Summary
בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.
Abstract
השליטה הגנטית באדריכלות העצבית. היא הנושא של חקירה אינטנסיבית מתוארים כאן היא שיטה פשוטה שפותחה ללמוד בקרת גנים vivo של מורפולוגיה הקרנה הניאו קליפת המוח. שיטה זו מבוססת על (1) בהנדסה מחוץ לתחום ויראלי של הנדסה עצבית מסוג "מבחן" ו-"שליטה" תאים, (2) שיתוף הפעולה שלהם למוח פראי, ו (3) לזווג הערכה מורמטרית של נגזרות עצבי שלהם. באופן ספציפי, E 12.5 מסמני מקדים מתורמים בעלי התווית גנטית, מעובדים בעלי התוויות, מועסקים למטרה זו. הם מתוכננים כדי לנצל את היזמים שנבחרו, tetON/OFF הטכנולוגיה, והם בחינם יד מושתלים לתוך החדרים לרוחב הלובין. מאוחר יותר, על הפרופילים של המוח המושתלים של מוחות הנמען, צלליות של נוירונים מושתלים מוזנים לתוך התוכנה הקוד הפתוח עצבי, הפרמטרים שלהם מורמטרים מופקים, ואת האורך הממוצע מדד הסתעפות מחושבים. בהשוואה לשיטות אחרות, אחד זה מציע שלושה יתרונות עיקריים: הוא מתיר השגת שליטה עדינה של ביטוי טרנזגני במחיר סביר, זה רק דורש כישורי ניתוח בסיסיים, והוא מספק תוצאות אמינות סטטיסטית על ניתוח מוגבל ספר בעלי חיים. בגלל העיצוב שלה, עם זאת, זה לא מספיק כדי לטפל שאינו השליטה האוטונומית התא של נוירוארכיטקטורה. כמו-כן, רצוי להשתמש בה כדי לחקור שליטה neurite ורפולוגיה לאחר השלמת הגירה עצבית. בניסוח הנוכחי שלה, שיטה זו מכוונת להפליא כדי לחקור בקרת גנים של האדריכלות נוירונים glutamatergic neoקורטיקלית. ניצול של קווים טרנסגניים המבטא EGFP בסוגים אחרים של תאים עצביים ספציפיים, זה יכול להיות מחדש תכליתי כדי לטפל בקרת גנים של הארכיטקטורה שלהם.
Introduction
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה שפיתחנו לנתח בקרת גנים vivo של אדריכלות עצבית. מבוסס על הנדסת חוץ גופית של מקדים עצביים, ההשתלה שלהם לתוך המוח הבין לבין הערכה מוגרמטרית של "מבחן" ו "שליטה" תאים, זה מאפשר לחשוף את ההשלכות תפקודית של גנים מבחן בשליטה עדינה של מורפולוגיה עצבית ב דרך מהירה ומשתלמת. כדי לחקור בקרת גנים vivo של אדריכלות עצבית, שלושה נושאים טכניים מרכזיים חייב להיות ממוען: (1) השגת ביטוי גן התעניינות מספקת (הגוי) ושליטה כמותית מדויקת של אותו; (2) קבלת הדמיה מקוטעת כראוי של צלליות נוירואליות נפרדות; (3) מעורר משמעות סטטיסטית של תוצאות תוך העסקת מספר מוגבל של בעלי חיים.
כאשר זמין, העכבר מוטציה קווים מחסה טטרציקלין (ט) מבוקרת transgenes עשוי להיות הכלי הטוב ביותר כדי לטפל בגיליון הראשון1. לחילופין, הטרנסגנזה הסומטית עשויה להיות מועסק. במקרים כאלה, הטרנסגנטית מועברת באמצעות אלקטרופורציה2 או התמרה נגיפית3. לאחר מכן, הוא נשמר כאפיכמה (למשל, על-ידי אלקטרופורציה סטנדרטית4), או שהוא משולב לתוך הגנום (באופן אקראי, באמצעות שילובים retroviral יעיל5; או במיקום מוגדר, באמצעות crispr-קידם הומולוציה שילוב מחדש (slendr)6 ).
שנית, צללית עצבית הדמיה עשוי להיות מושגת באמצעות (a) מדים דלילים תיוג או (ב) צפוף תיוג דיפרנציאלי. באשר לתיוג דליל, מתודולוגיות מתקדמות כמו Golgi עשוי להיות מועסק7, מיניסטים עצביים שנבחרו ניתן למלא על ידי biocytin8, ותיוג מלח ופלפל ניתן להשיג תודות לגנים מבוטא בדלילות. כזה יכול להציג שעתוק מגוון (שלך-EGFP)9 או יכול להיות מופעל על ידי שילוב סטוכסטי (morf)10. באשר (ב), המדינה של אסטרטגיות האמנות כוללים מתווך של היצור-תיווך סטוכסטי שילוב של בתוך מערך מרובה פלואופאנפרוטאין transopחלבון (במוח)11, כמו גם שילוב של מונחה גנומה-טרנספססאוסה של גנים fluoroprotein, בעבר נמסר באמצעות טרנסגנזה סומטית (שיבוט)12.
באשר לסוגיה השלישית, התוצאה המורמטרית מושפעת לעתים קרובות על ידי שינויים אקראיים גדולים, שמקורם הבדלים בין בעלי חיים ואפשרויות הזרקת תאים. בגלל זה, מספר גדול של בעלי חיים מועסק בדרך כלל כדי להשיג את הכוח הסטטיסטי הדרוש כדי להעריך את הפעילות הטובה ביותר של מורמטרי.
