Summary
이 프로토콜 운동 동작 및 멕시코 cavefish 수 면 측정 방법을 자세히 설명 합니다. 이전 분석은 사회적으로 지 내게 물고기에 이러한 행동을 측정 하기 위해 확장 됩니다. 이 시스템은 수 면과 다른 물고기 종에 있는 활동 연구에 널리 적용할 수 있습니다.
Abstract
문의 전체 수 면 매우 보존된 행동 특성 포함 된 높은 흥분을 일으키는 임계값, 수 면 부족, 다음 반 등 기간 행동 부동의 통합 특징 이다. 멕시코 cavefish Astyanax mexicanus (A. mexicanus), 는 섭 동 환경에 대 한 응답 특성이 진화를 공부에 대 한 모델입니다. A. mexicanus 는 눈된 표면 주거 형태와 강력한 형태학과 행동의 차이 여러 장 님 동굴 주거 인구 존재 한다. 수 면 손실을 여러, 독립적으로 진화 cavefish 인구에서 발생 했습니다. 이 프로토콜 수 면과 표면 생선과 A. mexicanus 동굴에서 운동 활동을 측정 하는 방법론을 설명 합니다. 비용 효율적인 비디오 모니터링 시스템 1 주일 이상 기간에 대 한 개별적으로 보관 되어 애벌레 또는 성인 물고기의 행동 이미징 할 수 있습니다. 물고기 세 일 성인 기 통해 게시물 수정 시스템을 적용할 수 있습니다. 접근도 단일 분야에서 여러 물고기를 기록 하 여 수 면에 사회적 상호 작용의 효과 측정 하기 위한 적응 될 수 있다. 행동 기록, 다음 데이터 분석 사용 하 여 자동으로 소프트웨어를 추적 하 고 수 면 분석 기간, 가릴 길이 및 시 합 수를 포함 하 여 여러 수 면 변수를 계량 하는 사용자 지정된 스크립트를 사용 하 여 처리 됩니다. 이 시스템은 측정 자, circadian 동작 및 거의 모든 어 종 zebrafish, sticklebacks 등에서 운동 활동에 적용할 수 있습니다.
Introduction
수 면이 높은 생리 기능과 행동 수준1,2,3에 동물의 왕국에 걸쳐 보존 됩니다. 일반적으로 포유류 실험실 동물 수 면 심장학을 사용 하 여 평가, electrophysiological 녹음은 작은 유전자 의무가 모델 시스템에서 덜 실용적 고 따라서 수 면은 일반적으로 측정 동작3 에 따라 , 4. 수 면과 관련 된 행동 특성 높은 동물의 왕국에 걸쳐 보존 및 증가 자극 임계값, 자극, 그리고 장시간된 행동 정지5가역을 포함. 이러한 조치는 인간6선 충 벌레 C. 선 충에서 배열 하는 동물에 잠의 특성을 사용할 수 있습니다.
수 면 하 행동 정지를 사용 하 여 자동화 된 추적 소프트웨어를 필요 합니다. 추적 소프트웨어, 활동과 부동의 기간 일 수를 통해 결정 하 고 비활동의 장기간7,8수 면으로 분류 됩니다. 최근 몇 년 동안, 여러 추적 시스템 개발 되었으며, 다양 한 작은 유전자 의무가 모델 시스템 중 활동 데이터 획득 웜, 과일 파리와 물고기9,,1011를 포함 하 여. 이 프로그램 프리웨어 오픈 소스와 상용 소프트웨어7,12,13,14 포함 하 여 동물의 행동의 자동화 된 추적에 대 한 수 있는 소프트웨어와 함께 제공 됩니다. . 이러한 시스템과 효율적인 검사 및 수 면 고기 수많은 유전자 amendable 모델의 특성에 대 한 허용 그들의 유연성에 다.
