Summary
Baserat på in vitro lentiviral Engineering av neuronala prekursorer, deras samtidig transplantation till vildtyp hjärnor och Parade morfometriska utvärdering av "test" och "kontroll" derivat, denna metod möjliggör noggrann modellering av in vivo gen kontroll av neokortikala neuron morfologi på ett enkelt och prisvärt sätt.
Abstract
Gen kontroll av neuronala cytoarchitecture är för närvarande föremål för intensiv utredning. Beskrivs här är en enkel metod som utvecklats för att studera in vivo gen kontroll av neokortikala projektion neuron morfologi. Denna metod är baserad på (1) in vitro lentiviral Engineering av neuronala prekursorer som "test" och "kontroll" celler, (2) deras co-transplantation till vildtyp hjärnor, och (3) Parade morfometriska utvärdering av deras neuronala derivat. Specifikt, E 12.5 pallial prekursorer från panneuronala, genetiskt märkta givare, är anställda för detta ändamål. De är konstruerade för att dra nytta av utvalda initiativtagare och tetON/OFF-teknik, och de är fria händer transplanteras in neonatal laterala ventriklar. Senare, vid immunofluorescensitering av mottagar hjärnor, silhuetter av transplanterade nervceller matas in neurphologyj programvara med öppen källkod, deras morfometriska parametrar extraheras, och genomsnittlig längd och branchning index beräknas. Jämfört med andra metoder, erbjuder detta en tre huvudsakliga fördelar: det tillåter att uppnå fin kontroll av transgenens uttryck till rimliga kostnader, det kräver bara grundläggande kirurgiska färdigheter, och det ger statistiskt tillförlitliga resultat vid analys av en begränsad antal djur. På grund av dess utformning, dock, det är inte tillräckligt för att lösa icke cell-autonom kontroll av neuroarchitecture. Dessutom, det bör företrädesvis användas för att undersöka neurit morfologi kontroll efter avslutad neuronala migration. I sin nuvarande formulering är denna metod utsökt trimmad för att undersöka gen kontroll av glutamatergic neokortikala neuron arkitektur. Dra nytta av transgena linjer som uttrycker EGFP i andra specifika neurala celltyper, det kan återanvändas för att ta itu med gen kontroll av deras arkitektur.
Introduction
Här beskriver vi en enkel metod som vi utvecklat för att dissekera in vivo gen kontroll av neuronala cytoarchitecture. Baserat på in vitro-Engineering av neuronala prekursorer, deras transplantation till neonatal hjärna och Parade morfometriska utvärdering av "test" och "kontroll" celler, det gör det möjligt att avslöja funktionella konsekvenserna av test gener i fin kontroll av neuronala morfologi i en snabbt och prisvärt sätt. För att undersöka in vivo gen kontroll av neuronala arkitektur, tre viktiga tekniska frågor måste åtgärdas: (1) att uppnå en tillräckligt mönstrad gen-of-Interest (GOI) uttryck och en noggrann kvantitativ kontroll av det; (2) få en korrekt segmenterad visualisering av distinkta neuronala silhuetter; (3) framkalla statistisk signifikans av resultat samtidigt anställa ett begränsat antal djur.
När tillgängliga, mus Mutant linjer hyser tetracyklin (tet)-kontrollerade transgener kan vara det bästa verktyget för att ta itu med den första frågan1. Alternativt kan somatisk transgenes vara anställd. I sådana fall levereras transgenen via elektroporation2 eller viral signaltransduktion3. Därefter bibehålls den som en Episome (t. ex. vid standard elektroporation4), eller det är integrerat i genomet (slumpmässigt, via antiretrovirala integras5; eller på en definierad plats, via CRISPR-befordrad homolog REKOMBINATION (slendr)6 ).
För det andra kan neuronala silhuett visualisering uppnås via (a) glesa enhetliga märkning eller (b) tät differential märkning. När det gäller glesa märkning, avancerade Golgi-liknande metoder kan användas7, utvalda neuronala minisets kan fyllas med biocytin8, och salt-och peppar märkning kan erhållas tack vare en glest uttryckt Transgene. En sådan transgen kan visa brokig transkription (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveras genom stokastisk rekombination (morf)10. När det gäller (b), State of Art strategier inkluderar CRE-medierad stokastisk rekombination inom en multi-floxed fluorprotein transgenens array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-driven genomisk integration av fluorproteingener, tidigare levereras via somatisk transgenes (klon)12.
När det gäller den tredje frågan, är morphometriska resultatet ofta påverkas av en stor slumpmässig variation, som härrör från Inter-Animal skillnader och cell-injektion oförutsedda händelser. På grund av detta, är ett stort antal djur vanligtvis används för att uppnå den statistiska kraft som krävs för att bedöma GOI morfometriska aktivitet.
