Summary
O método apresentado cria tecido vegetal danificado herbívoro natural através da aplicação de larvas de Manduca sexta a folhas destacadas de batata. O tecido vegetal é analisado para a expressão de seis homólogos do fator de transcrição envolvidos em respostas adiantadas ao herbivory do inseto.
Abstract
A natureza multitrófica dos estudos de expressão gênica de insetos herbívoros exige um grande número de repetições biológicas, criando a necessidade de protocolos herbívoros mais simples e simplificados. As perturbações dos insetos mastigatórios são geralmente estudadas em sistemas de plantas inteiras. Embora toda essa estratégia de organismo seja popular, não é necessário que observações semelhantes possam ser replicadas em uma única folha destacada. A suposição é que os elementos básicos exigidos para a transdução de sinal estão atuais dentro da folha própria. No caso de eventos precoces na transdução de sinal, as células precisam apenas receber o sinal da perturbação e transmitir esse sinal para as células vizinhas que são ensaiadas para a expressão gênica.
O método proposto simplesmente muda o tempo do destacamento. Em experimentos de plantas inteiras, as larvas são confinadas a uma única folha que é eventualmente separada da planta e ensaiada para a expressão gênica. Se a ordem da excisão é invertida, do último em estudos inteiros da planta, a primeiramente no estudo destacado, o experimento de alimentação é simplificado.
Solanum tuberosum var. Kennebec é propagado por transferência nodal em um meio de cultura simples do tecido e transferido ao solo para um crescimento mais adicional se desejado. As folhas são excisadas da planta-mãe e relocalizadas para placas de Petri onde o ensaio de alimentação é conduzido com os estágios larvares de M. sexta. O tecido foliar danificado é analisado para a expressão de eventos relativamente precoces na transdução de sinal. A análise da expressão gênica identificou fatores de transcrição Cys2-His2 (C2H2) específicos da infestação, confirmando o sucesso do uso de folhas destacadas em estudos de resposta precoce. O método é mais fácil de executar do que as infestações inteiras da planta e usa menos espaço.
Introduction
Herbívoros define em movimento uma série de eventos moleculares durante os quais uma planta pode identificar o ataque e montar uma resposta adequada para a sua sobrevivência. Uma planta recebe duas pistas básicas de insetos mastigadores; um dos danos físicos ao tecido e o outro a partir de substâncias específicas de insetos. Os padrões moleculares associados a danos (DAMPs) são liberados em resposta a danos criados por bocais larvares e desencadeiam uma resposta de ferida bem definida que resulta em um aumento no ácido jasmonico hormonal e na transcrição dos genes de defesa1. Um dos Damps mais conhecidos é systemin, um polipeptídeo que é formado pela clivagem da proteína prosystemin maior depois que uma folha é ferida2,3. A resposta da ferida do ácido jasmônico é modulada mais por testes padrões moleculars-associados HERBIVORE (hamps), que podem ser derivados da saliva da lagarta, dos índices do intestino (regurgitant) e das fezes (Frass)4. Os insetos usam essas substâncias para impulsionar ou evadir a resposta de defesa5. Os fatores de transcrição então retransmitem a mensagem dos sinais hormonais na resposta de defesa via regulação dos genes de defesa a jusante6,7,8.
Alguns estudos de interação planta-inseto utilizados em configurações laboratoriais são do tipo simulado, com o objetivo de aproximar o método natural de alimentação pelo inseto. A herbívoria simulada é geralmente realizada através da criação de danos artificiais em tecidos vegetais com várias ferramentas que imitam o mecanismo específico de bocais de insetos suficientes para causar a liberação de DAMPs e desencadear a produção de genes de defesa. Outros componentes específicos do inseto, como secreções orais ou regurgitantes, são freqüentemente adicionados para replicar a contribuição de hamps9,10,11. A criação de um tamanho específico e tipo de ferida e a aplicação de quantidades precisas de HAMPs é uma vantagem para estes tipos de estudos e pode oferecer resultados mais reprodutíveis. Estudos herbívoros naturais, onde o dano ao tecido vegetal é realizado pela aplicação de insetos adquiridos em campo ou de laboratório, são muitas vezes mais desafiadores porque as quantidades de tamanho da ferida e do HAMP são governadas pelo comportamento de insetos e adicionam variabilidade ao Dados. Os métodos naturais versus simulados e suas vantagens e desvantagens são bem debatidos na literatura12,13,14.
