Summary
Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.
Abstract
Die multitrophische Natur von Genexpressionsstudien von Insektenkraut erfordert eine große Anzahl biologischer Replizieren, wodurch einfachere, schlankere Kräuterschutzprotokolle erforderlich sind. Störungen von Kauinsekten werden in der Regel in ganzen Pflanzensystemen untersucht. Während diese ganze Organismus-Strategie beliebt ist, ist es nicht notwendig, wenn ähnliche Beobachtungen in einem einzigen abgetrennten Blatt repliziert werden können. Es wird davon ausgegangen, dass die für die Signaltransduktion erforderlichen Grundelemente innerhalb des Blattes selbst vorhanden sind. Bei frühen Ereignissen in der Signaltransduktion müssen Zellen nur das Signal von der Störung empfangen und an benachbarte Zellen übertragen, die auf Genexpression untersucht werden.
Die vorgeschlagene Methode ändert lediglich den Zeitpunkt der Ablösung. In ganzen Pflanzenexperimenten sind Larven auf ein einzelnes Blatt beschränkt, das schließlich von der Pflanze gelöst und auf Genexpression untersucht wird. Wenn die Reihenfolge der Exzision umgekehrt wird, von der letzten in ganzen Pflanzenstudien, auf den ersten in der freistehenden Studie, wird das Fütterungsexperiment vereinfacht.
Solanum tuberosum var. Kennebec wird durch Knotentransfer in einem einfachen Gewebekulturmedium vermehrt und auf Wunsch auf den Boden übertragen. Die Blätter werden von der Mutterpflanze entfernt und in Petrischalen verlegt, wo der Fütterungstest mit den Larvenstadien von M. sextadurchgeführt wird. Beschädigtes Blattgewebe wird auf die Expression relativ früher Ereignisse in der Signaltransduktion geprüft. Die Genexpressionsanalyse identifizierte befallspezifische Cys2-His2 (C2H2)-Transkriptionsfaktoren, was den Erfolg der Verwendung von freistehenden Blättern in frühen Reaktionsstudien bestätigte. Die Methode ist einfacher durchzuführen als ganze Pflanzenbefall und verbraucht weniger Platz.
Introduction
Herbivory setzt eine Reihe molekularer Ereignisse in Gang, bei denen eine Pflanze sowohl den Angriff identifizieren als auch eine angemessene Reaktion auf ihr Überleben montieren kann. Eine Pflanze erhält zwei grundlegende Hinweise von kauenden Insekten; eine durch die physische Schädigung des Gewebes und die andere durch insektenspezifische Substanzen. Schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) werden als Reaktion auf Schäden freigesetzt, die durch Larvenmspiele verursacht werden, und lösen eine klar definierte Wundreaktion aus, die zu einer Erhöhung des Hormons Jasmonsäure und der Transkription der Verteidigungsgene1führt. Eines der bekanntesten DAMPs ist systemin, ein Polypeptid, das durch die Spaltung des größeren Prosystemin-Proteins gebildet wird, nachdem ein Blatt 2,3verwundet wurde. Die Jasmonsäure-Wundreaktion wird durch pflanzenfressende molekulare Muster (HAMPs) weiter moduliert, die aus Raupenspeichel, Darminhalt (regurgitant) und Kot (frass) abgeleitet werden können4. Insekten verwenden diese Substanzen, um entweder die Abwehrzuwehr zu steigern oder zu umgehen5. Transkriptionsfaktoren leiten dann die Botschaft von Hormonsignalen in der Abwehrreaktion über die Regulierung der nachgeschalteten Abwehrgene6,7,8weiter.
Einige Pflanzen-Insekten-Interaktionsstudien, die in Laborumgebungen verwendet werden, sind vom simulierten Typ, mit dem Ziel, die natürliche Methode der Fütterung durch das Insekt zu annähernden. Simuliertes Krautwird wird in der Regel durch die Schaffung künstlicher Schäden an Pflanzengeweben mit verschiedenen Werkzeugen erreicht, die den spezifischen Mechanismus von Insektenmundteilen imitieren, die ausreichen, um die Freisetzung von DAMPs zu verursachen und die Produktion von Verteidigungsgenen auszulösen. Andere insektenspezifische Komponenten wie mundende Sekrete oder Regurgitant werden oft hinzugefügt, um den Beitrag von HAMPs9,10,11zu replizieren. Die Erstellung einer bestimmten Größe und Art der Wunde und die Anwendung präziser Mengen an HAMPs ist ein Vorteil für diese Arten von Studien und kann reproduzierbarere Ergebnisse liefern. Natürliche Pflanzenschutzstudien, bei denen Schäden am Pflanzengewebe durch die Anwendung von felderworbenen oder im Labor gezüchteten Insekten durchgeführt werden, sind oft schwieriger, da Wundgrößen- und HAMP-Mengen durch Insektenverhalten bestimmt werden und die Variabilität der daten. Die natürlichen versus simulierten Methoden und ihre Vor- und Nachteile sind in der Literatur gut diskutiert12,13,14.
