Summary
На основе in vitro лентивирной инженерии нейрональных прекурсоров, их совместной трансплантации в мозг дикого типа и парной морфометрической оценки "тест" и "контроль" производных, этот метод позволяет точное моделирование in vivo генного контроля неокортикальных морфология нейронов в простой и доступный способ.
Abstract
Генное управление нейрональной цитоархитектуры в настоящее время является предметом интенсивного исследования. Описан простой метод, разработанный для изучения виво-генного контроля неокортикальной проекционной морфологии нейронов. Этот метод основан на (1) in vitro lentiviral engineering нейрональных прекурсоров как "тест" и "контроль" клетки, (2) их совместной трансплантации в мозг дикого типа, и (3) парной морфометрической оценки их нейрональных производных. В частности, для этой цели используются прекурсоры E12.5 pallial от паннейрональных, генетически помеченных доноров. Они разработаны, чтобы воспользоваться выбранными промоутеров и тетон / OFF технологии, и они свободной руки трансплантированы в неонатальных боковых желудочков. Позже, при иммунофлуоресценцическом профилировании мозга реципиента, силуэты пересаженных нейронов подаются в программное обеспечение с открытым исходным кодом NeurphologyJ, извлекаются их морфометрические параметры, рассчитывается средняя длина и индекс ветвления. По сравнению с другими методами, этот предлагает три основных преимущества: он позволяет достичь тонкого контроля трансгенного экспрессии по доступным ценам, он требует только базовых хирургических навыков, и он обеспечивает статистически надежные результаты при анализе ограниченного животных. Из-за своей конструкции, однако, это не является адекватным для решения не клеток автономного контроля нейроархитектуры. Кроме того, он должен быть предпочтительно использовать для исследования контроля невритной морфологии после завершения миграции нейронов. В своей нынешней формулировке, этот метод изысканно настроен для исследования генного контроля глутаматергической неокортикальной архитектуры нейронов. Воспользовавшись трансгенными линиями, выражающими EGFP в других конкретных типах нейронных клеток, его можно перепрофилировать для решения проблемы генного контроля их архитектуры.
Introduction
Здесь мы описываем простой метод, который мы разработали для вскрытия виво генного контроля нейрональной цитоархитектуры. На основе интроинженерии нейронных прекурсоров, их трансплантации в неонатальный мозг и парной морфометрической оценки "тест" и "контроль" клеток, это позволяет раскрыть функциональные последствия тестовых генов в тонком контроле нейрональной морфологии в быстрый и доступный способ. Для изучения виво-генного контроля нейронной архитектуры необходимо решить три ключевых технических вопроса: (1) достижение адекватно узорчатого выражения гена интересов (GOI) и точного количественного контроля над ним; (2) получение правильно сегментированной визуализации различных нейрональных силуэтов; (3) получение статистической значимости результатов при использовании ограниченного числа животных.
При наличии, мыши мутант линий укрывательство тетрациклин (тет) контролируемых трансгенов может быть лучшим инструментом для решения первого вопроса1. Кроме того, может быть использован соматический трансгенез. В таких случаях трансген доставляется через электропорацию2 или вирусную трансдукцию3. Далее, он сохраняется в качестве эписома (например, при стандартной электропорации4),или он интегрируется в геном (случайно, через ретровирусную интегразу5; или в определенном месте, через CRISPR-раскрученная гомологическая рекомбинация (SLENDR)6 ).
Во-вторых, визуализация нейрональных силуэтов может быть достигнута с помощью а) разреженной равномерной маркировки или b) плотной дифференциальной маркировки. Что касается разреженной маркировки, передовые Golgi-подобные методологии могут быть использованы7, выбранные нейрональные минисеты могут быть заполнены биоцитина8, и соль и перец маркировки могут быть получены благодаря редко выраженный трансген. Такой трансген может отображать пеструю транскрипцию (Thy-EGFP)9 или может быть активирован стохастической рекомбинацией (MORF)10. Что касается b), современные стратегии включают Cre-опосредованной стохастической рекомбинации в мульти-флоксированный флюоропротеин трансген массива (Brainbow)11, а также поросенокBac-транспозаса инициативе геномной интеграции генопротеитов, ранее осуществляется через соматический трансгенез (CLoNE)12.
Что касается третьего вопроса, то на морфометрический исход часто влияет большая случайная изменчивость, возникающая из межживотных различий и непредвиденных обстоятельств в клеточных инъекциях. Из-за этого, большое количество животных, как правило, используется для достижения статистической мощности, необходимой для оценки ГОИ морфометрической активности.
Описанные ранее подходы часто опираются на передовые технические навыки и требуют заметных финансовых ресурсов, которые могут ограничить их распространение в научном сообществе. Чтобы обойти эти проблемы, мы задумали простой и простой трубопровод для вскрытия генного контроля нейроархитектуры in vivo быстрым и доступным способом. Это вдохновлено аналогичной конструкцией совместной трансплантации, ранее разработанной для быстрой оценки виво антибластной трансгенной активности13.
