Summary
제시 된 방법은 감자의 분리 된 잎에 만두카 sexta 애벌레의 응용 프로그램을 통해 자연 초식 동물 손상된 식물 조직을 만듭니다. 식물 조직은 곤충 허브에 대한 초기 반응에 관여하는 6개의 전사 인자 호몰로그의 발현을 위해 분석된다.
Abstract
곤충 초본의 유전자 발현 연구의 다영양 성질은 많은 수의 생물학적 복제본을 요구하며, 더 간단하고 능률적인 허브 프로토콜에 대한 필요성을 만듭니다. 츄잉 곤충의 교란은 일반적으로 전체 식물 시스템에서 연구된다. 이 전체 유기체 전략이 대중적이지만, 유사한 관찰이 단일 분리 된 잎에서 복제 될 수 있다면 필요하지 않습니다. 가정은 신호 변환에 필요한 기본 요소가 리프 자체 내에 존재한다는 것입니다. 신호 전달에 있는 초기 사건의 경우에, 세포는 섭동으로부터 신호를 수신하고 유전자 발현을 위해 분석되는 이웃 세포에 그 신호를 전송하기 만 하면 됩니다.
제안 된 방법은 단순히 분리의 타이밍을 변경합니다. 전체 식물 실험에서, 애벌레는 결국 식물에서 분리 되고 유전자 발현을 위해 분석되는 단 하나 잎에 수감됩니다. 절제의 순서가 반전되면, 전체 식물 연구에서 마지막에서, 분리 된 연구에서 첫 번째로, 공급 실험이 단순화됩니다.
솔라눔 튜트로섬 var. 케네벡은 간단한 조직 배양 배지에서 절달 전달에 의해 전파되고 원하는 경우 추가 성장을 위해 토양으로 옮겨질 수 있다. 잎은 모 공장에서 절제되어 페트리 접시로 옮겨져 먹이 분석이 M. sexta의애벌레 단계로 수행됩니다. 손상된 잎 조직은 신호 환전에서 비교적 초기 사건의 발현을 위해 분석된다. 유전자 발현 분석은 감염 특이적 Cys2-His2(C2H2) 전사 인자를 확인하, 초기 반응 연구에서 분리된 잎을 사용하는 성공을 확인하였다. 이 방법은 전체 식물 감염보다 수행하기 쉽고 적은 공간을 사용합니다.
Introduction
초초는 식물이 공격을 식별하고 생존을위한 적절한 반응을 탑재 할 수있는 일련의 분자 이벤트를 움직입니다. 식물은 곤충을 먹어도 두 가지 기본 단서를 받습니다. 하나는 조직에 물리적 인 손상에서 다른 하나는 곤충 특정 물질에서. 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)은 애벌레 입부분에 의해 생성된 손상에 반응하여 방출되고 호르몬 자스몬산 및 방어 유전자의 전사증가를 초래하는 잘 정의된 상처 반응을 유발한다1. 가장 잘 알려진 DAMPs 중 하나는 체계인이며, 잎이 상처입은 후 더 큰 프로젠틴단백질의 절단에 의해 형성되는 폴리펩티드는 2,3. 자스몬산 상처 반응은 애벌레 타액, 장 내 분당 (역류제) 및 대변 (frass)에서 유래 될 수있는 허브 관련 분자 패턴 (HAMPs)에 의해 더욱 변조된다. 곤충은 이러한 물질을 사용하여 방어 반응을 향상시거나 회피합니다5. 전사 인자는 다운스트림 방어 유전자 6,7,8의조절을 통해 방어 반응에서 호르몬 신호로부터 메시지를 전달한다.
실험실 설정에 사용되는 일부 식물 - 곤충 상호 작용 연구는 곤충에 의해 공급의 자연적인 방법을 근사하는 것을 목표로, 시뮬레이션 유형입니다. 모의 초본은 일반적으로 곤충 마우스 부품의 특정 메커니즘을 모방하는 다양한 도구를 사용하여 식물 조직에 인공 손상을 만들어 Damps의 방출을 유발하고 방어 유전자의 생산을 유발합니다. 경구 분비물 또는 역류제와 같은 다른 곤충 특이적 성분은종종 HAMPs 9,10,11에서기여를 복제하기 위해 첨가된다. 특정 크기와 유형의 상처를 생성하고 정확한 양의 HAMPs를 적용하면 이러한 유형의 연구에 대한 한 가지 장점이 있으며 보다 재현 가능한 결과를 제공할 수 있습니다. 식물 조직에 손상을 달성 하는 자연 초원 연구, 필드 획득 또는 실험실 사육 곤충의 응용 프로그램에 의해 달성 되는, 상처 크기와 HAMP 금액 곤충 행동에 의해 제어 되 고 에 가변성을 추가 하기 때문에 종종 더 도전 데이터. 자연 대 시뮬레이션 방법과 그 장점과 단점은 문헌12,13,14에서잘 논의된다.