הגישות שתוארו לעיל מסתמכות לעתים קרובות על מיומנויות טכניות מתקדמות ודורשות משאבים פיננסיים בולט, אשר עשויים להגביל את הדיפוזיה שלהם בתוך הקהילה המדעית. כדי לעקוף בעיות אלה, הצלחנו צינור קל ופשוט לנתח את השליטה גנים של נוירוארכיטקטורה ב vivo בדרך מהירה ובמחיר נוח. זה מעורר השראה על ידי עיצוב דומה שיתוף השתלת בעבר שפותחה במהירות vivo הערכה של פעילות antiblastic transgene13.
באופן ספציפי, הוא חשב כי השתלת המשותף של הנדסה חוץ גופית "ירוק" מקדים עצביים ("מבחן" ו "שליטה" תאים) לתוך המוח התינוק "שחור" התינוק יכול במקביל לתקן את שלושת הנושאים המרכזיים המפורטים לעיל. למעשה, בהנדסה מחוץ לתחום ויראלי של סמנים מוקדמים, בתנאים מבוקרים היטב, מאפשר תחזוקה של השתנות הביטוי העצבי-מגנטי במינימום, הרחק מתחת כי בדרך כלל הקשורים במניפולציות vivo סומטיים (שבוצעה בעבר מיכל בן 14 , 15 ובתוצאות שלא פורסמו. השליטה המדויקת המתקבלת על ביטוי הגנים דומה לזו שהושגה במודלים טרנסגניים מבוקרים. עם זאת, עלויות של הליך זה הן הרבה מתחת לאלה שמקורן בתחזוקת קו העכבר הטרנסגניים. לאחר מכן, הזרקת התא החופשי היא קלה ודורשת הכשרה מינימלית. כמו-כן, ניתן לכוונן בקלות את כמות הסמנים המושתלים המוזרקים לתוך כל מוח כדי להשיג מספר מצטבר מספיק של מקדם-סמנים בדלילות, תוך שמירה על המספר הכולל של חיות משושתלים במינימום. אחרון חביב, שיתוף הזרקה של fluoro שונים מתויג, "מבחן" ו-"שליטה" מראש סמנים וניתוח סטטיסטי הבאים של התוצאות לנטרל את ההשפעות של בעלי חיים השונות ניסיוני, המאפשר להגיע של משמעות סטטיסטית של תוצאות, גם על ניתוח של מספר מוגבל של אנשים13.
יודגש כי, אם כי מהיר וזול, שיטה זו יש שתי מגבלות עיקריות. ראשית, היא נועדה לחקור את השליטה הגנטית התאית של האדריכלות העצבית, וזה לא מתאים לטפל בשליטה סביבתית. שנית, כמו מושתלים המושתלים טרום המעבר להגיע למיקום הסופי שלהם על ידי לוח זמנים הטרוכרוני, שיטה זו עדיפה על מודל שליטה נוירופרטונידנטים המתרחשים השלמת הגירה בעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות וההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי הארגון SISSA הקדם אל Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. הדור הנדסי של בריכות מחולל "ירוקות"
- הכנת הבריכה "הירוקה"
- מחבר מסוג פראי CD1 נקבה עם מייסד Mtapt/+ + 16. המתת חסד הסכר ההרה על ידי פריקה צוואר הרחם ב 12.5 ימים post-coitum (היום 0 נקבע על ידי בדיקה לחבר הנרתיק) והקציר היום עובריים 12.5 (E 12.5) עוברים. הגדר אותם בארות בודדות של צלחת 24 מרבי בפתרון PBS קר.
- במהירות גנוטיפ העוברים על ידי בדיקה חזותית תחת מנורה כחולה אור, בדיקת פליטת זריחה ירוקה במוח.
- מניחים את "ירוק" עוברים לתוך 10 ס מ בקוטר צלחת פטרי מלא קר 1x PBS עם 0.6% גלוקוז ולהעביר אותו תחת stereomicroscope.
- חותכים את ראשי העובר באמצעות מספריים סטנדרטיים לחלץ את הטלנצאלון מהם באמצעות3 מלקחיים5.
- הפרד בין שתי הtelencephalic שלפוחיות ומבתר את הדרך באמצעות מלקחיים; לוודא להסיר את ההיפוקמפוס גרעינים הבסיס17.
- לאסוף מערבולות על ידי העברת אותם עם P1000 הצינורות לתוך שפופרת 1.5 mL שמרו על קרח.
- . השאר את החלק התחתון של הצינור
- . ומכה את הסופר ככל האפשר
- השהה מחדש את ה400 μL של מדיום מתרבים טרי [DMA-F12, 1x גלוטמקס, 1X N2, 1 מ"ג/mL סרום אלבומין חלבון (BSA), 0.6% גלוקוז, 2 μg/mL הפארין, 20 ng/mL בסיסי פיברופיצוץ גורם גידול (bFGF), 20 ng/mL גידול באפידרמיס פקטור (EGF), 1X עט-דלקת, ו-10 pg/mL אמפוריטיצין B].
- בעדינות פיפטה מעלה למעלה ולמטה, ברצף עם P1000, P200, ו P20 טיפים, 4x לכל עצה, כדי לקבל השעיה תא מעונן.
הערה: E 12.5 רקמה ניקורטיקלית רכה מאוד; הנתק אותו לתאים בודדים אינו דורש עיכול אנזימטי בכלל; ליטוף חוזר ונשנה מספיק. - תנו לקרום המוח ולגושים. הקורטיקליים להתיישב למשך 2 דקות
- העברת 150 μL מראש ההשעיה התא (בעיקר המכיל תאים בודדים) לתוך צינור חדש 1.5 mL סטרילי.
- הוסף 150 μL של בינוני מתרבים טרי וחזור על שלבים 1.1.10-1.1.12 עד שלא יהיו יותר גושים ברקמות. במהלך הפעולה הזאת, השמט את שלב P1000 ליטוף (בשלב 1.1.10).
