Summary
Basert på in vitro lentiviral engineering av neuronal forløpere, deres co-transplantasjon i vill-type hjerner og sammenkoblet morphometric evaluering av "test" og "kontroll" derivater, gir denne metoden nøyaktig modellering av in vivo gen kontroll av neocortical Nevron morfologi på en enkel og rimelig måte.
Abstract
Gene kontroll av neuronal cytoarchitecture er i dag gjenstand for intensiv etterforskning. Beskrevet her er en enkel metode utviklet for å studere in vivo gen kontroll av neocortical projeksjon Nevron morfologi. Denne metoden er basert på (1) in vitro lentiviral engineering av neuronal forløpere som "test" og "kontroll" celler, (2) deres co-transplantasjon i vill-type hjerner, og (3) sammenkoblet morphometric evaluering av deres neuronal derivater. Nærmere bestemt, E 12.5 pallial forløpere fra panneuronal, genetisk merket givere, er ansatt for dette formålet. De er konstruert for å dra nytte av utvalgte arrangører og tetON/OFF-teknologi, og de er fri hånds transplantert inn nyfødte lateral ventriklene. Senere, upon immunofluorescence profilering av mottakerens hjerner, silhuetter av transplanterte neurons er matet inn NeurphologyJ åpen kildekode programvare, deres morphometric parametrene er ekstrahert, og gjennomsnittlig lengde og forgrening indeksen er beregnet. Sammenlignet med andre metoder, gir denne en tre viktigste fordeler: det tillater å oppnå fin kontroll av transgene uttrykk til rimelige kostnader, det krever bare grunnleggende kirurgiske ferdigheter, og det gir statistisk pålitelige resultater på analyse av en begrenset antall dyr. På grunn av sin design, men er det ikke tilstrekkelig å ta ikke celle-autonome kontroll av neuroarchitecture. Videre bør det fortrinnsvis brukes til å undersøke neurite morfologi kontroll etter fullføring av neuronal migrasjon. I sin nåværende formulering, er denne metoden utsøkt innstilt til å undersøke gen kontroll av glutamatergic neocortical Nevron arkitektur. Dra nytte av transgene Lines uttrykke EGFP i andre spesifikke nevrale celletyper, kan det bli re-purposed å ta gen kontroll over sin arkitektur.
Introduction
Her beskriver vi en enkel metode vi utviklet for å analysere in vivo gen kontroll av neuronal cytoarchitecture. Basert på in vitro engineering av neuronal forløpere, deres transplantasjon til nyfødte hjernen og sammenkoblet morphometric evaluering av "test" og "kontroll" celler, det gjør det mulig å avsløre funksjonelle implikasjoner av test gener i fin kontroll av neuronal morfologi i en rask og rimelig måte. For å undersøke i vivo gen kontroll av neuronal arkitektur må tre viktige tekniske spørsmål tas opp: (1) oppnå et tilstrekkelig mønstret gen-av-interesse-uttrykk (GOI) og en nøyaktig kvantitativ kontroll av det; (2) få en riktig segmentert visualisering av distinkte neuronal silhuetter; (3) fremlokkende statistiske betydningen av resultater mens ansette et begrenset antall dyr.
Når tilgjengelig, mus mutant linjer harboring Tetracycline (tet)-kontrollerte transgenes kan være det beste verktøyet for å løse den første utgaven1. Alternativt kan somatiske transgenesis være ansatt. I slike tilfeller leveres transgene via electroporation2 eller viral Transduction3. Neste, det er beholdt som en episome (f. eks, ved standard electroporation4), eller det er integrert i Genova (tilfeldig, via retroviral integrase5; eller i en definert plassering, via CRISPR-FORFREMMET homologe rekombinasjon (SLENDR)6 ).