전사 인자와 같은 초기 신호 이벤트를 연구하려면 잎의 일정 비율이 비교적 짧은 시간 내에 소비되어야하므로 유충은 분석을 위해 잎이 얼어 붙을 때까지 즉시 츄를 시작하고 소비를 유지해야합니다. M. sexta는 애벌레 단계의 많은 동안 여러 solanaceous 식물에 탐욕스러운 피더, 시간의 상대적으로 짧은 금액에 최대 피해를 부여에 이상적 만들기15. 이는 곤충이 잎표면(16,17)에접촉한 직후식물반응이 거의즉시 발생하기 때문에 조기 시그널링 이벤트를 연구할 때 편리하다. 일반적으로 사용되는 클립 케이지 의 봉쇄 방법은 여러 케이지가 애벌레의 제거 또는 추가를 허용하기 위해 실험 전반에 걸쳐 지속적인 조정을 필요로하기 때문에 서투른 증명한다. 잎은 또한 동시에 여러 곤충 먹이를 지원하기에 충분히 크고 강한해야합니다. 감자 식물의 이러한 유형은 먹이를 관찰하기 위해 많은 양의 공간이 필요합니다. 애벌레는 종종 잎 표면의 밑면으로 옮겨지며 먹이 관찰을 매우 어렵게 만듭니다. 이러한 실험을 수행 하기 위해 전체 식물을 사용 하 여 명확 하 게 성가신.
현재 연구는 전체 식물보다는 페트리 접시에 고립 된 분리 된 잎을 사용하여 허브를 연구하는 전체 식물 접근 방식을 간소화하고 단순화합니다. 본 연구에서 프로토콜의 적용은 M. sexta 애벌레에 의한 초식성 손상 후 감자 잎에서 초기에 유도된 C2H2 전사 인자의 군의 관찰에 제한된다.
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Protocol
참고: 다음 프로토콜은 한 사람이 설정하고 관찰하고 샘플을 수집할 수 있도록 설계되었습니다. 생물학적 복제를 증가시키기 위해 동일한 설정의 다중 실행이 결합될 수 있다. 실험의 추가 반복은 유전자 발현에 가능한 일주 영향을 제거하기 위해 하루 중 동시에 설정되어야합니다. 이 프로토콜은 5개의 개별 수확 시간 지점에 대해 3개의 '감염된' 잎을 생성하도록 설계되었습니다. 각 시점마다 일치하는 컨트롤 잎은 총 30개의 샘플을 만듭니다. 실험은 다양한 잎 크기 및 애벌레 단계로 수행 될 수 있지만 잎 크기, 애벌레 단계 및 감염 시간은 절차 전반에 걸쳐 일관되게하는 것이 좋습니다.
1. 감자 식물의 준비
참고 : 멸균 기술을 필요로하는 모든 단계는 조직 배양 후드18,19에서수행해야합니다.
- 베플랜트 소스에서 케네벡 식물을 준비합니다.
- 전파 매체를 준비합니다.
- 비타민 파우더를 함유한 무라시게와 스쿠그(MS) 4.43 g, 자당 20g, 한천 대체물 2g을 스핀바가 있는 2L 플라스크에 역삼투(RO) 정제수 1L에 넣습니다. 플라스크를 저어접시에 옮기고 섞는다. 계속 저어면서 NaOH를 사용하여 pH를 5.8로 조정합니다.
참고: 한천은 오토클레이브가 될 때까지 녹지 않습니다. - 20 분 (121 °C, 101.3 kPa)에 대한 액체 주기에 방부제 / 살균제 및 오토 클레이브 1 mL을 추가하십시오. 사이클이 끝난 직후 오토클레이브에서 배지를 제거하고 50°C로 식힙니다. 멸균 및 냉각된 전파 배지의 100 mL를 멸균 배양 용기(예를 들어, 마젠타 또는 플랜트콘)로 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 사용하여 이송한다.
- 비타민 파우더를 함유한 무라시게와 스쿠그(MS) 4.43 g, 자당 20g, 한천 대체물 2g을 스핀바가 있는 2L 플라스크에 역삼투(RO) 정제수 1L에 넣습니다. 플라스크를 저어접시에 옮기고 섞는다. 계속 저어면서 NaOH를 사용하여 pH를 5.8로 조정합니다.
- 이식 재료를 준비합니다.