De metoder som tidigare beskrivits förlitar sig ofta på avancerade tekniska färdigheter och kräver iögonfallande ekonomiska resurser, vilket kan begränsa deras spridning inom forskarvärlden. För att kringgå dessa frågor, tänkte vi en enkel och enkel pipeline för att dissekera gen kontroll av neuroarchitecture in vivo på ett snabbt och prisvärt sätt. Detta är inspirerat av en liknande Co-transplantation design som tidigare utvecklats för snabb in vivo utvärdering av antiblastic transgenens aktivitet13.
Specifikt, det är tänkt att samtidig transplantation av in vitro-konstruerade "gröna" neurala prekursorer ("test" och "kontroll" celler) i en "svart" mottagare neonatal hjärna kan samtidigt fastställa de tre viktiga frågor som anges ovan. I själva verket, in vitro-lentiviral Engineering av prekursorer, i välkontrollerade förhållanden, tillåter underhåll av variationer av neuronala transgenens uttryck på ett minimum, långt under som vanligtvis förknippas med in vivo somatiska manipulationer (utförs tidigare fjorton , 15 och i våra opublicerade resultat). Den resulterande noggranna kontrollen av genuttrycket är jämförbar med den som uppnås genom tettkontrollerade transgena modeller. Kostnaderna för detta förfarande är dock långt under de som härrör från upprätthållandet av en transgen mus linje. Nästa, fri-hand cell injektion är lätt och kräver minimal träning. Dessutom kan mängden märkta prekursorer som injiceras i varje hjärna lätt justeras för att uppnå ett tillräckligt ackumulerat antal glest distribuerade prekursorer, samtidigt som det totala antalet transplanterade djur hålls på ett minimum. Sist men inte minst, samtidig injektion av olika fluoro-märkta, "test" och "kontroll" prekursorer och efterföljande Pairwise statistisk analys av resultaten motverka effekterna av Inter-Animal experimentell variation, vilket gör det möjligt att nå statistisk signifikans av resultat, även vid analys av ett begränsat antal individer13.
Det bör betonas att denna metod, om än snabb och billig, har två huvudsakliga begränsningar. För det första är den utformad för att undersöka cell-autonom gen kontroll av neuronala arkitektur, och det är inte lämpligt att ta itu med miljökontroll. För det andra, som transplanterade neuronala prekursorer nå sin slutliga plats genom ett heterokroniskt schema, är denna metod att föredra att modellera neuroarchitectonics kontroll inträffar tidigare migration slutförande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder och procedurer som beskrivs här har godkänts av SISSA Organismo preposto Al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. generering av konstruerade "gröna" progenitorceller pooler
- Beredning av den "gröna" poolen
- Para en vild-typ CD1 hona med en Mtaptegfp/+ grundare16. Euthanize den gravida dammen av livmoderhalscancer dislokation vid 12,5 dagar efter coitum (dag 0 bestäms av vaginal plugg inspektion) och skörd den embryonala dag 12,5 (E 12.5) embryon. Ställ in dem i enskilda brunnar på en 24 multispot plåt i Cold PBS-lösning.
- Snabbt genotyp embryona genom visuell inspektion under en blå Ljuslykta, kontroll för grön fluorescens utsläpp i hjärnan.
- Placera den "gröna" embryon i en 10 cm diameter petriskål fylld med kallt 1x PBS med 0,6% glukos och överföra den till under ett stereomikroskop.
- Skär embryohuvuden med standard sax och extrahera den telencephalon från dem med hjälp av #3 och #5 tång.
- Separera de två av blåsor och dissekera ut neocortices med hjälp av pincett; Se till att ta bort hippocampus och basala ganglierna17.
- Samla neocortices genom att överföra dem med en P1000 pipett till en 1,5 mL tub hålls på is.
- Låt dissekerade neocortices bosätta sig på botten av röret.
- Aspirera supernatanten så mycket som möjligt.
- Omsuspendera neocortices i 400 μL av färskt proliferativt medium [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL bovint serumalbumin (BSA), 0,6% glukos, 2 μg/mL heparin, 20 ng/mL grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), 20 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor (EGF), 1X Pen-STREP, och 10 PG/mL amfotericin B].
- Pipettera försiktigt neocortices upp och ner, sekventiellt med P1000, P200, och P20 tips, 4x per spets, för att få en grumlig cellsuspension.
Anmärkning: E 12.5 neokortikala vävnad är mycket mjuk; separera den till enskilda celler kräver inte enzymatisk matsmältning alls; upprepad pipettering räcker. - Låt hjärnhinnorna och kvarvarande neokortikala klumpar bosätta sig i 2 min.
- Överför 150 μL från toppen av cellsuspensionen (huvudsakligen innehållande enstaka celler) till ett nytt 1,5 mL sterilt rör.
- Tillsätt 150 μL färskt proliferativt medium och upprepa steg 1.1.10-1.1.12 tills inga fler vävnads klumpar är uppenbara. När du gör detta, utelämna den P1000 pipettering steg (i steg 1.1.10).