Para estudar eventos de sinalização precoce, como fatores de transcrição, uma determinada porcentagem da folha deve ser consumida em um período de tempo relativamente curto, de modo que as larvas devem começar a mastigar imediatamente e manter o consumo até que a folha seja congelada para análise. M. sexta é um alimentador voraz em várias plantas solanáceas durante muitos de seus estágios larval, fazendo o ideal para transmitir dano máximo em uma quantidade relativamente curta de tempo15. Isso é conveniente ao estudar eventos de sinalização precoce, pois a resposta da planta ocorre quase que imediatamente após um inseto contata a superfície foliar16,17. O método comumente usado da gaiola do grampo da contenção prova desajeitado, porque as gaiolas múltiplas exigiriam ajustes contínuos durante todo a experimentação para permitir a remoção ou a adição de larvas. As folhas devem igualmente ser grandes bastante e forte bastante suportar os insetos múltiplos que alimentam ao mesmo tempo. Estes tipos de plantas de batata exigem uma grande quantidade de espaço para observar a alimentação. As larvas frequentemente se realocarão para a parte inferior da superfície foliar, o que também torna as observações de alimentação bastante difíceis. Usar plantas inteiras para executar estes experimentos é claramente complicado.
O estudo atual usa folhas destacadas isoladas em placas de Petri um pouco do que plantas inteiras para simplificar e simplificar a aproximação inteira da planta a estudar o herbivory. A aplicação do protocolo neste estudo limita-se à observação de um grupo de C2H2 fatores de transcrição induzidos precocemente em folhas de batata após lesão herbívora por larvas de M. sexta .
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Protocol
Observação: o protocolo a seguir foi projetado para uma pessoa configurar, fazer observações e coletar amostras. Várias execuções da mesma configuração podem ser combinadas para aumentar a replicação biológica. Quaisquer repetições adicionais do experimento devem ser configuradas ao mesmo tempo do dia para eliminar possíveis influências diurnas na expressão gênica. O protocolo é projetado para criar 3 folhas ' infestadas ' para 5 pontos de tempo de colheita separados. As folhas de controle correspondentes para cada ponto de tempo criam um total de 30 amostras. O experimento pode ser realizado com uma variedade de tamanhos foliares e estágios larvares, mas recomenda-se que o tamanho das folhas, o estágio larval e o tempo de infestação sejam consistentes ao longo do procedimento.
1. preparação das plantas de batata
Nota: todas as etapas que necessitam de técnica estéril devem ser realizadas em uma capa de cultura tecidual18,19.
- Prepare mudas de Kennebec de fonte explante.
- Prepare o meio de propagação.
- Adicionar 4,43 g de Murashige e Skoog (MS) com vitaminas em pó, 20 g de sacarose e 2 g de substituto de agar a 1 L de osmose reversa (RO)-água purificada num balão de 2 L com uma barra de centrifugação. Transfira o balão para uma placa de agitação e misture. Ajuste o pH para 5,8 usando NaOH enquanto continua a mexer.
Nota: o agar não se dissolverá até esterilizado. - Adicionar 1 mL de conservante/biocida e autoclave no ciclo líquido durante 20 min (121 ° c, 101,3 kPa). Remova o meio da autoclave imediatamente depois que o ciclo é terminado e esfrie-o a 50 ° c. Transfira 100 mL de meio de propagação estéril e arrefecido para vasos de cultura estéreis (por exemplo, magenta ou Plantcon) usando técnica estéril em uma capa de cultura tecidual.
- Adicionar 4,43 g de Murashige e Skoog (MS) com vitaminas em pó, 20 g de sacarose e 2 g de substituto de agar a 1 L de osmose reversa (RO)-água purificada num balão de 2 L com uma barra de centrifugação. Transfira o balão para uma placa de agitação e misture. Ajuste o pH para 5,8 usando NaOH enquanto continua a mexer.
- Prepare o material explante.