В частности, считается, что совместное трансплантации in vitro инженерии "зеленых" нейронных прекурсоров ("тест" и "контроль" клетки) в "черный" получатель неонатального мозга может одновременно исправить три ключевых вопросов, перечисленных выше. В самом деле, in vitro лентивирной инженерии прекурсоров, в хорошо контролируемых условиях, позволяет поддержание изменчивости нейрональной трансгенной экспрессии, как минимум, гораздо ниже, что обычно связано с in vivo соматические манипуляции (выполненные ранее 14 Год , 15 и в наших неопубликованных результатах). В результате точный контроль экспрессии генов сопоставим с тем, что достигается тет-контролируемыми трансгенными моделями. Однако затраты на эту процедуру значительно ниже затрат, связанных с обслуживанием трансгенной линии мыши. Далее, инъекция клеток свободной руки проста и требует минимальной подготовки. Кроме того, количество помеченных прекурсоров, вводимых в каждый мозг, может быть легко настроено для достижения достаточного совокупного числа малораспределенных прекурсоров, сохраняя при этом общее число пересаженных животных на минимальном уровне. И последнее, но не менее, совместное введение по-разному флюоро-маркированных, "тест" и "контроль" прекурсоров и последующий парный статистический анализ результатов противодействовать воздействию межживотных экспериментальной изменчивости, что позволяет достичь статистической значимости результатов, даже при анализе ограниченного числа лиц13.
Следует подчеркнуть, что, хотя и быстро и дешево, этот метод имеет два основных ограничения. Во-первых, он предназначен для исследования клеточного автономного генного контроля нейронной архитектуры, и не подходит для решения проблемы экологического контроля. Во-вторых, по мере того, как трансплантированные нейронные прекурсоры достигают своего конечного места по гетерохроническому графику, этот метод предпочтительнее моделировать нейроархитектуру управления, происходящие в прошлом завершении миграции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы и процедуры, описанные здесь, были одобрены SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. Поколение инженерных "зеленых" бассейнов-прародителей
- Подготовка «зеленого» бассейна
- Mate дикого типа CD1 женщины с MtaptEGFP / » основатель16. Эвтаназия беременной плотины путем вывиха шейки матки в 12,5 дней после coitum (день 0 определяется вагинальной пробки инспекции) и урожай эмбрионального дня 12,5 (E12.5) эмбрионов. Установите их в отдельные скважины 24 многоцветной пластины в холодном растворе PBS.
- Быстрый генотип эмбрионов путем визуального осмотра под голубой лампой света, проверка на выброс зеленой флуоресценции в мозге.
- Поместите "зеленые" эмбрионы в 10 см диаметром Петри блюдо заполнены холодной 1x PBS с 0,6% глюкозы и передать его под стереомикроскоп.
- Вырежьте головы эмбриона с помощью стандартных ножниц и извлеките из них теленефалион с помощью #3 и #5 щипцы.
- Разделите две теленцефалические пузырьки и расчлените неокортики с помощью щипцы; убедитесь, что удалить гиппокампа и базальных ганглиев17.
- Соберите неокортики, переведя их с пипеткой P1000 в трубку 1,5 мл, хранящейся на льду.
- Пусть расчлененные неокортики оседают на дно трубки.
- Аспирируй супернатант как можно больше.
- Приостановить действие неокортиков в 400 л свежей пролиферативной среды «DMEM-F12», 1x Glutamax, 1X N2, 1 мг/мл булбумистого сыворотки крупного рогатого скота (BSA), 0,6% глюкозы, 2 мкг/мл гепарина, 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 1X pen-strep, и 10 пг/мл амфотерицин БЗ.
- Аккуратно пипетка неокортики вверх и вниз, последовательно с P1000, P200, и P20 советы, 4x на кончик, чтобы получить облачной подвески клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: E12.5 неокортикальной ткани очень мягкий; отмежевание его от одиночных клеток не требует ферментативного пищеварения на всех; повторное пайпеттинг достаточно. - Пусть оранжереи и остаточные неокортикальные комки оседают на 2 мин.
- Передача 150 л из верхней части клеточной подвески (в основном содержащей одиночные клетки) в новую стерильную трубку 1,5 мл.
- Добавьте 150 л свежей пролиферативной среды и повторите шаги 1.1.10-1.1.12 до тех пор, пока не будут видны больше сгустков тканей. При этом, опустить P1000 трубач шаг (в шаге 1.1.10).