הערה: שלושה איטרציה של צעדים 1.1.10-1.1.12 מספיקים בדרך כלל כדי להשיג את הדיסוציאציה רקמות מלא. - לספור תאים ("ירוק" בריכה) עם טרילון כחול הדרה שיטה בחדר בורקר17 ולהוסיף מדיום מתרבים טרי כדי לכוונן את הריכוז 103 תאים/μl.
הערה: שלבים 1.1.7-1.1.14 יש לבצע תחת מכסה זרימה סטרילית למינארי חיטוי שחוטא על ידי 70% אתנול והמשיך מאוורר לפחות 20 דקות.
- הנדסת תת-בריכות "ירוקות"
- חלוקת משנה את הבריכה "ירוק" לשתי משנה תת בריכות שני שונים 1.5 mL צינורות לזיהום ויראלי.
- הדביקו את תת-הבריכות באופן עצמאי עם שני התערובות הייעודיות. כל מיקס מכיל וירוס "אדום תווית" (Pgk1_mCherry) או "שחור" וירוס (pCAG_lacZ) כפקד, כמו גם וירוסים עבור tetOFF מונחה טרנסגנים (Pgk1p_tTA ו TRE_transgene) או שליטה (Pgk1p_tTA ו TRE_PLAP) ביטוי.
התראה: לטפל בווירוסים בסביבת הבה4 עם כל מדידות המגן שנקבעו על-ידי הכללים והחוקים הישימים.
הערה: כל הווירוסים חייבים להיות מנוהלים בריבוי של זיהום (מע) של 8, אשר (כפי שהוצג בעבר14) מספיק כדי לשנות את הרוב המכריע של התאים העצביים בתנאים ניסיוניים כאלה (איור 1). הווירוס מחסה לשנות את הפעילות ניתן לבנות על ידי הפעלת היזמים נוירוonal שונים נהיגה tTA/rtTA ביטוי (למשל, pTα1, pSyn, pCaMKII, pGAD1, וכו ') (איור 2). משרד המשרד הינו היחס של (א) למספר החלקיקים הנגיפי המדבקים הנמסרים ל-(ב) מספר תאי היעד שלהם. כאן, הראשון (א) מחושב על פי ההליך המקובל המתואר במקום אחר14, השני (ב) הוא פשוט מוערך באמצעות תא בורקר. - צלחת 600,000 תאים של כל תת מאגר נגוע לכל טוב של 12 צלחת multiwell יטב, ב 600 μL של בינוני מתרבים עם 2 μg/mL של דוקסיציקלין.
הערה: כאן, בארות אינן מטופלות מראש עם פולי ליזין, מה שמונע את ההחזקה של התא העצבי לתחתית שלהם. - העבר תאים לחממה ב 5% CO2 ב 37 ° c.
- לאחר יומיים, כדי להעריך את היעילות של זיהום ואת הסימון הדיפרנציאלי של בריכות הנדסה, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ פלורסנט קונבנציונאלי. שתי בריכות המשנה חייבות להופיע כהשעיות של נוירוספירות קטנות, המבטאות באופן ברור את חלבון הפלורסנט האדום ("שליטה") או לא ("מבחן" דגימה). בתוך הנוירוספירות אלה, ה- Mtaptegfp מוגבלת פעיל מוגבל למיעוט של תאים (post-mitotic נוירונים) ושקטים ברובם (precursors מתרבים) (איור 3).
2. הגדרת כלי הניתוח ואזור התפעול
-
הכנת מחטי בורוסיליקט
- השתמש נימים זכוכית בורוסיליקט עם קוטר חיצוני ופנימי שווה 1.5 מ"מ ו 1.12 מ"מ, בהתאמה.
- משוך את הנימים עם ה1000 P.
- . הגדר את תוכנית המשיכה פרמטרים אופייניים לתוכנית הם: חום = 614; vel = 60; זמן = 1; לחץ = 600. הם חייבים להיות מותאמים על פי מודל הפולר ואת המנגד חימום המועסקים.
- הניחו את הנימים בתוך מחזיקי הפולר והדקו אותם.
- הפעל את התוכנית ולקחת את שני מיקרו נימים משכו.
- חותכים את העצה נימי ביד, עם אזמל, תחת stereomicroscope כדי לקבל טיפ עם קוטר חיצוני של ~ 200-250 μm.
- הניחו את הנימים על חימר מדגמי (לדוגמא, פלסטלינה) בצלחת פטרי סגורה והעבירו אותו אל מתחת למכסה המנוע.
-
הקמת מכסה המנוע והכנת פתרון המעקב אחר תאים
- נקה את מכסה הזרימה האופקית בזהירות וחטא אותו באמצעות 70% אתנול.
- חיטוי סיבים אופטיים באמצעות 70% אתנול ומניחים אותם מתחת למכסה המנוע.
- מערבבים 10 μL של 125 מ"מ פתרון EGTA ו 10 μL של ירוק מהיר כדי להכין את" פתרון מעקב התא "ולמקם אותו מתחת למכסה המנוע.
- גזור חתיכות קטנות (4 ס"מ x 2 ס מ של גודל) של מעבדה איטום הסרט לאיתור ההשעיה התא.
- הכינו פתרון של 1 מ"ג/mL דוקסיציקלין סטרילי ומלא אותו לתוך מזרק 0.3 mL.
- החליפו את המכסה והמשיכו להזרים את המנוע במשך 20 דקות לפני הניתוח.
-
הרכבת צינורית ההזרקה
- קח את הנרתיק פלסטיק קשיח, שני צינורות לייטקס (כל אחד 30 ס מ ארוך) ומחזיק נימי מתוך ערכת הרכבה שפופרת מתכלה עבור פיפטות מכויל.
