
% נזק = [(אזור העלים לפני – אזור העלים)/אזור העלה לפני] x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צריכה העלה מגדירה הצלחה של הפרוטוקול. בריאים, הזחלים מבוים באופן מדויק צריך להתחיל להאכיל מיד לאחר הצבת על פני השטח ועל האכלה צריך להמשיך באופן עקבי למדי לאורך זמן הפלישה. ב וידאו 1, הזחל בחלק העליון מתחיל ללעוס מיד לאחר המיקום ושומר על שיעור עקבי תוך כדי האכלה. זה חשוב במיוחד אם לומר אירועים ביטוי גנים מוקדם לאחר התפשטות. הזחל בתחתית לא צורכים כל חומר עלה והוא דוגמה של התפשטות מוצלח.
קירובים חזותית במהלך צריכת העלים מנוטרים כדי להבטיח נזק מספיק מופק. כמות של חומר עלה נצרך ניתן לחשב כאחוז של נזק באמצעות תמונות של עלים לפני ואחרי התפשטות. איור 2 ממחיש את שיעורי הצריכה על ידי שלבים התפתחותיים שונים של הזחלים M. סקסטה על סוגים שונים של צמחים תפוחי אדמה. העלים באיור 2A היו מנותקים מצמחים שבועיים של תרבות הרקמה nodal מופץ. כל העלים בדמות זו הם באותו גודל אבל היו חשופים לזיהום על ידי שלבים שונים של זחלים עבור 5 דקות. איור 2A: I-IV, וידאו 2, וידאו 3, וידאו 4, ו- video 5 להמחיש את התעריפים השונים של הצריכה וסגנונות האכלה עבור כל שלב זחל מחלק התפשטות. הדבר מסייע בקביעת מידת הנזק האפשרית באמצעות כל שילוב של עלה וזחל וממחיש את טבעו העתיק של הזחלים הישנים. השימוש בזחלים של הסינטסיומאיה הראשון אינו מומלץ כמו שלהם הם לא פותחו מספיק כדי לייצר נזק בחלון 5 דקות התפשטות. חשוב לציין כי העלים הצעירים יותר עדין נגזר מצמחים רקמה-תרבות הגדלים הם לעתים קרובות יותר טעים הזחלים. בהתבסס על התוצאות הללו, הזחלים הרביעי 4 נבחרו להעריך עוד יותר נזק מעלים בוגרים יותר, אדמה בוגרים צמחים. צמחי האדמה הגדלים קרוב יותר לאלו שנרכשו בשטח. איור 2B ממחיש את מגוון הנזק כאשר הזחלים 3rd ו -4 הרימות הוחלו על העלים מנותקת צמחים תפוחי אדמה מגודלים. שני שבועות בן קטרי צמחים הושתל מושתלים אדמה וגדל במשך 3 שבועות נוספים. עלים פגומים של צמחים בוגרים נפלו לתוך שלוש קבוצות; 15-20%, 20-30% ו-30-40%. שלושת העלים בכל קבוצה מוצגים כדי לייצג את רמות שונות של נזק לכל טווח. העלים מן הצמחים בוגרים יותר בוגר הדרושים הזחלים החלים יותר זמן התפשטות יותר כדי להגיע לאותה רמה של נזק שנצפו בעלים של צמחים צעירים nodal הופץ. תוצאות אלה ממחישים את טווח התוצאות האפשריות מצמח העשב המצליח מסוגים שונים של צמחים.
