Summary
Basado en la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales, su co-trasplante en cerebros de tipo salvaje y evaluación morfométrica emparejada de derivados de "prueba" y "control", este método permite el modelado preciso del control genético in vivo del neocortical morfología de las neuronas de una manera simple y asequible.
Abstract
El control genético de la citoarquitectura neuronal es actualmente objeto de una investigación intensiva. Aquí se describe un método simple desarrollado para estudiar el control del gen in vivo de la morfología de la neurona de proyección neocortical. Este método se basa en (1) la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales como células de "prueba" y "control", (2) su cotrasplante en cerebros de tipo salvaje, y (3) la evaluación morfométrica emparejada de sus derivados neuronales. Específicamente, e12.5 precursores palliales de panneuronal, donantes genéticamente etiquetados, se emplean para este propósito. Están diseñados para aprovechar los promotores seleccionados y la tecnología tetON/OFF, y se trasplantan a mano alzada en ventrículos laterales neonatales. Más tarde, tras el perfil de inmunofluorescencia de los cerebros receptores, las siluetas de las neuronas trasplantadas se introducen en el software de código abierto NeurphologyJ, se extraen sus parámetros morfométricos y se calculan la longitud media y el índice de ramificación. En comparación con otros métodos, este ofrece tres ventajas principales: permite lograr un control fino de la expresión transgénica a costos asequibles, sólo requiere habilidades quirúrgicas básicas, y proporciona resultados estadísticamente confiables tras el análisis de una número de animales. Debido a su diseño, sin embargo, no es adecuado para abordar el control no autónomo celular de la neuroarquitectura. Además, se debe utilizar preferentemente para investigar el control morfológico de neurita después de la finalización de la migración neuronal. En su formulación actual, este método está exquisitamente ajustado para investigar el control genético de la arquitectura de neuronas neocorticales glutamatérgicas. Aprovechando las líneas transgénicas que expresan EGFP en otros tipos específicos de células neurales, se puede reutilizar para abordar el control genético de su arquitectura.
Introduction
Aquí describimos un método simple que desarrollamos para diseccionar el control genético in vivo de la citoarquitectura neuronal. Basado en la ingeniería in vitro de precursores neuronales, su trasplante en cerebro neonatal y evaluación morfométrica emparejada de células de "prueba" y "control", permite revelar implicaciones funcionales de genes de prueba en el control fino de la morfología neuronal en un manera rápida y asequible. Para investigar el control genético in vivo de la arquitectura neuronal, deben abordarse tres cuestiones técnicas clave: 1) lograr una expresión genética de interés (GOI) adecuadamente modelada y un control cuantitativo preciso de la misma; (2) obtener una visualización correctamente segmentada de siluetas neuronales distintas; 3) obtener una significancia estadística de los resultados mientras se emplea un número limitado de animales.
Cuando están disponibles, las líneas mutantes de ratón que albergan transgenes controlados por tetraciclina (tet) pueden ser la mejor herramienta para abordar el primer problema1. Alternativamente, se puede emplear transgénesis somática. En tales casos, el transgén se entrega a través de la electroporación2 o la transducción viral3. A continuación, se conserva como un epísmio (por ejemplo, sobre la electroporación estándar4), o se integra en el genoma (aleatoriamente, a través de la integrasa retroviral5; o en un lugar definido, a través de la recombinación homóloga promovida por CRISPR (SLENDR)6 ).
En segundo lugar, la visualización de la silueta neuronal puede lograrse mediante (a) etiquetado uniforme disperso o (b) etiquetado diferencial denso. En cuanto al etiquetado escaso, se pueden emplearmetodologías avanzadas similares a Golgi 7, los miniconjuntos neuronales seleccionados pueden ser llenados por biocictina8,y el etiquetado de sal y pimienta se puede obtener gracias a un transgén escasamente expresado. Dicho transgén puede mostrar transcripción variada (Thy-EGFP)9 o puede activarse mediante recombinación estocástica (MORF)10. En cuanto a (b), las estrategias de vanguardia incluyen la recombinación estocástica mediada por Cre dentro de una matriz transgénica de fluoroproteínas multifloxadas (Brainbow)11,así como la integración genómica impulsada por piggyBac-transposasa de genes de fluoroproteínas, anteriormente entregada a través de la transgénesis somática (CLoNE)12.
En cuanto a la tercera cuestión, el resultado morfométrico a menudo se ve afectado por una gran variabilidad aleatoria, originada por diferencias entre animales y contingencias de inyección celular. Debido a esto, un gran número de animales se emplea generalmente para lograr el poder estadístico necesario para evaluar la actividad morfométrica GOI.
Los enfoques descritos anteriormente a menudo se basan en habilidades técnicas avanzadas y requieren recursos financieros visibles, lo que puede limitar su difusión dentro de la comunidad científica. Para eludir estos problemas, concebimos una canalización fácil y directa para diseccionar el control genético de la neuroarquitectura in vivo de una manera rápida y asequible. Esto se inspira en un diseño similar de co-trasplante previamente desarrollado para una evaluación rápida in vivo de la actividad transgén al trasgeno antiblástica13.