Zebrafish, Danio rerio, 수 면의 유전자 조사 수많은 유전자와 잠15,16을 조절 하는 신경 회로의 식별을 주도하 고 있다. 이 척추 동물 실험실 동물에 잠의 신경 기초 조사를 위한 강력한 시스템 훨씬 덜 이며 수 면 진화 하는 방법에 대 한 알려진 어떻게 자연 제공 하는 동안 유사 규제 자에 기여 한다. 멕시코 cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), 수 면, 운동 활동 및 circadian 리듬17,18에 극적인 차이 진화 했다. 이 물고기는 멕시코와 남부 텍사스와 적어도 29의 강에 서식 하는 눈된 표면 물고기 동굴 북동 멕시코19,,2021의 시에라 델 Abra 지역의 인구 존재 합니다. 놀랍게도, 수 면 손실을를 포함 하 여 많은 행동 차이 등장 하지 독립적으로 여러 cavefish 인구14,22에 나타납니다. 따라서, cavefish 수 면, circadian, 그리고 사회적 행동의 수렴 진화를 조사에 대 한 모델을 제공 합니다.
이 프로토콜 수 면 및 A에서 운동 동작 측정을 위한 시스템을 설명 합니다. mexicanus 애벌레 고 어른입니다. 맞춤식 적외선 기반의 녹음 시스템 빛과 어두운 조건 하에서 동물의 비디오 녹화에 대 한 수 있습니다. 상용 소프트웨어를 사용 하 여 활동을 측정 하 고 사용자 정의 매크로 비활성의 여러 측면을 측정 하 고 수 면의 기간을 결정 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 또한 수 면과 사회적 행동 간의 상호 작용을 검사 하는 기능을 제공 하는 탱크 내의 여러 동물의 활동을 추적 하기 위한 실험 수정을 설명 합니다. 이러한 시스템은 측정 자, circadian 동작 및 추가 어 종 zebrafish, sticklebacks 등에서 운동 활동에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 애벌레와 성인 행동 추적을 위한 시스템을 설정 합니다.
1. 애벌레에 대 한 수 면 시스템 구축
참고: 적외선 (IR) 조명, 아크릴 IR 빛 확산 기를 포함 하 여 장비의 여러 조각을 자동 빛 추적 30 dpf A. mexicanus 통해 청소년 물고기 세 일 게시물 수정 (dpf)를 통해 애벌레에 대 한 모니터링 시스템 필요 컨트롤 (타이머), 컴퓨터, 카메라, 및 배선 및 전원 컨트롤러 (그림 1A) 등 보조 재료 다음 지침에 따라 정확 하 게 수 면에 애벌레 circadian 리듬 공부 하 고 운동 동작을 추적 하는 시스템을 구축 하는 방법을 알려드립니다 A. mexicanus.
- IR 및 백색 발광 다이오드 (LED)로 구성 된 조명 시스템 구축: 30.5 c m x 30.5 c m 얇은 금속 플랫폼 방열판에 각각 삼각형 약 7.62 c m에서 3 개의 IR 빛을 배치. 전기 철사 시리즈에서 조명 와이어 그리고 전원에 연결 합니다.
- 3 IR 빛의 센터에서 단일 백색 광 LED를 놓고 전원에 연결 합니다.
- LED 가벼운 타이머를 표준 circadian 시간 설정에 대 한 전원 공급 장치를 연결 합니다.
- 애벌레 추적 시스템을 위한 플랫폼을 구성 합니다. 0.33 c m 두께 흰색 기호 아크릴을 사용 하 여 모든 플랫폼의 구성 요소에 대 한.
- 행동 추적 중는 경기장에 있는 것입니다 물고기를 포함 하는 조명된 평방 방열판 위에 기록 플랫폼을 놓습니다.
-
두 번째 아크릴 조명과 최적의 조명 및 대비 IR 확산 동물 사이 상자 안에 놓습니다.