לאחר העשב המצליח מוצלחת הוא שלם ואחוז נזק מוערך, רקמת עלה הוא מיועד לביטוי גנים. ביטוי גנטי תוצאות צריך להצביע על אינדוקציה חזקה או דיכוי של תעתיקים המעורבים בתגובה לזיהום. איור 3 ממחיש את פרופילי ביטוי הגנים של שישה גורמים C2H2 שעתוק מניסוי מוצלח של העשב בעלים מנותקים. C2H2 אצבע אבץ StZFP2 המושרה על ידי M. סקסטה העשב ב תפוחי אדמה בשנת המפעל הקודם כולו24. למרות StZFP2 היה המושרה על ידי העשב בתוך שיטת העלים הפרטי, התפשטות לא היה משמעותי בהשוואה להשפעה של הניתוק עצמו. עם זאת, שני StZFP2 הומויומנים אחרים, StZFP5 ו StZFP7, המושרה באופן משמעותי ב 40 ו 80 min פוסט העשב בהשוואה פקדים מנותקים. StLOX3 ו StMYC2 הם לסמן גנים המושרה על ידי העשב שניהם ולציין את המעורבות של מסלולים חומצה יסמונית מוסדר הגנה. המטרה של מחקר מסוים זה היה לזהות את הגורמים שעתוק התפשטות תגובה בין פאנל של גנים המועמדים. הזיהוי של שני C2H2 אצבע אבץ שעתוק גורמים שאינם מגיבים לשימוש M. סקסטה העשב תומך שימוש בעלים מנותקים לצורך הדבקה.
איור 1: תרשים זרימה עבור פרוטוקול התפשטות. ייצוג סכמטי של השלבים הכלולים בזרימת העבודה הניסיונית של סעיף התפשטות הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הפגיעה בעלה נגרמת על ידי הזחלים מ. סקסטה . (א) הנזק אחוז לתרבות הרקמה עוזב בכל שלב הזחל מעל 5 דקות. בספרות רומיות I-IV מתייחסים קטעי וידאו 2-5 בהתאמה כי להראות כל הזנה האכלה על העלה בתמונה. (ב) טווח של נזק על עלים הגדלים אדמה על ידי הצגת 4 על 20 דקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי גנים ניתוח של עלים. בזמן אמת כמותי פולימראז תגובת שרשרת (RT-qPCR) ביטוי גנטי ניתוח של C2H2 האצבע בדיקות שעתוק גורמים מוצג. ברמת תעתיק ממוצע, 2-ΔCT עם (ΔCT = CT של גן הבדיקה-CT של גן בקרת אקסוגני). שליטה מחפירה בעלי העלים (כחול) ועלי העלים הנגועים (אדום) מוצגים בכל פעם. כל ערך הוא ממוצע של שלושה משכפל ביולוגי. ANOVA שלושה כיוון בוצעו על ערכי ΔCt. הבדלים משמעותיים בעלי השליטה לאורך זמן מסומנים באותיות רישיות. הבדלים משמעותיים בעלים נגועים לאורך זמן מצוינים באותיות קטנות. הבדלים משמעותיים בין שליטה לעלים שורצים באותה נקודה מוצגים עם כוכבית (*). Pr > ערכי F היו כולם פחות מ 0.001, למעט טיפול StZFP6 control עם 0.0086. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. מספרי ההצטרפות הם: StLOX3-X 96406.1, StZFP2-MK809525, StZFP4-CV 500970.1, StZFP6-DN 587601.1, StZFP7-DN 590005.1. מספרי ההצטרפות של ספאד DB מ< http://solanaceae.plantbiology.msu.edu > הם StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3 PGSC0003DMT400040144, StZFP5-PGSC0003DMT400040141. . הדמות הזאת השתנתה מ-22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרטון וידאו 1: סרטון וידאו של הזנת זחל. שנית M. סקסטה הזחלים האכלה (למעלה) ולא להאכיל (למטה) על עלה מתוך שבוע שבועיים תרבות רקמה הצמח הגדול תפוח אדמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו 2: איור 2A קליפ וידאו (I) של האכלה זחל. שנייה M. סקסטה זחל הזנה על עלה מתוך שבוע התרבות רקמה בת שבועיים צמח תפוחי אדמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו 3: איור 2A קליפ וידאו (II) של האכלה זחל. שלישית מתוך זחל שחור מ. סקסטה האכלה על עלה משני תרבות רקמה בת שבועיים צמח תפוחי אדמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו 4: איור 2A קליפ וידאו (III) של האכלה זחל. הגדל הרביעי מ. סקסטה זחל הזנה על עלה מתוך שבוע התרבות רקמה בת שבועיים צמח תפוחי אדמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו 5: איור 2A קליפ וידאו (IV) של האכלה זחל. השדרה החמישית M. סקסטה זחל האכלה על עלה מתוך שבוע התרבות רקמה בת שבועיים צמח תפוחי אדמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש הקיים הצמח כולו מתודולוגיות העשב הוא מיותר להשיג את המטרה של מחקר מסוים זה (כלומר, המסך מערכת של גנים המועמדים לתגובה שלהם התפשטות). היתרון הברור של עידון העלה הפרטי הוא קיצור הזמן שלוקח לבצע העשב vory assays. הטבע המרפא של צמחים שלמים עם כלובים מסולקים מסולק והוא מבוצע מוקדם יותר, מאז הצמחים צעירים כמו 2 שבועות ניתן להשתמש כדי הקציר עלים. זה דורש גם טביעת רגל קטנה הרבה יותר במהלך האכלה ופחות חלל קאמרית הצמיחה; חשוב גם כאשר משאבים אלה מוגבלים.
