Summary
神経前駆体のインビトロレンチウイルス工学、野生型脳への共同移植、および「テスト」および「コントロール」誘導体の対対モルモメトリック評価に基づいて、この方法は、新生児の生体内遺伝子制御における正確なモデリングを可能にするシンプルで手頃な方法でニューロン形態。
Abstract
ニューロン細胞構造の遺伝子制御は、現在、集中的な研究の対象である。ここで説明する、新生物投影ニューロン形態の生体内遺伝子制御を研究するために開発された簡単な方法である。この方法は、(1)ニューロン前駆体の「試験」および「制御」細胞のインビトロレンチウイルス工学、(2)野生型脳へのそれらの共移植、および(3)それらの神経誘導体の対対形態評価に基づいている。具体的には、この目的のために、パンニューロン由来のE12.5pallial前駆体、遺伝的標識ドナーが用いられる。それらは選択されたプロモーターおよびtetON/OFFの技術を利用するように設計され、新生児の横心室に自由に移植される。その後、レシピエント脳の免疫蛍光プロファイリングに際して、移植されたニューロンのシルエットをNeurphologyJオープンソースソフトウェアに送り込み、それらの形態パラメータを抽出し、平均長さと分岐指数を算出する。他の方法と比較して、この1つは3つの主要な利点を提供する:それは手頃な費用でトランスジーン発現の細かい制御を達成することを可能にし、それは基本的な外科的スキルを必要とし、限られた分析の場合に統計的に信頼できる結果を提供する動物の数。しかし、その設計のため、神経アーキテクチャの非細胞自律制御に対処するには不十分です。さらに、神経移動の完了後にニューライト形態制御を調べるために好ましくは用いるべきである。本製剤では、この方法は、グルタマチング性新生物神経系統アーキテクチャの遺伝子制御を調べるために絶妙に調整されている。EGFPを発現するトランスジェニックラインを他の特定の神経細胞タイプで利用して、そのアーキテクチャの遺伝子制御に対処するために再利用することができる。
Introduction
ここでは、ニューロン細胞構造の生体内遺伝子制御を解剖するために開発した簡単な方法について述述びます。神経前駆体のインビトロ工学に基づいて、新生児脳への移植と「テスト」および「制御」細胞の対化形態評価に基づいて、ニューロン形態の細かい制御における試験遺伝子の機能的影響を明らかにすることができる。高速かつ手頃な価格の方法。ニューロンアーキテクチャの生体内遺伝子制御を調べるには、(1)適切にパターン化された遺伝子(GOI)発現と正確な定量的制御の達成という3つの重要な技術的課題に取り組む必要があります。(2)異なるニューロンシルエットの適切にセグメント化された可視化を得ること。(3)限られた数の動物を用いながら、結果の統計的有意性を引き出す。
利用可能な場合、テトラサイクリン(tet)制御トランスジーンを収容するマウス変異線は、最初の問題1に対処するための最良のツールである可能性があります。あるいは、体性トランスジェネシスが採用されてもよい。このような場合、トランスジーンは、エレクトロポレーション2またはウイルス伝達3を介して送達される。次に、エピソームとして保持される(例えば、標準的なエレクトロポレーション4)、またはゲノムに統合される(ランダムに、レトロウイルスインテグラーゼ5;または定義された場所に、CRISPR促進相同組換え(SLENDR)6).