Um frühe Signalereignisse wie Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, muss ein bestimmter Prozentsatz des Blattes in relativ kurzer Zeit verbraucht werden, so dass Larven sofort zu kauen beginnen und den Verbrauch aufrecht erhalten müssen, bis das Blatt zur Analyse eingefroren ist. M. sexta ist ein gefräßiger Feeder auf mehreren solanaceous Pflanzen während vieler seiner Larvenstadien, so dass es ideal für die Vermittlung von maximalen Schaden in einer relativ kurzen Zeit15. Dies ist praktisch, wenn frühe Signalereignisse untersucht werden, da die Reaktion der Pflanze fast unmittelbar nach einem Insektenkontakt mit der Blattoberfläche16,17auftritt. Die häufig verwendete Clip-Käfig-Methode der Einschließung erweist sich als ungeschickt, da mehrere Käfige während des gesamten Experiments kontinuierliche Anpassungen erfordern würden, um die Entfernung oder Zugabe von Larven zu ermöglichen. Die Blätter müssen auch groß genug und stark genug sein, um mehrere Insekten zu unterstützen, die gleichzeitig füttern. Diese Arten von Kartoffelpflanzen benötigen viel Platz, um die Fütterung zu beobachten. Larven werden oft an die Unterseite der Blattoberfläche verlagert, was auch Fütterungsbeobachtungen recht schwierig macht. Ganze Pflanzen zu verwenden, um diese Experimente durchzuführen, ist eindeutig umständlich.
Die aktuelle Studie verwendet freistehende Blätter, die in Petrischalen isoliert sind, anstatt ganze Pflanzen, um den gesamten Pflanzenansatz für das Studium von Kräutern zu rationalisieren und zu vereinfachen. Die Anwendung des Protokolls in dieser Studie beschränkt sich auf die Beobachtung einer Gruppe von C2H2-Transkriptionsfaktoren, die früh in Kartoffelblättern nach pflanzenfressenden Schäden durch M. sexta Larven induziert wurden.
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Protocol
HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für eine Person zum Einrichten, Erfassen von Beobachtungen und Sammeln von Proben konzipiert. Mehrere Durchläufe desselben Setups können kombiniert werden, um die biologische Replikation zu erhöhen. Alle zusätzlichen Wiederholungen des Experiments sollten zur gleichen Tageszeit eingerichtet werden, um mögliche tagtägliche Einflüsse auf die Genexpression zu beseitigen. Das Protokoll ist so konzipiert, dass 3 "befallene" Blätter für 5 separate Erntezeitpunkte erstellt werden. Abgestimmte Steuerelementblätter für jeden Zeitpunkt erstellen insgesamt 30 Samples. Das Experiment kann mit einer Vielzahl von Blattgrößen und Larvenstadien durchgeführt werden, aber es wird empfohlen, dass Blattgröße, Larvenstadium und Befallzeit während des gesamten Verfahrens konsistent sein.
1. Zubereitung der Kartoffelpflanzen
HINWEIS: Alle Schritte, die sterile Technik erfordern, müssen in einer Gewebekulturhaube18,19durchgeführt werden.
- Bereiten Sie Kennebec-Pflanzen aus der Explantationsquelle vor.
- Vorbereiten des Ausbreitungsmediums.
- 4,43 g Murashige und Skoog (MS) mit Vitaminpulver, 20 g Saccharose und 2 g Agarersatz zu 1 L Umkehrosmose (RO) gereinigtem Wasser in einem 2 L Kolben mit Spinbar hinzufügen. Kolben auf eine Rührplatte geben und mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 5,8 ein, während Sie weiter rühren.
HINWEIS: Agar löst sich erst auf, wenn er autoklaviert ist. - 1 ml Konservierungsmittel/Biozid und Autoklav auf Flüssigkeitszyklus für 20 min (121 °C, 101,3 kPa) hinzufügen. Entfernen Sie das Medium unmittelbar nach Demzyklus aus dem Autoklaven und kühlen Sie es auf 50 °C. Übertragen Sie 100 ml steriles und gekühltes Vermehrungsmedium auf sterile Kulturgefäße (z. B. Magenta oder Plantcon) mit steriler Technik in einer Gewebekulturhaube.
- 4,43 g Murashige und Skoog (MS) mit Vitaminpulver, 20 g Saccharose und 2 g Agarersatz zu 1 L Umkehrosmose (RO) gereinigtem Wasser in einem 2 L Kolben mit Spinbar hinzufügen. Kolben auf eine Rührplatte geben und mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 5,8 ein, während Sie weiter rühren.
- Bereiten Sie Explant-Material vor.
- Erhalten Sie die Explantationsquelle als Kennebec-Pflanzkartoffeln und entfernen Sie alle Spuren des Bodens, indem Sie mit Demhahn H2O waschen. Sprossen entfernen und mit einem sterilen Skalpell in 2 cm große Stücke schneiden.