참고: 애벌레 라이트 박스에 대 한 치수는 다음과 같습니다: 두 18 cm x 8.5 cm 및 2 개의 17 cm x 8.5 c m Led는 화학적 형태는 18 cm x 18 cm에 함께 보 세 광장 즉 8.5 c m 높이. 또한, 아크릴 컷 또는 사용자 지정된 크기 조정에 대 한 적절 한 도구를 사용 하 여 드릴에 쉽게 있을 수 있습니다.- 전체 애벌레 추적 단계와 동봉 된 플라스틱 튜브, 내 조명 설치 놓고 튜브 위에 카메라를 위치 합니다.
참고: 그것은이 추적 정확도 손상 것으로 추적 비디오에 나타나지 않도록 조명 반사를 유지 하는 것이 중요입니다. 플랫폼을 둘러싸는 튜브 위에 카메라의 배치 조명과이 실험에 사용 되는 카메라에 대 한 선명도 향상 시킵니다.
- 전체 애벌레 추적 단계와 동봉 된 플라스틱 튜브, 내 조명 설치 놓고 튜브 위에 카메라를 위치 합니다.
- 웹캠을 조작 ( 재료의 표참조) IR 기반 녹음. 회전 도구를 사용 하 여 제조 업체 렌즈 제거 ( 재료의 표참조).
- 내부 틀을 제거 하려면 카메라의 뒷면 양쪽에 작은 은색 나사를 제거 합니다.
- 카메라 렌즈의 나머지를 풀고 몸 안에 작은 검정색 나사를 제거 합니다. 작은 드라이버를 사용 하 여 렌즈를 절단 후 남아 있는 렌즈의 어떤 부분을 제거.
- 제거는 블루 LED는 충전의 상단 부분에 결합 장치 (CCD) 주택.
- 그것의 원래 방향으로 다시 내 면 주택 배치 및 그들의 원래 위치로 다시 두 개의 은색 나사를 속이 고 다시 카메라를 함께 넣어.
- 경로 사용 하 여 작은 카메라의 내부는 둥근된 플라스틱 라우팅 비트에 맞게 보았다. 여분의 플라스틱 렌즈 어댑터 들어갈 수 때까지 아래로 부드러운.
- 카메라와 직접 접촉 하지 않고 가능한 CCD에 가까운 카메라 안에 IR-패스 필터를 설치 합니다.
참고: 알아서 하지 하우징 내에서 카메라의 CCD 칩 손상. 절단 가능한 수준 유지 해야 합니다. IR 필터의 외부와 필터링 없이 CCD에 도달에서 빛을 계속 카메라의 본문 사이 모든 열린 공간을 봉인. - 35mm 고정 렌즈에 카메라를 연결할 ( 재료의 표참조) 렌즈의 뒷면에 카메라의 전면 어댑터를 속이 고 여.
- 카메라와 렌즈 무대 및 조명 튜브 위에 뚜껑으로 교 련된 구멍에 놓고 동물에서 기록 될 것입니다 컴퓨터에 USB를 연결 합니다.
참고: 주식 물고기 행동 녹음 하는 동안 최소한의 중단을 보장 하기 위해 보관은 별개 행동 방에 물고기를 놓습니다. 온도 환기는 행동 실험을 혼동 수 있는 동요를 최소화 하기 위해 주의.
2. 성인을 위한 시스템 자
- 약 46 cm 간격으로 IR 스트립을 절단 하 여 성인 물고기를 추적 하기 위한 적외선 조명 시스템을 구성 합니다. 1 46 cm 스트립은 각 10 L 동작 탱크에 대 한 충분 합니다.
- 각 스트립 DC 전기 와이어를 납땜 일련에 함께 각 스트립 와이어 그리고 9 V 전원에 연결 합니다.
- 각 IR 스트립 알루미늄 열 싱크 역할의 51 cm x 5.1 c m 조각에 연결 합니다.
- 46 cm x 5 cm, 0.32 cm 두께 9% 빛 통과 흰색 기호 아크릴 시트 IR 확산 각 IR 빛 스트립 앞 직접 빛 장소.