第二に、ニューロンシルエット可視化は、(a)まばらな均一標識または(b)緻密な差分標識を介して達成され得る。まばらな標識に関しては、高度なゴルジ様方法論7を用いてもよいし、選択されたニューロンミニセットはバイオシシン8で充填することができ、また、まばらに発現したトランスジーンのおかげで塩およびコショウ標識を得ることができる。このようなトランスジーンは、可変転写(Thy-EGFP)9を表示してもよいし、確率的組換え(MORF)10によって活性化されてもよい。(b)に関しては、最先端の戦略には、多フロキ散性フルオロプロテイントランスジーン配列(Brainbow)11内のクレ媒介確率的組換え、ならびにピギーバクトランスポサーゼ駆動のフルオロタンパク質遺伝子のゲノム統合が含まれる。体細胞トランスジェネシス(CLoNE)12を介して配信されます。
第3の問題に関しては、形態学的結果は、多くの場合、動物間の違いと細胞注入の不測の事態に起因する大きなランダム変動の影響を受けます。このため、GOI形態測定活性を評価するために必要な統計的な力を達成するために、通常、多数の動物が使用されます。
前述のアプローチは、高度な技術的スキルに依存することが多く、目立つ財源を必要とし、科学界内での拡散を制限する可能性があります。これらの問題を回避するために、我々は迅速かつ手頃な方法で生体内の神経構造の遺伝子制御を解剖するための簡単で簡単なパイプラインを考案しました。これは、抗芽細胞トランスジーン活性13の高速生体内評価のために以前に開発された同様の共同移植設計に触発される。
具体的には、インビトロで「緑色」の神経前駆体(「テスト」と「制御」細胞)を「黒」レシピエント新生児脳に同時に移植すると、上記の3つの重要な問題を同時に修正できると考えられている。実際、前駆体のインビトロレンチウイルス工学では、十分に制御された条件下で、ニューロントランスジーン発現の変動性の維持を可能にし、通常は生体内の体系操作に関連するよりもはるかに低い(以前に行われた)14歳,15と私たちの未発表の結果で)。得られた遺伝子発現の正確な制御は、tet制御トランスジェニックモデルによって達成されるものと同等である。しかし、この手順のコストは、トランスジェニックマウスラインのメンテナンスに起因するものよりもはるかに低いです。次に、自由な手の細胞注入は容易で、最低の訓練を必要とする。さらに、各脳に注入される標識された前駆体の量は、移植された動物の総数を最小限に抑えながら、まばらに分布する前駆体の十分な累積数を達成するために容易に調整することができる。最後に、異なるフルオロ標識の共注入、"テスト"と"制御"前駆体およびその後のペアワイズ統計分析は、動物間実験変動の影響を打ち消し、結果の統計的有意性は、限られた数の個人の分析でも13.
高速かつ安価であるにも関しては、この方法には2つの主な制限があることを強調する必要があります。第一に、神経構造の細胞自律遺伝子制御を調べるように設計されており、環境制御に取り組むのは適切ではない。第二に、移植された神経前駆体がヘテロクロニクススケジュールによって最終位置に達するにつれて、この方法は、過去の移行完了が起こる神経設計制御をモデル化することが好ましい。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法および手順は、SISSAオルガニスト・アル・ベネッセア・アニマル(SISSA IACUC)によって承認されています。
1. エンジニアリングされた「グリーン」前駆子プールの生成
- 「緑」プールの準備
- MtaptEGFP/+創設者16と野生型 CD1 メスを合致します。12.5日後の子宮頸部脱臼により妊娠中のダムを安楽死させ(0日目は膣プラグ検査で決定)、胚12.5(E12.5)胚を収穫する。冷たいPBS溶液で24マルチウェルプレートの個々のウェルにそれらを設定します。
- 青色光灯の下で目視検査を行い、脳内の緑色蛍光放出を確認します。
- 「緑色」の胚を直径10cmのペトリ皿に入れ、0.6%のブドウ糖で冷たい1x PBSで満たされ、立体顕微鏡下に移します。
- 標準的なはさみを使用して胚の頭部を切断し、#3と#5鉗子によってそれらからテレスファロンを抽出します。
- 2つの脳静脈炎を分離し、鉗子を使用して新生物を解剖する;海馬と基底神経節17を削除してください。
- P1000ピペットを氷の上に保管された1.5mLチューブに移してネオコルチズを採取します。
- 解剖したネオコルチテスをチューブの底に落ち着かせてください。
- 可能な限り上清を吸引する。
- 新生増殖培地の400μLでネオコルチクスを再懸濁 [DMEM-F12, 1xグルタマックス, 1X N2, 1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA), 0.6% グルコース, 2 μg/mL ヘパリン, 20 ng/mL 基本線維芽成長因子 (bFGF), 20 ng/mLと10 pg/mLアンホテリシンB]。
