Summary
Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.
Abstract
Die Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur wird derzeit intensiv untersucht. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, die entwickelt wurde, um die in vivo Genkontrolle der neokortikalen Projektionsneuronenmorphologie zu untersuchen. Diese Methode basiert auf (1) in vitro lentiviralen Engineering sernischen Vorläufern als "Test"- und "Kontrollzellen", (2) ihrer Co-Transplantation in Wild-Gehirne und (3) gepaarter morphometrischer Auswertung ihrer neuronalen Derivate. Konkret werden dafür E12.5 palliale Vorläufer von panneuronalen, genetisch gekennzeichneten Spendern eingesetzt. Sie sind so konzipiert, dass sie ausgewählte Promotoren und tetON/OFF-Technologie nutzen, und sie werden freihändig in neonatale Querventrikel transplantiert. Später, nach der Immunfluoreszenzprofilierung von Empfängergehirnen, werden Silhouetten transplantierter Neuronen in NeurphologyJ Open Source Software eingespeist, ihre morphometrischen Parameter extrahiert und die durchschnittliche Länge und der Verzweigungsindex berechnet. Im Vergleich zu anderen Methoden bietet diese drei Hauptvorteile: Sie ermöglicht die Erzielung einer feinen Kontrolle der Transgenexpression zu erschwinglichen Kosten, sie erfordert nur grundlegende chirurgische Fähigkeiten und liefert statistisch zuverlässige Ergebnisse bei der Analyse einer begrenzten Anzahl der Tiere. Aufgrund seines Designs reicht es jedoch nicht aus, die nicht zellautonome Kontrolle der Neuroarchitektur zu adressieren. Darüber hinaus sollte es vorzugsweise verwendet werden, um die Kontrolle der Neuritenmorphologie nach Abschluss der neuronalen Migration zu untersuchen. In ihrer gegenwärtigen Formulierung ist diese Methode exquisit abgestimmt, um die Genkontrolle der glutamatergen neokortikalen Neuronenarchitektur zu untersuchen. Unter Ausnutzung transgener Linien, die EGFP in anderen spezifischen neuronalen Zelltypen exemiten, kann es umfunktioniert werden, um die Genkontrolle ihrer Architektur zu adressieren.
Introduction
Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die wir entwickelt haben, um die in vivo Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur zu sezieren. Basierend auf in vitro Engineering von neuronalen Vorläufern, ihre Transplantation in neonatale Gehirn und gepaart morphometrische Bewertung von "Test" und "Kontroll" Zellen, ermöglicht es, funktionelle Auswirkungen von Testgenen in der feinen Kontrolle der neuronalen Morphologie in einem schnell und erschwinglich. Um die In-vivo-Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, müssen drei wichtige technische Fragen angegangen werden: (1) Die Erreichung einer angemessen gemusterten Gen-of-Interest-Expression (GOI) und eine genaue quantitative Kontrolle dieser Expression; (2) Eine korrekt segmentierte Visualisierung unterschiedlicher neuronaler Silhouetten zu erhalten; (3) Statistische Signifikanz der Ergebnisse bei der Verwendung einer begrenzten Anzahl von Tieren.
Wenn verfügbar, können Maus-Mutantenlinien, die Tetracyclin (tet)-gesteuerte Transgene beherbergen, das beste Werkzeug sein, um das erste Problem zu beheben1. Alternativ kann eine somatische Transgenese eingesetzt werden. In solchen Fällen wird das Transgen über Elektroporation2 oder virale Transduktion3geliefert. Als nächstes wird es als Episom (z.B. bei Standardelektroporation4) beibehalten oder in das Genom integriert (zufällig über retrovirale Integrase5; oder an einem definierten Ort, über CRISPR-geförderte homologe Rekombination (SLENDR)6 ).
Zweitens kann die neuronale Silhouettenvisualisierung durch (a) eine spärliche einheitliche Kennzeichnung oder (b) dichte Differentialbeschriftung erreicht werden. Wie für die spärliche Etikettierung können fortschrittliche Golgi-ähnliche Methoden verwendet werden7, ausgewählte neuronale Minisets können mit Biocytin8gefüllt werden, und Salz-und-Pfeffer-Etikettierung kann dank einer spärlich exprimierenden Transgene erhalten werden. Ein solches Transgen kann eine bunte Transkription (Thy-EGFP)9 aufweisen oder durch stochastische Rekombination (MORF) aktiviert werden10. Was (b) betrifft, so umfassen die modernsten Strategien die cre-vermittelte stochastische Rekombination innerhalb eines multi-floxierten Fluorprotein-Transgen-Arrays (Brainbow)11, sowie die piggyBac-transposase-getriebene genomische Integration von Fluorproteingenen, über somatische Transgenese (CLoNE)12geliefert.
Was die dritte Ausgabe betrifft, so wird das morphometrische Ergebnis häufig durch eine große zufällige Variabilität beeinflusst, die auf Unterschiede zwischen den Tieren und Zellinjektionskontingenten beruht. Aus diesem Grund wird in der Regel eine große Anzahl von Tieren eingesetzt, um die statistische Leistung zu erreichen, die für die Bewertung der morphometrischen Aktivität der ausländischen Aktivitäten erforderlich ist.
Die zuvor beschriebenen Ansätze beruhen häufig auf fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten und erfordern auffällige finanzielle Ressourcen, die ihre Verbreitung innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft einschränken können. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine einfache und einfache Pipeline konzipiert, um die Genkontrolle der Neuroarchitektur in vivo schnell und erschwinglich zu sezieren. Dies ist inspiriert von einem ähnlichen Co-Transplantations-Design, das zuvor für die schnelle in vivo-Bewertung der antiblastischen Transgenaktivität13entwickelt wurde.