- 랙 IR 조명 후면 마운트를 지 원하는 모든 탱크를 배치 합니다.
- 10 L 유리 탱크의 불투명 플라스틱 분배기를 사용 하 여 개별 경기장을 만들.
참고: 경기장 크기 사용 분할자의 수와 탱크의 크기에 따라 다양 한 수 있습니다. 경기장 크기 운동 활동 및 동굴에 표면 물고기23수 면에 미치는 영향. - 카메라 탱크에서 약 4-6 m를 탑재 합니다. 각 카메라 수 있습니다 추적에 대 한 충분 한 해상도 제공 하기 위해 한 번에 3 탱크에서 일반적으로 기록 된다.
참고: 성인 행동 녹음은 일반적으로 하루 밤 변화를 제어 하는 별도 흰색 조명 시스템을 필요 하지 않습니다. 단순히 타이머에 연결 하는 행동 방에 표준 오버 헤드 조명 활용 충분할 것입니다.
3. 녹화 운동 활동
참고: 모든 행동 기록 백업 배터리 소스와 표준 노트북 컴퓨터 또는 데스크탑을 사용 하 여 만들어집니다. 24 h (60-100 기가바이트) 녹음 큰 파일 크기 때문에 외장 하드 드라이브에 모든 녹음을 저장 합니다.
- 물고기 4-30 세 dpf 녹음을 시작 하기 전에 18-24 h에 대 한 적응 처음 배치 녹음 실에서 녹음을 시작 하기 전에 1 시간 때 라이브 소금물 새우 애벌레 물고기를 먹이. 적응 성인 물고기 기록 동작 하기 전에 4-5 일 하 고 일단 매일 찌 질 음식 또는 라이브 blackworms 피드.
참고: 반드시 기록, 전에 민물에서 애벌레 물고기를 배치로 남은 소금물 새우는 나중에 분석 하는 동안 추적 문제를 일으킬 것입니다. 그들의 소형 추적 방해 하지 않습니다 rotifers와 공동 경작 한 대체 옵션을 제공 합니다. - 장소 물고기 24-잘 조직 문화 접시에 4-6 dpf 세. 집 물고기 기록에 대 한 12 음 조직 문화 접시에 20-30 dpf 세.
- 10 L 탱크에 기록 성인 5 개별적으로 지 내게 물고기에 맞게 분배자 또는 기록 수 면과 사회 환경에서 활동 하는 분배자 없이 잘 맞습니다.
참고: 추적 정확도 극대화 하기 위해 녹음을 시작 하기 전에 카메라를 집중 하는 것을 주의. 카메라 렌즈의 조리개를 열지 마십시오 너무 멀리, 이미지의 선명도 대폭 줄어들 것입니다. 그러나 균형, 있다; 조리개를 너무 멀리 닫힌 경우 비디오의 프레임 속도 15.00 fps 아래 떨어질 것 이다. 프레임 속도 일부 사용자 작성 수 면 스크립트23,24와 함께 사용 하기 위해 s 당 15.00 프레임 남아 나중에 분석을 위해 필수적 이다. - 배경 조명과 조명/밝기를 설정 합니다.
- 녹음의 시작에 앞서 조명 최적화. 항상 가능한 가장 높은 수준에서 대비를 유지 하 고 동물 들이 가장 명확한 때까지 밝기를 조정 하려면 밝기 및 배경 조명 사용.
- 24 또는 48 h에 대 한 기록 물고기입니다.
참고: 정전 시 비상 백업 배터리 팩을 모든 조명, 컴퓨터, 및 카메라 구입할 수 있습니다. 모든 배터리 팩 한다 또한에 연결 비상 전원 콘센트, 가능한 경우. 배터리 팩 일반적으로 하지 시간 보다 몇 분에 대 한 장비를 대부분 전원 되며 다리 사이 지는 주 전원 및 비상 전원 시스템에 전송 하는 역할.