- Sterilisieren Sie Sprossenstücke durch Einweichen für 15 s in 70% Ethanol, gefolgt von 13 min in 1:1 Bleichmittel (1 Teil RO-Wasser: 1 Teil konzentrierte keimtötende/kommerzielle Bleichmittel). 5 Mal steril h2 Oabspülen.
- Übertragen Sie Explantationsmaterial mit Sterilisationsmedium in einer Gewebekulturhaube mit steriler Technik auf sterile Gewebekulturgefäße mit Vermehrungsmedium. Übertragen Sie Gefäße in eine Pflanzengewebekulturkammer und wachsen Sie für 2-u20123 Wochen oder bis sich Pflanzenbeilage bei 24 °C, 16 h Licht (140 x-m -2s-1)/8 h dunkle Photoperiode bildet.
- Vorbereiten des Ausbreitungsmediums.
- Bereiten Sie knotenvermehrte Gewebekultur Kartoffelpflanzen vor.
- Vorbereiten von Knotentransfermedium.
HINWEIS: Dadurch werden 10 Gewebekulturgefäße hergestellt, die am selben Tag oder im Voraus verwendet und bei 4 °C bis zum Knotentransfer gelagert werden können.- Fügen Sie 36,43 g Nährstoff-Agar-Mix zu 1 L RO-gereinigtem Wasser in einem 2 L-Kolben mit einem Spin-Bar hinzu. Kolben auf eine Rührplatte geben und mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 5,8 ein, während Sie weiter rühren.
HINWEIS: Agar löst sich erst auf, wenn er autoklaviert ist. - Autoklav auf Flüssigkeitszyklus für 20 min (121 °C, 101,3 kPa). Entfernen Sie das Medium unmittelbar nach Demzyklus aus dem Autoklaven und kühlen Sie es auf 50 °C. Übertragen Sie 100 ml sterilgekühltes Knotentransfermedium auf sterile Kulturgefäße (siehe Materialtabelle)mit steriler Technik in einer Gewebekulturhaube.
- Fügen Sie 36,43 g Nährstoff-Agar-Mix zu 1 L RO-gereinigtem Wasser in einem 2 L-Kolben mit einem Spin-Bar hinzu. Kolben auf eine Rührplatte geben und mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 5,8 ein, während Sie weiter rühren.
- Bereiten Sie Knotenschnitte vor.
- Erhalten Sie Kennebec-Pflanzen, die aus Explant-Material (hergestellt in Schritt 1.1.2) angebaut werden. Plantlets sollten mindestens 3 bis 4 Knoten (Zweigpunkte) haben. Entfernen Sie die Blätter mit einer sterilen Schere oder einem Skalpell. Schneiden Sie Äste in der Nähe des Hauptstamms, so dass etwa 2 mm Zweiggewebe.
- Entfernen Sie Knotenabschnitte vom Stamm, indem Sie etwa 2 mm über und unter jedem Astpunkt oder Knoten schneiden. Anordnen Sie Knotenschnitte in einem sterilen Gewebekulturgefäß, das das Knotentransfermedium (hergestellt in Schritt 1.2.1.2) in der gleichen Ausrichtung wie im vorherigen Gefäß (Zweig nach oben) enthält.
- Gefäße mit Knotenschnitten in eine Pflanzengewebekulturkammer übertragen und für 2-u20123 Wochen bei 24 °C, 16 h Licht (140 x-2-s-1)/8 h dunkle Photoperiode wachsen.
HINWEIS: Jeder Knotenschnitt wird zu einem neuen Pflanzgefäß heranwachsen. Die Anzahl der Stecklinge in jedem Gefäß bestimmt die Blattgröße. Weniger Stecklinge, die pro Gefäß übertragen werden, führen zu größeren Blättern. Drei Pflanzen pro Gefäß haben 15 mm x 20 mm Blätter in 2-u20123 Wochen.
- Vorbereiten von Knotentransfermedium.
- (Optional) Bereiten Sie bodenangebaute Kennebec-Kartoffelpflanzen vor.
HINWEIS: Um größere Blätter zu produzieren, können knotenvermehrte Kartoffelpflanzen auf den Boden übertragen werden.- Übertragen Sie Kartoffelpflanzen, die in Knotenanbaumittel angebaut werden, auf den Boden, indem Sie die Pflanze sanft aus dem Medium ziehen, bis das gesamte Wurzelgewebe aus dem Agar freigesetzt wird.
- Von den Wurzeln auf den Boden direkt über dem 1. Knoten übertragen und den Boden leicht um die Transplantation verpacken. Wasser schonend, um den Bodenkontakt mit dem Wurzelsystem zu gewährleisten.
- In eine Wachstumskammer mit 16 h Licht (140 'mol'm-2's-1)/8 h dunkle Photoperiode und 25/20 °C Tag/Nacht Temperaturen platzieren.
HINWEIS: Pflanzen sind bereit, wenn die beiden oberen vollständig expandierten Blätter die für den Test geeignete Größe erreicht haben.