- תקן את הדבר הקשה-פלסטיק. לקצה אחד של צינור גומי
- לתקן את מחזיק הנימי לקצה אחד של צינור לייטקס אחר.
- לחבר את הקצוות החופשיים של שני צינורות לייטקס עם מסנן סטרילי 0.45 יקרומטר, כמחסום נגד חיידקים מפעיל.
- מניחים את שפופרת הצינור המתקבל על מחזיק חימר הדוגמנות להישמר מתחת למכסה המנוע.
3. שילוב תאים והשתלת מדרסים
- ערבוב "מבחן" ו-"שליטה" תא ירוק בריכות משנה
- לאסוף "מבחן" ו "שליטה" נוירוספירות (ראה שלב 1.2.5) בנפרד 1.5 mL צינורות.
- כדורים צנטריפוגה מושעה ב 200 g עבור 5 דקות.
- לאסוף ולמחוק את סופרנטאנט, הימנעות הפרעה של הגלולה התא.
- השעיה מחדש בעדינות של נוירוספירות ב-500 μL של 1x PBS.
- צנטריפוגה אותם ב 200 g עבור 1 דקות.
- . הסר את הסופרנטאנט
- חזור על הצעדים 3.1.4-3.1.6 עוד פעמיים.
- השהה בעדינות את הספירות ב-200 μL של הפתרון של 2x טריפסין (2x טריפסין, 1x PBS) והתא הפיפטה למעלה ולמטה 4x-5x.
הערה: שים לב לא לעשות בועות אוויר. - השאר תאים בחממה עבור 5 דקות ב 37 ° צ' כדי להשיג השעיה תא בודד.
- לחסום טריפסין עם 200 μL של טריפסין פתרון מעכבי (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse I, 0.28 mg/mL טריפסין מעכבי) על ידי ליטוף למעלה ולמטה 4x-5x.
- בתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות ולהשעות אותם מחדש 1 מ ל של מדיום מתרבים טרי (Dמאמ-F12, 1X גלוטמקס, 1X N2, 1 מ"ג/ML bsa, 0.6% גלוקוז, 2 μg/ml הפארין, 20 Ng/Ml bFGF, 20 Ng/ML egf, 1x עט-דלקת, 10 pg/Ml אמפוריטיצין B).
- הרוזן תאים של שתי הבריכות עם טרי, שיטת אי-הכללה כחולה בחדר בורקר.
- להתאים את הריכוז שלהם כדי 100,000 תאים/μL במדיום ההתרבות.
- מערבבים 1:1 "בדיקת" תאים עם "שליטה" אלה.
- בדוק את התמהיל המתקבל תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (הגדלה אובייקטיבית: 10x) כדי להבטיח כי התמהיל הוא תא בודד השעיה של שתי הבריכות (איור 3C).
- הניחו את התערובת על הקרח מתחת למכסה המנוע.
- השתלת אנטרריקולריות
- הכן את הכלוב עם האם והגורים הP0 על השולחן הרחק מאזור הניתוח הכירורגי.
- הציבו כלוב שחזור על עגלה הקרובה למכסה המנוע.
- שימו תערובת של נסורת נלקח מהכלוב של האם בתחתית כלוב ההתאוששות ומניחים אותו מתחת למנורה.
- בצד, להגדיר תיבת קרח מכוסה על ידי רדיד אלומיניום להרדמה של גורים P0.
- רק לפני השתלת, להוסיף 1/10 נפח של פתרון מעקב תאים (משלב 2.2.3) עד 1 נפח של ההשעיה התא (משלב 3.1.16) ובמקום 3 μL של התוצאה "הזרקת הזרקה" על פיסת מעבדה איטום הסרט.
- הצב את הגור על רדיד אלומיניום קריר במשך 1 דקות ובדוק כי הוא מורדם לחלוטין.
הערה: כדי לאשר הרדמה, לסחוט בעדינות כפה ולעקוב אחר הכלבלב על העדר תנועות, תוך שהוא עדיין נושם. - בינתיים, לאכול את 3 μL של תערובת הזרקה (משלב 3.2.5) לתוך נימי הזכוכית.
- נגב בעדינות את ראש הכלבלב. ההרדמה עם 70% אתנול
- מניחים את סנטרו של הגור על קצה הסיבים האופטיים כדי לזהות בבירור את האונות הקורטיקלית.
הערה: ב-P0-P1, עור הראש דק מאוד, ומאפשר זיהוי ויזואלי ישיר של האונות מעל העיניים ומאחורי הנורות הריח. - שמרו את הקפילר (טעונים כמתואר בשלב 3.2.7) באחד משני מטוסי האדם הבינוניים (שמאל או ימין), מעל לנורת הריח, ונקב את עור המצח בהצטלבות עם המישור הקדמי המכיל את מרכזי העיניים. שימו לב לא לפגוע בכלי הדם. הכניסו את הקפילר לקליפת המוח הקדמית והיכנסו לחלל המוח (איור 4A).
- כדי למנוע נזק מקרי של כבוד גנגלייוני, לסובב את המחט למעלה על ידי 30 מעלות, מצביע הקצה שלה caudal-המדיאלי-וורד (איור 4B).
- בעדינות להזריק את התאים לתוך חלל חדרית ולפקח על הדיפוזיה שלהם באמצעות ירוק מהיר (איור 4C).
- לחכות 5-10 s.
- הסר את המחט זכוכית מטפלת לא להשליך את ההשעיה התא ולמחוק אותו בסל סילוק מתאים.
- לפני התאוששות הגור מן הרדמה להזריק 150 μL של intraperitoneally פתרון דוקסיציקלין לשמור על ביטוי transgene עדיין לאחר ההשתלה.
- לאחר הזריקה, למקם את הגור מיד מתחת למנורה להחלמה.