- 케네벡 종자 감자로 배식물 소스를 얻고 탭 H2O. 새싹을 제거하고 멸균 메스로 2cm 조각으로 잘라 서 토양의 모든 흔적을 제거합니다.
- 새싹 조각을 70% 에탄올에 15s로 담그고 1:1 표백제(1부 RO-water: 1부분 농축 살균/상업용 등급 표백제)에 13분간 담가 소독합니다. 멸균 H 2O로 5회 헹구어 내보소서
- 멸균 기술을 사용하여 조직 배양 후드에서 전파 배지를 가진 멸균 조직 배양 용기에 이식 물질을 전달한다. 혈관을 식물 조직 배양 챔버로 옮기고 2\u20123 주 동안 또는 24 °C, 16 h 빛 (140 μmol·m-2·1)/8 h 어두운 광기간에 식물이 형성될 때까지 성장한다.
- 전파 매체를 준비합니다.
- 절제 된 조직 배양 감자 식물을 준비하십시오.
- 절절 전달 매체를 준비합니다.
참고: 이것은 당일 에 사용될 수 있거나 미리 만들어질 수 있는 10개의 조직 배양 혈관을 만들고 절점 전달될 때까지 4°C에서 저장될 수 있다.- 36.43 g의 영양한 한천 믹스를 스핀 바가 있는 2L 플라스크에 RO 정제수 1L에 넣습니다. 플라스크를 저어접시에 옮기고 섞는다. 계속 저어면서 KOH를 사용하여 pH를 5.8로 조정합니다.
참고: 한천은 오토클레이브가 될 때까지 녹지 않습니다. - 20 분 동안 액체 사이클에 오토 클레이브 (121 °C, 101.3 kPa). 사이클이 끝난 직후 오토클레이브에서 배지를 제거하고 50°C로 식힙니다. 멸균 냉각 된 절달 전달 배지의 100 mL를 멸균 배양 용기 (재료 표참조)로 옮기고 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 사용한다.
- 36.43 g의 영양한 한천 믹스를 스핀 바가 있는 2L 플라스크에 RO 정제수 1L에 넣습니다. 플라스크를 저어접시에 옮기고 섞는다. 계속 저어면서 KOH를 사용하여 pH를 5.8로 조정합니다.
- 절개를 준비합니다.
- 베임 재료에서 자란 케네벡 식물을 구하십시오 (단계 1.1.2에서 생산). 플랜트렛에는 적어도 3~4개의 노드(분기 점)가 있어야 합니다. 멸균 가위 나 메스를 사용하여 잎을 제거합니다. 주 줄기에 가까운 가지를 자르고 약 2mm의 가지 조직을 남깁니다.
- 각 분기점 또는 노드 에서 약 2mm 를 절단하여 절점 절개를 제거합니다. 절점 전달 배지(단계 1.2.1.2에서 제조)를 포함하는 멸균 조직 배양 용기에 절인 절단을 이전 용기(분기 포인팅 위쪽)와 동일한 방향으로 배열한다.
- 식물 조직 배양 챔버에 절제 된 절단혈관을 옮기고 24 °C, 16 h 빛 (140 μmol ·m-1)/8 h 어두운 광주기에서 2\u20123 주 동안 성장한다.
참고 : 각 절제는 새로운 식물로 성장할 것입니다. 각 선박의 절단 수는 잎 크기를 결정합니다. 선박당 이송되는 절단 횟수가 줄어들면 잎이 커집니다. 선박 당 3 개의 식물은 2 \u20123 주에 15mm x 20mm 잎을 가질 것입니다.
- 절절 전달 매체를 준비합니다.
- (선택 사항) 토양 재배 케네벡 감자 식물을 준비합니다.
참고 : 더 큰 잎을 생산하기 위해, 절점 전파 감자 식물은 토양으로 전송 될 수있다.- 모든 뿌리 조직이 한천에서 방출 될 때까지 배지에서 식물을 부드럽게 당겨 서 토양에 절절 전달 배지에서 재배 감자 식물을 전송합니다.
- 뿌리에서 1 절 바로 위의 토양으로 옮기고 이식 주위의 토양을 가볍게 포장합니다. 뿌리 시스템과 토양 접촉을 보장하기 위해 부드럽게 물.
- 16 h 빛 (140 μmol·m-2·s -1)/8 h 어두운 광주기 및 25/20 °C 낮/밤 온도와 성장 챔버에 놓습니다.
참고 : 식물은 상단 두 개의 완전히 확장 된 잎이 분석에 적합한 크기에 도달하면 준비됩니다.
- (선택 사항) 덩이줄기에서 자란 감자 식물을 준비합니다.