- Obtenha a fonte do explante como batatas de semente de Kennebec e remova todos os traços do solo lavando com torneira H2O. Retire os rebentos e corte em pedaços de 2 cm com um bisturi estéril.
- Esterilizar pedaços de broto por imersão para 15 s em 70% etanol, seguido por 13 min em 1:1 lixívia (1 parte RO-água: 1 parte concentrada germicidal/Bleach grau comercial). Enxague 5 vezes em H2O estéril.
- Transfira o material explante para vasos de cultura de tecidos estéreis com meio de propagação em uma capa de cultura tecidual usando técnica estéril. Transfira embarcações a uma câmara da cultura do tecido de planta e cresça para 2 \ u20123 semanas ou até o formulário das plântulas em 24 ° c, luz de 16 h (140 μmol · m-2· s-1)/8 h Photoperiod escuro.
- Prepare o meio de propagação.
- Prepare plantas nodal-propagadas da batata da cultura do tecido.
- Prepare o meio de transferência nodal.
Nota: isso fará 10 vasos de cultura de tecidos que podem ser usados no mesmo dia ou podem ser feitos antes do tempo e armazenados a 4 ° c até transferência nodal.- Adicionar 36,43 g de mistura de ágar nutriente a 1 L de água purificada em RO num balão de 2 L com uma barra de centrifugação. Transfira o balão para uma placa de agitação e misture. Ajuste o pH para 5,8 usando KOH enquanto continua a mexer.
Nota: o agar não se dissolverá até esterilizado. - Autoclave no ciclo líquido por 20 min (121 ° c, 101,3 kPa). Remova o meio da autoclave imediatamente depois que o ciclo é terminado e esfrie-o a 50 ° c. Transfira 100 mL de meio de transferência nodal de refrigeração estéril para vasos de cultura estéreis (veja a tabela de materiais) usando uma técnica estéril em uma capa de cultura tecidual.
- Adicionar 36,43 g de mistura de ágar nutriente a 1 L de água purificada em RO num balão de 2 L com uma barra de centrifugação. Transfira o balão para uma placa de agitação e misture. Ajuste o pH para 5,8 usando KOH enquanto continua a mexer.
- Prepare estacas nodais.
- Obter as plântulas de Kennebec cultivadas a partir de material explante (produzido no passo 1.1.2). As plântulas devem ter pelo menos 3 a 4 nós (pontos de ramificação). Retire as folhas usando tesouras estéreis ou bisturi. Corte ramos perto da haste principal, deixando cerca de 2 mm de tecido de ramo.
- Remova seções nodais do tronco cortando aproximadamente 2 mm acima e abaixo de cada ponto ou nó de ramificação. Organize estacas nodais em uma embarcação estéril da cultura do tecido que contem o meio de transferência nodal (produzido na etapa 1.2.1.2) na mesma orientação que na embarcação precedente (filial que aponta acima).
- Transfira embarcações com estacas nodal a uma câmara da cultura do tecido de planta e cresça para 2 \ u20123 semanas em 24 ° c, luz de 16 h (140 μmol · m-2· s-1)/8 h fotoperíodo escuro.
Nota: cada corte nodal crescerá em um novo plantlet. O número de estacas em cada embarcação determina o tamanho da folha. Menos estacas transferidas por embarcação resultará em folhas maiores. Três plantas por navio terá 15 mm x 20 mm folhas em 2 \ u20123 semanas.
- Prepare o meio de transferência nodal.
- Opcional Prepare plantas de batata de Kennebec cultivadas no solo.
Nota: para produzir folhas maiores, as plântulas de batata propagadas nodal podem ser transferidas para o solo.- Transfira plântulas da batata crescidos no meio de transferência nodal ao solo puxando delicadamente a planta do meio até que todo o tecido da raiz esteja liberado do ágar.
- Transfira para o solo logo acima do 1º nó das raízes e embale levemente o solo ao redor do transplante. Molhe delicadamente para assegurar o contato do solo com o sistema da raiz.
- Coloque em uma câmara de crescimento com 16 h de luz (140 μmol · m-2· s-1)/8 h fotoperíodo escuro e 25/20 ° c temperatura dia/noite.
Nota: as plantas estão prontas quando as duas folhas totalmente expandidas atingiram o tamanho apropriado para o ensaio.