Insbesondere wird angenommen, dass die Co-Transplantation von in vitro entwickelten "grünen" neuronalen Vorläufern ("Test"- und "Kontrollzellen") in ein "schwarzes" neonatales Gehirn gleichzeitig die drei oben aufgeführten Schlüsselprobleme beheben kann. Tatsächlich ermöglicht die in vitro lentivirale Entwicklung von Vorläufern unter gut kontrollierten Bedingungen die Aufrechterhaltung der Variabilität der neuronalen Transgenexpression auf ein Minimum, weit unter dem, das normalerweise mit in vivo somatischen Manipulationen verbunden ist (zuvor durchgeführt 14 , 15 und in unseren unveröffentlichten Ergebnissen). Die daraus resultierende genaue Kontrolle der Genexpression ist vergleichbar mit der von tet-kontrollierten transgenen Modellen. Die Kosten dieses Verfahrens liegen jedoch weit unter denen, die aus der Wartung einer transgenen Mauslinie stammen. Als nächstes ist die Freihandinjektion einfach und erfordert minimales Training. Darüber hinaus kann die Menge der in jedes Gehirn injizierten markierten Vorläufer leicht darauf abgestimmt werden, eine ausreichende kumulative Anzahl von dünn verteilten Vorläufern zu erreichen, während gleichzeitig die Gesamtzahl der transplantierten Tiere auf ein Minimum beschränkt bleibt. Last but not least wirken die Co-Injektion unterschiedlich fluormarkierter, "test" und "kontrollierter" Vorläufer und die anschließende paarweise statistische Analyse der Ergebnisse den Auswirkungen der versuchsweisen Variabilität zwischen Dentieren entgegen, die das Erreichen von statistische Signifikanz der Ergebnisse, auch nach der Analyse einer begrenzten Anzahl von Personen13.
Es sollte betont werden, dass diese Methode, wenn auch schnell und billig, zwei Hauptbeschränkungen hat. Erstens wurde es entwickelt, um die zellautonome Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, und es ist nicht angemessen, sich mit der Umweltkontrolle zu befassen. Zweitens ist diese Methode, da transplantierte neuronale Vorläufer durch einen heterochronischen Zeitplan ihren endgültigen Standort erreichen, dem Modell der neuroarchitektonischen Kontrolle nach der Migration vorzuziehen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden und Verfahren wurden vom SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC) zugelassen.
1. Erzeugung von "grünen" Vorläuferpools
- Vorbereitung des "grünen" Pools
- Mate eine wilde CD1 Hündin mit einem MtaptEGFP/+ Gründer16. Euthanisieren Sie die schwangere Mutter durch Zervixdislokation bei 12,5 Tagen nach dem Koitum (Tag 0 wird durch vaginale Steckerinspektion bestimmt) und ernten Sie den embryonalen Tag 12.5 (E12.5) Embryonen. Stellen Sie sie in einzelne Brunnen einer 24 Multiwell-Platte in kalter PBS-Lösung ein.
- Schnell genotypisieren die Embryonen durch visuelle Inspektion unter einer blauen Lichtlampe, Überprüfung auf grüne Fluoreszenzemission im Gehirn.
- Legen Sie die "grünen" Embryonen in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm, gefüllt mit kalten 1x PBS mit 0,6% Glukose, und übertragen Sie sie unter ein Stereomikroskop.
- Schneiden Sie die Embryoköpfe mit standardscheren und extrahieren Sie das Telencephalon aus ihnen mittels #3 und #5 Zangen.
- Trennen Sie die beiden telenzephalen Vesikel und sezieren Sie die Neokortika mit Zangen; achten Sie darauf, den Hippocampus und die Basalganglien17zu entfernen.
- Sammeln Sie Neokortika, indem Sie sie mit einer P1000 Pipette in ein 1,5 ml Rohr auf Eis gehalten.
- Lassen Sie die sezierten Neokortiker auf dem Boden der Röhre absetzen.
- Aspirieren Sie den Überstand so viel wie möglich.
- Setzen Sie die Neocortice in 400 l frischem proliferativen Medium [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 0,6% Glukose, 2 g/ml Heparin, 20 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 1X Pen-Strep, und 10 pg/ml Amphotericin B].
- Die Neokortiker nach oben und unten, sequenziell mit P1000- und P20-Spitzen, 4x pro Spitze, vorsichtig pipette, um eine trübe Zellsuspension zu erhalten.
HINWEIS: E12.5 neokortikales Gewebe ist sehr weich; Die Dissoziierung an einzelne Zellen erfordert überhaupt keine enzymatische Verdauung; wiederholte Pipettierung ist ausreichend. - Lassen Sie die Meningen und restlichen neokortikalen Klumpen für 2 min absetzen.
- Übertragen Sie 150 l von der Oberseite der Zellsuspension (hauptsächlich mit Einzelzellen) in ein neues 1,5 ml steriles Rohr.
- Fügen Sie 150 l frisches proliferatives Medium hinzu und wiederholen Sie die Schritte 1.1.10-1.1.12, bis keine Gewebeklumpen mehr sichtbar sind. Lassen Sie dabei den Pipettierschritt P1000 aus (in Schritt 1.1.10).
HINWEIS: Drei Iterationen der Schritte 1.1.10-1.1.12 reichen in der Regel aus, um eine vollständige Gewebetrennung zu erreichen. - Zählzellen ("grüner" Pool) mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode in einer Bürker-Kammer17 und frisches proliferatives Medium hinzufügen, um die Konzentration auf 103 Zellen/L einzustellen.
HINWEIS: Die Schritte 1.1.7-1.1.14 müssen unter einer sterilen laminaren Durchflusshaube durchgeführt werden, die mit 70 % Ethanol desinfiziert und mindestens 20 min belüftet bleibt.