Específicamente, se cree que el co-trasplante de precursores neuronales "verdes" de ingeniería in vitro ("células de prueba" y "control") en un cerebro neonatal receptor "negro" puede corregir simultáneamente los tres problemas clave mencionados anteriormente. De hecho, la ingeniería lentiviral in vitro de precursores, en condiciones bien controladas, permite el mantenimiento de la variabilidad de la expresión transgénica neuronal como mínimo, muy por debajo de la generalmente asociada con manipulaciones in vivo somáticas (realizadas previamente 14 , 15 y en nuestros resultados inéditos). El control preciso resultante de la expresión génica es comparable al logrado por los modelos transgénicos controlados por tet. Sin embargo, los costes de este procedimiento están muy por debajo de los derivados del mantenimiento de una línea de ratón transgénica. A continuación, la inyección de células a mano alzada es fácil y requiere un entrenamiento mínimo. Además, la cantidad de precursores etiquetados inyectados en cada cerebro se puede ajustar fácilmente para lograr un número acumulado suficiente de precursores escasamente distribuidos, manteniendo al mismo tiempo el número total de animales trasplantados como mínimo. Por último, pero no menos importante, la coinyección de precursores de etiqueta fluorada, "prueba" y "control" de manera diferente y el posterior análisis estadístico por pares de los resultados contrarrestan los efectos de la variabilidad experimental interanimal, permitiendo alcanzar significación estadística de los resultados, incluso tras el análisis de un número limitado de individuos13.
Cabe destacar que, aunque rápido y barato, este método tiene dos limitaciones principales. En primer lugar, está diseñado para investigar el control genético autónomo celular de la arquitectura neuronal, y no es apropiado para abordar el control ambiental. En segundo lugar, a medida que los precursores neuronales trasplantados llegan a su ubicación final por un horario heterocrónico, este método es preferible a modelar el control neuroarquitectónico que se produce después de la finalización de la migración.
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Protocol
Todos los métodos y procedimientos descritos aquí han sido aprobados por la SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. Generación de piscinas de progenitores "verdes" de ingeniería
- Preparación de la piscina "verde"
- Mate una hembra de CD1 de tipo salvaje con un fundador de MtaptEGFP/+ 16. Eutanasia la presa embarazada por luxación cervical a los 12,5 días después del coíto (el día 0 se determina mediante la inspección del tapón vaginal) y cosechar los embriones embrionarios del día 12,5 (E12.5). Establézcalos en pozos individuales de una placa multipocilla 24 en solución PBS fría.
- Genotipo rápidamente los embriones mediante inspección visual bajo una lámpara de luz azul, comprobando la emisión de fluorescencia verde en el cerebro.
- Coloque los embriones "verdes" en una placa Petri de 10 cm de diámetro llena de PBS frío 1x con 0.6% de glucosa y transfiera a bajo un estereomicroscopio.
- Cortar las cabezas de los embriones utilizando tijeras estándar y extraer el telencéfalo de ellos por medio de #3 y #5 fórceps.
- Separar las dos vesículas telencéfalas y diseccionar los neocortices usando fórceps; asegúrese de eliminar el hipocampo y los ganglios basales17.
- Recoger los neocóticos transfiriéndolos con una pipeta P1000 en un tubo de 1,5 ml mantenido en hielo.
- Deje que los neocóticos diseccionados se asienten en la parte inferior del tubo.
- Aspira al sobrenadante tanto como sea posible.
- Resuspender los neocóticos en 400 l de medio proliferativo fresco [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA), 0,6% de glucosa, 2 g/ml de heparina, factor de crecimiento de fibroblasto básico de 20 ng/ml (bFGF), 20 ng/mL factor de crecimiento epidérmico (EGF), y 10 pg/ml de anfotericina B].
- Pipetee suavemente los neocóticos hacia arriba y hacia abajo, secuencialmente con puntas P1000, P200 y P20, 4 veces por punta, para obtener una suspensión celular turbia.
NOTA: El tejido neocortical E12.5 es muy blando; disociándolo a células individuales no requiere digestión enzimática en absoluto; pipeteo repetido es suficiente. - Deje que las meninges y los grumos neocorticales residuales se asienten durante 2 min.
- Transfiera 150 l desde la parte superior de la suspensión celular (principalmente concélulas individuales) a un nuevo tubo estéril de 1,5 ml.
- Añadir 150 l de medio proliferativo fresco y repetir los pasos 1.1.10-1.1.12 hasta que no se puedan ver más grumos de tejido. Al hacer esto, omita el paso de pipeteo P1000 (en el paso 1.1.10).
NOTA: Tres iteraciones de los pasos 1.1.10-1.1.12 suelen ser suficientes para lograr la disociación completa del tejido. - Contar las células (piscina "verde") con el método de exclusión azul trypan en una cámara de B-rker17 y añadir un medio proliferativo fresco para ajustar la concentración a 103 células / L.