Anmärkning: tre iteration av steg 1.1.10-1.1.12 är oftast tillräckligt för att uppnå full vävnad dissociation. - Räkna celler ("grön" pool) med trypan blå uteslutnings metod i en Bürker kammare17 och tillsätt färskt proliferativt medium för att justera koncentrationen till 103 celler/μl.
Anmärkning: steg 1.1.7-1.1.14 skall utföras under ett sterilt laminärt flödeshuv som desinficeras med 70% etanol och hålls ventilerat i minst 20 min.
- Engineering de "gröna" sub-pooler
- Dela upp den "gröna" poolen i två sub-pooler i två distinkta 1,5 mL rör för lentiviral infektion.
- Infektera sub-pooler självständigt med två dedikerade lentiviral blandningar. Varje blandning innehåller "Red Label" virus (Pgk1_mCherry) eller "Black" virus (pCAG_lacZ) som en kontroll, samt virus för tetOFF driven transgenens (Pgk1p_tTA och TRE_transgene) eller kontroll (Pgk1p_tTA och TRE_PLAP) uttryck.
FÖRSIKTIGHET: manipulera lentivirus i en BLS-2 miljö med alla de skydds mätningar som föreskrivs i tillämpliga regler och lagar.
Anmärkning: varje lentivirus måste administreras med en mångfald av infektion (MOI) av 8, som (som tidigare visat14) är tillräcklig för att transduce de allra flesta neurala celler i sådana experimentella förhållanden (figur 1). Den lentivirus hyser tet transaktivatorer kan byggas genom att anställa olika neuronala initiativtagare kör tTA/rtta uttryck (t. ex., ptα1, psyn, pcamkii, pGAD1, etc.) (Figur 2). MOI är förhållandet mellan (a) antalet infektiösa viruspartiklar som levereras till (b) antalet av deras målceller. Här beräknas den förstnämnda (a) enligt det konventionella förfarande som beskrivs på annan plats14, den senare (b) helt enkelt utvärderas med hjälp av en bürker kammare. - Platta 600 000 celler av varje infekterad sub-pool per brunn av en 12 multispot tallrik, i 600 μl av proliferativt medium med 2 μg/ml doxycyklin.
Anmärkning: här, brunnar är inte förbehandlade med poly-lysin, som förhindrar neurala cell fastsättning på deras bottnar. - Överför celler till inkubatorn i 5% CO2 vid 37 ° c.
- Efter 2 dagar, för att bedöma effektiviteten av infektion och differential markering av de konstruerade poolerna, inspektera cellerna under ett konventionellt fluorescerande Mikroskop. De två sub-pooler måste visas som suspensioner av små neurospheres, likartad uttrycker rött fluorescerande protein ("kontroll" prov) eller inte ("test" prov). Inom dessa neurosfärer är Mtaptegfp transgenens aktiv begränsad till en minoritet av cellerna (postmitotiska neuroner) och tysta i de flesta av dem (prolifererande prekursorer) (figur 3).
2. inrättande av kirurgiska instrument och operationsområdet
-
Beredning av borosilikatnålar
- Använd borosilikatglaskapillärerna med utvändig och invändig diameter motsvarande 1,5 mm respektive 1,12 mm.
- Dra kapillär med en P 1000 avdragare.
- Ställ in drag programmet. Typiska programparametrar är: Heat = 614; Vel = 60; tid = 1; Tryck = 600. De måste justeras enligt avdragarmodellen och det värmemotstånd som används.
- Placera kapillär i avdragare hållarna och dra åt dem.
- Starta programmet och ta de två dragna mikrokapillärerna.
- Skär kapillärspetsen för hand, med en skalpell, under stereomikroskopet för att få en spets med en yttre diameter på ~ 200-250 μm.
- Placera kapillärerna på en modellerings lera (t. ex. Plasticine) stöd i en sluten petriskål och överföra den till under huven.
-
Ställa in huven och förbereda cell Tracer lösning
- Rengör den horisontella flödes kåpan noggrant och desinficera den med hjälp av 70% etanol.
- Desinficera optiska fibrer med 70% etanol och placera dem under huven.
- Blanda 10 μL 125 mM EGTA-lösning och 10 μL snabb grön för att bereda "cell Tracer-lösningen" och placera den under huven.
- Skär små bitar (4 cm x 2 cm i storlek) av laboratorie tätning film för cellsuspension spotting.
- Bered en lösning på 1 mg/mL steril doxycyklin och aspirera den i en 0,3 mL spruta.
- Slå på huven och håll laminärt flödet på i 20 min före operationen.
-
Montering av insprutnings röret
- Ta ett hårt Plastmunstycke, två latex rör (vardera ca 30 cm lång) och en kapillärhållare från en rökrörs rör Monteringssats för kalibrerade microcapillary pipetter.