המגבלה של מעשה זה, כלומר ניתוק, נתקל כאשר ביטוי גן הביטחון הוא הדבר. ניתוק עצמו גורם לתגובה הפצע, ולכן חשוב להעריך מה הניתוק השפעה יש על רמות בסיס של גן הביטחון ביטוי. במחקר אחד מעורבים העשב מדומה, תעתיק רמות של גן הביטחון מדכא פרוטאז ההגנה השנייה(PIN2) היו גבוהים באופן בלתי צפוי בעלי השליטה של תפוחי אדמה מנותקים כנראה בשל "פצועים שנגרמו במהלך איסוף של העלה" 25. עם זאת, היישום של חרק regurgitant מתוך M. סקסטה רמות משופרות מאוד של PIN2 ביטוי גנטי. זה ממחיש את הצורך להשתמש בפקדים כדי להקניט את ההשפעה של ניתוק מתגובת התפשטות.
מנותקת עלים מבוצעים לעתים קרובות כדי לחסוך זמן, מרחב ומשאבים. הם שימשו בהקרנה עבור התנגדות מחלות פטרייתי בחיטה26,27, ועמידות חרקים ב סויה28 ו חומוס29. הקביעה מתקבלת באופן נרחב לחקר הפתוגן הגורם לנגיף מאוחר בתפוחי אדמה30,31. מחקר שנערך לאחרונה מצא כי מנותקת עלים מנותקים היו שוות ערך של צמח שלם בקביעת התנגדות מאוחרת בשדה32.
לעומת זאת, ראיות מעטות קיימות בספרות, לצורך שימוש בעלים מנותקים לצורך ביטוי להגנה על גנים. אחד המחקר הפרופיל שש גנים הביטחון בתגובה הדבקה קרדית עכביש של שעועית לימה מנותקת33. העלים הפיק גם וולאטילה שגרם לתגובות ההגנה בעלים שאינם נגועים בקרבת מקום, אסטרטגיה ידועה של ביטוי גנים הגנה בצמחים34. לידיעת הידע שלנו, לא לעיסת העשב לעיסה המחקר עד היום לנצל את העלים מנותקים לצורך ביטוי גנים.
התפשטות בעבר הגדיר תגובה C2H2 אצבע האבץ, StZFP2 לא הושרה באופן משמעותי על ידי הדבקה בתוך הנוכחי שנוצר מנותק העלה. מלבד ההבדל הברור של הצמח כולו לעומת העלים מנותקים, המחקר הקודם ניצל סוג רציף של התפשטות שבה רקמת הצמח היה מיועד לביטוי גנים מיד לאחר הסרת הזחלים24. זה שונה מסוג מקוטע של התפשטות מנוצל במחקר הנוכחי, שם הסרת זחל היה אחריו תקופת מנוחה לפני הקציר עלה. במהלך תקופת ההחלמה הזו, רמות StZFP2 מפחיתים במהירות ועלולות לגרום לרמה נמוכה יותר של StZFP2 אינדוקציה. יכול להיות גם אחרים כל כך-רחוק איתות מערכתית מוגדר שעשויים לתרום אינדוקציה מוגבר נצפתה במחקר הצמח כולו. אפשרות נוספת היא כי התעתיקים StZFP2 היה יכול להיות בשיאו לפני 20 דקות הקציר הזמן. ברור, עם זאת, כי אינדוקציה מרשים של StZFP5 ו StZFP7 תעתיקים להפוך סוג זה של פרוטוקול התפשטות רלוונטי. מגבלה נוספת של השיטה הנוכחית תהיה חוסר היכולת להשתמש בזחלים האכלה שורש כגון בסיס תירס. זה גם לא יהיה מתאים כאשר התקשורת הצמח השלם כגון השורש כדי איתות העלה35 או איתות מעלים מערכתית36,37 הוא למד.