참고: 덩이줄기에서 자란 감자 식물은 더 크고 견고하며 식물에서 유충을 사육하거나 밤새 애벌레 먹이를 원하는 경우 유용할 수 있습니다.- 10 mL 펠릿 느린 방출 비료로 보충 된 토양 혼합을 포함하는 냄비에 10 깊은 감자 덩이줄기 6을 놓습니다.
- 16 h 빛 (140 μmol·m-2·s -1)/8 h 어두운 광주기 및 25/20 °C 낮/밤 온도와 성장 챔버에 놓습니다. 식물은 덩이줄기 심기로부터 약 30\u201240 일 준비가되어 있습니다.
참고: 꽃이 피우기 시작한 식물은 사용하지 마십시오.
2. 먹이를위한 곤충의 준비
- M. sexta의원하는 애벌레 단계를 가져옵니다.
참고 : 이 연구를위한 애벌레는 5 th instar20을 통해 인공 식단에서 사육되었으며 사내 곤충에서 경험이 풍부한 개인에 의해 준비되었습니다. 유충은 또한 식물 조직에 부분적으로 또는 완전히 사육될 수 있습니다. 애벌레는 몰트 직전에 먹지 않으며 몰트 직후에 먹을 가능성이 가장 높으므로 적절한 준비는 21이 중요합니다. - 애벌레 크기에 따라 적절한 격납 용기(예를 들어, 6-, 12-, 24웰 조직 배양 접시)로 유충을 옮긴다. 접시에 잘 당 하나의 애벌레가 있어야합니다.
참고: 애벌레는 식량 원천없이 영토 또는 식인풍 행동을 표시 할 수 있으며 함께 보관하면 부상을 입을 수 있습니다. - (선택 사항) 이 애벌레 먹이를 향상시킬 수 있습니다이 로 최대 2 시간 동안 굶주린 애벌레.
참고 : 애벌레는이 시간 동안 성장 챔버에 저장된 봉쇄 용기에 있어야합니다.
3. 감염 실험을 위한 구성 요소 설정
참고: 그림1의 회로도 요약을 참조하십시오.
- 각 수확 시간 점에 대한 배치 템플릿을 만듭니다.
참고: 각 수확 시간대5개의 트레이를 설정하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 샘플을 체계적으로 정리하고 배열을 변경하지 않고도 요리를 세트로 보다 효율적으로 이동할 수 있습니다. 손상 비율 계산을 수행하는 경우 감염 전후 이미지를 동일한 초점 거리에서 캡처해야 하므로 필수적입니다.- 적당한 크기의 페트리 접시 6개를 들고 백지와 줄을 설 수 있는 튼튼한 트레이 5개를 구한다.
참고 : 페트리 접시의 크기는 먹이 분석에 대해 선택한 잎 크기를 기반으로합니다. 잎은 측면을 건드리지 않고 접시에 쉽게 맞아야합니다. 예를 들어, 60mm x 15mm 접시는 길이 또는 너비가 최대 50mm인 잎에 적합합니다. - 각 트레이의 용지에 적당히 크기의 페트리 접시를 사용하여 6개의 원을 추적합니다. 한 세트의 원을 '제어' A, B 및 C로 표시하고 다른 '감염된' A, B 및 C에 레이블을 지정합니다. 또한 각 배치 템플릿에 적절한 수확 시간을 지정합니다.
- 적당한 크기의 페트리 접시 6개를 들고 백지와 줄을 설 수 있는 튼튼한 트레이 5개를 구한다.
- (선택 사항) '감염 전'과 '감염 후' 이미지 캡처를 위해 카메라를 설정합니다.
- 배치 템플릿의 모든 Petri 접시의 이미지 캡처를 위해 적절한 초점 거리에서 스탠드에 카메라를 고정합니다.
- 수확 시간 점 튜브에 레이블을 지정합니다.
- 배치 템플릿의 각 원에 해당하는 30, 1.7 mL 미세 원심분리튜브 세트를 라벨을 붙입니다. 튜브에 라벨을 부착하여 섭동(제어/감염), 식물 복제 문자(A, B 또는 C) 및 수확 시간(감염 후 시간 후 시간(분 수)을 적절히 식별합니다.
- 3.1.1단계에서 선택한 페트리 요리를 준비한다.
- 3.1.1단계에서 30개의 페트리 접시 각각에 멸균 필터 페이퍼 디스크를 놓습니다. 디스크를 적시기 위해 멸균 수를 추가하십시오. 접시에 물을 과도하게 마시지 마십시오. 각 배치 템플릿의 6개의 원 각각에 각 접시를 놓습니다.