- Fäst den hårda plast munstycket i ena änden av ett latex rör.
- Fixera kapillärhållaren till ena änden av en annan latex tub.
- Anslut de fria ändarna av de två latex rören med en 0,45 μm sterilt filter, som en barriär mot operatören bakterier.
- Placera den resulterande aspiratorslangen på en modell ler hållare som ska förvaras under huven.
3. cell blandning och intraventrikulär transplantation
- Blandning "test" och "kontroll" grön cell sub-pooler
- Samla in "test" och "kontroll" neurospheres (se steg 1.2.5) i separata 1,5 mL-rör.
- Centrifugera neurospheres suspension vid 200 g i 5 min.
- Samla in och Kassera supernatanten, undvika störning av cellpelleten.
- Omsuspendera neurosfärer försiktigt i 500 μL 1x PBS.
- Centrifugera dem på 200 g i 1 min.
- Ta bort supernatanten.
- Upprepa steg 3.1.4-3.1.6 två gånger till.
- Försiktigt Omsuspendera sfärer i 200 μL av 2x trypsin lösning (2x trypsin, 1x PBS) och pipett cell pellet upp och ner 4x-5x.
Obs: uppmärksamma att inte göra luftbubblor. - Lämna celler i inkubatorn i 5 min vid 37 ° c för att uppnå en encellig suspension.
- Blockera trypsin med 200 μL av trypsin inhibitor lösning (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse I, 0,28 mg/mL trypsin-hämmare) genom att Pipettera upp och ner 4x-5x.
- Centrifugera celler vid 200 x g i 5 min och Omsuspendera dem i 1 ml färskt proliferativt medium (DMEM-F12, 1x glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glukos, 2 μg/ml heparin, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 1x Pen-STREP, 10 pg/ml amfotericin B).
- Räkna celler av de två poolerna med trypan blå uteslutnings metod i en Bürker kammare.
- Justera deras koncentration till 100 000 celler/μL i proliferativt medium.
- Blanda 1:1 "test" celler med "kontroll" sådana.
- Kontrollera den resulterande blandningen under ett fluorescensmikroskop (objektiv förstoring: 10X) för att säkerställa att blandningen är en encellig suspension av de två poolerna (figur 3c).
- Placera blandningen på isen under huven.
- Intraventrikulär transplantation
- Förbered buren med modern och P0-pups på ett bord långt borta från det kirurgiska området.
- Placera en återvinnings bur på en vagn nära huven.
- Sätt en blandning av sågspån tas från moderns bur på botten av återvinnings bur och placera den under en lampa.
- Bortsett, som en Ice Box täckt av en aluminiumfolie för anestesi av P0 valpar.
- Strax före transplantation, tillsätt 1/10 volym av cell Tracer lösning (från steg 2.2.3) till 1 volym av cellsuspensionen (från steg 3.1.16) och spot 3 μL av den resulterande "injektion mix" på en bit av laboratorie tätning film.
- Placera PUP på den svala aluminiumfolie för 1 min och kontrollera att det är helt sövda.
Anmärkning: för att bekräfta anestesi, försiktigt pressa en tass och övervaka PUP för brist på rörelser, medan fortfarande andas. - Samtidigt aspirera 3 μL injektions blandning (från steg 3.2.5) till glas kapillär.
- Torka försiktigt huvudet av den sövda PUP med 70% etanol.
- Placera PUP hakan på spetsen av den optiska fibern för att tydligt identifiera kortikala halvklot.
Obs: vid P0-P1, är huvudet huden mycket tunn, vilket möjliggör enkel visuell identifiering av hjärnhalvorna strax ovanför ögongloberna och bakom lukt lökar. - Håll kapillär (lastas som beskrivs i steg 3.2.7) i antingen en av de två Mid-parasagittal flygplan (vänster eller höger), ovanför luktbulben, och punktera pannan huden vid dess skärningspunkt med det främre planet som innehåller ögonglober centra. Uppmärksamma att inte skada blodkärlen. Ange kapillär i frontala cortex och tillgång till ventrikulär hålighet (figur 4a).
- För att förhindra oavsiktlig skada på ganglieblockerande Eminence, rotera nålen i sidled med 30 grader, pekar dess spets caudal-medial-Ward (figur 4b).
- Injicera försiktigt cellerna i ventrikulär hålighet och övervaka deras diffusion med hjälp av snabb grön (figur 4c).
- Vänta 5-10 s.
- Ta bort glasnålen noga med att inte aspirera cellsuspensionen och kassera den i en lämplig kasse rings behållare.
- Innan PUP återhämtning från anestesi injicera 150 μL av doxycyklin lösning intraperitonealt att hålla transgenens uttryck fortfarande utanför efter transplantation.
- Efter injektionen, placera PUP omedelbart under lampan för återhämtning.
- Lämna pups under lampan för 5-10 min och, när helt vaken, placera dem i buren med modern.