For det andre kan neuronal silhuett visualisering oppnås via (a) sparsom uniform merking eller (b) tett differensial merking. Som for sparsom merking, avanserte Golgi-lignende metoder kan være ansatt7, utvalgte neuronal minisets kan fylles av biocytin8, og salt-og-pepper merking kan fås takket være et tynt uttrykt transgene. En slik transgene kan vise spraglete transkripsjon (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveres av Stokastisk REKOMBINASJON (MORF)10. Som for (b), State of Art strategier inkluderer grobunn-mediert Stokastisk rekombinasjon innenfor en multi-floxed fluoroprotein transgene array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-drevet genomisk integrering av fluoroprotein gener, tidligere leveres via somatiske transgenesis (klone)12.
Som for det tredje problemet, er morphometric utfallet ofte påvirket av en stor tilfeldig variasjon, som stammer fra Inter-dyr forskjeller og celle-injeksjon situasjoner. På grunn av dette, er et stort antall dyr vanligvis brukt for å oppnå den statistiske kraften som er nødvendig for å vurdere GOI morphometric aktivitet.
Tilnærminger tidligere beskrevet ofte stole på avanserte tekniske ferdigheter og krever iøynefallende økonomiske ressurser, som kan begrense deres diffusjon i det vitenskapelige samfunnet. For å omgå disse problemene, har vi unnfanget en enkel og grei rørledning å analysere gen kontroll av neuroarchitecture in vivo på en rask og rimelig måte. Dette er inspirert av en lignende co-transplantasjon design tidligere utviklet for rask in vivo evaluering av antiblastic transgene aktivitet13.
Nærmere bestemt er det antatt at co-transplantasjon av in vitro konstruert "grønne" nevrale forløpere ("test" og "kontroll" celler) til en "svart" mottaker nyfødt hjernen kan samtidig fikse de tre sentrale spørsmålene nevnt ovenfor. Faktisk, in vitro lentiviral engineering av forløpere, i godt kontrollerte forhold, tillater vedlikehold av variasjon av neuronal transgene uttrykk på et minimum, langt under som vanligvis forbindes med in vivo somatiske manipulasjoner (utført tidligere 14 priser og priser , 15 og i våre upubliserte resultater). Den resulterende nøyaktig kontroll av genuttrykk er sammenlignbar med det som oppnås ved tet-kontrollerte transgene modeller. Men kostnadene ved denne prosedyren er langt under de som kommer fra vedlikehold av en transgene muse linje. Neste, fri hånds celle injeksjon er enkel og krever minimal trening. Videre kan mengden av navngitte prekursorer injiseres i hver hjerne enkelt stilles inn for å oppnå et tilstrekkelig kumulativ antall av tynt fordelte forløpere, samtidig som det totale antallet transplanterte dyr på et minimum. Sist men ikke minst, co-injeksjon av forskjellig fluoro-merket, "test" og "kontroll" forløpere og påfølgende parvis statistisk analyse av resultatene motvirke virkningene av Inter-dyr eksperimentell variasjon, slik at det å nå Statistisk betydning av resultatene, selv ved analyse av et begrenset antall individer13.
Det bør understrekes at, riktignok rask og billig, har denne metoden to hoved begrensninger. For det første er det designet for å undersøke celle-autonome gen kontroll av neuronal arkitektur, og det er ikke hensiktsmessig å ta miljøkontroll. For det andre, som transplantert neuronal prekursorer nå sitt endelige sted ved en heterochronic tidsplan, er denne metoden å foretrekke å modellere neuroarchitectonics kontroll oppstår tidligere migrering ferdigstillelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder og prosedyrer som er beskrevet her er godkjent av SISSA Organismo preposto Al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. generering av konstruerte "grønne" Stam bassenger
- Utarbeidelse av "grønne" basseng
- Mate en vill-type CD1 kvinne med en MtaptEGFP/+ grunnlegger16. Euthanize den gravide demningen ved cervical forvridning på 12,5 dager etter coitum (dag 0 bestemmes av vaginal plug inspeksjon) og høste den embryonale dagen 12,5 (E 12.5) embryo. Sett dem i individuelle brønner av en 24 multiwell plate i kald PBS løsning.
- Raskt genotype embryo ved visuell inspeksjon under en blå lys lampe, sjekker for grønn fluorescens utslipp i hjernen.