- ネオコルティクスを上下にゆっくりとピペットし、P1000、P200、P20チップをチップあたり4倍、曇りセル懸濁液を得る。
注:E12.5新皮組織は非常に柔らかいです。単一細胞に関連付け合うには、酵素消化をまったく必要としません。繰り返しピペッティングで十分です。 - 髄膜と残留ネオコルチカルの塊を2分間落ち着かせてください。
- 細胞懸濁液(主に単一細胞を含む)の上部から150 μLを新しい1.5 mL無菌チューブに移します。
- 新鮮な増殖培地の150 μLを追加し、組織の塊が明らかになるまでステップ1.1.10-1.12を繰り返します。これを行っている間、P1000 ピペッティング ステップを省略します (ステップ 1.1.10)。
注:ステップ1.1.10-1.1.12の3回の反復は、通常、完全な組織解離を達成するのに十分です。 - Bürker室17におけるトリパン青色排除法を用いて細胞(「緑」プール)をカウントし、新鮮な増殖培地を添加して濃度を103細胞/μLに調整する。
注:ステップ1.1.7-1.1.14は、70%のエタノールで消毒された無菌層流フードの下で行い、少なくとも20分間換気を保たなければなりません。
- 「グリーン」サブプールのエンジニアリング
- レンチウイルス感染のための2つの異なる1.5 mLチューブで「緑」プールを2つのサブプールに細分化します。
- 2つの専用レンチウイルスミックスでサブプールに独立して感染します。各ミックスには、コントロールとして「赤ラベル」ウイルス(Pgk1_mCherry)または「黒」ウイルス(pCAG_lacZ)、tetOFF駆動トランスジーン(Pgk1p_tTAおよびTRE_transgene)またはコントロール(Pgk1p_tTAおよびTRE_PLAP)式のウイルスが含まれています。
注意: BLS-2 環境でレンチウイルスを操作し、適用される規則および法律で規定されているすべての保護測定値を使用します。
注:各レンチウイルスは、(前述の14)このような実験条件で神経細胞の大部分をトランスデュースするのに十分である8の多重感染(MOI)で投与されなければならない(図1)。レンチウイルスハープティングテットトランスベーターは、tTA/rtTA発現を駆動する異なるニューロンプロモーターを採用することによって構築することができる(例えば、pTα1、pSyn、pCaMKII、pGAD1など)(図2)。MOIは、(a)(b)その標的細胞の数に送達される感染性ウイルス粒子の数の比率である。ここで、前者(a)は、他の場所に記載された従来の手順に従って計算され、後者(b)は、単にBürker室を用いて評価される。 - 12個のマルチウェルプレートのウェル当たり各感染サブプールのプレート600,000細胞を、ドキシサイクリンの2μg/mLを有する増殖培地の600 μL中に含有する。
注:ここでは、ウェルはポリリジンで前処理されていないため、神経細胞が底部に付着するのを防ぐことができます。 - 細胞を37°Cで5%CO2でインキュベーターに移す。
- 2日後、工学プールの感染効率と差動マーキングの効率を評価し、従来の蛍光顕微鏡下で細胞を検査する。2つのサブプールは、小さな神経球の懸濁液として現れなければならず、赤色蛍光タンパク質(「対照」サンプル)を均一に発現させるか(「検定」サンプル)。これらの神経球の中で、Mtapt EGFPトランスジーンは少数の細胞(有人性ニューロン)に限られ、それらの大部分で無声(増殖前駆体)である(図3)。
2. 手術器具及び手術領域の設定
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ホウケイ酸塩針の準備
- 外径と内径がそれぞれ1.5mmと1.12mmのホウケイ酸塩ガラスキャピラリーを使用してください。
- P 1000プーラーで毛細血管を引っ張ります。
- プル プログラムを設定します。一般的なプログラムパラメータは、熱 = 614 です。ベル = 60;時間 = 1;圧力 = 600。それらは、プーラーモデルと採用された加熱抵抗に従って調整する必要があります。
- 毛細血管を引き出しホルダーに入れ、引き締めます。
- プログラムを開始し、2つの引っ張った微小毛細血管を取ります。
- キャピラリー先端を手でカットし、メスで、立体顕微鏡の下で、〜200〜250 μmの外径の先端を得る。
- 毛細血管をモデリング粘土(例えば、プラスチック)のサポートを閉じたペトリ皿に置き、フードの下に移します。
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フードのセットアップとセルトレーサーソリューションの準備
- 水平流フードを慎重にクリーンアップし、70%エタノールを使用して消毒します。
- 70%エタノールを使用して光ファイバを消毒し、ボンネットの下に置きます。