- Observera de manövrerade pups för 2-3 h, för att säkerställa att mamman accepterar dem.
- Förse buren med dricksvatten innehållande 0,5 mg/mL doxycyklin och 50 g/L sackaros för att bibehålla transgenexpression.
- Byt ut det doxycyklin-haltiga vattnet med Doxy-fritt vatten 4 dagar efter transplantation, vilket aktiverar transgenen i post-mitotiska neuroner. Håll möss i ett Doxy-fritt system i 6 dagar och euthanize dem på P10 av koldioxid inandning följt av halshuggning.
4. analys av transplanterade hjärnor
-
Histologi och immunofluorescensteknik
- Euthanize de transplanterade ungarna 10 dagar efter celltransplantation genom koldioxid inandning följt av halshuggning. Fix hjärnor av euthanized valpar i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) vid 4 ° c över natten.
FÖRSIKTIGHET: PFA är mycket giftigt; hantera den med omsorg, strikt följa tillverkarens föreskrifter, under en kemisk rök huva; Kassera PFA-lösning resti en märkt avfallsbehållare. - Ta bort PFA-lösningen och ersätt den med 30% sackaroslösning.
- Lämna hjärnorna vid 4 ° c eller tills de sjunker till botten av flaskan.
- Överföra hjärnor till en disponibel inbäddning mögel ungefär halv fyllda med Cryo-integration medium.
- Frys de medföljande hjärnorna vid-80 ° c.
- Skär 60 μm tjocka koronala sektioner med en kryostat.
Obs: Undvik att anställa tunnare sektioner, eftersom detta kan resultera i oacceptabel förlust av information om hela arkitekturen av enskilda nervceller. - Process sektioner för immunofluorescens18,19, med anti-GFP [1:400] och anti-RFP (mcherry) [1:500] antikroppar. Motbets kärnor med 1 mg/mL DAPI-lösning [1:200].
- Euthanize de transplanterade ungarna 10 dagar efter celltransplantation genom koldioxid inandning följt av halshuggning. Fix hjärnor av euthanized valpar i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) vid 4 ° c över natten.
-
Morfometri
- Ställ in arbets parametrarna för konfokalmikroskopet enligt följande: z-stack höjd = 40 μm; steg = 2 μm.
- Samla bilder av immunoassayed skivor välja GFP positiva neuron-rika fotografiska fält, blind av RFP signal distribution.
- Exportera bilderna som. nd2 filer.
- Generera maximala Z-projektioner av dem som. TIFF-filer (figur 5a).
- För att möjliggöra sub-sekventiell neuronala skeletonization blind till celler genotyp, dölja den röda signalen. Det gör du genom att öppna varje TIFF-fil med en lämplig programvara och lägga till ett justeringslager. Välj "nivåer", "röd", och sedan ange "output" till noll. Spara filen som sådan.
Obs: Skeletonization utförs sedan av en ny operatör som inte hade någon tidigare tillgång till ursprungliga vanliga röda filer. - För varje dold röd fil lägger du till ett rit skikt i den primära bilden och väljer pennverktyget (vit färg). Spåra Soma på grundval av GFP signal, sedan spåra neuriter.
Obs: pennan verktyget kan ställas in på 40 pixlar för Soma och vid tre pixlar för neuriter. - Spara Multilayer-filen inklusive neuronala silhuetter (Figur 5b).
Anmärkning: efterföljande analys av neuronala skelett kan utföras av endera operatören. - Skapa en ny 1024 x 1024 16-bitars gråskala fil med svart bakgrund, en per neuron.
- Kopiera och klistra in enstaka neuronala silhuetter från den primära bilden till den nya grå Skale filen. Komma tillbaka till Multilayer fil och stänga av justerings skiktet att avslöja neuronala genotyper. Spara 16-bitars grå Skale filen som kommenterar motsvarande neuronala genotyp.
- Importera gråskalebilder i imagej en efter en och analysera skelett av neurphologyj plugin av imagej programvara20 (figur 5c).
- Kopiera neurphologyj primära data (neurite_length, attachment_points och slutpunkter; för varje, ta "total Area" värden), klistra in dem i ett kalkylblad och anställa dem för att beräkna sekundära morfometriska parametrar ( genomsnittlig neuritlängd, förgrening index) (figur 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns fem primära datauppsättningar som ger användbar information om viktiga aspekter av förfarandet, den första är (1) effektivitet neuralprekursorer transduktion och co-transduktion av lentivirala vektorer. (2) ett exempel på huvuddragen hos de projektansvariga som används för att driva "test genen". (3) ett exempel på konstruerade celler redo för transplantation. (4) en tecknad serie med viktiga processuella uppgifter om cell mikroinjektion i neonatal hjärnan. (5) en sammanfattning av hela morphometriska rörledningen.