ПРИМЕЧАНИЕ: Три итерации шагов 1.1.10-1.1.12 обычно достаточны для достижения полной диссоциации тканей. - Подсчитайте клетки ("зеленый" бассейн) с методом исключения трипан синего исключения в камере Бюркер17 и добавьте свежую пролиферативную среду, чтобы настроить концентрацию до 103 ячеек/ЗЛ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1.7-1.1.14 должны выполняться под стерильным ламинарным капотом, продезинфицированным 70% этанолом и проветриваемым в течение не менее 20 мин.
- Проектирование «зеленых» подпулов
- Разделите «зеленый» бассейн на два подбассейна на две различные трубки мощностью 1,5 мл для лентивирусной инфекции.
- Заразить субпулы самостоятельно с двумя выделенными лентивирными смесями. Каждая смесь содержит вирус «красная этикетка» (Pgk1'mCherry) или «черный» вирус (pCAG-lac) в качестве элемента контроля, а также вирусы для выражения тетоффа(Pgk1p'ttTA и TRE'transgene) или контроль (Pgk1p-tTA и TRE-PLAP).
ВНИМАНИЕ: Манипулировать лентивирусами в среде BLS-2 со всеми защитными измерениями, предписанными применимыми правилами и законами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый лентивирус должен вводиться при множественности инфекции (MOI) 8, которая (как ранее показано14)достаточно, чтобы преобразовать подавляющее большинство нервных клеток в таких экспериментальных условиях (Рисунок 1). Лентивирус укрывательство tet трансактиваторов может быть построен путем использования различных нейрональных промоутеров вождения tTA / rtTA выражение (например, pT,1, pSyn, pCaMKII, pGAD1 и т.д.) (Рисунок 2). МВД представляет собой соотношение а) количества инфекционных вирусных частиц, доставленных в b) число их целевых клеток. Здесь, первый (а) рассчитывается в соответствии с обычной процедурой, описанной в другом месте14, последний (б) просто оценивается с помощью камеры Бюркер. - Плита 600000 клеток каждого инфицированного суббассейна на скважину 12 многокровной пластины, в 600 л размножающейся среды с 2 мкг/мл доксициклина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь колодцы не обрабатываются полилизином, который предотвращает привязанность нервных клеток к их днищам. - Перенесите клетки в инкубатор в 5% CO2 при 37 градусах Цельсия.
- Через 2 дня, чтобы оценить эффективность инфекции и дифференциальную маркировку инженерных бассейнов, осмотрите клетки под обычным флуоресцентным микроскопом. Два подбассейна должны отображаться как суспензии малых нейросфер, однородно выражающие красный флуоресцентный белок ("контрольный" образец) или нет ("тест" образца). В этих нейросферах, MtaptEGFP трансгена активна ограничивается меньшинством клеток (пост-митотических нейронов) и молчать в большинстве из них (пролиферации прекурсоров) (Рисунок 3).
2. Настройка хирургических инструментов и операционной зоны
-
Подготовка боросиликатных игл
- Используйте боросиликатные стеклянные капилляры с внешним и внутренним диаметром, равными 1,5 мм и 1,12 мм соответственно.
- Потяните капилляр с p 1000 шкив.
- Настройка программы потянув. Типичные параметры программы: тепло No 614; vel 60; время No 1; давление 600. Они должны быть отрегулированы в соответствии с моделью шкива и применяемым противопотопительным реипулатором.
- Поместите капилляр в держатели шкива и затяните их.
- Запустите программу и возьмите два вытащил микрокапилляров.
- Вырезать капиллярный кончик вручную, скальпелем, под стереомикроскоп, чтобы получить наконечник с внешним диаметром 200-250 мкм.
- Поместите капилляры на глиняную глину (например, пластилин) в закрытом блюде Петри и перенесите ее под капотом.
-
Настройка капота и подготовка решения для трассировщика ячеек
- Тщательно очистите капот горизонтального потока и дезинфицируйте его с помощью 70% этанола.
- Дезинфекция оптических волокон с использованием 70% этанола и поместить их под капотом.
- Смешайте 10 юл 125 мМ EGTA раствор и 10 л быстрого зеленого, чтобы подготовить "решение для ячеечного трассировщика" и поместить его под капот.
- Вырезать мелкие кусочки (4 см х 2 см размера) лабораторной пленки герметизации для клеточной подвески пятнистости.
- Приготовьте раствор стерильного доксициклина 1 мг/мл и сагите его в шприц 0,3 мл.
- Включите капот и держите ламинарный поток на 20 минут до операции.
-
Сборка трубки для инъекций
- Возьмите жесткий пластиковый мундштук, две латексные трубки (каждый около 30 см в длину) и капиллярный держатель из комплекта сборки трубки аспиратора для откалиброванных микрокапиллярных пипетки.
- Закрепите жесткий пластиковый мундштук на одном конце латексной трубки.
- Закрепите держатель капилляра на одном конце другой латексной трубки.
- Соедините свободные концы двух латексных трубок с стерильным фильтром 0,45 мкм в качестве барьера против микробов оператора.