4. 개별적으로 보관 되어 물고기를 사용 하 여 자동 추적 소프트웨어에서 운동 활동의 분석
- 행동의 분석을 시작 하려면 열 추적 소프트웨어, 서식 파일에서 새 실험, 다음 선택 미리 정의 된 서식 파일을 적용.
- 프로그램이 지금 어떤 종 추적을 요청,으로 생선을 선택 합니다. 드롭다운 상자를 사용 하 여 어느 Zebrafish 애벌레 Zebrafish 성인 따라 실험 패러다임의 선택.
- 있는 각 동물을 추적 것입니다 경기장을 설정 합니다. 애벌레, 잘 플레이트 라운드 잘 , 아니 영역 서식 파일을 선택 합니다. 성인을 위한, 아니 영역 템플릿을사용 하 여 오픈 필드, 광장을 사용 합니다. 다음 경기장, 하나는 비디오에 추적 되 고 각 동물에 대 한 적절 한 수를 결정 합니다.
- 최적의 추적에 대 한 모델을 선택, 클릭 추적 센터 포인트, 동물 색상을 배경 보다 어두운 것을 선택 해야 하 고. 비디오 구입한 프레임 속도 적용 합니다. 추적 소프트웨어는 자동으로이 감지 한다.
- 아레나 설정을사용 하 여 물고기의 운동 동작을 정확 하 게 결정 하는 개체의 실제 거리를 보정 하기 위해 규모를 그립니다.
- 그 물고기에 있는 전체 영역을 추적 됩니다; 되도록 무대 편집 그렇지 않으면 샘플 중에 손실 될 것입니다.
참고: 영역을 설정할 때 주의 사용 합니다. 애벌레 물고기는 특히 민감한 경우는 경기장에 너무 큰 또는 작은 오류를 추적 하는. 나쁜 조명 실험에 잘 접시, 생각 하는 프로그램 있습니다 가양성을 생성 하는 동물의 벽에 그림자를 만들 수도 있습니다. - 고급클릭 하십시오. 검색설정에서 방법 동적 빼기, 다음 배경 을 클릭 선택 하 고 시작 학습. 동물, 추적 하 고 배경 이동 추적 발생 하지 때까지 어두운 대비 신호/잡음 비율을 조정 합니다.
참고: 비디오 품질 실험, 각 재판 그에 따라 다른 설정을 사용 해야 할 수도 있습니다 그래서 사이 달라질 수 있습니다. 주제 윤곽 및 제목 크기 기능을 사용 하 여 추적 결과 크게 향상 시킬 수 있습니다. - 재판 목록 선택한 프로그램에 데이터를 기록 하기 시작 하기 전에 적절 한 매개 변수를 로드 합니다.
- 인수 탭을 클릭 합니다, 그리고 트랙 모든 계획 재판 을 선택 하 고 레코드 버튼을 클릭 합니다.
- 프로 파일 분석에서 거리 및 시간 이동 선택 되어 있는지 확인 합니다.
참고: 나중에 수 면 분석에서 그것은 중요 이러한 설정이 올바른지는.perl으로 파일 수를 계산 하는 올바른 순서에 이러한 데이터를 읽어야 합니다. - 수출, 원시 데이터선택에서 유니코드 텍스트 데이터를 내보낼.
5. 추적 사회적으로 물고기를 지 내게
- 4.1-4.4 추적 소프트웨어에서 실험을 설정 하려면 단계.
- 드롭다운 메뉴에서 얼마나 많은 동물 실험에 대 한 추적을 선택 합니다.
- 무대 설정에서 실제 거리를 보정 하기 위해 정확한 규모를 그립니다.
- 검색 설정에서 동적 빼기를 사용 하 고 최고의 동물을 추적 하는 어두운 대비를 조정 합니다.
- 동물의 아주 작은 부분만 추적 탐지 설정에서 제목 크기를 조정 합니다.