- 각 배치 템플릿 옆에 감자 식물 3개 배치합니다. 식물이 모두 같은 연령과 상대적인 크기인지 확인하십시오.
4. 감염 수행
참고: 한 번에 하나의 수확 시간/배치 템플릿이 설정됩니다.
- 멸균 가위로 각 식물에서 크기가 일치하는 잎 두 개를 제거하고 제어 페트리 접시에 잎 한 개와 각 식물 (A, B 및 C)에 감염된 페트리 접시에 하나씩 놓습니다. 이 프로세스를 가능한 한 빨리 수행하십시오.
- (선택 사항) 배치 템플릿을 카메라 스탠드로 전송하여 '감염 전' 이미지를 캡처합니다.
- 가능한 한 빨리 부드러운 터치 포셉을 사용하여 감염된 각 접시에 애벌레를 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 드시면 됩니다. 원하는 '감염' 시간에 대한 타이머를 설정합니다.
참고 : 애벌레가 잎 조직을 소비하는 기간은 '감염 시간'입니다. 이것은 실제 침략의 시작 의 앞에 몇몇 시험 잎/애벌레를 사용하여 경험적으로 결정될 수 있는 무언가입니다. 선택한 '감염 시간'은 감염된 모든 잎에 대해 일관성이 있어야합니다.
참고 : 애벌레는 부드러운 터치 집게에 의해주의처리되어야한다. 2~4번째 인스타는 경적 이나 중간 부에 의해 부드럽게 파악 될 수 있습니다. - 모든 애벌레가 먹고 있는지 확인하기 위해 먹이를 관찰. 유충은 먹이 행동에 따라 추가 / 제거해야합니다. 페트리 접시에 뚜껑을 최대한 두십시오.
참고: 잎당 여러 유충을 사용할 수 있습니다. - 감염 시간이 끝나면 잎에서 애벌레를 제거하십시오. 수확 시간에 대한 타이머를 시작합니다.
- (선택 사항) 배치 템플릿을 카메라 스탠드로 전송하여 '침입 후' 이미지를 캡처합니다.
참고: 배치 템플릿의 6개 잎은 모두 특정 수확 시간에 수확됩니다.
5. 잎 수확
- 각 잎을 각 수확 시점의 끝에 해당 표지 된 튜브로 옮기고 튜브를 액체 N2에 떨어 뜨려 즉시 동결합니다. 수확된 식물 조직을 RNA가 분리될 때까지 -80°C에서 보관한다.
- 각 수확 시간 점에 대해 4\u20125.1 단계를 반복합니다.
6. 유전자 발현 분석을 위한 잎 조직 처리
- 냉동 잎 조직을 마이크로 페슬로 분말로 갈아.
- 앞서 설명한 바와 같이 유전자 발현을 위한 총 RNA 및 공정을분리하는 22.
7. (선택 사항) 잎 손상 추정
- 리프 손상의 퍼센트를 시각적으로 추정하거나 감염 전후 이미지에서 잎 면적을 계산합니다.
- 소프트웨어 도구(예: Phenophyte)를 사용하여 리프 영역을 측정합니다(예: Phenophyte)23.
- 잎 면적 측정에서 손상 비율을
% 피해 = [(잎 영역 이전 – 잎 영역 이후)/잎 영역 이전] x 100.
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Representative Results
리프 소비는 프로토콜의 성공을 정의합니다. 건강하고 정확하게 준비된 유충은 잎 표면에 배치 한 직후에 먹이를 시작해야하며 수유는 감염 시간 내내 상당히 일관된 방식으로 계속되어야합니다. 비디오1에서, 상단의 애벌레는 배치 직후에 먹기 시작하고 먹이를 주는 동안 일관된 속도를 유지한다. 이것은 감염 후에 초기 유전자 발현 사건을 계산하는 경우에 특히 중요합니다. 하단의 유충은 잎 물질을 소비하지 않았으며 실패한 감염의 예입니다.