- Поместите полученную сборку трубки аспиратора на держатель глины для моделирования, который будет храниться под капотом.
3. Клеточное сочетание и внутрижелудочковая трансплантация
- Смешивание "тест" и "контроль" зеленых клеток подпулы
- Сбор "тест" и "контроль" нейросфер (см. шаг 1.2.5) в отдельных 1,5 мл труб.
- Центрифуга нейросферы подвески на 200 г в течение 5 мин.
- Соберите и отбросьте супернатант, избегая нарушения клеточных гранул.
- Аккуратно повторно притяжать нейросферы в 500 Л 1x PBS.
- Центрифуге их на 200 г в течение 1 мин.
- Удалите супернатант.
- Повторите шаги 3.1.4-3.1.6 еще два раза.
- Аккуратно resuspend сферы в 200 Зл 2x трипсин раствор (2x трипсин, 1x PBS) и пипетки клеток гранулы вверх и вниз 4x-5x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, чтобы не сделать пузырьки воздуха. - Оставьте клетки в инкубаторе в течение 5 мин при 37 градусах по Цельсию для достижения одноклеточной подвески.
- Блок трипсин с 200 л раствора ингибитора трипсина (DMEM-F12, 10 мкг/мл DNAse I, 0,28 мг/мл трипсин ингибитор) путем pipetting вверх и вниз 4x-5x.
- Клетки центрифуги при 200 х г в течение 5 мин и повторно притяжают их в 1 мл свежей пролиферативной среды (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 мг/мл BSA, 0,6% глюкозы, 2 мкг/мл гепарина, 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мЛ EGF, 1x pen-strep, 10 пг/мл амфотерицин B).
- Подсчитайте ячейки двух бассейнов с методом исключения trypan blue в камере Бюркера.
- Отрегулируйте их концентрацию до 100 000 клеток/Л в пролиферативной среде.
- Смешайте 1:1 "тест" клетки с "контрольными" из них.
- Проверьте полученную смесь под флуоресцентным микроскопом (объективное увеличение: 10x), чтобы убедиться, что смесь представляет собой одноклеточную подвеску двух бассейнов(рисунок 3C).
- Поместите смесь на лед под капотом.
- Внутрижелудочковая трансплантация
- Подготовка клетки с матерью и P0 щенки на столе далеко от хирургического оператора области.
- Поместите клетку восстановления на тележку рядом с капотом.
- Положите смесь опилок, взятых из клетки матери на дно клетки восстановления и поместите его под лампу.
- Кроме того, установите ледяную коробку, покрытую алюминиевой фольгой, для анестезии p0 щенков.
- Незадолго до трансплантации добавьте 1/10 объема клеточного трассирующего раствора (от шага 2.2.3) к 1 тому клеточной подвески (от ступени 3.1.16) и наместе 3 злицы полученной «инъекционной смеси» на кусок лабораторной герметичной пленки.
- Поместите щенка на холодную алюминиевую фольгу на 1 мин и убедитесь, что он полностью обезожжен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить анестезию, аккуратно сжать лапу и контролировать щенка за отсутствием движений, в то же время дыхание. - Между тем, аспирируйте смесь впрыска 3 зЛ (от шага 3.2.5) в стеклянную капиллярную капиллярию.
- Аккуратно протрите голову обезболиваемого щенка 70% этанола.
- Поместите подбородок щенка на кончик оптического волокна, чтобы четко определить корковых полушарий.
ПРИМЕЧАНИЕ: На P0-P1, кожа головы очень тонкая, что позволяет для прямой визуальной идентификации полушарий чуть выше глазных яблок и за обонятельные луковицы. - Держите капилляр (загруженный, как описано в шаге 3.2.7) в одном из двух среднепарасагиттальных плоскостей (слева или справа), над обонятельной лампой, и проколить кожу лба на ее пересечении с лобной плоскостью, содержащей центры глазных яблок. Обратите внимание, чтобы не повредить кровеносные сосуды. Введите капилляр в лобную кору и доступ к полости желудочков(рисунок 4A).
- Для предотвращения случайного повреждения ганглияского преосвященства, поверните иглу боково на 30 градусов, указывая на ее кончик каудально-медиаль-палате(рисунок 4B).
- Аккуратно впрысните клетки в желудочковую полость и следите за их диффузией с помощью fast Green(рисунок 4C).
- Подождите 5-10 с.
- Удалите стеклянную иглу, заботясь, чтобы не аспирировать клеточной подвески и выбросить его в подходящий мусорный бак.
- Перед восстановлением щенка после анестезии вводят 150 Л доксициклинового раствора интраперитоне, чтобы сохранить трансгенное выражение еще после трансплантации.
- После инъекции поместите щенка сразу под лампу для выздоровления.
- Оставьте щенков под лампой на 5-10 минут и, как только полностью проснуться, поместите их в клетку с матерью.