NOTA: Los pasos 1.1.7-1.1.14 deben realizarse bajo una campana de flujo laminar estéril desinfectada por etanol en un 70% y mantenida ventilada durante al menos 20 minutos.
- Ingeniería de las subpiscinas "verdes"
- Subdividir la piscina "verde" en dos sub-piscinas en dos tubos distintos de 1,5 ml para la infección lentiviral.
- Infectar los sub-pools de forma independiente con las dos mezclas lentivirales dedicadas. Cada mezcla contiene el virus "etiqueta roja" (Pgk1_mCherry) o el virus "negro" (pCAG_lacZ) como control, así como virus para transgén controlado por tetOFF (Pgk1p_tTA y TRE_transgene) o expresión de control (Pgk1p_tTA y TRE_PLAP).
ADVERTENCIA: Manipule los lentivirus en un entorno BLS-2 con todas las medidas de protección prescritas por las normas y leyes aplicables.
NOTA: Cada lentivirus debe administrarse con una multiplicidad de infección (MOI) de 8, que (como se ha demostrado anteriormente14) es suficiente para transducir la gran mayoría de las células neuronales en tales condiciones experimentales (Figura1). Los transactivadores de tet de lentivirus se pueden construir empleando diferentes promotores neuronales que impulsan la expresión tTA/rtTA (p. ej., pT-1, pSyn, pCaMKII, pGAD1, etc.) (Figura 2). El MOI es la proporción de (a) el número de partículas virales infecciosas entregadas a (b) el número de sus células diana. En este caso, la primera (a) se calcula de acuerdo con el procedimiento convencional descrito en otros lugares14,la segunda (b) simplemente se evalúa utilizando una cámara de B-rker. - Placa 600.000 células de cada subpool infectado por pozo de una placa multipocilla de 12, en 600 ml de medio proliferativo con 2 g/ml de doxiciclina.
NOTA: Aquí, los pozos no son pretratados con polilisina, lo que impide la fijación de las células neurales a sus fondos. - Transfiera las células a la incubadora en unCO2 del 5% a 37 oC.
- Después de 2 días, para evaluar la eficiencia de la infección y el marcado diferencial de las piscinas de ingeniería, inspeccione las células bajo un microscopio fluorescente convencional. Los dos subgrupos deben aparecer como suspensiones de pequeñas neuroesferas, expresando homogéneamente la proteína fluorescente roja ("muestra de control") o no ("muestra de prueba"). Dentro de estas neuroesferas, el transgén MtaptEGFP es activo limitado a una minoría de células (neuronas postmitóticas) y silencioso en la mayoría de ellos (precursores proliferantes) (Figura 3).
2. Configuración de los instrumentos quirúrgicos y el área de operación
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Preparación de agujas de borosilicato
- Utilice los capilares de vidrio borosilicato con diámetro externo e interno igual a 1,5 mm y 1,12 mm, respectivamente.
- Tire del capilar con un tirador P 1000.
- Configure el programa de tracción. Los parámetros típicos del programa son: heat 614; vel 60; tiempo 1; presión de 600. Deben ajustarse de acuerdo con el modelo de tirador y la resistencia de calefacción empleada.
- Coloque el capilar en los soportes del tirador y apriételos.
- Inicie el programa y tome los dos microcapilares tirados.
- Cortar la punta capilar a mano, con un bisturí, bajo el estereomicroscopio para obtener una punta con un diámetro externo de 200-250 m.
- Coloque los capilares en un soporte de arcilla de modelado (por ejemplo, plasticina) en un plato de Petri cerrado y transfieralo a debajo del capó.
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Configuración del capó y preparación de la solución del trazador de células
- Limpie la campana de flujo horizontal cuidadosamente y desinfecte con 70% de etanol.
- Desinfecte las fibras ópticas con 70% de etanol y colóquelas debajo del capó.
- Mezclar 10 ml de solución EGTA de 125 mM y 10 ml de verde rápido para preparar la "solución de trazador celular" y colocarla debajo del capó.
- Corte piezas pequeñas (4 cm x 2 cm de tamaño) de película de sellado de laboratorio para el manchado de suspensión celular.
- Preparar una solución de 1 mg/ml de doxiciclina estéril y aspirarla en una jeringa de 0,3 ml.
- Encienda el capó y mantenga el flujo laminar encendido durante 20 minutos antes de la operación.
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Montaje del tubo de inyección
- Tome una boquilla de plástico duro, dos tubos de látex (cada uno de unos 30 cm de largo) y un soporte capilar de un kit de montaje de tubo de aspirador para pipetas microcapilares calibradas.
- Fije la boquilla de plástico duro a un extremo de un tubo de látex.
- Fije el soporte capilar a un extremo de otro tubo de látex.
- Conecte los extremos libres de los dos tubos de látex con un filtro estéril de 0,45 m, como barrera contra los gérmenes del operador.