참고: 동물의 단지 작은 부분을 추적 하 여이 동물 중 경로 교차 하는 경우 전환의 양을 줄어 듭니다. - 트랙 획득 되 면 트랙 편집기 를 사용 하 여 수동으로 수정 시간 물고기 경로 교차 수 있습니다.
6. 운동 활동에서 수 면 데이터의 추출
참고: 애벌레와 성인 A. mexicanus 수 면 행동 정의 1 분 이상 정지. 이 정의 큰 감각 자극은 수 면 상태에서 행동 응답 시작 해야 흥분을 일으키는 임계값 실험을 사용 하 여 결정 되었다 (> 60 s) 깨어 있는14,17에 비해. 작은 움직임과 떠도는 일반적인 물고기 종, 거기에 대 한 계정에 속도 임계값에 적용 잡음 또는 드리프트에서 실제 움직임을 분리. 이러한 임계값은 계산 파생 된 거리 및 가장 높은 R-제곱 값; 찾을 수 면 기간 사이의 상관 관계를 비교 하 여 따라서 운동과 수 면에 대 한 가장 정확한 속도 결정합니다. 애벌레의 물고기에 대 한 위와 더 낮은 한계는 모두 12 m m/s 만큼은 거의 아무 드리프트. 성인 물고기에 대 한 하한값 2 cm/s 드리프트에 대 한 계정에 4 cm/s의 상한값입니다.
- 운동 추출 및 동작 자 사용자 작성 스크립트의 실행을 수행 하는 분석 컴퓨터에 Cygwin을 설치 합니다.
- Cygwin 홈 디렉토리 내의 새로운 실험 폴더를 만듭니다.
- 추적 소프트웨어에서 원시 유니코드 데이터를 가져올 하 고 u t F-16에서 인코딩을 u t F-8로 변환 하는 Cygwin에서.sh 파일을 실행 합니다.
- 수 면 데이터를 추출 하는 Cygwin에서.perl 파일을 실행 합니다.
- 매크로 파일을 열고 원하는 대로 데이터 분석을 마무리 하는 스프레드시트 내에서 지침에 따라.
참고: 명령줄 코딩의 기본적인 수준을 분석의이 부분을 수행 하는 데 필요한 것입니다. 일반 리눅스 명령 충분 합니다. 데이터를 제대로 읽을 프로그램에 문제가 있다면 인코딩 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수 있는 텍스트 편집기에서를 확실 하 게 추적에서 데이터를 확인 하 고 순서는 제대로 작성 하는 실행 파일에 대 한 올바른.
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Representative Results
애벌레 연령대 4-30 dpf를 안정적으로 그림 1에 설명 된 사용자 지정 빌드 닫힌된 시스템에서 기록 될 수 있습니다. 시스템에는 적외선과 보이는 조명 조건 하에서 빛과 어둠, 다양 한 표시 빛 조건 (그림 1A)에서 녹음 수 있도록 포함 되어 있습니다. 동영상은 다음 추적 소프트웨어 (그림 1BC)를 사용 하 여 분석 하 고 이후 사용자 지정 수 면 매크로 (참조 추가 다운로드)를 사용 하 여 처리. 3 개의 독립적인 cavefish 인구에서 애벌레 생선 표면 물고기 (그림 1D)와 20 dpf에 비해 수 면에 상당한 감소를 표시 하 고 발달 단계에 걸쳐이 수 면 손실은. 물고기 수 면에 대 한 분석의 나이 실험 조작에 따라 자주. 예를 들어 A. mexicanus 하지 소비지 않습니다 음식 4 일, 그래서 수 면과 먹이 사이 상호 작용을 조사 하는 실험 이전 애벌레25에서 일반적으로 발생. 반대로, morpholinos 되므로 초 튀김 (일반적으로 미만 4 dpf)에 효과적이 시대 엉덩이 잠24,,2627에 사용 됩니다.