- 125 mM EGTA溶液の10 μLとファーストグリーンの10 μLを混ぜ、「セルトレーサー溶液」を準備し、フードの下に置きます。
- 細胞懸濁液スポッティング用の実験室用シールフィルムの小片(4cm x 2 cm)を切断します。
- 1 mg/mL滅菌ドキシサイクリンの溶液を準備し、0.3 mLシリンジにそれを吸引します。
- フードのスイッチを入れ、操作の前に20分間層の流れをオンに保ちます。
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注入管の組み立て
- 硬質プラスチックのマウスピース、2本のラテックスチューブ(それぞれ約30cm)とキャピレーターチューブアセンブリキットからキャピラリーホルダーを取り、キャリブレーションされたマイクロキャピラリーピペット用に取り付けます。
- 硬質プラスチックのマウスピースをラテックスチューブの一方の端に固定します。
- 毛細管ホルダーを別のラテックスチューブの一方の端に固定します。
- オペレータ細菌に対する障壁として、2つのラテックスチューブの自由な端を0.45 μmの滅菌フィルターで接続します。
- 得られた吸引管アセンブリをボンネットの下に保持するモデリング粘土ホルダーに置きます。
3. 細胞混合および静脈内移植
- 「テスト」と「コントロール」グリーンセルサブプールの混合
- 別々の1.5 mLチューブで「テスト」と「制御」神経球(ステップ1.2.5を参照)を収集します。
- 遠心分離機神経球懸濁液を200gで5分間懸濁する。
- 上清を回収して廃棄し、細胞ペレットの乱れを避ける。
- 1x PBSの500 μLで神経球を穏やかに再中断する。
- 遠心分離機を200gで1分間使用します。
- 上清を取り除く。
- 手順 3.1.4-3.1.6 をもう 2 回繰り返します。
- 2xトリプシン溶液(2xトリプシン、1x PBS)とピペットセルペレットを上下4x-5xの200 μLでゆっくりと再中断します。
注:気泡を作らないように注意してください。 - 37°Cで5分間インキュベーターに細胞を残し、単一細胞懸濁液を達成する。
- トリプシン阻害剤溶液の200 μLを使用したブロックトリプシン(DMEM-F12、10 μg/mL DNAse I、0.28 mg/mLトリプシン阻害剤)を上下4x-5xでピペッティングします。
- 200 x gで5分間遠心分離球を5分間、新鮮増殖培地の1mLで再中断(DMEM-F12、 1xグルタマックス、1x N2、1mg/mL BSA、0.6%グルコース、2 μg/mLヘパリン、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、1xペンストレップ、10 pg/mLアンフォテリシンB。
- Bürkerチャンバー内のトリパンブルー除外法で2つのプールの細胞をカウントします。
- 増殖培地中の100,000細胞/μLに濃度を調整します。
- 1:1の「テスト」セルと「コントロール」細胞を混ぜます。
- 蛍光顕微鏡(対倍率:10倍)で得られたミックスをチェックして、ミックスが2つのプールの単細胞懸濁液であることを確認します(図3C)。
- フードの下の氷の上にミックスを置きます。
- 静脈内移植
- 外科手術場から遠く離れたテーブルの上に母親とP0の子犬とケージを準備します。
- フードの近くのカートに回復ケージを置きます。
- 回復ケージの底に母親のケージから取られたおがくずの混合物を入れ、ランプの下に置きます。
- 別に、P0の子犬の麻酔のためのアルミ箔で覆われた氷箱を設定します。
- 移植の直前に、細胞トレーサー溶液の1/10体積(ステップ2.2.3から)を1体の細胞懸濁液(ステップ3.1.16から)に加え、結果として得られる「注入ミックス」を実験室のシールフィルムにスポット3 μLを追加します。
- 子犬を冷たいアルミホイルの上に1分間置き、完全に麻酔が整っていることを確認します。
注:麻酔を確認するには、足をそっと絞り、呼吸しながら子犬の動きの欠如を監視します。 - 一方、3μLの注入ミックス(ステップ3.2.5から)をガラス毛細血管に吸引する。
- 70%のエタノールで麻酔された子犬の頭をそっと拭きます。
- 光ファイバの先端に子犬の顎を置き、皮質半球を明確に識別します。
注:P0-P1では、頭部皮膚は非常に薄く、眼球のすぐ上と嗅球の後ろの半球を簡単に視覚的に識別できます。 - 毛細血管(ステップ3.2.7で説明されているようにロード)を、嗅球の上にある2つの中間パラサジタール平面(左または右)のいずれかで保持し、眼球の中心を含む正面面との交点で額の皮膚を穿刺します。血管を損傷しないように注意してください。前頭皮質に毛細血管を入力し、心室腔にアクセスする(図4A)。
- 神経節の偶発的な損傷を防ぐために、針を横方向に30度回転させ、先端を斜体中間区(図4B)を指します。
- 細胞を心室腔に穏やかに注入し、高速グリーン(図4C)によってその拡散を監視する。
- 5-10 s.