- Coloque el conjunto de tubo del aspirador resultante en un soporte de arcilla de modelado que se mantenga debajo del capó.
3. Mezcla celular y trasplante intraventricular
- Mezcla de subpools de células verdes "test" y "control"
- Recoger las neuroesferas de "prueba" y "control" (ver paso 1.2.5) en tubos separados de 1,5 ml.
- Suspensión de las neuroesferas centrífugas a 200 g durante 5 min.
- Recoger y desechar el sobrenadante, evitando la perturbación del pellet celular.
- Resuspenda suavemente las neuroesferas en 500 ml de 1pbS.
- Centrifugarlos a 200 g durante 1 min.
- Retire el sobrenadante.
- Repita los pasos 3.1.4-3.1.6 dos veces más.
- Resuspenda suavemente las esferas en 200 ml de 2 x solución de trippsina (2x trypsin, 1x PBS) y pellets de células pipetas arriba y abajo 4x-5x.
NOTA: Preste atención para no hacer burbujas de aire. - Deje las células en la incubadora durante 5 min a 37 oC para lograr una suspensión de una sola célula.
- Bloquear la trippsina con 200 l de solución inhibidora de la trippsina (DMEM-F12, 10 g/ml de DNAse I, 0,28 mg/ml de inhibidor de trippsina) pipeteando 4 veces y hacia abajo 4 veces y más abajo.
- Células centrífugas a 200 x g durante 5 min y resuspenderlas en 1 ml de medio proliferativo fresco (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glucosa, 2 g/ml de heparina, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x pen-strep, 10 pg/mL de anfotericina B).
- Cuente las celdas de las dos piscinas con el método de exclusión azul trypan en una cámara de B-rker.
- Ajustar su concentración a 100.000 células/L en medio proliferativo.
- Mezclar las células de "prueba" 1:1 con las de "control".
- Compruebe la mezcla resultante bajo un microscopio de fluorescencia (ampliación objetiva: 10x) para asegurarse de que la mezcla es una suspensión de una sola célula de las dos piscinas (Figura3C).
- Coloque la mezcla sobre hielo debajo de la capucha.
- Trasplante intraventricular
- Prepare la jaula con la madre y los cachorros P0 en una mesa lejos de la zona del operador quirúrgico.
- Coloque una jaula de recuperación en un carro cerca de la capucha.
- Coloque una mezcla de aserrín extraída de la jaula de la madre en la parte inferior de la jaula de recuperación y colóquela debajo de una lámpara.
- Aun así, ponga una caja de hielo cubierta por una lámina de aluminio para la anestesia de cachorros P0.
- Justo antes del trasplante, agregue 1/10 volumen de solución de trazador celular (desde el paso 2.2.3) a 1 volumen de suspensión celular (desde el paso 3.1.16) y detecte 3 l de la "mezcla de inyección" resultante en una pieza de película de sellado de laboratorio.
- Coloque el cachorro en la lámina de aluminio fría durante 1 min y compruebe que esté completamente anestesiado.
NOTA: Para confirmar la anestesia, apriete suavemente una pata y controle el cachorro en busca de falta de movimientos, mientras respira. - Mientras tanto, aspirar los 3 l de mezcla de inyección (del paso 3.2.5) en el capilar de vidrio.
- Limpie suavemente la cabeza del cachorro anestesiado con un 70% de etanol.
- Coloque la barbilla del cachorro en la punta de la fibra óptica para identificar claramente los hemisferios corticales.
NOTA: En P0-P1, la piel de la cabeza es muy delgada, lo que permite una identificación visual directa de los hemisferios justo por encima de los globos oculares y detrás de las bombillas olfativas. - Mantener el capilar (cargado como se describe en el paso 3.2.7) en cualquiera de los dos planos de medio parasagittal (izquierda o derecha), por encima de la bombilla olfativa, y perforar la piel de la frente en su intersección con el plano frontal que contiene los centros de los globos oculares. Preste atención para no dañar los vasos sanguíneos. Introduzca el capilar en la corteza frontal y acceda a la cavidad ventricular (Figura4A).
- Para evitar daños accidentales de la eminencia gangliónica, gire la aguja lateralmente 30 grados, apuntando su punta caudal-medial-ward (Figura4B).
- Inyecte suavemente las células en la cavidad ventricular y monitoree su difusión por medio de Fast Green (Figura4C).
- Espera 5-10 s.
- Retire la aguja de vidrio teniendo cuidado de no aspirar la suspensión de la célula y deseche la aguja en un recipiente de eliminación adecuado.
- Antes de la recuperación del cachorro de la anestesia, inyecte 150 ml de solución de doxiciclina por vía intraperitoneal para mantener la expresión del transgén todavía desactivada después del trasplante.
- Después de la inyección, coloque el cachorro inmediatamente debajo de la lámpara para su recuperación.
- Dejar los cachorros debajo de la lámpara durante 5-10 minutos y, una vez completamente despierto, colocarlos en la jaula con la madre.