- Opcional Prepare plantas de batata cultivadas com tubérculos.
Nota: as plantas de batata cultivadas a partir de tubérculos são maiores e mais robustas e podem ser úteis se a criação de larvas em plantas ou se a alimentação larval durante a noite é desejada.- Coloque um tubérculo de batata 6 em profundidade em um 10 em pote contendo mistura de solo suplementado com 10 mL de fertilizante de liberação lenta peletizada.
- Coloque em uma câmara de crescimento com 16 h de luz (140 μmol · m-2· s-1)/8 h fotoperíodo escuro e 25/20 ° c temperatura dia/noite. As plantas estão prontas aproximadamente 30 \ u201240 dias do tubérculo que plantam.
Nota: não use plantas que começaram a florescer.
2. preparação de insetos para alimentação
- Obter o estágio larval desejado de M. sexta.
Nota: larvas para este estudo foram criadas em dieta artificial através do 5º instar20 e encenadas por um indivíduo experiente do insectário em casa. As larvas também podem ser criadas parcialmente ou completamente no tecido vegetal. As larvas não comem imediatamente antes de um Molt e são mais prováveis comer logo após o Molt, assim que a encenação apropriada é21importante. - Transfira larvas para um recipiente de contenção apropriado (por exemplo, 6-, 12-, prato de cultura de tecido de 24 poços), dependendo do tamanho da larva. Deve haver uma larva por poço no prato.
Nota: as larvas podem exibir comportamento territorial ou canibalístico sem uma fonte de alimento e podem ficar feridas se abrigadas juntas. - Opcional Larvas de fome para até 2 h, pois isso pode melhorar a alimentação larval.
Nota: as larvas devem estar em um recipiente de contenção armazenado na câmara de crescimento durante este tempo.
3. configuração de componentes para o experimento de infestação
Observação: consulte o resumo esquemático na Figura 1.
- Faça modelos de posicionamento para cada ponto de tempo de colheita.
Nota: é útil configurar 5 bandejas diferentes para cada ponto de tempo de colheita. Isto mantem amostras organizadas e permite que os pratos sejam movidos ao redor mais eficientemente como um jogo sem mudar seu arranjo. Se os cálculos de porcentagem de dano forem realizados, isso é essencial, pois as imagens antes e depois da infestação devem ser capturadas com a mesma distância focal.- Obtenha 5 bandejas resistentes capazes de prender um jogo de seis pratos de Petri apropriadamente feitos medida e alinham com o livro branco.
Nota: o tamanho do prato de Petri é baseado no tamanho da folha escolhido para o ensaio de alimentação. A folha deve caber facilmente no prato sem tocar os lados. Por exemplo, um prato de 60 mm x 15 mm é adequado para folhas de até 50 mm de comprimento ou largura. - Trace um conjunto de seis círculos usando o prato de Petri apropriadamente dimensionado no papel em cada bandeja. Rotule um conjunto de círculos ' controle ' A, B e C e os outros ' infestados ' A, B e C. Também rotule cada modelo de posicionamento com o tempo de colheita apropriado.
- Obtenha 5 bandejas resistentes capazes de prender um jogo de seis pratos de Petri apropriadamente feitos medida e alinham com o livro branco.
- Opcional Configurar uma câmera para ' antes da infestação ' e ' após a infestação ' captura de imagem.
- Fixe uma câmera em um suporte na distância focal apropriada para captura de imagem de todos os pratos de Petri no modelo de posicionamento.
- Rotule os tubos de ponto de tempo de colheita.
- Rotule um conjunto de 30, 1,7 mL de tubos de microcentrífuga correspondentes a cada círculo no modelo de posicionamento. Rotule os tubos para identificar adequadamente a perturbação (controle/infestada), a letra de replicação da planta (a, B ou C) e o ponto de tempo de colheita (número de minutos após o período de infestação).
- Prepare os pratos de Petri escolhidos na etapa 3.1.1.
- Coloque um disco de papel de filtro estéril em cada um dos 30 pratos de Petri do passo 3.1.1. Adicione água estéril para umedecer os discos; Não permitir que o excesso de água para a piscina no prato. Coloque cada prato em cada um dos seis círculos em cada modelo de posicionamento.