- Plasser "grønne" embryo i en 10 cm diameter Petri parabolen fylt med kaldt 1x PBS med 0,6% glukose og overføre den til under en stereomikroskopet.
- Skjær fosteret hodene ved hjelp av standard saks og pakk ut Telencephalon fra dem ved hjelp av #3 og #5 tang.
- Skill de to telencephalic blemmer og analysere ut blødningen bruker tang; Sørg for å fjerne hippocampus og basal ganglia17.
- Samle blødningen ved å overføre dem med en P1000 pipette til et 1,5 mL rør som oppbevares på is.
- La dissekert blødningen bosette seg til bunnen av røret.
- Aspirer supernatanten så mye som mulig.
- Resuspend blødningen i 400 μL av friskt proliferativ medium [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL storfe serum albumin (BSA), 0,6% glukose, 2 μg/mL heparin, 20 ng/mL grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF), 20 ng/mL epidermal vekstfaktor (EGF), 1X penn-strep, og 10 PG/mL amfotericin B].
- Pipetter forsiktig blødningen opp og ned, sekvensielt med P1000, P200 og P20 tips, 4X per tips, for å få en overskyet celle suspensjon.
Merk: E 12,5 neocortical vev er veldig myk; dissociating det til enkeltceller krever ikke enzymatisk fordøyelse i det hele tatt; gjentatt pipettering er tilstrekkelig. - La hjernehinnene og resterende neocortical klumper bosette seg i 2 min.
- Overfør 150 til μL fra toppen av celle fjæringen (hovedsakelig med enkeltceller) til et nytt 1,5 mL sterilt rør.
- Tilsett 150 μL av friskt proliferativ medium og gjenta trinn 1.1.10-1.1.12 inntil det ikke er noen flere vevs klumper synlige. Når du gjør dette, utelater du trinnet P1000 pipettering (i trinn 1.1.10).
Merk: tre gjentakelser av trinnene 1.1.10-1.1.12 er vanligvis tilstrekkelig til å oppnå full vev dissosiasjon. - Count celler ("grønn" pool) med trypan blå eksklusjon metoden i et Bürker kammer17 og tilsett friskt proliferativ medium for å justere konsentrasjonen til 103 celler/μL.
Merk: trinn 1.1.7-1.1.14 må utføres under en steril laminær strømnings hette desinfiseres med 70% etanol og holdes ventilert i minst 20 min.
- Engineering den "grønne" sub-pools
- Del det "grønne" bassenget i to sub-Pools i to forskjellige 1,5 mL rør for lentiviral infeksjon.
- Infisere sub-Pools uavhengig med de to dedikerte lentiviral mikser. Hver blanding inneholder "Red label" virus (Pgk1_mCherry) eller "svart" virus (pCAG_lacZ) som en kontroll, samt virus for tetOFF drevet transgene (Pgk1p_tTA og TRE_transgene) eller kontroll (Pgk1p_tTA og TRE_PLAP) uttrykk.
FORSIKTIG: manipulere lentiviruses i et BLS-2 miljø med alle de beskyttende målingene foreskrevet av gjeldende regler og lover.
Merk: hver lentivirus må administreres på et mangfold av infeksjoner (MOI) av 8, som (som tidligere vist14) er tilstrekkelig til å overfører de aller fleste nevrale celler i slike eksperimentelle forhold (figur 1). Den lentivirus harboring tet transactivators kan bygges ved å bruke ulike neuronal arrangører kjøring tTA/rtTA uttrykk (f. eks, pTα1, pSyn, pCaMKII, pGAD1, etc.) (Figur 2). Den MOI er forholdet mellom (a) antall smittsomme viral partikler levert til (b) antall deres målceller. Her er den tidligere (a) beregnes i henhold til den konvensjonelle prosedyren beskrevet andre steder14, sistnevnte (b) er rett og slett evaluert ved hjelp av en Bürker kammer. - Plate 600 000 celler av hvert infisert under basseng per brønn av en 12 multiwell plate, i 600 μL av proliferativ medium med 2 μg/mL av Doxycycline.