잎 소비 중 시각적 근사치를 모니터링하여 충분한 손상이 발생하도록 합니다. 소비된 잎 재료의 양은 감염 전후의 나뭇잎 이미지를 사용하여 손상의 백분율로 계산할 수 있습니다. 도 2는 상이한 유형의 감자 식물에 대한 M. sexta 유충의 상이한 발달 단계에 의한 소정의 가변비율을 나타낸다. 도 2A의 잎은 2주령의 절인 전파 조직 배양 식물로부터 분리되었다. 이 그림의 모든 잎은 크기가 같지만 5 분 동안 애벌레의 다른 단계에 의해 감염되었습니다. 그림 2A: I-IV, 비디오 2, 비디오3, 비디오 4및 비디오 5의 다른 비율을 보여줍니다. 감염의 부분에서 각 애벌레 단계에 대한 소비 및 공급 스타일. 이것은 각 잎과 애벌레 단계 조합을 사용하여 얼마나 많은 손상이 가능한지 결정하는 데 도움이되며 이전 애벌레의 탐욕스러운 특성을 보여줍니다. 그들의 하악골이 5 분 감염 창에서 손상을 생성하기에 충분히 개발되지 않기 때문에 첫 번째 instar 애벌레의 사용은 권장되지 않습니다. 조직 배양 재배 식물에서 파생 된 더 젊은 부드러운 잎은 종종 애벌레에 더 맛있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 이러한 결과에 기초하여, 4번째 인스타 애벌레는 더 성숙한 토양 에서 자란 감자 식물의 잎에 대한 손상을 추가로 평가하기 위해 선택되었습니다. 토양 재배 식물은 현장에서 획득 한 식물에 더 가깝게 가세합니다. 도 2B는 토양에서 자란 감자 식물로부터 분리된 잎에 3및 4번째 유충을 적용했을 때의 피해 범위를 도시한다. 2주된 절개 식물을 토양에 이식하고 추가로 3주 동안 재배했습니다. 토양 재배 식물에서 손상된 잎은 세 그룹으로 떨어졌다; 15-20%, 20-30%, 30-40%. 각 그룹의 세 잎은 각 범위에 대한 피해의 다른 수준을 나타내는 것으로 표시됩니다. 더 성숙한 토양 재배 식물에서 잎 더 많은 애벌레 적용 하 고 더 이상 감염 시간 젊은 nodal 전파 식물에서 잎에서 관찰 하는 손상의 동일한 수준에 도달 하는 데 필요한. 이러한 결과는 다양한 유형의 식물에서 성공적인 허브에서 가능한 결과의 범위를 보여줍니다.
성공적인 초본이 완료되고 백분율 손상이 평가된 후에, 잎 조직은 유전자 발현을 위해 분석됩니다. 유전자 발현 결과는 감염에 대한 반응에 관여하는 전사체의 강력한 유도 또는 억압을 나타내야 한다. 도 3은 분리된 잎에서 성공적인 허브 실험으로부터의 6개의 C2H2 전사 인자의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. C2H2 아연 핑거 StZFP2는 M. sexta 초본에 의해 감자에 유도되었고 이전 전체 식물 연구에서24. StZFP2는 분리된 잎 분석에서 허브에 의해 유도되었지만, 분리 자체의 효과와 비교할 때 감염은 유의하지 않았다. 그러나, 두 개의 다른 StZFP2 호동, StZFP5 및 StZFP7,크게 에서 유도 되었다 40 그리고 80 분리 된 컨트롤에 비해 분 후 초초. StLOX3 및 StMYC2는 상처와 초본 모두에 의해 유도된 마커 유전자이며 자스몬산 조절 방어 경로의 개입을 나타냅니다. 이 특정 연구 결과의 목표는 후보 유전자의 위원회 중 침략 반응하는 전사 요인을 확인하는 것이었습니다. M. sexta 약초에 강력하게 반응하는 2개의 C2H2 아연 핑거 전사 인자의 확인은 침략 적인 검정을 위한 분리된 잎의 사용을 지원합니다.
그림 1: 감염 프로토콜에 대한 순서도입니다. 프로토콜의 감염 섹션의 실험 워크플로우에 포함된 단계의 개략적 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: M. sexta 애벌레에 의한 잎 손상. (a) 각 애벌레 단계에서 조직 배양에 대한 손상률 5분 이상. 로마 숫자 I-IV는 각각 2-5개의 영상을 참조하여 각 별이 잎에 먹이를 주는 것을 보여준다. (B) 20분 이상 4번째 에스타에 의한 토양 재배 잎의 손상 범위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 잎의 유전자 발현 분석. C2H2 아연 손가락 전사 인자의 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 유전자 발현 분석이 도시되어 있다. 평균 전사체 수준은, 2−ΔCT(ΔCT = CT 의 시험 유전자-외인성 대조유전자의 CT)이다. (파란색)에서 절제된 대조군 잎(빨강)에서 의한 절제된 잎은 각 시점에서 도시된다. 각 값은 3개의 생물학적 복제의 평균이다. 3방향 ANOVA는 ΔCt 값에 따라 수행되었습니다. 시간이 지남에 따라 제어 잎의 중요한 차이는 대문자로 표시됩니다. 시간이 지남에 따라 감염된 잎의 중요한 차이는 소문자로 표시됩니다. 