- (Optional) Bereiten Sie in Knollen angebaute Kartoffelpflanzen zu.
HINWEIS: Kartoffelpflanzen, die aus Knollen angebaut werden, sind größer und robuster und können nützlich sein, wenn Larven auf Pflanzen aufgezogen werden oder wenn über Nacht Larvenfütterung gewünscht wird.- Legen Sie eine Kartoffelknolle 6 in tief in einen 10 in Topf mit Bodenmischung ergänzt mit 10 ml pelleted Slow Release Dünger.
- In eine Wachstumskammer mit 16 h Licht (140 'mol'm-2's-1)/8 h dunkle Photoperiode und 25/20 °C Tag/Nacht-Temperatur. Die Pflanzen sind ca. 30-u201240 Tage nach der Knollenbepflanzung bereit.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Pflanzen, die zu blühen begonnen haben.
2. Zubereitung von Insekten zur Fütterung
- Erhalten Sie gewünschte Larvenstadium von M. sexta.
HINWEIS: Larven für diese Studie wurden auf künstliche Nein-Diät durch die 5. instar20 aufgezogen und von einer erfahrenen Person aus dem hauseigenen Insektary inszeniert. Larven können auch teilweise oder vollständig auf Pflanzengewebe aufgezogen werden. Larven essen nicht unmittelbar vor einem Molt und sind am ehesten direkt nach molt zu essen, so dass angemessene Inszenierung ist wichtig21. - Larven je nach Larvengröße in ein geeignetes Containmentgefäß (z.B. 6-, 12-, 24-Well-Gewebekulturschale) übertragen. Es sollte eine Larve pro Brunnen in der Schale sein.
HINWEIS: Larven können territoriales oder Kannibalistisches Verhalten ohne Nahrungsquelle anzeigen und verletzt werden, wenn sie zusammen untergebracht werden. - (Optional) Larven bis zu 2 h verhungern, da dies die Larvenfütterung verbessern kann.
HINWEIS: Larven sollten sich während dieser Zeit in einem Rückhaltegefäß in der Wachstumskammer befinden.
3. Komponenten-Setup für das Befallexperiment
HINWEIS: Siehe die schematische Zusammenfassung in Abbildung 1.
- Erstellen Sie Platzierungsvorlagen für jeden Erntezeitpunkt.
HINWEIS: Es ist hilfreich, 5 verschiedene Schalen für jeden Erntezeitpunkt einzurichten. Dies hält Die Proben organisiert und ermöglicht es, die Gerichte effizienter als Set zu bewegen, ohne ihre Anordnung zu ändern. Wenn Schadensberechnungen durchgeführt werden, ist dies unerlässlich, da Bilder vor und nach dem Befall mit der gleichen Brennweite aufgenommen werden müssen.- Erhalten Sie 5 robuste Schalen, die in der Lage sind, einen Satz von sechs entsprechend großen Petrischalen zu halten und mit weißem Papier zu säumen.
HINWEIS: Die Größe der Petrischale basiert auf der Blattgröße, die für den Fütterungstest gewählt wurde. Das Blatt sollte leicht in die Schale passen, ohne die Seiten zu berühren. Zum Beispiel eignet sich eine 60 mm x 15 mm Schale für Blätter bis 50 mm Länge oder Breite. - Verfolgen Sie einen Satz von sechs Kreisen mit der entsprechend großen Petrischale auf dem Papier in jedem Fach. Beschriften Sie einen Satz von Kreisen 'steuern' A, B und C und die andere 'befallen' A, B und C. Etikettieren Sie auch jede Platzierungsvorlage mit der entsprechenden Erntezeit.
- Erhalten Sie 5 robuste Schalen, die in der Lage sind, einen Satz von sechs entsprechend großen Petrischalen zu halten und mit weißem Papier zu säumen.
- (Optional) Richten Sie eine Kamera für die Bildaufnahme "vor dem Befall" und "nach dem Befall" ein.
- Sichern Sie eine Kamera an einem Ständer an der entsprechenden Brennweite für die Bildaufnahme aller Petri-Gerichte in der Platzierungsvorlage.
- Beschriften Sie die Erntezeitpunktrohre.
- Beschriften Sie einen Satz von 30, 1,7 ml Mikrozentrifugenrohren, die jedem Kreis in der Platzierungsvorlage entsprechen. Beschriften Sie die Rohre, um die Störung (Steuerung/Befallen), den Pflanzenreplikationsbuchstaben (A, B oder C) und den Erntezeitpunkt (Anzahl der Minuten nach dem Befall) angemessen zu identifizieren.
- Bereiten Sie Petri-Gerichte in Schritt 3.1.1 gewählt.
- Legen Sie eine sterile Filterpapierscheibe in jede der 30 Petrischalen ab Schritt 3.1.1. Fügen Sie steriles Wasser hinzu, um die Scheiben zu befeuchten; lassen Sie nicht zu, dass überschüssiges Wasser in der Schale pool. Platzieren Sie jedes Gericht in jedem der sechs Kreise in jeder Platzierungsvorlage.