- セル懸濁液を吸引しないように注意してガラス針を取り外し、適切な処分箱に捨てます。
- 麻酔からの子犬の回復の前に、移植後もトランスジーン発現をオフに保つために、150 μLのドキシサイクリン溶液を経後に注射する。
- 注射後、回復のためにランプの直下に子犬を置きます。
- ランプの下に5〜10分間子犬を残し、一度完全に目を覚ますと、母親とケージにそれらを置きます。
- 母親がそれらを受け入れることを確認するために、2-3時間のために操作された子犬を観察します。
- 0.5mg/mLドキシサイクリンと50g/Lスクロースを含む飲料水をケージに供給し、トランスジーン発現をオフに維持します。
- 移植の4日後にドキシサイクリン含有水をドキシフリー水で置き換え、有糸性後ニューロンでトランスジーンを活性化する。マウスを6日間ドキシフリーの状態に保ち、二酸化炭素吸入によってP10で安楽死させ、その後首を切り落とす。
4. 移植脳の解析
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組織学と免疫蛍光
- 二酸化炭素吸入による細胞移植後10日後に移植された子犬を安楽死させ、その後首を切り落とす。安楽死した子犬の脳を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩4°Cに固定します。
注意: PFA は非常に有毒です。化学ヒュームフードの下で、厳密にメーカーの処方箋を遵守し、注意してそれを処理します。PFA溶液残留物をラベル付き廃棄物容器に廃棄する。 - PFA溶液を取り出し、30%ショ糖溶液に交換します。
- 脳を4°Cに、またはバイアル底に沈むまで放置します。
- 脳を使い捨て埋め込み型に移し、クライオ含浸媒体で約半分充填します。
- 含まれる脳を-80 °Cで凍結します。
- クライオスタットを使用して60 μmの厚いコロナセクションを切断します。
注: 単一ニューロンのアーキテクチャ全体に関する情報の許容できない損失につながる可能性があるため、より細いセクションを使用しないようにしてください。 - 免疫蛍光18、19のプロセスセクションは、抗GFP[1:400]および抗RFP(mCherry)[1:500]抗体を用いて使用する。1 mg/mL DAPI 溶液で核をカウンターステイン [1:200]
- 二酸化炭素吸入による細胞移植後10日後に移植された子犬を安楽死させ、その後首を切り落とす。安楽死した子犬の脳を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩4°Cに固定します。
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モルホ家庭
- 共焦点顕微鏡の作業パラメータを次のように設定します: z スタックの高さ = 40 μm;ステップ = 2 μm。
- GFP陽性ニューロンが豊富な写真場を選択し、RFP信号分布の盲目を選択する免疫アッセイスライスの写真を収集します。
- イメージを .nd2 ファイルとしてエクスポートします。
- それらの最大 Z 投影を .tiff ファイルとして生成します (図 5A)。
- 細胞遺伝子型に対するサブシーケンシャルなニューロン骨格化を可能にするために、赤色シグナルを隠す。これを行うには、適切なソフトウェアで各 .tiff ファイルを開き、調整レイヤーを追加します。「レベル」、「赤」を選択し、「出力」をゼロに設定します。ファイルを保存します。
注: スケルトン化は、元の単純な赤いファイルに以前にアクセスしなかった新しいオペレータによって実行されます。 - 非表示の赤いファイルごとに、描画レイヤーをプライマリ イメージに追加し、鉛筆ツール (白色) を選択します。GFP信号に基づいてソマをトレースし、ニューライトをトレースします。
注:鉛筆ツールは、ソマの場合は40ピクセル、ニューライト用は3ピクセルに設定できます。 - ニューロンシルエットを含む多層ファイルを保存します(図5B)。
注:ニューロン骨格の後続の分析は、いずれかのオペレータによって行うことができます。 - ニューロンごとに 1 つずつ、黒い背景を持つ新しい 1024 x 1024 16 ビットグレースケール ファイルを作成します。
- プライマリ イメージから新しいグレースケール ファイルに単一のニューロン シルエットをコピーして貼り付けます。多層ファイルに戻り、調整層をオフにしてニューロンのジェノタイプを明らかにします。対応するニューロン遺伝子型にアノニティを付した 16 ビットグレースケール ファイルを保存します。
- ImageJ でグレースケール画像を 1 つずつ読み込み、ImageJ ソフトウェア20の NeurphologyJ プラグインでスケルトンを解析します (図 5C)。
- NeurphologyJの一次データ(neurite_length、添付ファイル_ポイント、エンドポイント;それぞれに「総面積」の値を取り、スプレッドシートに貼り付け、それらを使用して二次形態学的パラメータを計算する( 平均ニューライト長さ、分岐指数(図5D)。