- להשאיר את הגורים מתחת למנורה עבור 5-10 דקות, פעם הערה לגמרי, למקם אותם בכלוב עם האם.
- הביטו בגורים המופעלים ב-2-3 h כדי לוודא שהאם מקבלת אותם.
- לספק את הכלוב עם מי שתייה המכילה 0.5 mg/mL דוקסיציקלין ו 50 g/L סוכות כדי לשמור על הבעה גנטית לבטל.
- להחליף את המים דוקסיציקלין-המכיל מים ללא 4 ימים לאחר ההשתלה, ובכך מפעיל את הטרנסגנים ב-post-mitotic נוירונים. שמרו על עכברים במשטר ללא דופי במשך 6 ימים והללו את המתת החסד שלהם ב-P10 על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריה בעריפת ראש.
4. ניתוח מוחות מושתלים
-
היסטולוגיה ואימונולואונציה
- המתת חסד את הגורים המושתלים 10 ימים לאחר השתלת התא על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריו עריפת ראש. לתקן את המוח של כלבלבים מורדמים ב 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב 4 ° c בלילה.
התראה: המטה רעיל מאוד; לטפל בו בזהירות, להיענות בקפדנות למרשמים של היצרן, תחת כיסוי כימי; להיפטר הפתרון הכיורי שיורית במיכל פסולת בעלת תווית. - הסר את הפתרון הב, והחלף אותו ב-30% סוכרוז פתרון.
- השאירו את המוח בארבע מעלות צלזיוס או עד שהוא ישקע לתחתית הבקבוקון.
- להעביר את המוח לתוך עובש הטבעה חד פעמי בערך חצי מלא עם מדיום הכללת ההקפאה.
- הקפא את המוחות הכלולים ב--80 ° c.
- גזור 60 יקרומטר סעיפים ילתית עבה באמצעות קריוסטט.
הערה: הימנע משימוש במקטעים דקים, כמו זה עלול לגרום לאובדן מקובל של מידע על הארכיטקטורה כולה של נוירונים בודדים. - מקטעי תהליכים לאימונולואונציה18,19, באמצעות anti-gfp [1:400] ו anti-rfp (mcherry) [1:500] נוגדנים. גרעיני נגד כתמים עם פתרון 1 מ"ג/mL DAPI [1:200].
- המתת חסד את הגורים המושתלים 10 ימים לאחר השתלת התא על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריו עריפת ראש. לתקן את המוח של כלבלבים מורדמים ב 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב 4 ° c בלילה.
-
גומורמטריה
- הגדר פרמטרים עבודה של המיקרוסקופ קונפוקלית וקד כדלקמן: z-מחסנית גובה = 40 μm; שלב = 2 μm.
- לאסוף תמונות של פרוסות חיסוני בחירת שדות הצילום של העצב הגדול GFP-עשיר, עיוור של התפלגות אותות RFP.
- יצא את התמונות כקבצי. nd2.
- צור הקרנות Z מרביות שלהן כקבצי tiff (איור 5A).
- כדי לאפשר לשלד משני סדרתי. להיות עיוור לתאים, תחביא את האות האדום לשם כך, פתח כל קובץ. tiff באמצעות תוכנה מתאימה והוסף שכבת התאמה. בחר "רמות", "אדום", ואז להגדיר "פלט" לאפס. שמור את הקובץ ככזה.
הערה: השלד מבוצע לאחר מכן על ידי מפעיל חדש שלא הייתה לו גישה קודמת לקבצים המקוריים של אדום רגיל. - לכל קובץ אדום מוסתר, הוסיפו שכבת ציור לתמונה הראשית ובחרו בכלי העיפרון (צבע לבן). לעקוב אחר הסומה על בסיס האות GFP, ואז לעקוב אחר neurites.
הערה: ניתן להגדיר את כלי העיפרון ב 40 פיקסלים עבור הסומה ובשלושה פיקסלים עבור neurites. - שמור את קובץ רובת שכבות כולל צלליות עצבי (איור 5b).
הערה: ניתוח מאוחר יותר של שלד עצבי יכול להתבצע על ידי כל אופרטור. - צור קובץ חדש בגווני אפור של 1024 x 1024 16-bit עם רקע שחור, אחד לכל תא עצב.
- העתק והדבק צלליות בודדות מהתמונה הראשית לקובץ גווני האפור החדש. חזור לקובץ מרובה שכבות והחלף את שכבת ההתאמה כדי לחשוף גנוסוגים עצביים. שמור את הקובץ בגווני אפור של 16 סיביות המדגיש את הגנוטיפ העצבי המתאים.
- יבא תמונות בגווני אפור ב-ImageJ אחד אחד ונתח שלדים על-ידי תוסף עצבי התוכנה של imagej (איור 5c).
- העתק את הנתונים הראשוניים (neurite_length, attachment_points ונקודות קצה; עבור כל אחד מהם, קח את הערכים "שטח כולל"), הדבק אותם בגיליון אלקטרוני והשתמש בהם לחישוב פרמטרים משניים מורמטרים ( ממוצע neurite אורך, מדד הסתעפות) (איור 5d).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קיימות חמש מערכות נתונים ראשיות המספקות מידע שימושי אודות היבטים מרכזיים של הפרוצדורה, היעילות הראשונה (1) התייעלות של התמרה ושיתוף התמרה של וקטורים מבוססי-ויראליות. (2) דוגמה של תכונות עיקריות של היזמים המועסקים לנהוג "גן מבחן". (3) דוגמה של תאים מהונדסים מוכן השתלת. (4) קריקטורה הכוללת פרטים פרוצדורליים מרכזיים של הזרקת מיקרותא למוח הירחי. (5) תמצית של הצינור המטרי השלם.