Merk: Her er brønner ikke forbehandlet med Poly-lysin, som hindrer nevrale celle vedlegg til sine bunner. - Overfør celler til inkubator i 5% CO2 ved 37 ° c.
- Etter 2 dager, for å vurdere effektiviteten av infeksjonen og differensial merking av konstruerte bassengene, inspisere cellene under et konvensjonelt fluorescerende mikroskop. De to sub-Pools må fremstå som suspensjoner av små neurospheres, homogenously uttrykke det røde fluorescerende proteinet ("kontroll" prøve) eller ikke ("test" sample). Innenfor disse neurospheres er MtaptEGFP transgene aktiv begrenset til et mindretall av celler (post-mitotisk neurons) og taus i de fleste av dem (voksende forløpere) (Figur 3).
2. oppsett av kirurgiske instrumenter og driftsområde
-
Klargjøre Borosilikatglass nåler
- Bruk Borosilikatglass glass blodkar med utvendig og innvendig diameter tilsvarer 1,5 mm og 1,12 mm.
- Trekk kapillær med en P 1000 avtrekker.
- Sett opp trekk programmet. Typiske program parametre er: Heat = 614; Vel = 60; tid = 1; Trykk = 600. De må justeres i henhold til avtrekker modellen og oppvarmings motstanden ansatt.
- Plasser kapillær inn i avtrekker holdere og stram dem.
- Start programmet og ta de to trakk mikrokapillærer.
- Skjær kapillær spissen for hånd, med en skalpell, under stereomikroskopet for å få et tips med en ekstern diameter på ~ 200-250 μm.
- Plasser blodkar på en modellering leire (f. eks plastikk) støtte i en lukket Petri parabolen og overføre den til under panseret.
-
Sette opp hetten og forberede cellen Tracer løsning
- Rydd opp den horisontale strømnings panseret forsiktig og desinfisere den med 70% etanol.
- Desinfisere optiske fibre med 70% etanol og plasser dem under panseret.
- Bland 10 μL av 125 mM EGTA-oppløsning og 10 μL av fast Green for å klargjøre "celle sporingsløsningen" og plassere den under panseret.
- Skjær små biter (4 cm x 2 cm i størrelse) av laboratoriet tetnings film for celle suspensjon spotting.
- Klargjør en løsning på 1 mg/mL steril Doxycycline og aspirer den inn i en 0,3 mL sprøyte.
- Slå på hetten og la laminær flyte på i 20 minutter før operasjonen.
-
Montering av injeksjons røret
- Ta en hard-plast munnstykke, to latex rør (hver ca 30 cm lang) og en kapillær holderen fra en aspirator rør monteringssett for kalibrert microcapillary pipetter.
- Fest den harde plast munnstykket til den ene enden av en latex tube.
- Fest kapillær holde ren til den ene enden av en annen latex tube.
- Koble den frie endene av de to latex rørene med et sterilt 0,45 μm-filter, som en barriere mot operatør bakterier.
- Plasser den resulterende aspirator tube forsamlingen på en modellering leire holderen skal holdes under panseret.
3. Cell mix og intraventricular transplantasjon
- Blanding "test" og "kontroll" grønn celle sub-pools
- Samle "test" og "kontroll" neurospheres (se trinn 1.2.5) i separate 1,5 mL rør.
- Sentrifuger neurospheres suspensjon på 200 g i 5 min.
- Samle og kast supernatanten, unngå forstyrrelse av celle pellet.
- Resuspend neurospheres forsiktig i 500 μL av 1x PBS.
- Sentrifuger dem på 200 g i 1 min.
- Fjern supernatanten.
- Gjenta trinn 3.1.4-3.1.6 to ganger.
- Forsiktig resuspend kuler i 200, μL av 2x Trypsin oppløsning (2x Trypsin, 1x PBS) og pipette celle pellet opp og ned 4X-5x.