- Posicione três plantas de batata ao lado de cada modelo de colocação. Assegure-se de que as plantas estejam toda a mesma idade e tamanho relativo.
4. realizando a infestação
Nota: um modelo de ponto/colocação de tempo de colheita é configurado de cada vez.
- Retire as duas folhas de cada planta com uma tesoura estéril e coloque uma folha no prato de Petri de controle e uma na placa de Petri infestada para cada planta (A, B e C). Realize este processo o mais rápido possível.
- Opcional Transfira o modelo de posicionamento para o suporte da câmera para capturar uma imagem "antes da infestação".
- Transfira as larvas para cada prato infestado usando o fórceps macio do toque o mais rapidamente possível. Ajuste o temporizador para o tempo desejado da "infestação".
Nota: o período de tempo em que as larvas estão consumindo o tecido foliar é o "tempo de infestação". Isso é algo que pode ser determinado empiricamente usando algumas folhas/larvas de teste antes do início da infestação real. O ' tempo de infestação ' escolhido deve ser consistente para todas as folhas infestadas.
Nota: as larvas devem ser tratadas com cuidado por pinça de toque suave. 2º a 4º instar pode ser agarrado suavemente pelo seu chifre ou midsection. - Observe a alimentação para certificar-se de todas as larvas estão comendo. As larvas devem ser adicionadas/removidas com base no comportamento alimentar. Mantenha as tampas nos pratos de Petri tanto quanto possível.
Nota: larvas múltiplas podem ser usadas por folha. - Retire as larvas das folhas no final do tempo de infestação. Inicie o temporizador para o tempo de colheita.
- Opcional Transfira o modelo de posicionamento para o suporte da câmera para capturar a imagem "após a infestação".
Nota: todas as seis folhas no modelo de colocação são colhidas no tempo de colheita específico.
5. colheita de folhas
- Transfira cada folha para o tubo rotulado correspondente no final de cada ponto de tempo de colheita e congelar imediatamente, soltando o tubo no líquido N2. Armazene o tecido vegetal colhido a-80 ° c até o isolamento do RNA.
- Repita as etapas 4 \ u 20125.1 para cada ponto de tempo de colheita.
6. processamento de tecido foliar para análise da expressão gênica
- Moer o tecido da folha congelada para um pó com um micropilão.
- Isole o RNA e o processo totais para a expressão de gene como descrito previamente22.
7. (opcional) estimativa de danos foliares
- Estimar visualmente por cento do dano foliar ou calcular a área foliar nas imagens antes e depois da infestação.
- Medir a área foliar com ferramentas de software (por exemplo, Phenophyte)23.
- A partir das medições da área foliar, calcule a percentagem de danos
% Damage = [(área foliar antes – área foliar depois)/área da folha antes] x 100.
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Representative Results
O consumo foliar define o sucesso do protocolo. As larvas saudáveis, encenadas exatamente devem começar a alimentar imediatamente depois que a colocação na superfície da folha e a alimentação devem continuar em uma maneira razoavelmente consistente durante todo o tempo da infestação. No vídeo 1, a larva no topo começa a mastigar imediatamente após a colocação e mantém uma taxa consistente durante a alimentação. Isto é especialmente importante se ensaio eventos precoces da expressão gênica após a infestação. A larva na parte inferior não consumi qualquer material foliar e é um exemplo de uma infestação malsucedida.