- Наблюдайте за оперированными щенками в течение 2-3 ч, чтобы убедиться, что мать принимает их.
- Поставка клетки с питьевой водой, содержащей 0,5 мг /мл доксициклина и 50 г / l сахарозы для поддержания трансгенного экспрессии.
- Замените доксициклинсодержащие воды докси-свободной водой через 4 дня после трансплантации, тем самым активируя трансген в постмитотических нейронах. Держите мышей в режиме, свободном от докси, в течение 6 дней и эвтаназии их на P10 путем вдыхания углекислого газа с последующим обезглавливанием.
4. Анализ пересаженных мозгов
-
Гистология и иммунофлуоресценция
- Эвтаназия пересаженных щенков через 10 дней после пересадки клеток путем вдыхания углекислого газа с последующим обезглавливанием. Исправить мозг эвтанированных щенков в 4% параформальдегида (PFA) на 4 градуса Цельсия в одночасье.
ВНИМАНИЕ: ПФА является высокотоксичным; обращаться с ним с осторожностью, строго соблюдая предписания производителя, под химическим капотом дыма; отбросить раствор PFA, остаточный в маркированном контейнере для отходов. - Удалите раствор PFA и замените его 30% сахарозным раствором.
- Оставьте мозги при 4 градусах Цельсия или пока они не опустятся на дно флакона.
- Передача мозгов в одноразовые встраивания формы примерно наполовину заполнены крио-включения среды.
- Заморозить включенные мозги при -80 градусов по Цельсию.
- Вырезать 60 мкм толщиной корональных секций с помощью криостата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования более тонких секций, так как это может привести к неприемлемой потере информации о всей архитектуре одиночных нейронов. - Обработка разделов для иммунофлуоресценции18,19, с использованием анти-GFP (1:400) и анти-RFP (mCherry) антитела. Противостопотоловые ядра с 1 мг/мл DAPI раствором 1:200.
- Эвтаназия пересаженных щенков через 10 дней после пересадки клеток путем вдыхания углекислого газа с последующим обезглавливанием. Исправить мозг эвтанированных щенков в 4% параформальдегида (PFA) на 4 градуса Цельсия в одночасье.
-
Морфаметрия
- Установить рабочие параметры конфокального микроскопа следующим образом: z-stack высота - 40 мкм; шаг 2 мкм.
- Соберите фотографии иммуноанализированных ломтиков, выбирающих положительные нейронные полеи, богатые нейронами, слепые распределения сигналов RFP.
- Экспорт изображений как файлы .nd2.
- Создание максимальных s-проекций из них как .tiff файлов(рисунок 5A).
- Чтобы обеспечить субпоследовательный нейрональной скелетизации слепой к клеткам генотип, скрыть красный сигнал. Для этого откройте каждый файл .tiff подходящим программным обеспечением и добавьте коррективный слой. Выберите "уровни", "красный", а затем установите "выход" до нуля. Сохранить файл как таковой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скелетизация впоследствии выполняется новым оператором, который не имел предыдущего доступа к оригинальным простым красным файлам. - Для каждого скрытого красного файла добавьте слой чертежа к основному изображению и выберите инструмент для карандаша (белый цвет). Проследите сому на основе сигнала GFP, а затем проследите невриты.
ПРИМЕЧАНИЕ: карандашный инструмент может быть установлен на 40 пикселей для сомы и на трех пикселях для невритов. - Сохранить многослойный файл, включая нейронные силуэты(рисунок 5B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Последующий анализ нейронального скелета может быть выполнен любым оператором. - Создайте новый 1024 x 1024 16-битный серый файл с черным фоном, по одному на нейрон.
- Копировать и вставить одиночные нейрональные силуэты от основного изображения до нового серого файла. Вернитесь к многослойному файлу и выключите корректироворовый слой, чтобы раскрыть нейрональные генотипы. Сохраните 16-битный серый файл, аннотируя соответствующий нейрональный генотип.
- Импорт серых изображений в ImageJ один за другим и анализ скелетов по NeurphologyJ плагин программного обеспечения ImageJ20 (Рисунок 5C).
- Копировать первичные данные NeurphologyJ(нейритнаядлина, вложения и конечные точки;для каждого, возьмите значения "Общая площадь"), вставьте их в электронную таблицу и нанимите их для вычисления вторичных морфометрических параметров ( средняя длина неврита, индекс ветвления) (рисунок5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Существует пять первичных наборов данных, предоставляющих полезную информацию о ключевых аспектах процедуры, первый из которых (1) эффективность трансдукции нейронных прекурсоров и ко-трансдукции с помощью лентивирных векторов. (2) Пример ключевых особенностей промоутеров, используемых для привода "тест гена". (3) Пример инженерных клеток, готовых к трансплантации. (4) Мультфильм, включающая ключевые процедурные детали клеточной микроинъекции в неонатальный мозг. (5) Краткий обзор всего морфометрического трубопровода.