- Observe los cachorros operados durante 2-3 h, para asegurarse de que la madre los acepta.
- Suministrar a la jaula agua potable que contenga 0,5 mg/ml de doxiciclina y sacarosa de 50 g/L para mantener la expresión transgénica desactivada.
- Sustituya el agua que contiene doxiciclina por agua sin doxi4 días después del trasplante, activando así el transgén en las neuronas postmitóticas. Mantener a los ratones en un régimen libre de durante 6 días y eutanasiarlos en P10 por inhalación de dióxido de carbono seguida de decapitación.
4. Análisis de cerebros trasplantados
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Histología e inmunofluorescencia
- Eutanasia los cachorros trasplantados 10 días después del trasplante de células por inhalación de dióxido de carbono seguido de decapitación. Arreglar cerebros de cachorros eutanasiados en 4% paraformaldehído (PFA) a 4 oC durante la noche.
ADVERTENCIA: La PFA es altamente tóxica; manejarlo con cuidado, cumpliendo estrictamente con las prescripciones del fabricante, bajo una campana de humo químico; desechar el residuo de solución de PFA en un contenedor de residuos etiquetado. - Retire la solución de PFA y reemplácela por una solución de sacarosa al 30%.
- Dejar los cerebros a 4 oC o hasta que se hundan hasta el fondo del vial.
- Transfiera los cerebros a un molde de incrustación desechable aproximadamente medio lleno de medio crio-incluido.
- Congela los cerebros incluidos a -80 oC.
- Corta secciones coronales de 60 m de espesor usando un criostato.
NOTA: Evite emplear secciones más delgadas, ya que esto puede resultar en una pérdida inaceptable de información con respecto a toda la arquitectura de las neuronas individuales. - Secciones de proceso para inmunofluorescencia18,19, utilizando anticuerpos anti-GFP [1:400] y anti-RFP (mCherry) [1:500]. Núcleos de contrastaína con solución DAPI de 1 mg/ml [1:200].
- Eutanasia los cachorros trasplantados 10 días después del trasplante de células por inhalación de dióxido de carbono seguido de decapitación. Arreglar cerebros de cachorros eutanasiados en 4% paraformaldehído (PFA) a 4 oC durante la noche.
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Morfometría
- Establezca los parámetros de trabajo del microscopio confocal de la siguiente manera: altura de la pila z a 40 m; paso 2 m.
- Recoger imágenes de rebanadas inmunoensayos seleccionando campos fotográficos ricos en neuronas positivas de GFP, ciegos de distribución de señal RFP.
- Exporte las imágenes como archivos .nd2.
- Generar proyecciones Z máximas de ellos como archivos .tiff (Figura5A).
- Para permitir la esquelización neuronal subsecuencial ciega al genotipo de las células, oculte la señal roja. Para ello, abra cada archivo .tiff con un software adecuado y agregue una capa de ajuste. Seleccione "levels", "red", luego establezca "output" en cero. Guarde el archivo como tal.
NOTA: La esqueletización se realiza posteriormente por un operador nuevo que no tenía acceso previo a los archivos rojos sin formato originales. - Para cada archivo rojo oculto, añada una capa de dibujo a la imagen principal y seleccione la herramienta lápiz (color blanco). Rastrear el soma sobre la base de la señal GFP, luego rastrear los neurites.
NOTA: la herramienta de lápiz se puede ajustar en 40 píxeles para el soma y en tres píxeles para los neuróitas. - Guarde el archivo multicapa, incluidas las siluetas neuronales (Figura5B).
NOTA: Cualquier operador puede realizar un análisis posterior del esqueleto neuronal. - Crea un nuevo archivo de escala de grises de 1024 x 1024 de 16 bits con fondo negro, uno por neurona.
- Copie y pegue siluetas neuronales individuales de la imagen principal al nuevo archivo en escala de grises. Vuelva al archivo multicapa y desactive la capa de ajuste para desvelar los genotipos neuronales. Guarde el archivo en escala de grises de 16 bits que anota el genotipo neuronal correspondiente.
- Importe imágenes en escala de grises en ImageJ una por una y analice esqueletos mediante el plugin NeurphologyJ del software ImageJ20 (Figura 5C).
- Copiar datos primarios de NeurphologyJ (neurite_length, attachment_points y endpoints; para cada uno, tomar valores de "área total", pegarlos en una hoja de cálculo y emplearlos para calcular parámetros morfométricos secundarios ( longitud mediade la neurita, índice de ramificación) (Figura5D).
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Representative Results
Existen cinco conjuntos de datos principales que proporcionan información útil sobre aspectos clave del procedimiento, siendo el primero (1) la eficiencia de la transducción de precursores neuronales y la co-transducción por vectores lentivirales. (2) Un ejemplo de las características clave de los promotores empleados para impulsar el "gen de prueba". (3) Un ejemplo de células de ingeniería listas para el trasplante. (4) Una caricatura que incluye los detalles procesales clave de la microinyección celular en el cerebro neonatal. (5) Una sinopsis de toda la tubería morfométrica.