באשר (1), את היכולת של הפרוטואוליים וקטורים מועברים ב MOIs שונים (2, 4, 8) כדי לשלב ביעילות הקדם בקליפת המוח החלה הוערך. בפעם הראשונה, המסמנים העצביים שמקורם מוקדם מסוג הפראי החלה נדבקו על ידי כתב האנטי ויראלי, מחסה את רצף mCherry קידוד (תקליטורים) תחת השליטה של עצבי-גנטי-ספציפי pTα1 יזם, במוי = 2, 4, 8, לאחר מכן ותר להבדיל. Co-immunoprofiling של הprogenies שלהם עבור mCherry ואת הפאן-עצבי הסמן Tubb3 הראה כי נוירונים היו ביעילות התמרה בתדר של 64%, 69%, ו 78%, בהתאמה (איור 1A). בתוך שיטת המשנה השנייה, הייתה מדבקת מקדם-קורטימית בחריפות על ידי שני כתבים מונגיים, ביטוי EGFP ו מצ, תחת שליטתה של היזם pPgk1 הקונסטיטוטיבי, ב-MOIs = (2, 2), (4, 4) ו-(8, 8). כמה ימים לאחר מכן, co-immunoprofiling של נגזרות שלהם הראו כי היחס בין EGFP+mcherry+ ו egfp+mcherry± תאים היה 80%, 88%, ו 93%, בהתאמה (איור 1b). נתונים אלה מצביעים על כך, עם המסירה של פרוטוקול ההנדסה שנקבע עבור המחקר הנוכחי, (א) הרוב המכריע של הנוירונים הם התמרה, ו (ב) כמעט כל מערכת הנוירונים החלה להגדיר את הצורך המלא ויראלי לאפיון שלהם.
איור 1 : יעילות של בתאי הקודמן העצבי התמרה על ידי וקטורים לנטינגיזציה. פאנלים לדווח על הערכה של היעילות על ידי התאים E 12.5 בקליפת המוח הם התמרה (או שיתוף התמרה) בעת המסירה של כתבים המוקדש האנטי ויראלי ב מכפילי שונים של זיהום (MOIs). במקרה הקודם (א), התאים היו נגועים בחריפות עם הנגיף (LV) PTα1-mcherry ב-מו = 2, 4, 8, תרבותי במדיום מתרבים עבור 2 ימים, הועבר למדיום בינוני, ומותר להבדיל לשבוע 1. עם קיבעון ביום מבחנה (DIV) 9, התרבויות היו co-immunoprofiled עבור mCherry ואת הפאן-עצבי סמן Tubb3. mCherry ו-EGFP אותות זוהו על ידי anti-RFP ו anti-EGFP נוגדנים העיקרי נחשף על ידי אלקסה-594-ו אלקסה-488-מעלה מעלה נוגדנים משני, בהתאמה. לבסוף, mCherry+Tubb3+/mCherryTubb3+ יחס היו מחושבים, ממוצעים ו התווה נגד mois המקביל. במקרה האחרון (ב), תאים היו נגועים בחריפות עם שילוב 1:1 של שני וירוסים, קידוד עבור הפעיל הקונסטיטוקטיבי Ppgk-mcherry ו-PPGK-egfp, ב mois שונים (2, 4, 8 עבור כל וירוס). תאים היו מתורבתים בינונית מתרבים במשך 4 ימים, טריסינטזציה, על ידי קיבעון, מפרופיל עבור mCherry ו-EGFP מחלת האימונולובורנציה כמו לעיל. לבסוף, mCherry+egfp+/mcherryegfp+ יחס שחושבו, הממוצע והתווה נגד mois המקביל. קווי שגיאה מייצגים את S.E.M. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
באשר (2), דפוסי הפעילות pTα1 ו-pSyn ניתן להסיק על בסיס פרופילי ביטוי של גנים fluoroprotein תחת שליטתה. בדוגמה זו, פקד כזה הוא ישיר במקרה של mCherry (איור 2A), ו עקיף [i.e. מתווך על ידי ממשק הדור השני של teton (איור 2a)], במקרה של Egfp (איור 2A, C, D). שני היזמים פעילים במיוחד בתוך Tubb3+ postmitotic נוירונים (איור 2b, C, D), אבל pTα1 גם שריפות בקבוצת משנה של Ki67+ intermitotic (כונן עצבי) טרום סמנים (איור 2b). כאן, כדי לספק מושג של שינויים מוגבלים של פעילות היזם כאשר התאים מהונדסים לפי תנאים סטנדרטיים אלה (איור 2E), pTα1-ו psyn מונחה ביטויים egfp בתוך Tubb3+ נוירונים היו כמותית על ידי היסטוגרמה לפוטושופ CS6 תוסף. לאחר מכן, נתונים גולמיים הונורמו כנגד medians ומותווים נגד היזמים (איור 2F). למרבה הצער, רמות הזריחה של תא יחיד היו בצפיפות באשכולות סביב medians: הרבינים הראשון והשלישי שווה 0.86 ו 1.16, כמו גם 0.89 ו 1.12 במקרים של pTα1 ו pSyn, בהתאמה.