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Representative Results
手順の主要な側面に関する有用な情報を提供する5つの主要なデータセットがあり、最初のは(1)レンチウイルスベクターによる神経前駆体の伝達および共伝導の効率である。(2)「試験遺伝子」を駆動するために用いられるプロモーターの主な特徴の一例。(3)移植準備ができている工学的細胞の例。(4)新生児脳への細胞マイクロインジェクションの主要な手続き上の詳細を含む漫画。(5) 形態パイプライン全体の概要
(1)に関しては、異なるMOI(2,4,8)で送達された原型レンチウイルスベクターの能力が、新皮質前駆体を効果的に転移させる能力を評価した。最初のアッセイでは、初期の野生型ネオコルチスに由来する神経前駆体がレンチウイルスレポーターに感染し、神経性系統特異的pTα1プロモーターの制御下でmCherryコード配列(cds)を、MOI =2,4,8で投与した。差別化を可能にします。mCherryと汎ニューロンマーカーTubb3に対する子孫の共免疫プロファイリングは、ニューロンがそれぞれ64%、69%、78%の周波数で効果的に転移したことを示した(図1A)。第2のアッセイでは、新生物前駆体は、構成的pPgk1プロモーターの制御下で、(2,2)、(4,4)、および(8,8)で、EGFPおよびmCherryを発現する2つのレンチウイルスレポーターによって急性共感染した。数日後、それらの誘導体の共免疫プロファイリングは、EGFP +mCherry+およびEGFP+mCherry±細胞の比率がそれぞれ80%、88%、および93%であったことを示した(図1B)。これらのデータは、本研究のために想定される工学プロトコルの配信時に、(a)大部分のニューロンがトランスコードされ、(b)ほぼすべてのトランスコードニューロンがその特徴付けに必要な完全なレンチウイルスセットを受け取ることを示唆している。
図 1: レンチウイルスベクターによる神経前駆細胞の伝達の効率パネルは、感染の異なる多重性(MOI)で専用レンチウイルスレポーターの送達時にE12.5ネオコルチカル前駆細胞がトランスネクスト(または共生)される効率の評価を報告する。前者(A)では、細胞をMOI=2、4、8でレンチウイルス(LV)pTα1-mCherryに急性感染させ、増殖培地で2日間培養し、分化培地に移し、1週間分化させた。インビトロ(DIV)9の日に固定すると、培養物はmCherryとパンニューロンマーカーTubb3について共免疫プロファイルされた。mCherryおよびEGFPシグナルは、抗RFPおよび抗EGFP一次抗体によって検出され、Alexa-594-およびAlexa-488結合二次抗体によってそれぞれ明らかにされた。最後に、mCherry+Tubb3+/ mCherryTubb3+比率を計算し、平均化し、対応するMOIに対してプロットした。後者の場合(B)では、細胞は2つのレンチウイルスの1:1混合物で急性に感染し、構成的に活性なpPgk-mCherryおよびpPgk-EGFPトランスジーンを異なるMOI(各ウイルスに対して2、4、8)でコードする。細胞を増殖培地で4日間培養し、トリプシン化し、固定すると、上記のようにmCherryおよびEGFP免疫蛍光についてプロファイリングした。最後に、mCherry+EGFP+/ mCherryEGFP+比率を計算し、平均化し、対応するMOIに対してプロットした。エラーバーはS.E.M. を表し、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
(2)に関しては、pTα1およびpSyn活性パターンは、その制御下にあるフルオロタンパク質遺伝子の発現プロファイルに基づいて推測することができる。この例では、このような制御は、mCherry(図2A)の場合に直接行われ、および間接的な[すなわちtetON第2世代インターフェース(図2E))]、EGFPの場合(図2B、C、D)の場合である。両方のプロモーターは、Tubb3+ポストマイト術ニューロン内で特異的に活性である(図2B、C、D)が、pTα1はまた、Ki67+間経(神経原性)前駆体のサブセットで発火する(図2A)。 ここで、これらの標準条件に従って細胞を設計した場合のプロモーター活性の変動が限定的な考え方を提供するために(図2E)、pTα1-およびpSyn駆動EGFP発現レベルをTubb3+ニューロン内で定量した。フォトショップCS6ヒストグラムプラグイン。次に、生データを中央値に対して正規化し、プロモーターに対してプロットした(図2F)。驚くべきことに、単一細胞蛍光レベルは中央値の周りに密集していた:第1四分位と第3四分位は0.86と1.16に等しく、pTα1およびpSynの場合はそれぞれ0.89と1.12であった。