As aproximações visuais durante o consumo de folhas são monitoradas para garantir dano suficiente é produzida. A quantidade de material foliar consumido pode ser calculada como a porcentagem de dano usando imagens de folhas antes e após a infestação. A Figura 2 ilustra as taxas variáveis de consumo por diferentes estágios de desenvolvimento de larvas de M. sexta em diferentes tipos de plantas de batata. As folhas na Figura 2a foram separadas das plantas nodal-propagadas 2 week-old da cultura do tecido. Todas as folhas nesta figura são do mesmo tamanho, mas foram submetidas a infestação por diferentes estágios de larvas por 5 min. Figura 2a: I-IV, vídeo 2, vídeo 3, vídeo 4e vídeo 5 ilustram as diferentes taxas de consumo e estilos de alimentação para cada fase larval de uma porção da infestação. Isso é útil para determinar quanto dano é possível usando cada combinação de folha e fase larval e ilustra a natureza voraz das larvas mais velhas. O uso de larvas do 1º ínstar não é recomendado, pois suas mandíbulas não são suficientemente desenvolvidas para produzir dano na janela de infestação de 5 min. É importante notar que mais jovens folhas mais macias derivadas de plantas cultivadas com cultura de tecido são muitas vezes mais palatáveis para as larvas. Com base nesses resultados, foram escolhidas 4 larvas de ínstar para avaliar ainda mais o dano às folhas de plantas de batata mais maduras, cultivadas no solo. As plantas cultivadas do solo aproximam mais pròxima aquelas adquiridas no campo. A Figura 2b ilustra o intervalo de dano quando as larvas de 3º e 4º ínstar foram aplicadas em folhas separadas de plantas de batata cultivadas no solo. As plantas propagadas nodal de duas semanas de idade foram transplantadas para o solo e cultivadas por um adicional de 3 semana. As folhas danificadas das plantas cultivadas no solo caíram em três grupos; 15-20%, 20-30% e 30-40%. As três folhas em cada grupo são mostradas para representar os diferentes níveis de dano para cada intervalo. As folhas de plantas cultivadas mais maduras do solo necessitaram de mais larvas aplicadas e um tempo de infestação mais longo para atingir o mesmo nível de dano observado nas folhas de plantas mais jovens propagadas nodal. Estes resultados ilustram a escala dos resultados possíveis do herbivoria bem sucedido dos tipos diferentes de plantas.
Depois que herbivoria bem sucedido é completo e o dano dos por cento é avaliado, o tecido da folha é analisado para a expressão de Gene. Os resultados da expressão gênica devem indicar uma indução robusta ou repressão de transcrições envolvidas na resposta à infestação. A Figura 3 ilustra os perfis de expressão gênica de seis fatores de transcrição C2H2 de um experimento herbívory bem-sucedido em folhas destacadas. C2H2 dedo de zinco StZFP2 foi induzido por M. sexta herbivoria em batata em estudos de plantas inteiras anteriores24. Embora StZFP2 tenha sido induzido por herbívoria no ensaio foliar destacado, a infestação não foi significante quando comparada ao efeito do próprio descolamento. Entretanto, dois outros homologs StZFP2 , StZFP5 e StZFP7, foram induzidos significativamente em 40 e em 80 minutos após o herbivoria quando comparados aos controles destacados. StLOX3 e StMYC2 são genes do marcador induzidos pelo ferimento e pelo herbivoria e indicam a participação de caminhos de defesa regulados ácido jasmônico. O objetivo deste estudo particular foi identificar fatores de transcrição responsivos à infestação entre um painel de genes candidatos. A identificação de dois fatores de transcrição do dedo de zinco C2H2 que são robustamente responsivos ao M. sexta herbivoria suporta o uso de folhas destacadas para ensaios de infestação.