- Engineering der "grünen" Subpools
- Unterteilen Sie den "grünen" Pool in zwei Unterpools in zwei unterschiedliche 1,5 ml-Röhren für lentivirale Infektionen.
- Infizieren Sie die Subpools unabhängig mit den beiden dedizierten lentiviralen Mischungen. Jede Mischung enthält "red label" Virus (Pgk1_mCherry) oder "black" Virus (pCAG_lacZ) als Kontrolle, sowie Viren für tetOFF getriebentransgene (Pgk1p_tTA und TRE_transgene) oder Kontrolle (Pgk1p_tTA und TRE_PLAP) Ausdruck.
VORSICHT: Manipulieren Sie Lentiviren in einer BLS-2-Umgebung mit allen Schutzmessungen, die in den geltenden Regeln und Gesetzen vorgeschrieben sind.
HINWEIS: Jedes Lentivirus muss bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 8 verabreicht werden, die (wie zuvor gezeigt14) ausreichen, um die überwiegende Mehrheit der Nervenzellen unter solchen experimentellen Bedingungen zu transduzieren (Abbildung 1). Das Lentivirus, das Tet-Transaktivatoren beherbergt, kann durch den Einsatz verschiedener neuronaler Promotoren, die die tTA/rtTA-Expression antreiben (z. B. pT-1, pSyn, pCaMKII, pGAD1 usw.), aufgebaut werden. (Abbildung 2). Das MOI ist das Verhältnis von (a) der Anzahl der infektiösen Viruspartikel, die zu (b) der Anzahl ihrer Zielzellen abgegeben werden. Hierbei wird ersteres (a) nach dem an anderer Stelle beschriebenen konventionellen Verfahren berechnet14, letzteres (b) wird einfach mit einer Bürkerkammer ausgewertet. - Platte 600.000 Zellen jedes infizierten Subpools pro Brunnen einer 12 Mehrwellplatte, in 600 l proliferativem Medium mit 2 g/ml Doxycyclin.
HINWEIS: Hier werden Brunnen nicht mit Polylysin vorbehandelt, was die Anhaftung von nerventonenförmigen Zellen an ihren Böden verhindert. - Übertragen Sie die Zellen in 5%CO2 bei 37 °C in den Inkubator.
- Nach 2 Tagen, um die Effizienz der Infektion und die Differentialmarkierung der technischen Pools zu bewerten, inspizieren Sie die Zellen unter einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop. Die beiden Unterpools müssen als Suspensionen kleiner Neurosphären erscheinen, die das rote fluoreszierende Protein homogen ausdrücken ("Kontrollprobe") oder nicht ("Test"-Probe). Innerhalb dieser Neurosphären ist das Mtapt EGFP-Transgen auf eine Minderheit von Zellen (post-mitotische Neuronen) beschränkt und in den meisten von ihnen stumm (prolifeierende Vorläufer) (Abbildung3).
2. Einrichtung der chirurgischen Instrumente und des Operationsbereichs
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Zubereitung von Borosilikatnadeln
- Verwenden Sie die Borosilikatglaskapillaren mit Außen- und Innendurchmessern von 1,5 mm bzw. 1,12 mm.
- Ziehen Sie die Kapillare mit einem P 1000 Abzieher.
- Richten Sie das Ziehprogramm ein. Typische Programmparameter sind: Wärme = 614; vel = 60; Zeit = 1; Druck = 600. Sie müssen entsprechend dem Abziehermodell und dem eingesetzten Heizwiderstand eingestellt werden.
- Legen Sie die Kapillare in die Pullerhalter und ziehen Sie sie fest.
- Starten Sie das Programm und nehmen Sie die beiden gezogenen Mikrokapillaren.
- Schneiden Sie die Kapillarspitze mit einem Skalpell unter dem Stereomikroskop von Hand, um eine Spitze mit einem Außendurchmesser von 200-250 m zu erhalten.
- Die Kapillaren auf einen Modellton (z.B. Plastilin) in eine geschlossene Petrischale legen und unter die Haube geben.
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Einrichten der Haube und Vorbereitung der Zell-Tracer-Lösung
- Reinigen Sie die horizontale Durchflusshaube sorgfältig und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol.
- Disfizieren Sie optische Fasern mit 70% Ethanol und legen Sie sie unter die Haube.
- Mischen Sie 10 l von 125 mM EGTA-Lösung und 10 l Fast Green, um die "Zell-Tracer-Lösung" vorzubereiten und unter die Haube zu legen.
- Kleine Stücke (4 cm x 2 cm Größe) von Labor-Dichtungsfolie für Zellsuspensions-Spotting schneiden.
- Bereiten Sie eine Lösung von 1 mg/ml sterilem Doxycyclin vor und aspirieren Sie sie in eine 0,3 ml Spritze.
- Schalten Sie die Haube ein und halten Sie den laminaren Durchfluss 20 min vor dem Betrieb eingeschaltet.
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Montage des Injektionsrohres
- Nehmen Sie ein Hartplastik-Mundstück, zwei Latexrohre (jeweils ca. 30 cm lang) und einen Kapillarhalter aus einem Aspiratorrohr-Montagesatz für kalibrierte Mikrokapillarpipetten.
- Befestigen Sie das Hartplastik-Mundstück an einem Ende eines Latexrohrs.
- Befestigen Sie den Kapillarhalter an einem Ende eines anderen Latexrohrs.
- Verbinden Sie die freien Enden der beiden Latexröhren mit einem 0,45 m sterilen Filter als Barriere gegen Bedienerkeime.
- Legen Sie die resultierende Aspiratorrohranordnung auf einen Modelltonhalter, der unter der Haube aufbewahrt werden soll.
3. Zellmischung und intraventrikuläre Transplantation
- Mischen von "Test" und "Control" grüner Zell-Unterpools
- Sammeln Sie "Test" und "Kontroll" Neurosphären (siehe Schritt 1.2.5) in separaten 1,5 ml Röhren.