図 2: GOI過剰発現を駆動するのに適した神経前駆体型特異的プロモーターのプロファイリング。パネルは、ツブリンα1(pTα1)およびシナプシン(pSyn)プロモーターの特性を指し、それぞれ、神経系および経糸下ニューロン全体において特に活性である。試験は、異なる胚(E n)年齢で収穫された新生物前駆体で実施され、専用のレンチウイルス混合物[pTα1-mCherry in (A);pTα1-rtTA、TREt-EGFP in (B); pSyn-rtTA, TREt-EGFP in(C,D); 2μg/mlドキシabinitio]、および増殖培地(A)で培養し、増殖性(2日間)、分化培地(B,C)、または分化(D)培地を続ける。インビトロ(DIV)nの日の固定時に、播体後ニューロンはαTubb3およびαKi67免疫蛍光によって間体前駆体によって同定された。図1に示すように、mCherryおよびEGFPが検出された。信号は図1に示すように明らかにされた。スケール バー: 100 μm(A,B)、50 μm(C、D))図パネルを参照して、本研究で使用される専用のレンチウイルスミックスを示す。図示は、(B)および(D)で参照されるTubb3+細胞におけるpTα1−pSyn駆動EGFP信号の散布図(F)である。ボックス化された細胞は、25番目から75番目のパーセンシレの間に落ちる細胞です。ひげは10番目と90番目のパーセンチルを指します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
(3)に関しては、レンチウイルス伝達の3日後に、Mtapt EGFP/+「緑色」神経球はPgk1pプロモーター駆動、mCherry赤色蛍光タンパク質(「対照」球)またはしない(「試験」球)(図3A、B)を発現する。すべての球体は単一のセルに解離され、束が残らず、対応する懸濁液が1:1に混合されます。得られた混合物(図3C)は氷の上に置かれ、移植のために20分以内に使用される。
図 3:試験の例(「緑のみ」)と制御(「緑赤色」)DIV2神経球および細胞懸濁液を移植準備完了。(A,B)これらの球体は、MtaptEGFP/+E 12.5ネオコルチカル前駆体から得られ、レンチウイルスミックス「pCAG_lacZ、Pgk1p_tTA、TREt_GOI」(A)および「Pgk1p_tTA、TREt_PLAP」(それぞれ、各LVで、それぞれLVI)に感染した。8、増殖培地に保たれている。(C)細胞懸濁液は、「試験」および「対照」神経球(A,B)を単一細胞に解離し、それらを1:1に混合することによって得られた。スケール バー: 200 μm(A,B)、100 μm(C))この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
(4)に関しては、新生児脳への細胞注入の手順には、3つの重要なステップが含まれる。中間パラジタル面上に置かれた毛細血管は、前皮壁を介して横心室腔内に入る(図4A)。次に、神経節の損傷を防ぐために、毛細血管を水平面内で30°回転させ、先端が中間/口頭で指し出す(図4B)。最後に、細胞懸濁液は、横心室腔内に繊細に排出され、容易に識別可能な水色の「雲」(図4C)を形成する。
図 4: 新生児脳への細胞注入に用いられる3つのステップ手順の回路図。(A)毛細血管は、前頭新生物壁を通して横心室に入る。そして、(B)中間に回転させ、神経節の発現の損傷を防止する。最後に(C)、細胞懸濁液は、水色の雲を形成する横心室に穏やかに注入される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
(5)に関しては、分析手順には4つの主要なステップが含まれる。まず、移植されたニューロンリッチフィールドの光学共焦点部は、MAX Z投影モダリティに従って平坦化され、RGB .tiffファイルを生成する。ここで、一例として、共移植前駆体に由来する「グリーンテスト」ニューロンと「イエローコントロール」ニューロンのみが容易に区別することができる(mCherryは、代わりに「テスト」ニューロンに標識を用いることができることに留意されたい)(図5A)。次に、理想化されたスケルトン化されたカメラlucidaバージョンの画像は、適切なグラフィックソフトウェア(ステップ4.2.6を参照)(図5B)によって赤チャネルのオペレータブラインドによって生成される。赤チャネルの失明は、データ評価における意図しない偏りを防ぐために最も重要です。次に、単一ニューロンシルエットはNeurphologyJソフトウェアに白黒画像として供給され、3つの主要パラメータ「出口点の総数」(アタッチメント_ポイント)、「エンドポイントの総数」(エンドポイントの総数)と「合計」の値として供給されます。ニューライト長さ"(ノイライト長さ)が収集される(図5C)。最後に、各ニューロンの二次パラメータが計算され、平均化され、Excelソフトウェア(図5D)によって統計的に評価されます。