동시에 제어와 감염된 잎 사이의 유의한 차이는 별표(*)로 표시됩니다. Pr> F 값은 모두 0.0086을 가진 StZFP6 대조군 처리를 제외하고 0.001 미만이었다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. NCBI 가입 번호는 다음과 같습니다: StLOX3-X96406.1, StZFP2- MK809525, StZFP4-CV500970.1, StZFP6-DN587601.1, StZFP7-DN590005.1. Spud DB 수탁 번호는 & http://solanaceae.plantbiology.msu.edu> StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3-PGSC0003DMT40000040044, StZFP5-PGSC0004404040000400. 이 그림은22에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : 애벌레 먹이의 비디오 클립. 두 번째 instar M. sexta 유충 먹이 (상단) 및 2 주 된 조직 배양 재배 감자 식물에서 잎에 먹이 (아래). 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 2: 애벌레 먹이의 도 2A 비디오 클립(I). 두 번째 instar M. sexta 애벌레는 2 주 된 조직 배양 재배 감자 식물에서 잎에 먹이. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 3: 애벌레 먹이의 도 2A 비디오 클립(II). 세 번째 인스타 M. sexta 애벌레는 2 주 된 조직 배양 재배 감자 식물에서 잎에 먹이. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 4: 애벌레 먹이의 도 2A 비디오 클립 (III). 네 번째 인스타 M. sexta 애벌레는 2 주 된 조직 배양 재배 감자 식물에서 잎에 먹이. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 5: 애벌레 먹이의 도 2A 비디오 클립(IV). 다섯 번째 인스타 M. sexta 애벌레는 2 주 된 조직 배양 재배 감자 식물에서 잎에 먹이. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
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Discussion
기존의 전체 식물 약초 방법론의 사용은이 특정 연구의 목표를 달성하기 위해 불필요합니다 (즉, 감염에 대한 반응을위한 후보 유전자세트를 스크리브). 분리 된 잎 정제의 명백한 장점은 허브 분석 을 수행하는 데 걸리는 시간을 단축하는 것입니다. 클립 케이지가있는 전체 식물의 다루기 힘든 특성이 제거되고 2 주 어린 식물이 잎을 수확하는 데 사용할 수 있기 때문에 더 빨리 수행됩니다. 또한 수유 시 훨씬 더 작은 설치 공간과 적은 성장 챔버 공간이 필요합니다. 이러한 리소스가 제한될 때 모두 중요합니다.
이 분석의 한계, 즉 분리는 방어 유전자 발현이 분석될 때 발생합니다. 분리 자체는 상처 반응을 일으키고 따라서 분리가 방어 유전자 발현의 기저 수준에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것이 중요합니다. 모의 허브를 포함 한 연구에서, 잘 알려진 방어 유전자 프로테아제 억제제 II의 성적 증명서 수준(PIN2)때문에 가능성이 분리 감자 잎의 제어 잎에서 예기치 않게 높았다 "잎의 수집 중에 발생 상처" 25. 그러나, M. sexta에서 곤충 역류제의 적용은 크게 PIN2 유전자 발현의 수준을 향상. 이는 침입 반응에서 분리의 효과를 애타게 하기 위해 컨트롤을 사용해야 할 필요성을 보여 줍니다.
분리 된 잎 공소시약은 종종 시간, 공간 및 자원을 절약하기 위해 수행됩니다. 이들은 밀26,27,곤충 내성, 대두28 및병아리콩29에서곰팡이 질환에 대한 내성을 선별하는 데 사용되어 왔다. 이 분석은 감자30,31에서늦은 빛을 일으키는 병원균의 연구에서 널리 받아들여진다. 최근 연구는 분리 된 잎 공아학이 필드(32)에서늦은 브라이트 저항을 결정하는 전체 식물 성애와 동일하다는 것을 발견했다.
그러나 방호 유전자 발현을 위한 분석으로 분리된 잎을 사용하는 것에 대한 부족한 증거가 문헌에 존재한다. 한 연구는 분리 된 리마 콩(33)의거미 계수 감염에 대한 응답으로 6 개의 방어 유전자를 프로파일화했습니다. 잎은 또한 식물34에서방어 유전자 발현의 잘 알려진 전략인 근처의 감염되지 않은 잎에서 방어 반응을 유도하는 휘발성을 생성하였다. 우리의 지식에, 현재까지 어떤 츄잉 곤충 초초 연구는 유전자 발현을위한 분석에 분리 된 잎을 활용하지 않습니다.