Merk: Vær oppmerksom på at det ikke blir luftbobler. - La celler i inkubator i 5 min ved 37 ° c for å oppnå en enkelt celle suspensjon.
- Blokk Trypsin med 200 μL av Trypsin inhibitor løsning (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse I, 0,28 mg/mL Trypsin inhibitor) ved pipettering opp og ned 4X-5x.
- Sentrifuger celler ved 200 x g i 5 min og resuspend dem i 1 ml fersk proliferativ medium (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glukose, 2 μg/ml heparin, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 1x penn-strep, 10 PG/ml amfotericin B).
- Telle celler av de to bassengene med trypan blå utelukkelse metode i et Bürker kammer.
- Juster konsentrasjonen til 100 000 celler/μL i proliferativ medium.
- Bland 1:1 "test" celler med "kontroll" seg.
- Kontroller den resulterende blandingen under et fluorescens mikroskop (objektiv forstørrelse: 10x) for å sikre at blandingen er en enkelt celle suspensjon av de to bassengene (figur 3c).
- Plasser blandingen på is under panseret.
- Intraventricular transplantasjon
- Forberede byrået med det moder og det p0 pups opp på en bord far fjerne fra det inngrep operasjonsområde.
- Plasser en oppsamlings bur på en vogn nær panseret.
- Sett en blanding av sagflis tatt fra mors bur på bunnen av utvinningen buret og plasser den under en lampe.
- Til side, sette en isen bokse med belagt av en aluminiumsfolie for anestesi av p0 pups.
- Like før transplantasjon, tilsett 1/10 volum av celle Tracer løsning (fra trinn 2.2.3) til 1 volum av celle suspensjon (fra trinn 3.1.16) og spot 3 μL av den resulterende "injeksjon Mix" på et stykke laboratorium tetting film.
- Plasser valpen på den kjølige aluminiumsfolie i 1 min og sjekk at den er helt anesthetized.
Merk: for å bekrefte anestesi, forsiktig klemme en labb og overvåke pup for mangel på bevegelser, mens du fortsatt puster. - I mellomtiden aspirer 3 μL av injeksjon mix (fra trinn 3.2.5) inn i glass kapillær.
- Tørk forsiktig av hodet på den anesthetized valpen med 70% etanol.
- Plasser pup ' s haken på spissen av den optiske fiber for å klart identifisere kortikale halvkuler.
Merk: på p0-P1, hode huden er svært tynn, slik at for enkel visuell identifisering av halvkuler like over øynene og bak olfactory pærer. - Hold kapillær (lastet som beskrevet i trinn 3.2.7) i enten en av de to mid-parasagittal fly (venstre eller høyre), over olfactory pære, og punktering av pannen huden på sitt skjæringspunkt med frontal flyet som inneholder øynene sentre. Vær oppmerksom på ikke å skade blodårene. Angi kapillær inn i frontal cortex og få tilgang til ventrikkel hulen (figur 4a).
- For å hindre utilsiktet skade av ganglionic, Roter nålen sideveis med 30 grader, og peker spissen caudal-midtre-menighet (figur 4b).
- Injiser forsiktig cellene i ventrikkel hulen og Overvåk deres diffusjon ved hjelp av fast Green (figur 4c).
- Vent 5-10 s.
- Ta av glass nålen og pass på at du ikke aspirer celle fjæringen og kast den i en egnet avfallsbeholder.
- Før valp utvinning fra anestesi injisere 150 μL av Doxycycline løsning intraperitonealt å holde transgene uttrykk fortsatt av etter transplantasjon.
- Etter injeksjonen, sted det pup med det samme under lampen for det å bli frisk.
- Avreise det pups under lampen for 5-10 min og, en gang fullt ut våken, sted seg inne byrået med det moder.
- Observer det operert pups for 2-3 h, å sikre det moren aksepterer seg.
- Forsyne buret med drikkevann som inneholder 0,5 mg/mL Doxycycline og 50 g/L sukrose for å opprettholde transgene uttrykk.