- Positionieren Sie drei Kartoffelpflanzen neben jeder Platzierungsvorlage. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzen alle das gleiche Alter und die relative Größe haben.
4. Durchführen von Befall
HINWEIS: Eine Erntezeitpunkt-/Platzierungsvorlage wird gleichzeitig eingerichtet.
- Entfernen Sie die oberen beiden größenangepassten Blätter von jeder Pflanze mit steriler Schere und legen Sie ein Blatt in die Kontrolle Petrischale und eines in die befallene Petrischale für jede Pflanze (A, B und C). Führen Sie diesen Prozess so schnell wie möglich durch.
- (Optional) Übertragen Sie die Platzierungsvorlage auf den Kameraständer, um ein "vor dem Befall" Bild zu erfassen.
- Übertragen Sie Larven so schnell wie möglich mit Soft Touch Forceps auf jede befallene Schale. Stellen Sie den Timer für die gewünschte 'Befallzeit' ein.
HINWEIS: Der Zeitraum, in dem Larven das Blattgewebe verbrauchen, ist die "Befallszeit". Dies ist etwas, das empirisch mit ein paar Testblättern/Larven vor Beginn des tatsächlichen Befalls bestimmt werden kann. Die gewählte "Befallszeit" sollte für alle befallenen Blätter konsistent sein.
HINWEIS: Larven sollten mit Vorsicht durch Soft-Touch-Zangen behandelt werden. 2. bis 4. Instern kann sanft von ihrem Horn oder Mittelteil erfasst werden. - Beobachten Sie die Fütterung, um sicherzustellen, dass alle Larven fressen. Larven sollten je nach Fütterungsverhalten hinzugefügt/entfernt werden. Halten Sie die Deckel auf den Petri-Gerichten so weit wie möglich.
HINWEIS: Pro Blatt können mehrere Larven verwendet werden. - Entfernen Sie Larven von den Blättern am Ende der Befallszeit. Starten Sie den Timer für die Erntezeit.
- (Optional) Übertragen Sie die Platzierungsvorlage auf den Kameraständer, um das Bild "nach dem Befall" zu erfassen.
HINWEIS: Alle sechs Blätter in der Platzierungsvorlage werden zur jeweiligen Erntezeit geerntet.
5. Ernteblätter
- Jedes Blatt am Ende jedes Erntezeitpunkts in das entsprechende beschriftete Rohr geben und sofort einfrieren, indem man das Rohr in Flüssigkeit N2abgibt. Lagern Sie das geerntete Pflanzengewebe bei -80 °C bis zur Isolierung der RNA.
- Wiederholen Sie die Schritte 4-u20125.1 für jeden Erntezeitpunkt.
6. Verarbeitung von Blattgewebe für die Genexpressionsanalyse
- Das gefrorene Blattgewebe zu einem Pulver mit einem Mikroschädling mahlen.
- Isolieren Sie die gesamte RNA und den Prozess zur Genexpression, wie zuvor beschrieben22.
7. (Optional) Abschätzung der Blattschäden
- Schätzen Sie den Prozentsatz der Blattschäden visuell oder berechnen Sie die Blattfläche in den Vor- und Nachbefallbildern.
- Messen Sie die Blattfläche mit Software-Tools (z.B. Phenophyt)23.
- Berechnen Sie aus Blattflächenmessungen den Schadensprozentsatz als
% Schaden = [(Blattfläche vor – Blattfläche nach)/Blattfläche vor] x 100.
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Representative Results
Der Blattverbrauch definiert den Erfolg des Protokolls. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten sofort nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während der Befallzeit ziemlich konsistent fortgesetzt werden. In Video 1beginnt die Larve an der Spitze sofort nach der Platzierung zu kauen und hält eine konstante Rate während der Fütterung. Dies ist besonders wichtig, wenn frühe Genexpressionsereignisse nach dem Befall zu finden sind. Die Larve am Boden verbrauchte kein Blattmaterial und ist ein Beispiel für einen erfolglosen Befall.