Что касается (1), была оценена способность прототипных ленцикложных векторов, поставляемых в различные МОИ (2,4,8) эффективно преобразовывать неокортикальные прекурсоры. В первом ассиде, нервные предшественники, происходящие из ранних диких типа неокортики были инфицированы лентивирной репортер, укрывательство mCherry кодирования последовательности (CDS) под контролем нейроногенной линии конкретных pT'1 промоутер, в МВД No 2, 4, 8, то разрешается дифференцировать. Со-иммунопрофилирование их потомков для mCherry и паннейронального маркера Tubb3 показало, что нейроны эффективно трансцировались на частотах 64%, 69% и 78%, соответственно(рисунок 1A). Во втором ассоциировании неокортикальные прекурсоры были остро заразились двумя лентивирными репортерами, выражающими EGFP и mCherry, под контролем составного промоутера pPgk1, в MOI (2,2), (4,4) и (8,8). Несколько дней спустя, совместное иммунопрофилирование их производных показали, что соотношение между EGFPиEGFP и EGFPmCherry- клетки составили 80%, 88% и 93%, соответственно (рисунок1B). Эти данные свидетельствуют о том, что после выполнения инженерного протокола, предусмотренного для настоящего исследования, а) подавляющее большинство нейронов транс-индуцируется, и b) почти все трансиндуцированные нейроны получили полный лентивирусный набор, необходимый для их характеристики.
Рисунок 1 : Эффективность передаваемых нервных клеток-прекурсоров с помощью лентивирных векторов. Панели сообщают об оценке эффективности, с помощью которой E12.5 неокортикальных прекурсорных клеток транскортируются (или совместно трансдируются) при доставке специальных лентивирных репортеров при различных множественности инфекций (MOI). В первом случае(A ), клетки были остро инфицированы лентивирусом (LV) pT'1-mCherry в МВД No 2, 4, 8, культивируется в пролиферативной среде в течение 2 дней, переведены в дифференциативной среде, и позволилди дифференцировать в течение 1 недели. При фиксации в день in vitro (DIV) 9, культуры были совместно иммунопрофилированы для mCherry и паннейронального маркера Tubb3. сигналы mCherry и EGFP были обнаружены анти-RFP и анти-EGFP первичных антител и выявлены Alexa-594- и Alexa-488-конъюгированных вторичных антител, соответственно. Наконец, коэффициенты mCherryиTubb3 / mCherryTubb3 были рассчитаны, усреднены и построены в соответствии с соответствующими MO. В последнем случае (B), клетки были остро инфицированы 1:1 смесь двух лентивирусов, кодирование для составно активных pPgk-mCherry и pPgk-EGFP трансгенов, в различных MOIs (2, 4, 8 для каждого вируса). Клетки культивировались в пролиферативной среде в течение 4 дней, трипсинизированы и, при фиксации, профилированные для mCherry и EGFP иммунофлуоресценции, как указано выше. Наконец, коэффициентыmCherryиEGFP / mCherryEGFP были рассчитаны, усреднены и построены в соответствии с соответствующими MO. Бары ошибок представляют S.E.M. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Что касается (2), модели активности pT' 1 и pSyn можно сделать вывод на основе экспрессионных профилей генов фторпротеинов, наданных под их контролем. В этом примере такой контроль является прямым в случае mCherry(рисунок 2A),и косвенным ,т.е. опосредовано tetON второго поколения интерфейса (Рисунок 2E) , в случае EGFP (Рисунок 2B, C, D). Оба промоутера специально активны в Табб3и постмитотических нейронов (Рисунок2B, C,D), но pT '1 также пожары в подмножестве Ki67и межтерминических (нейроногенных) предшественников (Рисунок 2A). Здесь, чтобы обеспечить представление об ограниченной изменчивости активности промоутера, когда клетки разработаны в соответствии с этими стандартными условиями(Рисунок 2E), pT- и pSyn-управляемых уровней экспрессии EGFP в Tubb3- нейроны были количественно Фотошоп CS6 Histogram плагин. Затем, необработанные данные были нормализованы против медианы и построены против промоутеров(рисунок 2F). Примечательно, что одноклеточные уровни флуоресценции были плотно сгруппированы вокруг медианы: первый и третий квартиля равнялись 0,86 и 1,16, а также 0,89 и 1,12 в случаях pT-1 и pSyn, соответственно.