När det gäller (1) utvärderades förmågan hos de prototypiska lentivirala vektorer som levereras vid olika MOIs (2, 4, 8) för att effektivt transduce neokortikala prekursorer. I den första analysen, neuronprekursorer som härrör från tidiga vildtyp neocortices var smittade av en lentiviral reporter, hyser mcherry kodning sekvens (CDS) under kontroll av den neuron-Lineage-specifika ptα1 promotor, på Moi = 2, 4, 8, sedan tillåtas att differentiera. Samtidig immunprofilering av deras progenier för mCherry och den pan-neuronala markören Tubb3 visade att neuroner effektivt omvandlades vid frekvenser på 64%, 69% respektive 78% (figur 1a). I en andra analys, neokortikala prekursorer var akut coinfected av två lentivirala reportrar, uttrycker EGFP och mCherry, under kontroll av konstitutiva pPgk1 promotor, på MOIs = (2, 2), (4, 4), och (8, 8). Några dagar senare visade Co-immunoprofilering av deras derivat att förhållandet mellan EGFP + mcherry+ och egfp+mcherry± cells var 80%, 88% och 93%, respektive (figur 1b). Dessa uppgifter tyder på att, vid leverans av det tekniska protokoll som planeras för den aktuella studien, (a) den stora majoriteten av nervceller är sensorik, och (b) nästan alla sensorik nervceller fick hela lentiviral som behövs för deras karakterisering.
Figur 1 : Effektivitet neurala föregångare celler transduktion av lentivirala vektorer. Paneler rapporterar en utvärdering av effektiviteten genom vilken e 12.5 neokortikala prekursorceller är transducerade (eller co-sensorik) vid leverans av dedikerade lentivirala reportrar på olika multiplicities av infektion (Mois). I det förstnämnda fallet (a), celler var akut smittade med LENTIVIRUS (LV) pTα1-MCHERRY vid Moi = 2, 4, 8, odlade i proliferativt medium för 2 dagar, överföras till differentiativt medium, och tillåtas att differentiera för 1 vecka. Vid fixering vid dag in vitro (DIV) 9 var kulturer Co-immunoprofilerade för mCherry och den pan-neuronala markören Tubb3. mCherry och EGFP signaler upptäcktes av anti-RFP och anti-EGFP primära antikroppar och avslöjas av Alexa-594-och Alexa-488-konjugerade sekundära antikroppar, respektive. Slutligen, mCherry+Tubb3+/mCherryTubb3+ nyckeltal beräknades, i genomsnitt och plottas mot motsvarande Mois. I det senare fallet (B), celler var akut infekterade med en 1:1 blandning av två lentivirus, kodning för de konstitutivt aktiva Ppgk-mcherry och PPGK-egfp transgener, på olika Mois (2, 4, 8 för varje virus). Celler odlade i proliferativt medium i 4 dagar, trypsinized och, vid fixering, profilerad för mCherry och EGFP immunofluorescens som ovan. Slutligen, mCherry+egfp+/mcherryegfp+ nyckeltal beräknades, i genomsnitt och plottas mot motsvarande Mois. Felstaplar representerar S.E.M. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
När det gäller (2), pTα1 och pSyn aktivitetsmönster kan härledas på grundval av uttrycks profiler av fluorproteingener under deras kontroll. I detta exempel är en sådan kontroll direkt i fallet med mCherry (figur 2A), och indirekt [dvs. medierad av ett Teton andra generationens gränssnitt (figur 2e)], i fråga om Egfp (figur 2b, C, D). Båda initiativtagarna är specifikt aktiva inom Tubb3+ postmitotiska neuroner (figur 2b, C, D), men ptα1 bränder också i en delmängd av Ki67+ intermitotiska (Neuronogena) prekursorer (figur 2A). Här, för att ge en uppfattning om begränsad variation av promotorn aktivitet när celler är konstruerade enligt dessa standardvillkor (figur 2e), Ptα1-och psyn-driven egfp uttrycks nivåer inom Tubb3+ neuroner kvantifierades av Photoshop CS6 histogram plugin. Därefter normaliserades rådata mot medianer och plottade mot initiativtagare (figur 2F). Anmärkningsvärt var enkelcellig fluorescens nivåer tätt grupperade runt medianer: första och tredje kvartil equaled 0,86 och 1,16, samt 0,89 och 1,12 i fall av pTα1 och pSyn, respektive.