- Erstatt den Doxycycline-inneholdende vann ved Doxy-fritt vann 4 dager etter transplantasjon, og dermed aktivere transgene i post-mitotisk neurons. Hold mus i et Doxy-fritt regime i 6 dager og euthanize dem på P10 av karbondioksid inhalasjon etterfulgt av halshogging.
4. analyse av transplanterte hjerner
-
Histologi og immunofluorescence
- Euthanize de transplanterte valpene 10 dager etter celle transplantasjon av karbondioksid inhalasjon etterfulgt av halshogging. Fix hjerner av euthanized valper i 4% paraformaldehyde (PFA) ved 4 ° c over natten.
FORSIKTIG: PFA er svært giftig; håndtere det med forsiktighet, strengt i samsvar med produsentens resepter, under en kjemisk røyk hette; rester av PFA-løsningen i en merket avfallsbeholder. - Fjern PFA løsningen og erstatte den med 30% sukrose løsning.
- La hjernen ligge ved 4 ° c eller til de synker til bunnen av hetteglasset.
- Overfør hjernen til en en gangs innebygging mold ca halv-fylt med fryse-inkludering medium.
- Frys den inkluderte hjernen ved-80 ° c.
- Skjær 60 μm tykke koronale seksjoner ved hjelp av en kryostaten.
Merk: unngå å bruke tynnere seksjoner, da dette kan føre til uakseptabelt tap av informasjon om hele arkitekturen av enkelt neurons. - Prosess seksjoner for immunofluorescence18,19, ved hjelp av anti-GFP [1:400] og anti-RFP (mCherry) [1:500] antistoffer. Counterstain kjerner med 1 mg/mL DAPI-oppløsning [1:200].
- Euthanize de transplanterte valpene 10 dager etter celle transplantasjon av karbondioksid inhalasjon etterfulgt av halshogging. Fix hjerner av euthanized valper i 4% paraformaldehyde (PFA) ved 4 ° c over natten.
-
Morphometry
- Angi arbeids parametre for konfokalmikroskopi mikroskop som følger: z-stack Height = 40 μm; Trinn = 2 μm.
- Samle bilder av immunoassayed skiver velge GFP positive Nevron-rike fotografiske felt, blind av RFP signal distribusjon.
- Eksporter bilder som. nd2 filer.
- Generer maksimum Z-projeksjoner av dem som. TIFF-filer (figur 5a).
- For å tillate sub-sekvensiell neuronal skeletonization blinde til celler genotype, skjule det røde signalet. Dette gjør du ved å åpne hver TIFF-fil med en egnet programvare og legge til et justeringslag. Velg "Levels", "rød", deretter satt "output" til null. Lagre filen som sådan.
Merk: Skeletonization utføres senere av en ny operatør som ikke hadde tidligere tilgang til originale vanlig røde filer. - For hver skjult rød fil, legger du til et tegne lag i primær bildet og velger blyantverktøyet (hvit farge). Trace Soma på grunnlag av GFP signal, og deretter spore neurites.
Merk: blyanten verktøyet kan være satt til 40 piksler for Soma og på tre piksler for neurites. - Lagre fler lags filen, inkludert neuronal silhuetter (figur 5B).
Merk: påfølgende analyse av neuronal skjelett kan utføres av begge operatører. - Opprett en ny 1024 x 1024 16-bits grå tone fil med svart bakgrunn, en per Nevron.
- Kopier og lim inn enkelt neuronal silhuetter fra det primære bildet til den nye grå tone filen. Gå tilbake til flerlags fil og slå av justeringen laget for å avsløre neuronal genotyper. Lagre den 16-biters grå tone filen kommentering av den tilsvarende neuronal genotype.
- Importer gråtonebilder i ImageJ en etter en og analyser skjeletter av NeurphologyJ plugin av ImageJ programvare20 (figur 5c).