Visuelle Annäherungen während des Blattverbrauchs werden überwacht, um sicherzustellen, dass genügend Schäden entstehen. Die Menge des verbrauchten Blattmaterials kann als Prozentsatz des Schadens berechnet werden, indem Bilder von Blättern vor und nach dem Befall verwendet werden. Abbildung 2 zeigt die variablen Verbrauchsraten verschiedener Entwicklungsstadien von M. sexta Larven auf verschiedenen Kartoffelpflanzenarten. Die Blätter in Abbildung 2A wurden von 2 Wochen alten, knotenvermehrten Gewebekulturpflanzen gelöst. Alle Blätter in dieser Abbildung sind von der gleichen Größe, wurden aber durch verschiedene Stadien der Larven für 5 min befallen. Abbildung 2A: I-IV, Video 2, Video 3, Video 4, und Video 5 veranschaulichen die verschiedenen Raten von Verbrauchs- und Fütterungsstile für jede Larvenstufe aus einem Teil des Befalls. Dies ist hilfreich bei der Bestimmung, wie viel Schaden mit jeder Blatt- und Larvenstadium-Kombination möglich ist und veranschaulicht die gefräßige Natur der älteren Larven. Die Verwendung von 1. Instar-Larven wird nicht empfohlen, da ihre Unterkiefer nicht genug entwickelt sind, um Schäden im 5 min Befallfenster zu verursachen. Es ist wichtig zu beachten, dass jüngere zartere Blätter, die aus gewebekulturbewachsenen Pflanzen gewonnen werden, oft für Larven schmackhafter sind. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden 4. Instar-Larven ausgewählt, um Schäden an Blättern von reiferen, bodenangebauten Kartoffelpflanzen weiter zu bewerten. Die bodenangebauten Pflanzen nähern sich den auf dem Feld erworbenen pflanzen näher. Abbildung 2B zeigt die Schadensspanne, wenn 3. und 4. Insternlarven auf Blätter aufgetragen wurden, die von bodenangebauten Kartoffelpflanzen gelöst wurden. Zwei Wochen alte, vermehrte Knotenpflanzen wurden in den Boden transplantiert und für weitere 3 Wochen angebaut. Beschädigte Blätter aus bodenangebauten Pflanzen fielen in drei Gruppen; 15-20%, 20-30% und 30-40%. Die drei Blätter in jeder Gruppe werden gezeigt, um die verschiedenen Schadensstufen für jeden Bereich darzustellen. Die Blätter von reiferen Bodenpflanzen benötigten mehr Larven und eine längere Befallzeit, um das gleiche Schadensniveau zu erreichen, das in den Blättern von jüngeren Knoten vermehrten Pflanzen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse veranschaulichen die Bandbreite der Ergebnisse, die durch erfolgreiches Pflanzenelfenbein aus verschiedenen Pflanzenarten möglich sind.
Nachdem erfolgreiches Krautgut vollständig ist und prozentuale Schäden bewertet werden, wird Blattgewebe auf Genexpression untersucht. Die Ergebnisse der Genexpression sollten auf eine robuste Induktion oder Unterdrückung von Transkripten hinweisen, die an der Reaktion auf den Befall beteiligt sind. Abbildung 3 zeigt die Genexpressionsprofile von sechs C2H2-Transkriptionsfaktoren aus einem erfolgreichen Kräuterelfenbeinexperiment in abgetrennten Blättern. C2H2 Zinkfinger StZFP2 wurde durch M. sexta Herbivory in Kartoffeln in früheren ganzen Pflanzenstudien induziert24. Obwohl StZFP2 durch Krautimkodien im freistehenden Blatttest induziert wurde, war der Befall im Vergleich zur Wirkung der Ablösung selbst nicht signifikant. Zwei weitere StZFP2-Homologs, StZFP5 und StZFP7, wurden jedoch im Vergleich zu freistehenden Kontrollen mit 40 und 80 min Post-Kräutern signifikant induziert. StLOX3 und StMYC2 sind Markergene, die sowohl durch Wund- als auch durch Kräuterbakterien induziert werden und auf die Beteiligung von Jasmonsäure-regulierten Abwehrwegen hinweisen. Das Ziel dieser speziellen Studie war es, befallempfindliche Transkriptionsfaktoren in einem Gremium von Kandidatengenen zu identifizieren. Die Identifizierung von zwei C2H2 Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren, die robust auf M. sexta Kraut reagieren, unterstützt die Verwendung von freistehenden Blättern für Befall-Assays.