- Zentrifugen-Neurosphären Suspension bei 200 g für 5 min.
- Sammeln und entsorgen Sie den Überstand, um Störungen des Zellpellets zu vermeiden.
- Resuspendneurosphären in 500 l von 1x PBS.
- Zentrifugieren Sie sie bei 200 g für 1 min.
- Entfernen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.4-3.1.6 zwei weitere Male.
- Heben Sie Kugeln in 200 l 2x Trypsin-Lösung (2x Trypsin, 1x PBS) und Pipettenzellpellet auf und ab 4x-5x ab.
HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu machen. - Lassen Sie die Zellen 5 min bei 37 °C im Inkubator, um eine einzellige Suspension zu erreichen.
- Blockieren Sie Trypsin mit 200 L Trypsin-Inhibitorlösung (DMEM-F12, 10 g/mL DNAse I, 0,28 mg/ml Trypsin-Inhibitor) durch Pipettieren von 4x-5x.
- Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min und setzen sie in 1 ml frischem proliferativen Medium (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 mg/mL BSA, 0,6% Glukose, 2 g/ml Heparin, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x Pen-Strep, 10 pg/ml Amphotericin B).
- Zählen Sie Zellen der beiden Becken mit Trypanblau-Ausschlussmethode in einer Bürker-Kammer.
- Passen Sie ihre Konzentration auf 100.000 Zellen/L in proliferativem Medium an.
- Mischen Sie 1:1 "Test"-Zellen mit "Kontrollzellen".
- Überprüfen Sie die resultierende Mischung unter einem Fluoreszenzmikroskop (Objektivvergrößerung: 10x), um sicherzustellen, dass es sich bei der Mischung um eine einzellige Suspension der beiden Becken handelt (Abbildung 3C).
- Legen Sie die Mischung auf Eis unter der Haube.
- Intraventrikuläre Transplantation
- Bereiten Sie den Käfig mit der Mutter und den P0 Welpen auf einem Tisch weit weg vom chirurgischen Bedienerbereich vor.
- Legen Sie einen Bergungskäfig auf einen Wagen in der Nähe der Motorhaube.
- Legen Sie eine Mischung aus Sägemehl aus dem Käfig der Mutter auf den Boden des Bergungskäfigs und legen Sie es unter eine Lampe.
- Beiseite, stellen Sie eine Eiskiste mit einer Aluminiumfolie für die Anästhesie von P0 Welpen bedeckt.
- Kurz vor der Transplantation 1/10 Volumen der Zelltracerlösung (ab Schritt 2.2.3) auf 1 Volumen der Zellsuspension (ab Schritt 3.1.16) und Punkt 3 l des resultierenden "Injektionsmixes" auf einem Stück Labor-Dichtungsfolie hinzufügen.
- Legen Sie den Welpen 1 min auf die kühle Aluminiumfolie und überprüfen Sie, ob er vollständig beästhetisiert ist.
HINWEIS: Um die Anästhesie zu bestätigen, drücken Sie vorsichtig eine Pfote und überwachen Sie den Welpen auf Bewegungsmangel, während Sie noch atmen. - In der Zwischenzeit die 3 l Injektionsmischung (ab Schritt 3.2.5) in die Glaskapillare aspirieren.
- Wischen Sie den Kopf des anästhesierten Welpen vorsichtig mit 70% Ethanol ab.
- Legen Sie das Kinn des Welpen auf die Spitze der optischen Faser, um die kortikalen Hemisphären eindeutig zu identifizieren.
HINWEIS: Bei P0-P1 ist die Kopfhaut sehr dünn, was eine einfache visuelle Identifizierung der Hemisphären direkt über den Augäpfeln und hinter den Olfaktor-Lampen ermöglicht. - Bewahren Sie die Kapillare (wie in Schritt 3.2.7 beschrieben) in einer der beiden Mittelparasagittalebenen (links oder rechts) über der Olfaktor-Glühbirne auf und durchstechen Sie die Stirnhaut an ihrer Schnittweite mit der Frontalebene, die die Augäpfelzentrierten enthält. Achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Geben Sie die Kapillare in den frontalen Kortex ein und greifen Sie auf die ventrikuläre Kavität zu (Abbildung 4A).
- Um eine versehentliche Beschädigung der Ganglioneneing zu verhindern, drehen Sie die Nadel seitlich um 30 Grad und zeigen ihre Spitze kaudal-medial-ward (Abbildung 4B).
- Injizieren Sie die Zellen vorsichtig in die ventrikuläre Höhle und überwachen Sie deren Diffusion mit Fast Green (Abbildung 4C).
- Warten Sie 5-10 s.
- Entfernen Sie die Glasnadel, um die Zellsuspension nicht zu aspirieren und entsorgen Sie sie in einem geeigneten Entsorgungsbehälter.
- Vor der Rückgewinnung des Welpen von der Anästhesie injizieren 150 l Doxycyclinlösung intraperitoneal, um die Transgenexpression nach der Transplantation noch ausschalten zu lassen.
- Legen Sie den Welpen nach der Injektion sofort unter die Lampe, um sich zu erholen.
- Lassen Sie die Welpen unter der Lampe für 5-10 min und, einmal vollständig wach, legen Sie sie in den Käfig mit der Mutter.
- Beobachten Sie die operierten Welpen für 2-3 h, um sicherzustellen, dass die Mutter sie akzeptiert.
- Den Käfig mit Trinkwasser zu versorgen, das 0,5 mg/ml Doxycyclin und 50 g/L Saccharose enthält, um die Transgenexpression fern zu halten.