- Kopier NeurphologyJ primære data (neurite_length, attachment_points og endepunkter, for hver, ta "total Area" verdier), lime dem inn i et regneark og ansette dem til å beregne sekundære morphometric parametere ( gjennomsnittlig neurite lengde, forgrening indeks) (figur 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er fem primære datasett gi nyttig informasjon om viktige aspekter ved prosedyren, den første var (1) effektiviteten av nevrale forløpere Transduction og co-Transduction av lentiviral vektorer. (2) et eksempel på viktige funksjoner i arrangørene ansatt for å drive "test genet". (3) et eksempel på konstruerte celler klare for transplantasjon. (4) en tegneserie med viktige prosessuelle detaljer om celle microinjection inn i nyfødt hjernen. (5) et sammendrag av hele morphometric rørledningen.
Som for (1), evnen til prototypiske lentiviral vektorer levert på ulike fuktighet (2, 4, 8) til effektivt overfører neocortical forløpere ble evaluert. I den første analysen, nevrale forløpere som stammer fra tidlig vill-type blødningen ble smittet av en lentiviral reporter, harboring den mCherry koding sekvens (CDS) under kontroll av neuronogenic-avstamning-spesifikke pTα1 promoter, på MOI = 2, 4, 8, deretter lov til å differensiere. Co-immunoprofiling av deres Progenies for mCherry og Pan-neuronal markør Tubb3 viste at neurons var effektivt transduced på frekvenser av 64%, 69%, og 78%, henholdsvis (figur 1a). I en annen analyse ble neocortical prekursorer akutt coinfected av to lentiviral journalister, som uttrykte EGFP og mCherry, under kontroll av konstituerende pPgk1 promoter, på fuktighet = (2, 2), (4, 4), og (8, 8). Et par dager senere, co-immunoprofiling av deres derivater viste at forholdet mellom EGFP+mCherry+ og EGFP+mCherry± celler var 80%, 88%, og 93%, henholdsvis (figur 1B). Disse dataene tyder på at ved levering av engineering protokollen forutsett for den foreliggende studien, (a) det store flertallet av neurons er transduced, og (b) nesten alle transduced neurons mottatt hele lentiviral satt nødvendig for deres karakterisering.
Figur 1 : Effektivitet av nevrale forløper celler Transduction av lentiviral vektorer. Paneler rapportere en evaluering av effektiviteten som E 12,5 neocortical forløper celler er transduced (eller co-transduced) ved levering av dedikerte lentiviral journalister på ulike multiplicities (fuktighet). I det tidligere tilfellet (A), celler var akutt smittet med LENTIVIRUS (lv) PTα1-MCHERRY på Moi = 2, 4, 8, kultivert i proliferativ medium for 2 dager, overført til differentiative medium, og lov til å differensiere for 1 uke. Ved fiksering på dag in vitro (DIV) 9, var kulturer co-immunoprofiled for mCherry og Pan-neuronal markør Tubb3. mCherry og EGFP signaler ble oppdaget av anti-RFP og anti-EGFP primære antistoffer og avslørt av Alexa-594-og Alexa-488-bøyd sekundære antistoffer, henholdsvis. Til slutt, mCherry+Tubb3+/mCherryTubb3+ prosenter ble beregnet, gjennomsnitt og plottet mot tilsvarende fuktighet. I sistnevnte tilfelle (B), celler var akutt smittet med en 1:1 blanding av to lentiviruses, koding for Constitutively aktive PPgk-MCherry og PPGK-EGFP transgenes, på ulike fuktighet (2, 4, 8 for hvert virus). Celler ble kultivert i proliferativ medium for 4 dager, trypsinized og, ved fiksering, profilert for mCherry og EGFP immunofluorescence som ovenfor. Til slutt, mCherry+EGFP+/mCherryEGFP+ prosenter ble beregnet, gjennomsnitt og plottet mot tilsvarende fuktighet. Feilfelt representerer S.E.M. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som for (2), pTα1 og pSyn aktivitet mønstre kan utledes på grunnlag av uttrykket profiler av fluoroprotein gener under deres kontroll. I dette eksempelet er slik kontroll direkte i tilfelle av mCherry (figur 2a), og indirekte [dvs. formidlet av et tetON andre generasjons grensesnitt (figur 2e)], i tilfelle av EGFP (figur 2b, C, D). Begge arrangører er spesielt aktive innenfor Tubb3+ postmitotic neurons (figur 2b, C, D), men pTα1 også branner i en undergruppe av Ki67+ intermitotic (neuronogenic) forløpere (figur 2a). Her, for å gi en idé om begrenset variasjon av promoter aktivitet når cellene er konstruert i henhold til disse standard forhold (figur 2e), pTα1-og pSyn-drevet EGFP uttrykks nivåer innenfor Tubb3+ neurons ble kvantifisert av Photoshop CS6 histogram plugin. Deretter ble rådata normalisert mot medians og plottet mot arrangører (figur 2F). Bemerkelsesverdig, Single-celle fluorescens nivåer var tett gruppert rundt medians: første og tredje kvartiler likeverdig 0,86 og 1,16, samt 0,89 og 1,12 i tilfeller av pTα1 og pSyn, henholdsvis.