A. mexicanus 는 실험실에서 최대 30 년까지 살 수 있다 하지만 어른을 사용 하 여 실험은 일반적으로 물고기 세 3 년 6 개월. 물고기는 다양 한 실험에 따라 탱크 크기에에서 기록 될 수 하 고 IR 조명 기간 빛과 어둠 (그림 2A) 녹음에 대 한 있습니다. 개별 경기장, 물고기의 추적에 대 한 수 있도록 추적에 표시 됩니다 하 고 사용자 지정 매크로 사용 하 여 후 처리 수 면 (그림 2BC)의 판독을 제공 한다. 수 면은 몰리 노, Pachón, Tinaja cavefish, 표면 물고기 (그림 2D)에 비해 크게 감소 됩니다. 또한,이 시스템 기록에 대 한 단일 분야 (일반적으로 10 갤런 탱크)에서 어떻게 사회적 상호 작용의 분석에 대 한 수 있도록 여러 물고기에 영향을 미칠 수 면 (그림 2EF) 있습니다. 사회 주택 튼튼하게 Pachón cavefish (그림 2G) 수 면에 영향을 주지 않고 표면 물고기, 수 면을 감소 시킨다. Cavefish에 있는 효력의 부족 어디 cavefish 자 조금, 사회적 행동을 검사 하는 데 사용 하는 더 큰 경기장에서 특히 지 효과 인해 가능성이 높습니다.
그림 1: 기록 수 면 행동 애벌레 그리고 청소년 A. mexicanus. 애벌레 수 면 동작 설정의 개략도 (A): 애벌레 빛 제어 관 내의 플랫폼에 배치 됩니다. 적외선과 흰색 조명 시스템은 튜브의 맨 아래에 물고기 아래 앉아. 적외선 패스 카메라 튜브의 상단에 앉아서 비디오 기록 됩니다 노트북에 연결 되어. 모든 전원된 시스템 (조명 및 노트북) 백업 전원에 연결 됩니다. (B) 추적 소프트웨어에서 아레나 설정. 개별 애벌레 조직 배양 플레이트에 웰 스에 보관 됩니다 및 경기장 (녹청) 각 동물에 대 한 만들어집니다. (C) 추적 소프트웨어에서 데이터를 취득 후 물고기 운동 동작의 운동 자취. 20 일 오래 된 물고기에 활동의 붉은 흔적이 대표 10 s. (D) 결과 추적 소프트웨어에서 데이터 자. 청소년 cavefish 표면 물고기 변경해에 비해 감소 절전 동작 수렴 (단방향 ANOVA F(3, 116) = 76.12; Dunnett post hoc 분석 비교 표면 물고기, P와 각 cavefish 인구에 적용 된 < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 성인 A. mexicanus 시스템 절전 및 circadian 동작. 수 면 기록 시스템 (A) 다이어그램: 물고기 카메라 추적의 반대 선반에 탱크에서 개최 됩니다. 적외선 조명 시스템은 적외선 통과 카메라 기록 동작에 대 한 노트북에 연결 하는 동안 물고기 탱크 뒤에 배치 됩니다. 모든 전원된 시스템 전원 변동 시 백업 배터리 시스템에 연결 됩니다. (B) 아레나 추적 소프트웨어에 설치. 개별 물고기는 운동 동작을 추적 하기 위해 별도 경기장 (청록색)을 생성 하 여 표시 됩니다. (C) 대표 운동 추적 (레드 라인) 추적 소프트웨어에 행동 기록 인수 후 개별 물고기의 합니다. 활동의 추적 대표 20 s입니다. (D) 총 수 면 기간 동안 24 시간 크게 표면 물고기에 비해 cavefish의 3 가지 인구에 있는 감소 (단방향 ANOVA F(3, 106) 52.66; = Dunnett 게시물 임시 테스트 표면 물고기와 각 동굴 인구, P 사이 적용 된 < 0.001). (E) A 한 아레나 (오렌지) 사회적 상호 작용 및 수 면 추적을 만든 여러 물고기를 포함 하는 단일 탱크. (F) 소프트웨어 (각 선 색 나타내는 개별 물고기) 추적 데이터 수집 후 여러 물고기의 운동 자취. (G) 표면 및 사회 수 면 추적 Pachón cavefish의 대표적인 데이터입니다. 