Рисунок 2 : Профилирование нейронных прекурсоров типа конкретных промоутеров подходит для привода GOI переэкспрессии. Панели относятся к характеристике Тубулина альфа 1 (pT' 1) и Synapsin (pSyn) промоутеров, особенно активны в рамках всей нейронной линии и постмитотических нейронов, соответственно. Испытания проводились в неокортикальных прекурсорах, собранных в разных эмбриональных (En) возрастов, остро инфицированных выделенными лентивирными смесями (pT'1-mCherry в (A); pT-1-rtTA, TREt-EGFP в ( B); pSyn-rtTA, TREt-EGFP в (C,D); /ml doxy ab initio, и культивированный в пролиферативной среде (A), пролиферативной (2 дня), за которыми следует дифференциативная среда (B,C), или дифференциативная (D) среда. При фиксации в дневное время in vitro (DIV) n, постмитотические нейроны были выявлены по зТубб3 и перетеритотические предшественники по иммунофлуоресценции Ки67; mCherry и EGFP были обнаружены, как показано на рисунке 1. Сигналы были выявлены, как показано на рисунке 1. Шкала баров: 100 мкм в (A,B) и 50 мкм в (C,D). Показаны (E) выделенные лентивирные смеси, используемые в данном исследовании со ссылками на фигурные панели. Показан a (F) рассеяние сюжета pT' 1- и pSyn-управляемый сигнал EGFP в Tubb3и клетках, упомянутых в (B) и (D), соответственно. Коробок являются клетки падают между 25-й и 75-й процентилей; усы относятся к 10-й и 90-й процентиля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Что касается (3), через 3 дня после лентивирусной трансдукции, MtaptEGFP / "зеленые" нейросферы выразить Pgk1p промоутер-управляемый, mCherry красный флуоресцентный белок ("контроль" сферы) или нет ("тест" сферы) (Рисунок 3A, B). Все сферы отделены от одиночных ячеек, обеспечивая отсутствие сгустков слева, а соответствующие суспензии смешиваются 1:1. Полученная смесь(рисунок 3С) помещается на лед и используется в течение 20 минут для трансплантации.
Рисунок 3 : Пример теста ("только зеленый") и управления ("зелено-красный") DIV2 нейросферы и клеточной подвески готовы к трансплантации. (A,B) Эти сферы были получены из MtaptEGFP / Е12,5 неокортикальных прекурсоров, остро инфицированных лентивирными смесями "pCAG-lac", Pgk1p'tTA, TREt-GOI " (A) и "Pgk1p-mCherry, Pgk1p 8, и хранится в пролиферативной среде. (C) Си-клеточная подвеска была получена путем разъединения "теста" и "контроля" нейросфер (A,B) на одиночные клетки и смешивания их 1:1. Шкала баров: 200 мкм в (A,B) и 100 мкм в (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Что касается (4), процедура клеточной инъекции в неонатальный мозг включает в себя три ключевых шага. Капилляр, помещенный на среднепарагитальную плоскость, вводится в боковую желудочковую полость через лобную корковую стенку(рисунок 4A). Далее, чтобы предотвратить повреждение ганглия, капилляр вращается 30 "в горизонтальной плоскости, так что наконечник указывает медиально / caudally (Рисунок 4B). Наконец, клеточная подвеска деликатно выбрасывается в боковую желудочковую полость, где она образует легко различимое, светло-голубое "облако"(рисунок 4C).
Рисунок 4 : Схема трехэтапной процедуры, применяемых для клеточной инъекции в неонатальный мозг. (A) Капилляр вводится в боковой желудочек через лобную неокортикальную стену. Затем, (B) он вращается медиалвардись, чтобы предотвратить повреждение ганглия. Наконец (C), суспензия клетки аккуратно вводится в боковой желудочек, где она образует светло-голубое облако. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Что касается (5), то аналитическая процедура включает четыре основных этапа. Во-первых, оптические конфокальные секции пересаженных нейронов богатых полей сплющены, в соответствии с MAX и проекции модальности так генерации RGB .tiff файлов. Здесь, например, можно легко отличить только "зеленый тест" нейронов и нейронов "желтого контроля", происходящих из совместно пересаженных прекурсоров (следует отметить, что mCherry может быть использован в качестве альтернативы для обозначения "тест" нейронов) (Рисунок 5A). Затем идеализированная, скелетонизированная версия lucida камеры создается подходящим графическим программным обеспечением (см. шаг 4.2.6) (рисунок5B)оператором, слепым от красного канала. Слепота красного канала имеет первостепенное значение для предотвращения любых непреднамеренных предубеждений при оценке данных. Далее, однонейронные силуэты подаются в программное обеспечение NeurphologyJ как черно-белые картинки и значения трех основных параметров "общее количество точек выхода"(приложения),"общее количество конечных точек" (конечные точки) и "общее количество конечных точек" и "общее количество конечных точек" и "общее количество конечных точек" Нейрит длина"(neurite))собраны (Рисунок5C). Наконец, вторичные параметры каждого нейрона рассчитываются, усредняются и статистически оцениваются программным обеспечением Excel(рисунок 5D).