Figur 2 : Profilering av neurala föregångare typspecifika initiativtagare som lämpar sig för att driva GOI överuttryck. Paneler avser karakterisering av tubulin alfa 1 (pTα1) och Synapsin (pSyn) initiativtagare, särskilt aktiv inom hela neuronala härstamning och postmitotiska neuroner, respektive. Testet utfördes i neokortikala prekursorer skördade vid olika embryonala (En) åldrar, akut infekterade med dedikerade lentivirala blandningar [Ptα1-mcherry i (a); Ptα1-rtta, tret-Egfp i (B); Psyn-rtta, tret-EGFP i (C, D); 2μg /ml Doxy AB initio], och odlade i proliferativt medium (a), proliferativ (2 dagar) följt av differentiativt medium (B, C), eller Differentiativt (D) medium. Vid fixering vid dag in vitro (DIV) n, identifierades postmitotiska neuroner av αTubb3 och intermitotiska prekursorer av αKi67 immunofluorescens. mCherry och EGFP upptäcktes på det sätt som visas i figur 1. Signaler avslöjades som visas i figur 1. Skalstreck: 100 μm i (A, B) och 50 μm i (C, D). Visat är (E) dedikerade lentivirala blandningar som används i denna studie med hänvisningar till figur panelerna. Visas är en (F) en punktdiagram av pTα1-och psyn-driven egfp-signal i Tubb3+ -celler som avses iBrespektiveD. Boxed är celler som faller mellan 25: e och 75: e percentiler; morrhår hänvisar till 10: e och 90: e percentiler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som för (3), 3 dagar efter lentiviral Transduction, Mtaptegfp/+ "grön" neurospheres uttrycker Pgk1p promotorn-driven, mcherry rött fluorescerande protein ("kontroll" sfärer) eller inte ("test" sfärer) (figur 3a, B). Alla sfärer separeras till enskilda celler, se till att det finns inga klumpar lefts, och motsvarande suspensioner är blandade 1:1. Den resulterande blandningen (figur 3c) placeras på is och används inom 20 minuter för transplantation.
Figur 3 : Exempel på test ("endast grön") och kontroll ("grön-röd") DIV2 neurospheres och cellsuspension redo för transplantation. (a, B) Dessa sfärer erhölls från mtaptegfp/+E 12,5 neokortikala prekursorer, akut infekterade av lentivirala blandningar "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (a) och "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (B) respektive LV vid Moi = 8, och förvaras i proliferativt medium. Ccell suspensionen erhölls genom att man separerar "test" och "kontroll" Neurospheres (A, B) till enstaka celler och blandar dem 1:1. Skalstreck: 200 μm i (A, B) och 100 μm i (C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som för (4), förfarandet för cell injektion i neonatal hjärnan innehåller tre viktiga steg. Kapillär, placeras på mitten av parasagittal planet, förs in i sidled ventrikulär hålighet via den främre kortikala väggen (figur 4a). Därefter, för att förhindra skador på ganglieblockerande Eminence, är kapillär roteras 30 ° inom horisontalplanet, så att spetsen punkter medialt/caudally (figur 4b). Slutligen är cellsuspensionen försiktigt kastas in i sidled ventrikulär hålighet, där den bildar en lätt distinguishable, ljusblå "moln" (figur 4c).
Figur 4 : Schematics av de tre kliver tillvägagångssättet som används för cell injektion in i den neonatal hjärnan. (A) kapillärbenet förs in i den laterala ventrikeln genom frontala neokortikala väggen. Sedan, (B) det roteras medialward, för att förhindra skador på ganglieblockerande eminens. Slutligen (C), är cellsuspensionen försiktigt injiceras i den laterala ventrikeln, där den bildar en ljusblå moln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
När det gäller (5) omfattar analysförfarandet fyra huvudsteg. Först optiska konfokala delar av transplanterade neuron-rika fält är tillplattad, enligt MAX Z-projektion modalitet så genererar RGB. TIFF-filer. Här, som ett exempel, endast "gröna test" nervceller och "gula kontroll" nervceller, som härrör från Co-transplanterade prekursorer, kan lätt särskiljas (det bör noteras att mCherry kan alternativt användas för att märka "test" nervceller) (figur 5a). Sedan, en idealiserad, skeletterad kamera lucida version av bilden genereras av en lämplig grafisk programvara (se steg 4.2.6) (Figur 5b) av en operatör blind av röd kanal. Blindhet av röda kanalen är av största vikt för att förhindra oavsiktlig bias i datautvärdering. Nästa, Single-neuronala silhuetter matas in NeurphologyJ programvara som svartvita bilder och värden för de tre primära parametrarna "totalt antal exitpoints" (attachment_points), "totalt antal ändpunkter" (endpoints) och "total påverkar Length "(neurite_length) samlas in (figur 5c). Slutligen, sekundära parametrar för varje neuron beräknas, genomsnitt och statistiskt utvärderas av Excel-programvara (figur 5D).