이전에 정의된 감염 반응형 C2H2 아연 핑거, StZFP2는 현재 분리된 잎 분석법에서 의한 감염에 의해 유의하게 유도되지 않았다. 전체 식물과 분리된 잎의 명백한 차이를 제외하고, 이전 연구는 유충24의제거 직후 유전자 발현을 위해 식물 조직을 분석한 연속적인 유형의 감염을 이용하였다. 이것은 현재 연구에서 이용된 불연속적인 유형의 감염과는 다르며, 여기서 애벌레 제거는 잎 수확 전에 휴식 기간이 뒤따랐습니다. 이 복구 기간 동안, StZFP2 수준 신속 하 게 감소 하 고 StZFP2 유도의 낮은 수준이 발생할 수 있습니다. 또한 전체 식물 연구에서 관찰 된 증강 유도에 기여할 수있는 다른 지금까지 정의되지 않은 전신 신호 성분이있을 수 있습니다. 또 다른 가능성은 StZFP2 전사체가 20 분 수확 시간 전에 정점에 달했을 수 있다는 것입니다. 그러나 StZFP5 및 StZFP7 전사체의 인상적인 유도는 이러한 유형의 감염 프로토콜을 관련있게 만듭니다. 본 방법의 또 다른 한계는 옥수수 뿌리 벌레와 같은 뿌리 먹이 유충을 사용하는 무능력입니다. 또한 전신 잎(36) 36,37에서 신호하는 잎신호(35)에 대한 뿌리와 같은 전체 식물 통신이 연구될 때에도 적합하지 않을 것이다.
이 프로토콜의 성공은 실험에 사용된 유충의 품질과 정확한 스테이징에 크게 좌우됩니다. M. sexta 행동에 대한 양육 기술과 기본 지식은 도움이되지만 중요하지는 않습니다. 그러나, 건강 한, 적절 하 게 준비 된 애벌레를 얻는 직접 먹이 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. 애벌레는21을먹이지 않는 동안 각 애벌레 몰트 앞에 있는 정지 기간을 입력합니다. 분명히, 이러한 애벌레는 잎 조직을 손상시키지 않습니다. 애벌레를 사용하기에 이상적인 시간은 몰트 직후입니다. 특정 애벌레 단계의 곤충의 발달 단계 코호트는 또한 식물이 각 발달 단계에 다르게 반응할 수 있기 때문에 유전자 발현의 재현성을 향상시킬 것이다.
곤충에 대한 접근은 애벌레의 공급에 이상적 일 것이다. M. sexta 계란 또는 유충은 또한 상업적인 근원38,39및 적당한 단계로 규정식 또는 식물 물자상에 사육될 수 있습니다. 또한 각 instar40,41,42를식별하는 데 도움이되는 몇 가지 온라인 도구가 있습니다. 식단에서 사육된 애벌레는식물 43에서사육된 유충에 의해 취득된 미생물 공생제와 같은 식물 특이 성분을 포함하지 않을 것이다. 유전자 발현 프로필은 이러한 성분이 누락된 경우 변경될 수 있다. 애벌레는 이러한 효과 연구에 중요 한 경우 그들의 호스트 식물에 부분적으로 또는 완전히 사육 될 수 있습니다. 먹이 실험 전에 곤충에서 음식을 원천 징수 또한 먹이 행동을 향상 시킬 수 있습니다. 필드 수집 된 애벌레는 또한 적절 한 영양 수준에 노출 된 강력 하 고 유리한 수 있습니다., 하지만 그 모든 연구에 적합 하거나 적합 하지 않을 수 있습니다 또 다른 변수를 추가.
건강하고, 곤충과 무농약 식물의 생산도 중요합니다. 바이러스, 곤충 해충 및 곰팡이 유기체가있는 식물은 혼란 요인을 소개하고 재현 가능한 데이터를 얻는 데 어려움을 줄 것입니다.
많은 애벌레 instars, 감자 식물 나이 및 잎 크기는 연구의 특정 유형에 대한 프로토콜을 사용자 정의하기 위해 결합 될 수있다. 감염 및 수확 시간의 길이도 조정할 수 있습니다. 잠재적으로, 전체 식물 관측 기준선으로 사용 하는 경우 분리 된 잎을 사용 하 여 다른 많은 식물-곤충 상호 작용 연구 수 있습니다. 분리된 잎 분석은 유전자 발현을 분석하기 위한 전체 식물 허브 연구 결과에 대한 관련성 있고 귀중한 대안입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 이 연구에 사용된 곤충을 제공하고 애벌레 준비에 있는 그들의 전문지식에 대한 밥 패러와 알렉시스 공원에 감사하고 싶습니다. 원고의 비판적 검토에 대한 마이클 블랙번과 Saikat 고쉬에 추가 감사.
이 출판물의 상품명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 추천 또는 보증을 의미하지 않습니다.
USDA는 평등한 기회 제공자 이자 고용주입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
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