표면 물고기는 크게 10 L 탱크 2 L 경기장;에 비해 수 면을 줄일 물고기는 사회적으로 지 내게 될 때에 더 표면 물고기 수 면 감소 된다. Cavefish 수 면 어떤 조건에서 크게 변경 되지 (양방향 ANOVA F(2,46) = 4.545; 포스트 hoc 분석 총 수 10 L 싱글, P에 탱크 크기와 사회 주의 효과 테스트 하려면 각 인구 내에서 수행한 = 0.013; 10 L 사회, P = 0.0003). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서는 측정 수 면과 운동 활동 애벌레와 성인 cavefish에 대 한 사용자 지정 시스템을 설명 합니다. Cavefish는 수 면 수 면 규칙1의 유전과 신경 기초를 조사 하는 데 사용할 수 있습니다의 진화를 공부에 대 한 최고의 모델로 떠오르고 있다. 이 프로토콜의 중요 한 단계 점화의 최적화를 포함 하 고 정확한 추적을 보장 하기 위해서 비디오 품질은 수 면을 계량 하는 데 필요한. 수집 및 여기서 설명 하는 분석에 대 한 시스템은 많은 다른 시스템, 상업 및 사용자, 운동 및 행동28,,2930척도를 완벽 하 게 기능. 이전 분석 결과 단일 물고기 수 면 검사 그룹 보관 되어 물고기의 분석에 대 한 허용 하도록 확장할 수 있습니다. 문제 해결 또는 분석 실험을 설계 하는 때 중요 한 고려 사항은 이다는 혼동 한다 사회적 행동 개인의 수 면에 할 수 있습니다. 예를 들어 공격 Astyanax에서 일반적 이며 침략 수준의 표면 물고기와 cavefish31다. 물고기의 수, 경기장, 및 성 비율의 크기를 최적화, 침략을 최소화 하면 수 면의 재현성 측정에 대 한 있습니다.
제한 기술, 설명, 신뢰성 분석 결과 통해 개별 물고기 다음의 부족 이다. 그들은 가까운 접촉으로 올 때 자동된 동물 추적 것입니다 종종 동물을 전환 합니다. 이 임계값의 주의 최적화 또는 어떤 스위치를 수동으로 수정 하 여 해결할 수 있습니다. 또한, 설명 시스템 흐름을 통해 시스템 이며 따라서 수 질 녹음 몇 일 지속 후 문제가 될 수 있다. 시스템을 통해 다른 흐름 zebrafish13 에서 설명 해야 하 고 이러한 멕시코 cavefish의 촌에 쉽게 적용 될 수 있습니다.
설명 된 방법론은 중요 한 때문에 다양 한 어 종에 동작을 측정 하는 광범위 한 적용. 수 면은 Sticklebacks, swordtails32,,3334, 시 클 리드, 등 거의 모든 해양 또는 신선한 물 물고기에 특징을 아직. A. mexicanus 와 다른 물고기 모델에 수 면을 측정 하는이 시스템의 진화 및 유전 토대 수 면에 대 한 다양 한 질문을 주소 수 있습니다. 이 시스템과 관련 된 하드웨어는 매우 비용 효율적인, 약리학의 높은 처리량 분석 및 수 면과 운동 활동의 ecotoxilogical 분석을 위한 매우 액세스할 수 제공 하 고 잠재력을 만들기.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIGMS 수상 GM127872 ACK, ERD 및 ACK, NINDS 수상 105072과 NSF 상을 1656574 ACK.에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
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