図 5: 移植脳の形態解析の代表的なフローチャート上段のパネルは、(A)中間ネオコルテックスのMAX z投影.tiff画像、設計された細胞移植後10日間固定(緑=Mtapt駆動、ニューロン制限EGFP;赤=mCherry、構成的に「コントロール」細胞を標識し、青= DAPI)、緑色チャネル信号、および(B)そのスケルトン化された電子カメラルシダレンダリング。スケールバー:50 μm。一番下の行には、NeurphologyJソフトウェア解析によってニューロン骨格から抽出された一次形態測定パラメータ(neurite_length as Σli、N出口としての添付ファイル_ポイント、 エンドポイントをN終端) および (D) セカンダリ パラメータに基づいて計算します。この図は、Chiola et al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この手順の特定の側面/手順は重要であり、特別な注意が必要です。第一に、(a)オペレータは、BSL-2準拠のラボ環境でレンティウイルスを安全に操作するために十分な事前訓練を受ける必要があります。第二に、(b)神経製剤を混合する前に、必要に応じて2つの対応する神経球懸濁液を慎重に洗浄することが必須であり、不要なレンチウイルスによる2つの製剤の遅延クロス感染を防ぐために引き継ぐ第三に、(c)細胞を移植する間、心室腔を標的にしながら注意を払わなければならない。この点で、セルサスペンションに含まれる高速グリーントレーサーは実質的な助けになります。さらに、(d)カニバリズムを防ぐために、移植された子犬は麻酔から完全に回復した後にのみ母親に再移植する必要があります(通常10分で十分です)。(e) 移植組織の凍結断面は60μmで行うべきである。実際には、この厚さは同時に組織への容易な抗体の浸透を可能にし、有人のニューロン断片化に起因する情報の損失を制限する。最後に、(f)データ評価における意図しない偏りを防ぐために、ニューロンの骨格化は、赤チャネルの盲目のオペレータによって行われなければならないことを強調する。
ここで説明するプロトコルは、GOF遺伝子操作を指す。あるいは、「テスト」ニューロンは、RNAiエフェクターをコードするレンチウイルスによってGOI機能を下ろすために設計され得る。次に、通常、mCherryを使用して神経細胞を「コントロール」するラベルを付けます。ただし、mCherry/"コントロール"とLacZ/"テスト"スキームは明らかに反転する可能性があります。最後に、ここで説明するプロトコルは、静脈内細胞注射を指します。「検定」および「制御」ニューロンは、神経パレンキマ21に代わりに共注入されてもよい。
その利点にもかかわらず、この方法には2つの主要な制限があります。細胞-神経アーキテクチャの自律的遺伝子制御を調べることを可能にする一方で、それはそれの環境制御には適用されません。さらに、移植された神経前駆体が皮質壁の心室の側面から出生後の最終的な層状位置(すなわち非生理学的時間枠内)に移行するにつれて、この方法はモデル化するために好ましく用いられるべきである。移行完了後の神経アーキテクニクス制御。
最後に、結果の批判的な解釈に特別な注意を払う必要があります。特に、X遺伝子の被験者が「テスト」ニューロンの形態学的複雑さを軽減する場合、これは特にニューロンアーキテクチャに対するその本物の影響を反映していない可能性があります。むしろ、このような現象は、X過剰発現によって引き起こされた神経損傷の非特異的指標でありうって考えられる。この問題に対処するために、移植された「テスト」と「制御」ニューロンの局所的な密度を比較し、Xによって誘発されるニューロンの苦しみの指標として、「テスト」集団の可能な数値収縮を探すのに役立つかもしれません[この収縮はさらにあるべきです。移植された脳のさらなる分析の遅れで顕著である]。このような場合、X遺伝子の過剰抑圧レベルを下げたり、機能喪失の設計に移行したりすると、問題が解決する可能性があります。
我々の方法は、生体内の神経形態の遺伝子制御を調査するために採用される技術の広い配列に追加します,2, 3,4,7,8,9,10歳,11歳,12.導入で思い出すように、これらの技術は、GOI発現レベルを乱し、生物学的サンプルからの形態学的情報の抽出を容易にすることを目的とした様々なアドホック遺伝子操作に依存しています。これらの技術は、通常、このコントロールの正確な解剖を可能にします。しかし、彼らは貴重な実験スキルや財源を必要としません。この点で、この方法は3つの主要な利点を提供する。これは、トランスジェニックモデルに特有のものに匹敵するGOI発現レベルの正確な制御を可能にします。しかし、変異型コロニーの維持費がない場合。それは洗練された実験的な(外科)の技術を要求しない。それは多くの場合、比較的限られた数の動物の分析時に結果の統計的有意性を達成する。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
私たちは、この手順の早期設定に彼の貢献のためにMihn Duc Doに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
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