En cuanto a (1), se evaluó la capacidad de los vectores lentivirales prototípicos suministrados en diferentes MIM (2,4,8) para transducir eficazmente los precursores neocorticales. En el primer ensayo, los precursores neuronales procedentes de neocórticos de tipo salvaje temprano fueron infectados por un reportero lentiviral, albergando la secuencia de codificación mCherry (cds) bajo el control del promotor de pT-1 específico del linaje neuronogénico, en MOI 2, 4, 8, se permite diferenciar. El co-inmunoperfilamiento de sus progenies para mCherry y el marcador panneuronalTubb3 mostró que las neuronas fueron efectivamente transducidas a frecuencias de 64%, 69% y 78%, respectivamente (Figura1A). En un segundo ensayo, los precursores neocorticales fueron gravemente acuñados por dos reporteros lentivirales, expresando EGFP y mCherry, bajo el control del promotor constitutivo pPgk1, en los MOIs (2,2), (4,4) y (8,8). Unos días más tarde, la co-inmunoprofiling de sus derivados mostró que la relación entre EGFP+mCherry+ y EGFP+mCherry -células fue del 80%, 88% y 93%, respectivamente (Figura1B). Estos datos sugieren que, tras la entrega del protocolo de ingeniería previsto para el presente estudio, a) se transduyen la gran mayoría de las neuronas, y b) casi todas las neuronas transducidas recibieron el conjunto lentiviral completo necesario para su caracterización.
Figura 1 : Eficiencia de la transducción de células precursoras neuronales por vectores lentivirales. Los grupos especiales informan de una evaluación de la eficiencia mediante la cual se transducen (o co-transduyan) las células precursoras neocorticales E12.5 tras la entrega de reporteros lentivirales dedicados en diferentes multiplicidades de infección (MOI). En el primercaso (A ), las células se infectaron agudamente con el lentivirus (LV) pT-1-mCherry en MOI 2, 4, 8, cultivado en medio proliferativo durante 2 días, transferido a medio diferenciador, y se les permitió diferenciar durante 1 semana. Tras la fijación en el día in vitro (DIV) 9, los cultivos fueron co-inmunoperfilados para mCherry y el marcador panneuronal Tubb3. Las señales mCherry y EGFP fueron detectadas por anticuerpos primarios anti-RFP y anti-EGFP y reveladas por anticuerpos secundarios conjugados Alexa-594 y Alexa-488, respectivamente. Finalmente, se calcularon, promediaron y trazaron las proporciones mCherry+Tubb3+/ mCherryTubb3+. En este último caso (B), las células se infectaron agudamente con una mezcla de 1:1 de dos lentivirus, codificando para los transgenes pPgk-mCherry y pPgk-EGFP constitutivamente activos, en diferentes MO (2, 4, 8 para cada virus). Las células se cultivaron en medio proliferativo durante 4 días, se triprinizaron y, tras la fijación, se perfilaron para la inmunofluorescencia de mCherry y EGFP como se mencionó anteriormente. Finalmente, se calcularon, promediaron y trazaron las proporciones mCherry+EGFP+/ mCherryEGFP+. Las barras de error representan S.E.M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En cuanto a (2), los patrones de actividad pT-1 y pSyn pueden inferirse sobre la base de perfiles de expresión de genes de fluoroproteínabajo control. En este ejemplo, dicho control es directo en el caso de mCherry (Figura2A),e indirecto [es decir, mediado por una interfaz de segunda generación tetON (Figura 2E)], en el caso de EGFP (Figura 2B,C,D ). Ambos promotores son específicamente activos dentro de Tubb3+ neuronas postmitoticas (Figura 2B,C,D ), pero pT-1 también se dispara en un subconjunto de Ki67+ precursores intermitóticos (neuronogénicos)(Figura2A). Aquí, para proporcionar una idea de la variabilidad limitada de la actividad promotora cuando las células están diseñadas de acuerdo con estas condiciones estándar (Figura2E),pT-1- y pSyn-impulsado sniveles de expresión EGFP dentro de Tubb3 + neuronas fueron cuantificados por Tubb3+ neuronas fueron cuantificados por Plugin de histograma de Photoshop CS6. A continuación, los datos sin procesar se normalizaron con las medianas y se trazaron con los promotores (Figura2F). Sorprendentemente, los niveles de fluorescencia de una sola célula se agruparon densamente alrededor de las medianas: el primer y tercer cuartil equivalían a 0,86 y 1,16, así como 0,89 y 1,12 en los casos de pT-1 y pSyn, respectivamente.