Рисунок 5 : Представительная диаграмма морфометрического анализа пересаженных мозгов. Верхние рядные панели показывают: (A) MAX z-проекция .tiff изображение медиального neocortex, фиксированная 10 дней после инженерии трансплантации клетки (зеленый й Mtapt-управляемый, нейрон-ограниченный EGFP; красный mCherry, constitutively обозначая «контрольные» клетки; голубой DAPI), зеленый сигнал канала, и (B) его скелетизированной электронной камеры lucida рендеринга. Шкала баров: 50 мкм. Нижний ряд включает в себя: (C) первичные морфометрические параметры, извлеченные из нейрональных скелетов по анализу программного обеспечения NeurphologyJ(neurite-длина, как l, вложения, как Nвыхода и конечных точек как Nконец) и (D)вторичные параметры, рассчитанные на их основе. Эта цифра была изменена с Chiola et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Конкретные аспекты/шаги этой процедуры имеют решающее значение и требуют особого внимания. Во-первых, а) операторы должны быть надлежащим образом подготовлены к безопасному манипулированию лентивирусами в лабораторной среде, соответствующей требованиям BSL-2. Во-вторых, b) до смешивания "тест" и "контроль" нервных препаратов, это обязательно тщательно мыть две соответствующие нейросферные суспензии, как описано, в целях предотвращения любой задержки перекрестной инфекции двух препаратов из-за нежелательных lentiviral переносится. В-третьих, с) при пересадке клеток, уход должен быть помещен при ориентации на полость желудочков; в этом отношении, Быстрый зеленый трассировщик включены в подвеску ячейки существенной помощи. Кроме того, (d) для предотвращения каннибализма, пересаженные щенки должны быть повторно переданы матери только после их полного восстановления после анестезии (обычно 10 мин достаточно). e) криосекционирование пересаженной ткани должно проводиться на уровне 60 мкм; на самом деле, эта толщина одновременно позволяет легкое проникновение антител в ткани и ограничивает потерю информации, поступающей от фрагментации артефактных нейронов. Наконец, (f) для предотвращения любых непреднамеренных предубеждений в оценке данных, мы подчеркиваем, что скелетизация нейронов должна быть выполнена оператором, слепым от красного канала.
Описанный здесь протокол относится к манипуляциям генами GOF. Кроме того, "тест" нейроны могут быть разработаны для downregulate функции GOI с помощью лентивирусов кодирования для RNAi эффекторов. Далее мы обычно используем mCherry для обозначения "контрольных" нервных клеток; однако, схема mCherry/"control" и Lac/"test" может быть явно инвертирована. Наконец, описанный здесь протокол относится к инъекциям внутривенных клеток; "тест" и "контроль" нейронов могут быть альтернативно совместно вводили в нервной parenchima21.
Несмотря на свои преимущества, этот метод имеет два основных предела. Позволяя исследовать клетку-автономный генный контроль нейроархитектуры, она не относится к экологическому контролю над ней. Кроме того, поскольку трансплантированные нейронные прекурсоры мигрируют из желудочкового аспекта корковой стенки в их окончательное ламинарное расположение после рождения (т.е. в нефизиологические сроки), этот метод следует предпочтительно использовать для моделирования нейроархитектура контролирует сяпосле завершения миграции.
И последнее, но не менее важное внимание следует уделить критическому толкованию результатов. В частности, если x ген субъектисследования уменьшает морфологическую сложность "тестовых" нейронов, это может не отражать его подлинное влияние на архитектуру нейронов. Скорее, такое явление может быть неспецифическим индексом повреждения нейронов, вызванного переэкспрессией X. Для решения этой проблемы, может быть полезно сравнить местную плотность пересаженных, "тест" и "контроль" нейронов, а затем искать возможные численные усадки "тест" населения, как индекс нейронных страданий, вызванных X »это сокращение должно быть еще больше произносится при дальнейшем отложенный анализ пересаженных мозгов. В таких случаях снижение уровня overepression гена X или переход к конструкции убыточности может устранить проблему.
Наш метод добавляет к широкому спектру технологий, используемых дляисследования генного контроля нейронной морфологии in vivo1,2,3,4,7, 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год , 12. Как напоминается во введении, эти технологии опираются на различные специальные генетические манипуляции, направленные на возмущение уровня экспрессии ГОИ и облегчение извлечения морфологической информации из биологических образцов. Эти технологии обычно позволяют точное вскрытие этого элемента управления; однако они не требуют ценных экспериментальных навыков и финансовых ресурсов. В этом отношении метод предлагает три ключевых преимущества. Это позволяет точно контролировать уровни экспрессии GOI, сопоставимые с теми, которые характерны для трансгенных моделей; однако, в отсутствие расходов на содержание колонии мутантов. Он не требует сложных экспериментальных (хирургических) навыков. Он часто достигает статистической значимости результатов при анализе относительно ограниченного числа животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Мина Дюка До за его вклад в скорейшее создание этой процедуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