איור 2 : פרופיל של מקודמן הסוג העצבי-היזמים ספציפיים מתאים לנהוג ביטוי יתר. פאנלים מתייחסים לאפיון של טובולין alpha 1 (pTα1) ו סינפסין (pSyn) היזמים, פעיל במיוחד בתוך השושלת העצבית כולה וpostmitotic נוירונים, בהתאמה. הבדיקה היו מופעל בקליפת המוח מראש הקוצרים שנקטפו ב עובריים שונים (En) הגילאים, נגוע בחריפות בתערובות מסורים ויראליים [PTα1-mcherry ב (א); pTα1-rtta, TRET-Egfp ב (ב); Psyn-RTTA, tret-EGFP ב (ג, ד); /ml דוקסיציקלין ab, ומתורבת במדיום ההתרבות (A), ההתרבות (2 ימים) ואחריו בינונית דיפרנציאל (B, C), או דיפרנציאל (D) מדיום. עם קיבעון ביום בבית מתורבת (DIV) n, postmitotic נוירונים זוהו על ידי αTubb3 ו intermitotic מקדים על ידי αKi67 immunofluorescence; mCherry ו-EGFP זוהו כמוצג באיור 1. האותות נחשפו כמוצג באיור 1. סרגלי קנה מידה: 100 יקרומטר ב (A, B) ו-50 יקרומטר ב (ג, ד). מוצגים הם (E) מתערבב המוקדש לנטינגיו המשמשים במחקר זה עם הפניות ללוחות האיור. מוצג הוא a (F) מגרש פיזור של אות egfp מונחה pTα1 ו-psyn בתאי Tubb3+ המכונים ב-(ב) ו-(ד), בהתאמה. קופסה הם תאים נופלים בין 25 ו 75th אחוזונים; שפקרס מתייחסים 10th ו 90th אחוזונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
באשר (3), 3 ימים לאחר התמרה ויראלית, Mtaptegfp/+ "ירוק" נוירוספירות לבטא את Pgk1p יזם מונחה, mדובדבן חלבון פלורסנט אדום ("שליטה" כדורים) או לא ("בדיקת" ספירות) (איור 3a, B). כל הספירות אינן מקבילות לתאים בודדים, ומבטיחים שאין שמאליים, והשעיות המקבילות מעורבות ב1:1. ערבוב וכתוצאה מכך (איור 3C) ממוקם על הקרח ומשמש בתוך 20 דקות עבור השתלת.
איור 3 : דוגמה של מבחן ("ירוק בלבד") ושליטה ("ירוק-אדום") DIV2 neurospheres התא ההשעיה מוכן השתלת. (א, ב) התחומים הללו הושגו mtaptegfp/+E 12.5 neocortical בחריפות על ידי mixes ויראלי מתערבב "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (A) ו "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (ב), בהתאמה, כל LV ב-מוי = 8, ושמרו במדיום מתרבים. (ג) השעיית תא הושגה על ידי הנתק "מבחן" ו "שליטה" נוירוספירות (A, B) לתאים בודדים וערבוב אותם 1:1. סרגלי קנה מידה: 200 יקרומטר ב (A, B) ו-100 יקרומטר ב (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
באשר (4), ההליך של הזרקת התא לתוך המוח הירחי כולל שלושה מדרגות מפתח. הקפילר, הממוקם על המישור הבינוני-פארא, נכנס לתוך החלל הצדדי לרוחב דרך הקיר הקדמי של קליפת המוח (איור 4A). לאחר מכן, כדי למנוע נזק של כבוד גנגלייוני, הקפילר מסובב 30 ° בתוך המישור האופקי, כך את הטיפ נקודות מבחינה מדיה/מזמין (איור 4B). אחרון, ההשעיה התא הוא נפלט בעדינות לתוך חלל חדרית לרוחב, שם הוא יוצר בקלות להבדיל, בהיר כחול "ענן" (איור 4C).
איור 4 : תרשימים של שלושת השלבים הליך מועסק הזרקה התא לתוך המוח הירחי. (א) הקפילר נכנס לחדר הצדדי דרך הקיר הנאוקורטיאני הקדמי. לאחר מכן, (ב) זה מסובב מחלקה, כדי למנוע נזק של כבודך גנגלייוני. לבסוף (C), ההשעיה התא מוזרק בעדינות לתוך החדר הצדדי, שם הוא יוצר ענן כחול קל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
באשר (5), ההליך האנליטי כולל ארבעה צעדים עיקריים. ראשון, קטעי מוקד אופטי של שדות עצב-מושתל משוטחים, בהתאם מודאליות MAX Z-הקרנה כך יוצר קבצי RGB. tiff. כאן, כדוגמה, רק "מבחן ירוק" נוירונים ו "שליטה צהובה" נוירונים, שמקורם מושתלים שותפים precursors, ניתן להבדיל בקלות (זה צריך להיות ציין כי mCherry עשוי לחילופין לשמש תווית "מבחן" נוירונים) (איור 5A). לאחר מכן, הגרסה האידאלית, ששלד המצלמה לוצידה גירסה של התמונה נוצרת על ידי תוכנה גרפית מתאימה (ראה שלב 4.2.6) (איור 5b) על ידי מפעיל עיוור של ערוץ אדום. עיוורון של ערוץ אדום הוא בעל חשיבות עליונה על מנת למנוע כל הטיה בשוגג בהערכת נתונים. לאחר מכן, צלליות חד-מחובנות מוזנים לתוכנה העצבית כתמונות וערכים של שלושת הפרמטרים העיקריים "המספר הכולל של exitpoints" (attachment_points), "המספר הכולל של נקודות קצה" (נקודות קצה) ו-"סכום neurite אורך "(neurite_length) נאספים (איור 5c). לבסוף, פרמטרים משניים של תא העצב מחושבים, ממוצעים ומבחינה סטטיסטית הוערכו על ידי תוכנת Excel (איור 5D).