Figura 2 : Perfilado de promotores específicos de precursores neuronales adecuados para impulsar la sobreexpresión GOI. Los paneles se refieren a la caracterización de los promotores de Tubulin alfa 1 (pT-1) y Synapsin (pSyn), específicamente activos dentro de todo el linaje neuronal y las neuronas postmitoticas, respectivamente. Las pruebas se realizaron en precursores neocorticales cosechados en diferentes edades embrionarias (En), agudamente infectados con mezclas lentivirales dedicadas [pT-1-mCherry in (A); pT-1-rtTA, TREt-EGFP in (B); pSyn-rtTA, TREt-EGFP in (C,D); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 g ); 2 /ml doxy ab initio], y cultivado en medio proliferativo (A), proliferativo (2 días) seguido de medio diferenciador (B,C), o medio diferenciativo (D). Tras la fijación en el día in vitro (DIV) n, las neuronas posmitoticas fueron identificadas por el código de la xtubb3 y los precursores intermitoticos por la inmunofluorescencia de Ki67; mCherry y EGFP se detectaron como se muestra en la Figura1. Las señales se revelaron como se muestra en la Figura1. Barras de escala: 100 m de entrada (A,B) y 50 m de (C,D). Se muestran (E) mezclas lentivirales dedicadas utilizadas en este estudio con referencias a los paneles de figuras. Se muestra una gráfica de dispersión (F) de pT-1- y pSyn-driven EGFP en Tubb3+ células mencionadas en (B) y (D), respectivamente. En caja son células que caen entre percentiles 25 y 75; bigotes se refieren a percentiles 10 y 90. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En cuanto a (3), 3 días después de la transducción lentiviral, las neuroesferas "verdes" MtaptEGFP/+ expresan las esferas pgk1p impulsadas por el promotor, la proteína fluorescente roja mCherry ("control") o no (esferas de prueba) (Figura3A,B). Todas las esferas se disocian a células individuales, asegurando que no haya grumos a la izquierda, y las suspensiones correspondientes se mezclan 1:1. La mezcla resultante (Figura3C)se coloca en hielo y se utiliza dentro de los 20 minutos para el trasplante.
Figura 3 : Ejemplo de prueba ("sólo verde") y control ("verde-rojo") neuesferas DIV2 y suspensión celular lista para el trasplante. (A,B) Estas esferas se obtuvieron de precursores neocorticales MtaptEGFP/+E 12.5, agudamente infectados por mezclas lentivirales "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (A) y "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (B), respectivamente, cada uno en MOI 8, y mantenido en medio proliferativo. (C) La suspensión celular se obtuvo disociando las neuroesferas de "prueba" y "control" (A,B) a células individuales y mezclándolas 1:1. Barras de escala: 200 m de entrada (A,B) y 100 m de (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En cuanto a (4), el procedimiento para la inyección celular en el cerebro neonatal incluye tres pasos clave. El capilar, colocado en el plano medio parasagittal, se introduce en la cavidad ventricular lateral a través de la pared cortical frontal (Figura4A). A continuación, para evitar daños de la eminencia gangliónica, el capilar se gira 30o dentro del plano horizontal, de modo que la punta apunta medialmente/caudalmente (Figura4B). Por último, la suspensión celular se expulsa delicadamente en la cavidad ventricular lateral, donde forma una "nube" fácilmente distinguible, de color azul claro (Figura4C).
Figura 4 : Esquemas de los tres pasos del procedimiento empleado para la inyección celular en el cerebro neonatal. (A) El capilar se introduce en el ventrículo lateral a través de la pared neocortical frontal. Luego, (B) se gira hacia el medial, para evitar daños por eminencia gangliónica. Finalmente (C),la suspensión celular se inyecta suavemente en el ventrículo lateral, donde forma una nube azul claro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En cuanto a (5), el procedimiento analítico incluye cuatro pasos principales. En primer lugar, las secciones confocales ópticas de los campos ricos en neuronas trasplantadas se aplanan, de acuerdo con la modalidad de proyección Z MAX, generando así archivos RGB .tiff. Aquí, como ejemplo, sólo las neuronas de "prueba verde" y las neuronas de "control amarillo", procedentes de precursores co-trasplantados, se pueden distinguir fácilmente (cabe señalar que mCherry puede utilizarse alternativamente para etiquetar las neuronas de "prueba") (Figura 5A). A continuación, una versión lucida de la cámara esqueletizada idealizada de la imagen es generada por un software gráfico adecuado (véase el paso 4.2.6) (Figura5B)por un operador ciego de canal rojo. La ceguera del canal rojo es de suma importancia para evitar cualquier sesgo involuntario en la evaluación de datos. A continuación, las siluetas de una sola persona neuronal se introducen en el software NeurphologyJ como imágenes en blanco y negro y los valores de los tres parámetros principales "número total de puntos de salida" (attachment_points), "número total de puntos finales" (puntos finales) y "total longitud de neurita" (neurite_length) se recogen (Figura 5C). Por último, los parámetros secundarios de cada neurona son calculados, promediados y evaluados estadísticamente por el software de Excel (Figura5D).