- Ersetzen Sie das doxycyclinhaltige Wasser 4 Tage nach der Transplantation durch doxyfreies Wasser und aktivieren Sie so das Transgen in postmitotischen Neuronen. Halten Sie Mäuse 6 Tage lang in einem doxyfreien Regime und einschläfern Sie sie bei P10 durch Kohlendioxid-Inhalation, gefolgt von Enthauptung.
4. Analyse transplantierter Gehirne
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Histologie und Immunfluoreszenz
- Euthanisieren Sie die transplantierten Welpen 10 Tage nach der Zelltransplantation durch Kohlendioxid-Inhalation, gefolgt von Enthauptung. Fix Gehirne von eingeschläferten Welpen in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C über Nacht.
VORSICHT: PFA ist hochgiftig; mit Sorgfalt, streng nach Herstellervorschriften, unter einer chemischen Rauchhaube zu behandeln; PFA-Lösung restaiiert in einem markierten Abfallbehälter zu entsorgen. - Entfernen Sie die PFA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 30% Saccharoselösung.
- Lassen Sie das Gehirn bei 4 °C oder bis sie auf den Durchstechflasche boden sinken.
- Übertragen Sie die Gehirne in eine Einweg-Einbettform etwa halb gefüllt mit Kryo-Inklusionsmedium.
- Einfrieren der mitgelieferten Gehirne bei -80 °C.
- Schneiden Sie 60 'm dicke koronale Abschnitte mit einem Kryostat.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung dünnerer Abschnitte, da dies zu einem inakzeptablen Verlust von Informationen über die gesamte Architektur einzelner Neuronen führen kann. - Prozessabschnitte für Immunfluoreszenz18,19, mit Anti-GFP [1:400] und Anti-RFP (mCherry) [1:500] Antikörper. Counterstain-Kerne mit 1 mg/ml DAPI-Lösung [1:200].
- Euthanisieren Sie die transplantierten Welpen 10 Tage nach der Zelltransplantation durch Kohlendioxid-Inhalation, gefolgt von Enthauptung. Fix Gehirne von eingeschläferten Welpen in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C über Nacht.
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Morphometrie
- Einstellen der Arbeitsparameter des konfokalen Mikroskops wie folgt: Z-Stack-Höhe = 40 m; Schritt = 2 m.
- Sammeln Sie Bilder von immunoassayed Scheiben Auswahl GFP positive neuronreiche fotografische Felder, blind von RFP-Signalverteilung.
- Exportieren Sie die Bilder als .nd2-Dateien.
- Generieren Sie maximale Z-Projektionen von ihnen als .tiff-Dateien (Abbildung 5A).
- Um eine subsesequenzielle neuronale Skelettierung zu ermöglichen, die blind für den Zellgenotyp ist, blenden Sie das rote Signal aus. Öffnen Sie dazu jede .tiff-Datei mit einer geeigneten Software, und fügen Sie eine Anpassungsschicht hinzu. Wählen Sie "levels", "red", dann setzen Sie "Output" auf Null. Speichern Sie die Datei als solche.
HINWEIS: Die Skelettierung wird anschließend von einem neuen Operator durchgeführt, der zuvor keinen Zugriff auf originale rote Dateien hatte. - Fügen Sie für jede ausgeblendete rote Datei dem primären Bild eine Zeichnungsebene hinzu, und wählen Sie das Bleistiftwerkzeug (weiße Farbe). Verfolgen Sie das Soma auf der Grundlage des GFP-Signals, und verfolgen Sie dann die Neuriten.
HINWEIS: Das Bleistiftwerkzeug kann für das Soma auf 40 Pixel und für Neuriten auf drei Pixel eingestellt werden. - Speichern Sie die mehrschichtige Datei einschließlich neuronaler Silhouetten (Abbildung 5B).
HINWEIS: Die anschließende Analyse des neuronalen Skeletts kann von beiden Operatoren durchgeführt werden. - Erstellen Sie eine neue 1024 x 1024 16-Bit-Graustufendatei mit schwarzem Hintergrund, eine pro Neuron.
- Kopieren und fügen Sie einzelne neuronale Silhouetten aus dem primären Bild in die neue Graustufendatei ein. Kehren Sie zur Mehrschichtdatei zurück und schalten Sie die Einstellungsschicht aus, um neuronale Genotypen zu enthüllen. Speichern Sie die 16-Bit-Graustufendatei mit Anmerkungen zum entsprechenden neuronalen Genotyp.
- Importieren Sie Graustufenbilder in ImageJ nacheinander und analysieren Sie Skelette von NeurphologyJ Plugin der ImageJ-Software20 (Abbildung 5C).
- Kopieren Sie NeurphologyJ-Primärdaten (neurit_length, attachment_points und endpoints; für jeden nehmen Sie "Gesamtfläche"-Werte), fügen Sie sie in eine Kalkulationstabelle ein und verwenden Sie sie, um sekundäre morphometrische Parameter zu berechnen ( durchschnittliche Neuritenlänge, Verzweigungsindex) (Abbildung 5D).
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Representative Results
Es gibt fünf primäre Datensätze, die nützliche Informationen über schlüsselwichtige Aspekte des Verfahrens liefern, wobei der erste (1) die Effizienz der transdiven Neuronater-Vorläufertransduktion und Co-Transduktion durch lentivirale Vektoren ist. (2) Ein Beispiel für die wichtigsten Merkmale der Promotor, die für den Antrieb des "Testgens" eingesetzt werden. (3) Ein Beispiel für vermehrt transplantierte technische Zellen. (4) Eine Karikatur mit wichtigen Verfahrensdetails der Zellmikroinjektion in das neonatale Gehirn. (5) Eine Zusammenfassung der gesamten morphometrischen Pipeline.