Figur 5 : Representativt flödesschema av morphometrisk analys av transplanterade hjärnor. Övre rad paneler visar: (a) en Max z-projektion. TIFF-bild av mediala neocortex, fast 10 dagar efter konstruerad celltransplantation (grön = mtapt-driven, neuron begränsad Egfp; röd = mcherry, konstitutivt märkning "kontroll" celler; blå = DAPI), den gröna kanalsignalen, och (B) dess skeletterad e-camera lucida rendering. Skalstreck: 50 μm. Den nedersta raden innehåller: (C) primära morphometriska parametrar extraherade från neuronala skelett av neurphologyj mjukvaru analys (neurite_length som Σli, attachment_points as Nexit och endpoints som NEnd) och (D) sekundära parametrar beräknade på grundval av dessa. Denna siffra har modifierats från Chiola et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Specifika aspekter/steg i detta förfarande är kritiska och kräver särskild uppmärksamhet. För det första måste (a) operatörerna vara tillräckligt utbildade för att på ett säkert sätt manipulera lentivirus i en BSL-2-kompatibel labbmiljö. För det andra, (b) före blandning "test" och "kontroll" neurala preparat, är det obligatoriskt att noggrant tvätta de två motsvarande neurosphere suspensioner som beskrivs, för att förhindra fördröjd korsinfektion av de två preparaten på grund av oönskade lentivirala överföra. Tredje, (c) medan transplantation celler, försiktighet måste placeras samtidigt som riktar sig till ventrikulär hålighet; i detta avseende är den snabba gröna spårämne som ingår i cellsuspensionen betydande hjälp. Dessutom, (d) för att förhindra kannibalism, transplanterade ungar måste återföras till modern först efter sin fulla återhämtning från anestesi (vanligtvis 10 min är tillräcklig). e kryo-snittning av den transplanterade vävnaden skall utföras med 60 μm. i själva verket, denna tjocklek samtidigt möjliggör en enkel antikropp penetration i vävnaden och begränsar förlust av information som härrör från artifakto neuron fragmentering. Slutligen, (f) för att förhindra oavsiktlig bias i datautvärdering, vi betonar att neuron skeletonization måste utföras av en operatör blind av röd kanal.
Det protokoll som beskrivs här avser GOF genmanipulationer. Alternativt kan "test" neuroner vara konstruerade för att downreglera GOI funktion med hjälp av upphov kodning för RNAi effectors. Nästa, vi brukar anställa mCherry att märka "kontroll" neurala celler; dock kan mCherry/"kontroll" och LacZ/"test" Scheme vara uppenbarligen inverterad. Slutligen hänvisar det protokoll som beskrivs här till intraventrikulär cell injektioner; "test" och "kontroll" nervceller kan alternativt Co-injiceras i den neurala parenchima21.
Trots dess fördelar har denna metod två huvudsakliga gränser. Samtidigt gör det möjligt att undersöka cell-autonom gen kontroll av neuroarchitecture, det gäller inte för miljökontroll av den. Eftersom transplanterade neuronala prekursorer migrerar från den ventrikulära aspekten av den kortikala väggen till deras slutliga laminära placering efter födseln (dvs. inom en icke-fysiologisk tidsram) bör denna metod företrädesvis användas för att modellera neuroarchitectonics kontroll efter avslutad migration.
Sist men inte minst bör särskild uppmärksamhet ägnas åt kritisk tolkning av resultaten. I synnerhet, om X-genen föremål för utredning minskar den morfologiska komplexiteten av "test" neuroner, detta kanske inte specifikt återspeglar dess verkliga inverkan på neuron arkitektur. Snarare kan ett sådant fenomen vara ett icke-specifikt index för neuronala skador framkallade av X överuttryck. För att lösa detta problem, kan det vara bra att jämföra lokala tätheter av transplanterade, "test" och "kontroll" nervceller, sedan leta efter möjliga numeriska krympning av "test" befolkningen, som ett index för neuronala lidande induceras av X [denna krympning bör vara ännu mer uttalad vid ytterligare fördröjd analys av transplanterade hjärnor]. I sådana fall kan det lösa problemet genom att sänka övertryckningsnivån för X-genen eller flytta till en funktionsförlust.
Vår metod bidrar till ett brett spektrum av tekniker som används för att undersöka gen kontroll av neuronala morfologi in vivo1,2,3,4,7,8, 9 , 10 , elva , 12. som det erinras om i inledningen förlitar sig dessa tekniker på en rad olika ad hoc -genetiska manipulationer som syftar till att stör-uttrycksnivåer och underlätta utvinning av morfologisk information från de biologiska proverna. Dessa tekniker tillåter vanligtvis korrekt dissektion av denna kontroll; de kräver dock inte värdefulla experimentella färdigheter och ekonomiska resurser. I detta avseende erbjuder metoden tre viktiga fördelar. Det möjliggör en noggrann kontroll av de indiska uttrycks nivåer som är jämförbara med dem som är utmärkande för transgena modeller. men i avsaknad av muterade Colony underhållskostnader. Det kräver inte sofistikerade experimentella (kirurgiska) färdigheter. Det uppnår ofta statistisk signifikans av resultat vid analys av ett relativt begränsat antal djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Mihn Duc göra för hans bidrag till tidig inrättandet av detta förfarande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