Figura 1: fluxograma para o protocolo de infestação. Representação esquemática das etapas incluídas no fluxo de trabalho experimental da seção de infestação do protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: dano foliar causado por larvas de M. sexta . (A) percentagem de dano à cultura tecidual deixa em cada fase larval mais de 5 min. algarismos romanos I-IV referem-se a vídeos 2-5 respectivamente que mostram cada instar alimentação na folha retratada. (B) intervalo de dano às folhas cultivadas no solo por 4º instar mais de 20 min. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise da expressão gênica das folhas. A análise quantitativa em tempo real da reacção em cadeia do polymerase (RT-qPCR) da expressão de gene de fatores da transcrição do dedo do zinco C2H2 é mostrada. O nível médio do transcrito é, 2− ΔCt com (ΔCt = CT do gene do teste-CT do gene exógeno do controle). As folhas de controle extirpada em (azul) e as folhas infestadas extirpada em (vermelho) são mostradas em cada ponto de tempo. Cada valor é a média de três repetições biológicas. A ANOVA de três vias foi realizada nos valores de ΔCt. Diferenças significativas nas folhas de controle ao longo do tempo são indicadas com letras maiúsculas. As diferenças significativas nas folhas infestadas ao longo do tempo são indicadas em letras minúsculas. Diferenças significativas entre o controle e as folhas infestadas no mesmo ponto de tempo é mostrada com um asterisco (*). Os valores de RP > F foram inferiores a 0, 1, com exceção do tratamento StZFP6 com 0, 86. As barras de erro representam o desvio padrão. Os números de adesão do NCBI são: StLOX3-X 96406.1, StZFP2-MK809525, StZFP4-CV 500970.1, StZFP6-DN 587601.1, StZFP7-DN 590005.1. Spud DB adesão números de < http://Solanaceae.plantbiology.msu.edu > são StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3-PGSC0003DMT400040144, StZFP5-PGSC0003DMT400040141. Este número foi modificado de22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: videoclipe de alimentação larval. Segundo instar M. sexta larvas que alimentam (parte superior) e que não alimentam (parte inferior) em uma folha da planta de batata adulta velha da cultura do tecido de duas semanas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo 2: Figura 2a clipe de vídeo (I) de alimentação larval. Segunda larva do instar M. sexta que alimenta em uma folha da planta de batata adulta velha da cultura do tecido de duas semanas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo 3: Figura 2a clipe de vídeo (II) de alimentação larval. Terceiro instar M. sexta larva que alimenta em uma folha da planta de batata adulta velha da cultura do tecido de duas semanas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo 4: Figura 2a clipe de vídeo (III) de alimentação larval. Quarto instar M. sexta larva que alimenta em uma folha da planta de batata adulta velha da cultura do tecido de duas semanas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo 5: Figura 2a clipe de vídeo (IV) de alimentação larval. Quinto instar M. sexta larva que alimenta em uma folha da planta de batata adulta velha da cultura do tecido de duas semanas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
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Discussion
O uso de metodologias herbívórias de plantas inteiras existentes é desnecessário para atingir o objetivo deste estudo em particular (ou seja, um conjunto de genes candidatos para sua resposta à infestação). O benefício óbvio do refinamento desanexado da folha é encurtar o tempo que toma para executar ensaios herbivoria. A natureza pesado de plantas inteiras com gaiolas do grampo é eliminada e os ensaios são executados mais logo, desde que as plantas tão novas quanto 2 semanas podem ser usadas para colher folhas. Igualmente exige uma pegada muito menor durante a alimentação e menos espaço da câmara do crescimento; importantes quando esses recursos são limitados.
A limitação deste ensaio, a saber descolamento, é encontrada quando a expressão da defesa-gene é ensaiada. O próprio descolamento provoca uma resposta da ferida e, portanto, é importante avaliar o efeito que o descolamento tem sobre os níveis basais da expressão do gene da defesa. Em um estudo envolvendo herbívoros simulados, os níveis de transcrição de um bem conhecido inibidor da protease do gene da defesa II(PIN2) foram inesperadamente elevados nas folhas de controle de folhas de batata destacadas provavelmente devido a "ferimento causado durante a coleta da folha" 25. Entretanto, a aplicação do regurgitante do inseto de M. sexta melhorou extremamente níveis da expressão do gene PIN2 . Isso ilustra a necessidade de usar controles para provocar o efeito do descolamento da resposta de infestação.
Os ensaios foliares destacados são frequentemente realizados para economizar tempo, espaço e recursos. Eles têm sido utilizados na triagem para resistência a doenças fúngicas em trigo26,27, e resistência a insetos em soja28 e grão-de-bico29. O ensaio é amplamente aceito no estudo do patógeno que provoca a Blight tardia em batata30,31. Um estudo recente constatou que os ensaios foliares destacados foram equivalentes a ensaios de plantas inteiras na determinação da resistência à Blight tardia no campo32.
A evidência escassa existe na literatura, entretanto, para o uso de folhas destacadas ao ensaio para a expressão da defesa-Gene. Um estudo perfilou seis genes da defesa em resposta à infestação do ácaro-aranha do feijão de lima destacado33. As folhas também produziram voláteis que induziram respostas de defesa em folhas não infestadas próximas, uma estratégia bem conhecida de expressão de defesa-gene nas plantas34. A nosso conhecimento, nenhum estudo herbivoria do inseto de mastigação até agora utiliza folhas destacadas ao ensaio para a expressão de Gene.