Was (1) betrifft, so wurde die Fähigkeit der prototypischen lentiviralen Vektoren, die an verschiedenen MOIs (2,4,8) abgegeben wurden, um neokortikale Vorläufer wirksam zu transduzieren, bewertet. Im ersten Test wurden neuronale Vorläufer, die aus frühen wilden Neokortika stammten, von einem lentiviralen Reporter infiziert, der die mCherry-Codierungssequenz (cds) unter der Kontrolle des neuronogen-leinenspezifischen pT-1-Promotors bei MOI = 2, 4, 8, differenzieren. Die Co-Immunoprofilierung ihrer Progenies für mCherry und den panneuronalen Marker Tubb3 zeigte, dass Neuronen effektiv bei Frequenzen von 64%, 69% bzw. 78% transduziert wurden (Abbildung 1A). In einem zweiten Test wurden neokortikale Vorläufer von zwei lentiviralen Reportern, die EGFP und mCherry unter der Kontrolle des konstitutiven pPgk1-Promoters ausdrückten, akut mitinfiziert, und zwar mit MOIs = (2,2), (4,4) und (8,8). Einige Tage später zeigte die Co-Immunoprofilierung ihrer Derivate, dass das Verhältnis zwischen EGFP+mCherry+ und EGFP+mCherry-Zellen 80 %, 88 % bzw. 93 % betrug (Abbildung1B). Diese Daten deuten darauf hin, dass nach Derdurchtion des für die vorliegende Studie vorgesehenen Technischen Protokolls (a) die überwiegende Mehrheit der Neuronen transduziert wird und b) fast alle transduzierten Neuronen den vollständigen lentiviralen Satz erhalten haben, der für ihre Charakterisierung erforderlich ist.
Abbildung 1 : Effizienz der neuralen Vorläuferzellen Transduktion durch lentivirale Vektoren. Panels berichten über eine Bewertung der Effizienz, mit der E12.5 neokortikale Vorläuferzellen nach Lieferung von engagierten lentiviralen Reportern an verschiedenen Infektionsmultiplizitäten (MOIs) transduziert (oder ko-transduced) werden. Im erstgenannten Fall (A) wurden die Zellen akut mit dem Lentivirus (LV) pT-1-mCherry bei MOI = 2, 4, 8 infiziert, 2 Tage lang im proliferativen Medium kultiviert, auf ein differenziatives Medium übertragen und 1 Woche lang differenzieren lassen. Bei der Fixierung am Tag in vitro (DIV) 9 wurden Kulturen für mCherry und den panneuronalen Marker Tubb3 mitimmunprofiliert. mCherry- und EGFP-Signale wurden von Anti-RFP- und Anti-EGFP-Primärantikörpern nachgewiesen und von Alexa-594- bzw. Alexa-488-konjugierten sekundären Antikörpern aufgedeckt. Schließlich wurden mCherry+Tubb3+/ mCherryTubb3+ Verhältnisse berechnet, gemittelt und mit den entsprechenden MOIs geplottet. Im letzteren Fall (B) wurden die Zellen akut mit einer 1:1-Mischung aus zwei Lentiviren infiziert, die für die konstitutiv aktiven pPgk-mCherry- und pPgk-EGFP-Transgene bei verschiedenen MOIs (2, 4, 8 für jedes Virus) kodiert. Die Zellen wurden 4 Tage lang im proliferativen Medium kultiviert, trypsinisiert und bei Fixierung für mCherry und EGFP-Immunfluoreszenz wie oben beschrieben profiliert. Schließlich wurden mCherry+EGFP+/ mCherryEGFP+ Verhältnisse berechnet, gemittelt und mit den entsprechenden MOIs dargestellt. Fehlerbalken stellen S.E.M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Wie für (2), pT-1 und pSyn-Aktivitätsmuster können auf der Grundlage von Expressionsprofilen von Fluorproteingenen unter ihrer Kontrolle abgeleitet werden. In diesem Beispiel ist eine solche Steuerung direkt bei mCherry (Abbildung 2A) und indirekt [d.h. vermittelt durch eine tetON Schnittstelle der zweiten Generation (Abbildung 2E)], im Fall von EGFP (Abbildung 2B, C,D). Beide Promotoren sind speziell innerhalb von Tubb3+ postmitotischen Neuronen aktiv (Abbildung 2B, C,D), aber pT1 feuert auch in einer Teilmenge von Ki67+ intermitotischen (neuronogenen) Vorläufern (Abbildung 2A). Hier bei der Bereitstellung einer Vorstellung von begrenzter Variabilität der Promotoraktivität, wenn Zellen nach diesen Standardbedingungen entwickelt werden (Abbildung 2E), wurden die pT-1- und pSyn-gesteuerten EGFP-Expressionsniveaus innerhalb von Tubb3+ Neuronen durch Photoshop CS6 Histogramm-Plugin. Anschließend wurden Rohdaten gegen Median normalisiert und gegen Promotoren geplottet (Abbildung 2F). Bemerkenswerterweise waren die einzelzelligen Fluoreszenzwerte dicht um mediane gruppiert: das erste und dritte Quartil entsprachen 0,86 und 1,16 sowie 0,89 bzw. 1,12 in Fällen von pT-1 bzw. pSyn.