איור 5 : תרשים זרימה מייצג של ניתוח מורמטרי של המוח המושתלים. לוחות שורה עליונה להראות: (א) תמונה מקסימלית z-הקרנה. tiff של המוח המדיאלי, קבוע 10 ימים לאחר השתלת תא הנדסה (ירוק = mtapt-מונחה, תא מוגבל-Egfp; אדום = mדובדבן, תיוג מבחינה חוקתית "בקרת" תאים; כחול = DAPI), התדר הירוק הערוץ, ו (ב) השלד מצלמה e-המצלמה שלה לוצידה עיבוד. סרגלי קנה מידה: 50 μm. השורה התחתונה כוללת: (ג) פרמטרים ראשוניים מורמטרים שחולצו מתוך שלדים עצביים על ידי ניתוח תוכנה עצבי (neurite_length as Σlאני, attachment_points as Nיציאה ו נקודות קצה כפרמטרים משניים של NEndו-(D) שחושבו על בסיסו. דמות זו שונתה מתוך Chiola et al.21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היבטים/צעדים ספציפיים של הליך זה הם קריטיים ודורשים תשומת לב מיוחדת. ראשית, (א) אופרטורים חייבים להיות מאומנים בצורה מספקת כדי לתפעל בביטחה את הווירוסים בסביבת מעבדה תואמת BSL-2. שנית, (ב) לפני ערבוב "מבחן" ו "שליטה" ההכנות העצביות, זה הכרחי כדי לשטוף בזהירות את שני השעיות נוירוספירה המקביל כפי שמתואר, כדי למנוע כל עיכוב החוצה הידבקות של שתי ההכנות בשל העדשה לא רצויות להמשיך השלישי, (ג) תוך שתילת התאים, הטיפול חייב להיות ממוקם תוך מיקוד חלל חדרית; במובן זה, מכשיר המעקב הירוק מהיר כלול בהשעיה של התא הוא של עזרה משמעותית. בנוסף, (ד) כדי למנוע קניבליזם, גורים מושתלים יש להעביר מחדש האם רק לאחר ההתאוששות המלאה שלהם מהרדמה (בדרך כלל 10 דקות זה מספיק). (ה) הקפאה של הרקמה המושתלים יש לבצע ב 60 μm; למעשה, עובי זה בו מאפשר חדירת נוגדן קל לתוך רקמת ומגביל אובדן מידע שמקורם הפיצול תא העצב העובדתי. לבסוף, (f) כדי למנוע הטיה לא מכוונת בהערכת נתונים, אנו מדגישים ששלד הנוירונים חייב להתבצע על ידי מפעיל עיוור של ערוץ אדום.
הפרוטוקול המתואר כאן מתייחס GOF מניפולציות גנים. לחילופין, "מבחן" נוירונים עשוי להיות מהונדס כדי להוריד את הפונקציה הגוי באמצעות קידוד וירוסים של RNAi. לאחר מכן, אנחנו בדרך כלל מעסיקים mCherry לתווית "שליטה" בתאי העצבים; עם זאת, הערכה של mCherry/"control" ו-LacZ/"test" עשויה להיות הפוכה בעליל. אחרון, הפרוטוקול המתואר כאן מתייחס לזריקות תא בלתי מטרקיות; "מבחן" ו "שליטה" הנוירונים עשוי להיות מוזרק לחילופין לתוך הבית הנוירוצ'יא21.
למרות יתרונותיה, לשיטה זו שני מגבלות עיקריות. בעוד המאפשר לחקור את השליטה הגנטית התא האוטונומי של נוירוארכיטקטורה, זה לא חל על שליטה סביבתית על זה. יתר על כן, כמו מושתלים המושתלים מראש להגר מהיבט חדרית של הקיר קליפת המוח למיקום האחרון שלהם לאחר הלידה (כלומר בתוך פרק זמן לא פיזיולוגי), שיטה זו צריכה להיות מועסק באופן רצוי כדי לדגמן שליטה באמצעות נוירוטוניוניקה לאחר השלמת ההעברה.
אחרון חביב, תשומת לב מיוחדת יש לשלם לפרשנות קריטית של תוצאות. בפרט, אם הנושא הגנטי X החקירה מפחית את המורכבות המורפולוגית של "מבחן" נוירונים, זה לא יכול במפורש לשקף את ההשפעה האמיתית שלה על אדריכלות העצב. במקום זאת, תופעה זו עשויה להיות מדד לא ספציפי של נזק עצבי שעורר על ידי ביטוי יתר של X. כדי לטפל בבעיה זו, זה עשוי להיות שימושי כדי להשוות את הצפיפות המקומית של מושתלים, "בדיקה" ו "שליטה" נוירונים, לאחר מכן לחפש הצטמקות מספרית אפשרית של אוכלוסיית "בדיקה", כמדד של סבל עצבי הנגרמת על ידי X [הצטמקות זה צריך להיות אפילו יותר בוטא על ניתוח מושהה נוסף של מוחות מושתלים]. במקרים כאלה, הורדת רמת ביטוי היתר של הגן X או העברה לעיצוב של אובדן פונקציה עשויה לפתור את הבעיה.
השיטה שלנו מוסיפה למגוון רחב של טכנולוגיות המועסקים לחקור בקרת גנים של מורפולוגיה עצבית ב vivo1,2,3,4,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , 12. כפי שנזכר במבוא, טכנולוגיות אלו מסתמכות על מגוון של מניפולציות גנטיות אד הוק שמטרתן לperturb את רמות הביטוי של גוי ולהקל על הוצאת מידע מורפולוגיים מדגימות ביולוגיות. טכנולוגיות אלה מאפשרות בדרך כלל ניתוח מדויק של שליטה זו; עם זאת, הם דורשים לא כישורים ניסיוניים יקרי ערך ומשאבים פיננסיים. במובן זה, השיטה מציעה שלושה יתרונות עיקריים. היא מאפשרת שליטה מדויקת של רמות ביטוי של הגוי הדומה לאלה מודלים מיוחדים הטרנסגניים; עם זאת, בהיעדר עלויות תחזוקה של מושבת המוטציות. היא אינה דורשת כישורים ניסיוניים מתוחכמים (כירורגיים). היא משיגה לעתים קרובות משמעות סטטיסטית של תוצאות על ניתוח של מספר מוגבל יחסית של בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לקרן דוק על תרומתו לשלב מוקדם של הליך זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