הצלחה בפרוטוקול זה תלויה במידה רבה באיכות ובהיערכות המדויקת של הזחל המשמש בניסוי. כישורי הגידול והידע הבסיסי של ההתנהגות המיסקת מועילים אך אינם קריטיים. עם זאת, קבלת הזחלים בריאים, מבוים כראוי יכול להשפיע ישירות על הצלחת האכלה. הזחלים נכנסים לתקופה השקט שלפני כל זחל מולד שבמהלכו הם לא ניזונים21. ברור שזחלים כאלה לא יגרמו לפגיעה ברקמת העלים. הזמן האידיאלי להשתמש בזחלים הוא פשוט אחרי מולט. בשלבי פיתוח מבוים של חרקים של השלב זחל מסוים יהיה גם לשפר את השגות של הביטוי גנים כמו צמחים עשויים להגיב באופן שונה לכל שלב התפתחותי.
הגישה לחרקברות תהיה אידיאלית. לאספקת הזחלים M. סקסטה ביצים או זחלים ניתן גם להזמין ממקורות מסחריים38,39 וגדל על דיאטה או חומר הצמח לשלב המתאים. יש גם כמה כלים מקוונים שיכולים לעזור לזהות כל סינטסיומאיה40,41,42. הזחלים שגדלו בדיאטה לא יכילו רכיבים ספציפיים לצמח כגון סמיונטים מחיידקים שנרכשו על ידי הזחלים הגדלים על צמחים43. ייתכן שפרופילי ביטוי גנטי ישונו אם רכיבים אלה חסרים. הזחלים עשויים להיות חלקית או לגמרי גדל על צמח המארח שלהם אם ההשפעות הללו חשובות למחקר. מניעת מזון מחרקים כמה שעות לפני האכלה ניסויים יכול גם לשפר את התנהגות האכלה. הזחלים שנאספו שדה יכול גם להיות חזק ויתרון כפי שהם נחשפו רמות הזנה הנכון, אבל זה מוסיף משתנה אחר אשר עשוי או לא להיות מתאים לכל המחקרים.
הייצור של צמחים בריאים, חרקים וחומרי הדברה הוא גם קריטי. צמחים עם וירוסים, חרקים ואורגניזמים פטרייתי להחדיר גורמים מייסדים ולהציג אתגר בהשגת נתונים הנוזלת.
ניתן לשלב מגוון רב של מבני זחל, צמחי תפוח אדמה וגדלי עלים כדי להתאים אישית את הפרוטוקול לסוג מסוים של מחקר. את אורך זמני התפשטות והקציר ניתן גם לכוונן. באופן פוטנציאלי, ניתן לחקור אינטראקציות רבות של חרקים צמחיים באמצעות עלים מנותקים אם תצפיות צמחים שלמות משמשות כקו בסיס. שיטת העלה הפרטי היא חלופה רלוונטית ורבת ערך למחקרים שלמים של צמחי העשב לניתוח ביטוי הגנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות בוב Farrar ואלקסיס פארק עבור מתן חרקים המשמשים במחקר זה ועבור המומחיות שלהם בזחל הזמני. תודות למייקל בלקברן ולסקאט גוש לסקירה קריטית של כתב היד.
ציון שמות המסחר או מוצרים מסחריים בפרסום זה מיועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית.
משרד החקלאות הוא ספק הזדמנויות שוות ומעסיק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
- Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
- The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
- Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
- Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