Abbildung 2 : Profilierung von neuronalen Vorläufertyp-spezifischen Promotoren geeignet, GOI Überexpression zu fördern. Panels beziehen sich auf die Charakterisierung von Tubulin alpha 1 (pT-1) und Synapsin (pSyn) Promotoren, die speziell innerhalb der gesamten neuronalen Abstammung bzw. postmitotischen Neuronen aktiv sind. Der Test wurde an neokortikalen Vorläufern durchgeführt, die im alter Embryonal (En) geerntet wurden und akut mit speziellen lentiviralen Mischungen infiziert waren [pT-1-mCherry in (A); pT-1-rtTA, TREt-EGFP in (B); pSyn-rtTA, TREt-EGFP in (C,D); 2 /ml doxy ab initio], und kultiviert in proliferativem Medium (A), proliferative (2 Tage) gefolgt von differenziativem Medium (B,C) oder differenziativem (D) Medium. Bei der Fixierung am Tag in vitro (DIV) nwurden postmitotische Neuronen durch die Immunfluoreszenz von Tubb3 und intermitotische Vorläufer durch die Immunfluoreszenz von Ki67 identifiziert; mCherry und EGFP wurden wie in Abbildung 1dargestellt. Die Signale wurden wie in Abbildung 1dargestellt. Skalenstäbe: 100 m in (A,B) und 50 m in (C,D). Gezeigt werden (E) dedizierte lentivirale Mischungen, die in dieser Studie mit Verweisen auf die Figurentafeln verwendet werden. Gezeigt wird ein (F) ein Streudiagramm des pT-1- und pSyn-gesteuerten EGFP-Signals in Tubb3+ Zellen, auf die in (B) bzw. (D) verwiesen wird. Verpackt sind Zellen, die zwischen dem 25. und 75. Perzentil fallen; Schnurrhaare beziehen sich auf 10th und 90th Perzentile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Wie für (3), 3 Tage nach lentiviraler Transduktion, MtaptEGFP/+ "grüne" Neurosphären drücken die Pgk1p Promoter-gesteuert, mCherry rote fluoreszierende Protein ("Kontroll"Kugeln) oder nicht ("Test" Kugeln) (Abbildung 3A,B). Alle Kugeln sind zu einzelnen Zellen dissoziiert, so dass keine Klumpen übrig sind und die entsprechenden Suspensionen 1:1 gemischt werden. Die resultierende Mischung (Abbildung 3C) wird auf Eis gelegt und innerhalb von 20 min für die Transplantation verwendet.
Abbildung 3 : Beispiel für Test ("nur grün") und Kontrolle ("grün-rot") DIV2 Neurosphären und Zellsuspension bereit für die Transplantation. (A,B) Diese Kugeln wurden von MtaptEGFP/+E 12.5 neokortikalen Vorläufern gewonnen, akut infiziert durch lentivirale Mischungen "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (A) und "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (B), bzw. jeweils LV bei MOI = 8, und in proliferativem Medium gehalten. (C) Die Zellsuspension wurde durch Dissoziieren von "Test" und "Kontrolle" von Neurosphären (A,B) zu einzelnen Zellen und Mischen von 1:1 erhalten. Skalenbalken: 200 m in (A,B) und 100 m in (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Wie für (4), das Verfahren für die Zellinjektion in das neonatale Gehirn umfasst drei wichtige Schritte. Die Kapillare, die auf der mittelparasagittalen Ebene platziert ist, wird über die frontale kortikale Wand in die seitliche ventrikuläre Höhle eingelassen (Abbildung 4A). Um eine Beschädigung der ganglionischen Eminenz zu vermeiden, wird die Kapillare innerhalb der horizontalen Ebene um 30° gedreht, so dass die Spitze mitteljährlich/kaudal zeigt (Abbildung 4B). Schließlich wird die Zellsuspension zart in die seitliche ventrikuläre Höhle ausgestoßen, wo sie eine leicht zu unterscheidende, hellblaue "Wolke" bildet (Abbildung 4C).
Abbildung 4 : Schemata des dreischritte-Verfahrens für die Zellinjektion in das neonatale Gehirn. (A) Die Kapillare wird durch die frontale neokortikale Wand in den seitlichen Ventrikel eingefahren. Dann (B) wird es medial gedreht, um Schäden an ganglionischer Eminenz zu verhindern. Schließlich (C)wird die Zellsuspension sanft in den seitlichen Ventrikel injiziert, wo sie eine hellblaue Wolke bildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Was (5) betrifft, so umfasst das Analyseverfahren vier Hauptschritte. Erstens werden optische konfokale Abschnitte transplantierter neuronreicher Felder abgeflacht, gemäß der MAX Z-Projektionsmodalität, so dass RGB .tiff-Dateien generiert werden. Hier können beispielsweise nur "grüne Test"-Neuronen und "gelbe Kontroll"-Neuronen, die von kotransplantierten Vorläufern stammen, leicht unterschieden werden (es sei darauf hingewiesen, dass mCherry alternativ verwendet werden kann, um "Test"-Neuronen zu kennzeichnen) (Abbildung 5A). Dann wird eine idealisierte, skelettierte Kamera-Lucida-Version des Bildes von einer geeigneten Grafiksoftware (siehe Schritt 4.2.6) (Abbildung 5B) von einem Bediener blind von rotem Kanal erzeugt. Blindheit des roten Kanals ist von größter Bedeutung, um jede unbeabsichtigte Verzerrung bei der Datenauswertung zu verhindern. Als nächstes werden ein-neuronale Silhouetten in die NeurphologyJ-Software als Schwarzweißbilder und Werte der drei primären Parameter "Gesamtanzahl der Exitpoints" (attachment_points), "total number of endpoints" (Endpoints) und "total Neuritenlänge" (neurit_length) gesammelt (Abbildung 5C). Schließlich werden sekundäre Parameter jedes Neurons von Excel-Software berechnet, gemittelt und statistisch ausgewertet (Abbildung 5D).