Abbildung 1: Flussdiagramm für das Befallprotokoll. Schematische Darstellung der Schritte, die im experimentellen Workflow des Befallsabschnitts des Protokolls enthalten sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Blattschäden durch M. sexta Larven. (A) Prozentuale Schädigung der Gewebekulturblätter in jedem Larvenstadium über 5 min. Römische Ziffern I-IV beziehen sich auf Videos 2-5 bzw., die zeigen, dass jeder Instar sich auf dem abgebildeten Blatt ernährt. (B) Bereich der Schäden an bodengewachsenen Blättern durch 4. instar über 20 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Genexpressionsanalyse von Blättern. Gezeigt wird eine Echtzeit-Genexpressionsanalyse der Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) von C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren. Mittlere Rokatiumsebene ist, 2-CT mit (CT = CT des Testgens - CT des exogenen Kontrollgens). Die verbrauchsteuerpflichtigen Kontrollblätter in (blau) und die verbrauchenden befallenen Blätter in (rot) werden jeweils angezeigt. Jeder Wert ist der Durchschnitt von drei biologischen Replikationen. Die Drei-Wege-ANOVA wurde auf den Wert der Ct durchgeführt. Erhebliche Unterschiede in den Kontrollblättern im Laufe der Zeit werden mit Großbuchstaben angezeigt. Signifikante Unterschiede bei befallenen Blättern im Laufe der Zeit werden in Kleinbuchstaben angegeben. Signifikante Unterschiede zwischen Kontrolle und befallenen Blättern zur gleichen Zeit werden mit einem Sternchen (*) dargestellt. Pr > F-Werte waren alle kleiner als 0,001, mit Ausnahme der StZFP6-Kontrollbehandlung mit 0,0086. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar. NCBI-Beitrittsnummern sind: StLOX3-X96406.1, StZFP2- MK809525, StZFP4-CV500970.1, StZFP6-DN587601.1, StZFP7-DN590005.1. Spud DB-Beitrittsnummern von
Video 1: Videoclip der Larvenfütterung. Zweite instar M. sexta Larven Fütterung (oben) und nicht Fütterung (unten) auf einem Blatt aus zwei Wochen alten Gewebekultur angebaut Kartoffelpflanze. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 2: Abbildung 2A Videoclip (I) der Larvenfütterung. Zweite instar M. sexta larva Fütterung auf einem Blatt aus zwei Wochen alten Gewebekultur angebaut Kartoffelpflanze. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 3: Abbildung 2A Videoclip (II) der Larvenfütterung. Dritte instar M. sexta larva Fütterung auf einem Blatt aus zwei Wochen alten Gewebekultur angebaut Kartoffelpflanze. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 4: Abbildung 2A Videoclip (III) der Larvenfütterung. Vierte instar M. sexta larva Fütterung auf einem Blatt aus zwei Wochen alten Gewebekultur angebaut Kartoffelpflanze. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 5: Abbildung 2A Videoclip (IV) der Larvenfütterung. Fünfte instar M. sexta larva Fütterung auf einem Blatt aus zwei Wochen alten Gewebekultur angebaut Kartoffelpflanze. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Die Verwendung bestehender Methoden für pflanzenkräuterelfenbeinte Pflanzen ist nicht erforderlich, um das Ziel dieser speziellen Studie zu erreichen (d. h. eine Reihe von Kandidatengenen auf ihre Reaktion auf Densonfall zu untersuchen). Der offensichtliche Vorteil der losgelösten Blattverfeinerung ist die Verkürzung der Zeit, die es braucht, um Kräuter-Assays durchzuführen. Die sperrige Natur ganzer Pflanzen mit Clipkäfigen wird eliminiert und Tests werden früher durchgeführt, da Pflanzen, die noch 2 Wochen alt sind, zur Ernte von Blättern verwendet werden können. Es erfordert auch einen viel kleineren Platzbedarf während der Fütterung und weniger Wachstumsraum; beides wichtig, wenn diese Ressourcen begrenzt sind.
Die Einschränkung dieses Tests, nämlich die Loslösung, wird festgestellt, wenn die Expression des Verteidigungs-Gens assayed wird. Die Ablösung selbst verursacht eine Wundreaktion, und daher ist es wichtig zu beurteilen, welche Wirkung die Ablösung auf die Basalebenen der Verteidigungs-Gen-Expression hat. In einer Studie mit simuliertem Kraut, Transkript-Spiegel eines bekannten Abwehrgen Protease-Inhibitor II(PIN2) waren unerwartet hoch in der Kontrolle Blätter von freistehenden Kartoffelblättern wahrscheinlich aufgrund "Wundung verursacht während der Sammlung des Blattes" 25. Die Anwendung von Insektenregurgitant aus M. sexta hat jedoch die PIN2-Genexpression stark verbessert. Dies veranschaulicht die Notwendigkeit, Steuerelemente zu verwenden, um die Auswirkungen der Trennung von der Befallreaktion zu erarbeiten.
Abgetrennte Blatttests werden häufig durchgeführt, um Zeit, Platz und Ressourcen zu sparen. Sie wurden bei screening für Resistenz en resistance to fungal diseases in wheat26,27, and insect resistance in soybean28 and chickpea29. Der Assay ist weithin akzeptiert in der Studie des Erregers, die späte Blage in Kartoffel 30 verursacht30,31. Eine kürzlich durchgeführte Studie ergab, dass freistehende Blattassays den ganzen Pflanzenassays bei der Bestimmung der späten Blight-Resistenz im Feld32entsprachen.
In der Literatur gibt es jedoch kaum Belege für die Verwendung von losgelösten Blättern, um die Expression des Verteidigungsgens zu assayen. Eine Studie profilierte sechs Abwehrgene als Reaktion auf den Spinnenmilbenbefall von freibestückten Lima-Bohnen33. Die Blätter produzierten auch flüchtige Stoffe, die Abwehrreaktionen in nahegelegenen unbefallenen Blättern induzierten, eine bekannte Strategie der Verteidigung-Gen-Expression in Pflanzen34. Unserer Kenntnis nach nutzen bisher keine kauenden Insektenkräuterstudien freistehende Blätter, um die Genexpression zu ergründen.