Figura 5 : Diagrama de flujo representativo del análisis morfométrico de cerebros trasplantados. Los paneles de fila superior muestran: (A) una imagen .tiff de proyección z MAX de neocórtex medial, fija 10 días después del trasplante de células de ingeniería (verde - Mtapt-impulsado por Mtapt, EGFP con restricciones de neuronas; rojo - mCherry, etiquetando constitutivamente células de "control"; azul - azul DAPI), la señal del canal verde, y (B) su representación e-camera lucida esqueletizada. Barras de escala: 50 m. La fila inferior incluye: (C) parámetros morfométricos primarios extraídos de esqueletos neuronales por análisis de software NeurphologyJ (neurite_length como li, attachment_points as Nexit y puntos finales como N end) y (D) parámetros secundarios calculados sobre su base. Esta cifra ha sido modificada de Chiola et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los aspectos/pasos específicos de este procedimiento son críticos y requieren una atención especial. En primer lugar, (a) los operadores deben estar adecuadamente preparados para manipular de forma segura los lentivirus en un entorno de laboratorio compatible con BSL-2. En segundo lugar, b) antes de mezclar las preparaciones neuronales de "prueba" y "control", es obligatorio lavar cuidadosamente las dos suspensiones de neuroesfera correspondientes como se describe, con el fin de prevenir cualquier infección cruzada retrasada de las dos preparaciones debido a llevar adelante. En tercer lugar, c) mientras se trasplantan las células, se debe tener cuidado mientras se dirige a la cavidad ventricular; en este sentido, el trazador Fast Green incluido en la suspensión celular es de ayuda sustancial. Además, (d) para prevenir el canibalismo, los cachorros trasplantados deben ser retransferidos a la madre sólo después de su recuperación completa de la anestesia (generalmente 10 min es suficiente). (e) La crio-sección del tejido trasplantado debe realizarse a 60 m; de hecho, este grosor permite simultáneamente una fácil penetración de anticuerpos en el tejido y limita la pérdida de información procedente de la fragmentación artística de la neurona. Por último, (f) para evitar cualquier sesgo involuntario en la evaluación de datos, enfatizamos que la esqueletolamización de neuronas debe ser realizada por un operador ciego de canal rojo.
El protocolo descrito aquí se refiere a las manipulaciones genéticas GOF. Alternativamente, las neuronas de "prueba" pueden ser diseñadas para regular la función GOI por medio de lentivirus codificación para los efectores de ARNi. A continuación, normalmente empleamos mCherry para etiquetar las células neuronales "controladas"; sin embargo, el esquema mCherry/"control" y LacZ/"test" puede estar obviamente invertido. Por último, el protocolo descrito aquí se refiere a las inyecciones de células intraventriculares; Las neuronas de "prueba" y "control" pueden ser alternativamente co-inyectadas en el parenchima neural21.
A pesar de sus ventajas, este método tiene dos límites principales. Si bien permiteinvestigar el control celular -autónomo del gen de la neuroarquitectura, no se aplica al control ambiental de la misma. Además, a medida que los precursores neuronales trasplantados migran desde el aspecto ventricular de la pared cortical hasta su ubicación laminar final después del nacimiento (es decir, dentro de un período de tiempo no fisiológico), este método debe emplearse preferentemente para modelar control neuroarquitectónico después de la finalización de la migración.
Por último, pero no menos importante, se debe prestar especial atención a la interpretación crítica de los resultados. En particular, si el gen X sujeto de investigación reduce la complejidad morfológica de las neuronas "test", esto podría no reflejar específicamente su impacto genuino en la arquitectura de las neuronas. Más bien, tal fenómeno podría ser un índice no específico de daño neuronal provocado por la sobreexpresión de X. Para abordar este problema, puede ser útil comparar las densidades locales de las neuronas trasplantadas, "pruebas" y "control", luego buscar una posible contracción numérica de la población de "prueba", como un índice de sufrimiento neuronal inducido por X [esta contracción debe ser aún más se pronunció sobre un análisis más tardío de los cerebros trasplantados]. En tales casos, reducir el nivel de overepresión del gen X o pasar a un diseño de pérdida de función podría solucionar el problema.
Nuestro método se suma a una amplia gama de tecnologías empleadas para investigar el control genético de la morfología neuronal in vivo1,2,3,4,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. Como se recuerda en la introducción, estas tecnologías se basan en una variedad de manipulaciones genéticas ad hoc destinadas a perturbar los niveles de expresión de GOI y facilitar la extracción de información morfológica de las muestras biológicas. Estas tecnologías generalmente permiten la disección precisa de este control; sin embargo, no requieren habilidades experimentales valiosas y recursos financieros. A este respecto, el método ofrece tres ventajas clave. Permite un control preciso de los niveles de expresión GOI comparables a los propios de los modelos transgénicos; sin embargo, en ausencia de costos de mantenimiento de colonias mutantes. No requiere habilidades experimentales sofisticadas (quirúrgicas). A menudo logra la significación estadística de los resultados tras el análisis de un número relativamente limitado de animales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Mihn Duc Do por su contribución a la configuración temprana de este procedimiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
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