Abbildung 5 : Repräsentatives Flussdiagramm der morphometrischen Analyse transplantierter Gehirne. Obere Reihenpanels zeigen: (A) ein MAX-z-Projektionsbild von medialer Neocortex, fixiert 10 Tage nach der technischen Zelltransplantation (grün = Mtapt-getrieben, neuronrestricted EGFP; rot = mCherry, konstitutiv beschriftet "Kontrollzellen"; blau = DAPI), das grüne Kanalsignal und (B) sein skelettiertes e-Kamera-Lucida-Rendering. Skalenbalken: 50 m. Die untere Zeile enthält: (C) primäre morphometrische Parameter, die aus neuronalen Skeletten durch NeurphologyJ-Softwareanalyse extrahiert wurden (nreuit_length as li, attachment_points as Nexit and Endpunkte als N-Ende) und (D) sekundäre Parameter, die auf ihrer Basis berechnet werden. Diese Zahl wurde von Chiola et al.21geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Spezifische Aspekte/Schritte dieses Verfahrens sind von entscheidender Bedeutung und erfordern besondere Aufmerksamkeit. Erstens müssen (a) die Bediener ausreichend vortrainiert sein, um Lentiviren in einer BSL-2-kompatiblen Laborumgebung sicher zu manipulieren. Zweitens, b) vor dem Mischen von "Test" und "Kontrolle" neuronaler Präparate ist es obligatorisch, die beiden entsprechenden Neurosphärensuspensionen wie beschrieben sorgfältig zu waschen, um eine verzögerte Kreuzinfektion der beiden Präparate aufgrund unerwünschter lentiviraler vortragen. Drittens, c) bei der Transplantation von Zellen muss die Behandlung bei der Ausrichtung auf die ventrikuläre Höhle erfolgen; in dieser Hinsicht ist der fast grüne Tracer, der in die Zellsuspension eingeschlossen ist, eine wesentliche Hilfe. Zusätzlich (d) zur Vorbeugung von Kannibalismus dürfen transplantierte Welpen erst nach vollständiger Genesung von der Anästhesie auf die Mutter übertragen werden (in der Regel sind 10 min ausreichend). e) Die Kryosektion des transplantierten Gewebes sollte in einer Höhe von 60 m durchgeführt werden; in der Tat ermöglicht diese Dicke gleichzeitig ein einfaches Eindringen von Antikörpern in das Gewebe und begrenzt den Verlust von Informationen, die aus der artefaktischen Neuronenfragmentierung stammen. Schließlich betonen wir( f) um unbeabsichtigte Verzerrungen bei der Datenauswertung zu verhindern, betonen wir, dass die Neuronenskelettierung von einem Bediener durchgeführt werden muss, der vom roten Kanal blind ist.
Das hier beschriebene Protokoll bezieht sich auf GOF-Genmanipulationen. Alternativ können "Test"-Neuronen entwickelt werden, um die GOI-Funktion durch Lentiviren, die für RNAi-Effektoren kodieren, herunterzuregulieren. Als nächstes verwenden wir normalerweise mCherry, um neuronale Zellen zu beschriften; das Schema mCherry/"control" und LacZ/"test" kann jedoch offensichtlich umgekehrt sein. Schließlich bezieht sich das hier beschriebene Protokoll auf intraventrikuläre Zellinjektionen; "Test" und "Kontrolle" Neuronen können alternativ in das neuronale Parenchima21mitinjiziert werden.
Trotz ihrer Vorteile hat diese Methode zwei Hauptgrenzen. Während es erlaubt, Zell-autonome Genkontrolle der Neuroarchitektur zu untersuchen, gilt es nicht für die Umweltkontrolle von ihm. Da transplantierte neuronale Vorläufer vom ventrikulären Aspekt der kortikalen Wand an ihren endgültigen laminaren Standort nach der Geburt (d. h. innerhalb eines nicht-physiologischen Zeitrahmens) migrieren, sollte diese Methode vorzugsweise zur Modellierung Neuroarchitectonics-Kontrolle nach Abschluss der Migration.
Nicht zuletzt sollte der kritischen Interpretation der Ergebnisse besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden. Insbesondere wenn das untersuchte X-Gen die morphologische Komplexität von "Test"-Neuronen reduziert, spiegelt dies möglicherweise nicht speziell seine wirklichen Auswirkungen auf die Neuronenarchitektur wider. Vielmehr könnte ein solches Phänomen ein unspezifischer Index neuronaler Schäden sein, die durch X-Überexpression ausgelöst werden. Um dieses Problem anzugehen, kann es nützlich sein, lokale Dichten von transplantierten, "test" und "control" Neuronen zu vergleichen, dann nach einer möglichen numerischen Schrumpfung der "Test"-Population zu suchen, da ein Index des neuronalen Leidens, das durch X induziert wird [diese Schrumpfung sollte noch größer sein weitere verzögerte Analyse transplantierter Gehirne ausgesprochen]. In solchen Fällen könnte die Senkung des Overepressionsniveaus des X-Gens oder die Umstellung auf ein Funktionsverlust-Design das Problem beheben.
Unsere Methode ergänzt eine breite Palette von Technologien zur Untersuchung der Genkontrolle der neuronalen Morphologie in vivo1,2,3,4,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. Wie in der Einleitung erwähnt, stützen sich diese Technologien auf eine Vielzahl von Ad-hoc-Genmanipulationen, die darauf abzielen, die Expressionsniveaus der goI zu stören und die Extraktion morphologischer Informationen aus den biologischen Proben zu erleichtern. Diese Technologien ermöglichen in der Regel eine genaue Zerlegung dieser Steuerung; sie erfordern jedoch keine wertvollen experimentellen Fähigkeiten und finanziellen Ressourcen. In dieser Hinsicht bietet die Methode drei wesentliche Vorteile. Es ermöglicht eine genaue Kontrolle der GOI-Expressionsniveaus vergleichbar mit denen, die für transgene Modelle spezifisch sind; jedoch in Ermangelung von mutierten Kolonie-Wartungskosten. Es erfordert keine ausgeklügelten experimentellen (chirurgischen) Fähigkeiten. Bei der Analyse einer relativ begrenzten Anzahl von Tieren erreicht sie häufig eine statistische Signifikanz der Ergebnisse.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Mihn Duc Do für seinen Beitrag zur frühzeitigen Einrichtung dieses Verfahrens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