Der zuvor definierte befallempfindliche C2H2 Zinkfinger, StZFP2, wurde durch Befall im aktuellen abgetrennten Blatttest nicht signifikant induziert. Abgesehen von dem offensichtlichen Unterschied von ganzer Pflanze und abgetrennten Blättern, nutzte die vorherige Studie eine kontinuierliche Art von Befall, bei dem Pflanzengewebe unmittelbar nach der Entfernung der Larven24auf Genexpression untersucht wurde. Dies unterscheidet sich von der diskontinuierlichen Art des Befalls, die in der aktuellen Studie verwendet wird, wo larvenentfernung von einer Ruhezeit vor der Blatternte gefolgt wurde. Während dieser Erholungsphase, StZFP2 Ebenen verringern sich schnell und kann zu einem niedrigeren Niveau der StZFP2-Induktion führen. Es könnte auch andere bisher undefinierte systemische Signalkomponenten geben, die zur in der gesamten Pflanzenstudie beobachteten augmentierten Induktion beitragen können. Eine weitere Möglichkeit ist, dass StZFP2-Transkripte vor der 20-min-Erntezeit ihren Höhepunkt erreicht haben könnten. Es ist jedoch klar, dass die beeindruckende Induktion von StZFP5- und StZFP7-Transkripten diese Art von Befallprotokoll relevant macht. Eine weitere Einschränkung der vorliegenden Methode wäre die Unfähigkeit, Wurzelfütterungslarven wie Maiswurzelwurm zu verwenden. Es wäre auch nicht geeignet, wenn ganze Pflanzenkommunikation wie Wurzel-Blatt-Signalisierung35 oder Signalisierung von systemischen Blättern36,37 untersucht wird.
Der Erfolg dieses Protokolls hängt stark von der Qualität und genauen Inszenierung von Larven ab, die im Experiment verwendet werden. Erziehungsfähigkeiten und Grundkenntnisse des M. sexta Verhaltens sind hilfreich, aber nicht kritisch. Die Gewinnung gesunder, entsprechend inszenierter Larven kann jedoch den Fütterungserfolg direkt beeinflussen. Larven treten in eine Ruhephase ein, die jedem Larvenmolt vorausgeht, in dem sie21nicht füttern. Offensichtlich werden solche Larven das Blattgewebe nicht schädigen. Die ideale Zeit, um Larven zu verwenden, ist direkt nach einem Molt. Eine entwicklungsisch inszenierte Kohorte von Insekten eines bestimmten Larvenstadiums wird auch die Reproduzierbarkeit der Genexpression verbessern, da Pflanzen auf jedes Entwicklungsstadium unterschiedlich reagieren können.
Der Zugang zu einem Insektary wäre ideal für die Versorgung mit Larven. M. Sexta-Eier oder Larven können auch aus kommerziellen Quellen38,39 bestellt und auf Diät- oder Pflanzenmaterial auf die entsprechende Stufe aufgezogen werden. Es gibt auch mehrere Online-Tools, die helfen können, jeden instar40,41,42zu identifizieren. Larven, die auf Diät aufgezogen werden, enthalten keine pflanzenspezifischen Bestandteile wie mikrobielle Symbionten, die von Larven erworben wurden, die auf Pflanzen aufgezogen werden43. Genexpressionsprofile können geändert werden, wenn diese Komponenten fehlen. Larven können teilweise oder vollständig auf ihrer Wirtspflanze aufgezogen werden, wenn diese Effekte für die Studie wichtig sind. Das Zurückhalten von Lebensmitteln vor Insekten wenige Stunden vor der Fütterung simoniert experimentend kann auch das Fütterungsverhalten verbessern. Feldgesammelte Larven könnten auch robust und vorteilhaft sein, da sie den richtigen trophischen Werten ausgesetzt waren, aber das fügt eine weitere Variable hinzu, die für alle Studien geeignet sein kann oder nicht.
Auch die Produktion gesunder, insekten- und pestizidfreier Pflanzen ist entscheidend. Pflanzen mit Viren, Insektenschädlingen und Pilzorganismen werden verwirrende Faktoren einführen und eine Herausforderung bei der Beschaffung reproduzierbarer Daten darstellen.
Viele Larven-Insterne, Kartoffelpflanzenalter und Blattgrößen können kombiniert werden, um das Protokoll für eine bestimmte Art von Studie anzupassen. Die Dauer des Befalls und erntezeiten kann ebenfalls angepasst werden. Potenziell könnten viele andere Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Insekten mit abgetrennten Blättern untersucht werden, wenn ganze Pflanzenbeobachtungen als Ausgangsbasis verwendet werden. Der freistehende Blatttest ist eine relevante und wertvolle Alternative zu ganzen Pflanzenkräuterstudien zur Analyse der Genexpression.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Bob Farrar und Alexis Park für die Bereitstellung von Insekten, die in dieser Studie verwendet werden, und für ihre Expertise in der Larveninszenierung. Weiterer Dank an Michael Blackburn und Saikat Ghosh für die kritische Überprüfung des Manuskripts.
Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium.
USDA ist Ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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