A infestação previamente definida responsiva C2H2 dedo do zinco, StZFP2 não foi induzida significativamente pela infestação no ensaio destacado atual da folha. Além da diferença óbvia de planta inteira versus folhas destacadas, o estudo anterior utilizou um tipo contínuo de infestação em que o tecido vegetal foi analisado para expressão gênica imediatamente após a remoção das larvas24. Isso é diferente do tipo de infestação descontínua utilizado no presente estudo, onde a remoção larval foi seguida por um período de repouso antes da colheita foliar. Durante este período de recuperação, os níveis de StZFP2 diminuem rapidamente e podem resultar em um nível mais baixo de indução de StZFP2 . Também pode haver outros componentes de sinalização sistêmica indefinidos assim distantes que possam contribuir para a indução aumentada observada em todo o estudo da planta. Outra possibilidade é que StZFP2 transcrições poderia ter atingido antes do tempo de colheita 20 min. É desobstruído, entretanto, que a indução impressive de transcritos StZFP5 e StZFP7 faz este tipo de protocolo da infestação relevante. Outra limitação do presente método seria a incapacidade de usar larvas de alimentação de raízes, como o rootworm de milho. Também não seria adequado quando toda a comunicação vegetal, como a raiz para a sinalização foliar35 ou sinalização de folhas sistêmicas36,37 está sendo estudada.
O sucesso deste protocolo depende fortemente da qualidade e do estadiamento exato da larva usada no experimento. As habilidades de criação e o conhecimento básico do comportamento de M. sexta são úteis, mas não críticas. No entanto, a obtenção de larvas saudáveis e adequadamente encenadas pode afetar diretamente o sucesso alimentar. As larvas entram em um período quiescente que precede cada larval durante o qual não alimentam21. Claramente, tais larvas não danificam o tecido foliar. O momento ideal para usar larvas é logo após um Molt. Uma coorte desenvolvida em estágios de insetos de um estágio larval particular também melhorará a reprodutibilidade da expressão gênica, pois as plantas podem responder diferentemente a cada estágio de desenvolvimento.
O acesso a um insetário seria ideal para o fornecimento de larvas. M. sexta ovos ou larvas também podem ser encomendados a partir de fontes comerciais38,39 e criados em dieta ou material vegetal para o estágio adequado. Há também várias ferramentas on-line que podem ajudar a identificar cada instar40,41,42. As larvas criadas na dieta não contêm componentes específicos de plantas, como simontes microbianos adquiridos por larvas criadas em plantas43. Os perfis de expressão gênica podem ser alterados se esses componentes estiverem ausentes. As larvas podem ser parcialmente ou completamente criadas em sua planta hospedeira se esses efeitos forem importantes para o estudo. Reter alimentos de insetos algumas horas antes de experimentos de alimentação também pode melhorar o comportamento de alimentação. As larvas coletadas em campo também podem ser robustas e vantajosas, pois foram expostas a níveis tróficos adequados, mas isso acrescenta outra variável que pode ou não ser adequada para todos os estudos.
A produção de plantas saudáveis, inseto-e insecticidas-livres é igualmente crítica. Plantas com vírus, pragas de insetos e organismos fúngicos introduzirão fatores de confundimento e apresentarão um desafio na obtenção de dados reprodutíveis.
Muitos ínstares larvais, as idades das plantas de batata e os tamanhos das folhas podem ser combinados para personalizar o protocolo para um tipo específico de estudo. O comprimento da infestação e os tempos de colheita também podem ser ajustados. Potencialmente, muitas outras interações planta-inseto poderiam ser estudadas usando folhas destacadas se as observações inteiras da planta são usadas como uma linha de base. O ensaio de folha destacado é uma alternativa relevante e valiosa para estudos herbívoros de plantas inteiras para analisar a expressão gênica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Bob Farrar e Alexis Park por fornecer insetos usados neste estudo e por sua expertise em estadiamento larval. Agradecimentos adicionais a Michael Blackburn e Saikat Ghosh para a revisão crítica do manuscrito.
Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é unicamente para fins de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura dos EUA.
USDA é um provedor de oportunidades iguais e empregador.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
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