Figur 2 : Profilering av nevrale forløper type-spesifikke arrangører egnet til å kjøre GOI overuttrykte. Paneler refererer til karakterisering av Tubulin Alpha 1 (pTα1) og Synapsin (pSyn) arrangører, spesielt aktive innenfor hele neuronal avstamning og postmitotic neurons, henholdsvis. Testen ble kjørt i neocortical forløpere høstes på ulike embryonale (En) aldre, akutt smittet med dedikerte lentiviral mikser [PTα1-mCherry i (A); PTα1-RTTA, TREt-EGFP i (B); PSYN-rtTA, TREt-EGFP i (C, D); 2μg /ml Doxy ab initio], og kultivert i proliferativ medium (A), proliferativ (2 dager) etterfulgt av differentiative medium (B, C), eller Differentiative (D) medium. Ved fiksering på dag in vitro (DIV) nble postmitotic neurons identifisert av αTubb3 og intermitotic forløpere av αKi67 immunofluorescence; mCherry og EGFP ble oppdaget som vist i figur 1. Signalene ble avslørt som vist i figur 1. Vektstenger: 100 μm i (A, B) og 50 μm i (C, D). Vist er (E) dedikerte lentiviral mikser brukt i denne studien med referanser til figuren panelene. Vist er en (F) en scatter plott av pTα1-og pSyn-drevet EGFP signal i Tubb3+ celler referert til i (B) og (D), henholdsvis. Eske er celler som faller mellom 25th og 75th prosentiler; kinnskjegg refererer til 10th og 90th prosentiler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som for (3), 3 dager etter lentiviral Transduction, MtaptEGFP/+ "Green" neurospheres uttrykke Pgk1p promoter-drevet, mCherry rødt fluorescerende protein ("kontroll" kuler) eller ikke ("test" kuler) (figur 3a, B). Alle kuler er dissosiert til enkeltceller, slik at det ikke er noen klumper venstre, og de tilsvarende suspensjoner er blandet 1:1. Den resulterende mix (figur 3c) er plassert på is og brukes innen 20 min for transplantasjon.
Figur 3 : Eksempel på test ("bare grønn") og kontroll ("grønn-rød") DIV2 neurospheres og celle oppheng klar for transplantasjon. (A, B) Disse kulene ble innhentet fra MtaptEGFP/+E 12,5 neocortical forløpere, akutt smittet av lentiviral mikser "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (A) og "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (B), henholdsvis hver lv på Moi = 8, og oppbevares i proliferativ medium. (C) celle suspensjon ble innhentet av dissociating "test" og "kontroll" Neurospheres (A, B) til enkeltceller og blande dem 1:1. Vektstenger: 200 μm i (A, B) og 100 μm i (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som for (4), inkluderer prosedyren for celle injeksjon i nyfødt hjernen tre viktige trinn. Kapillær, plassert på midten av parasagittal plan, er inngått den laterale ventrikkel hulrom via frontal kortikale veggen (figur 4a). For å unngå skade på ganglionic, roteres kapillær 30 ° innenfor det horisontale planet, slik at spissen peker anteriort/caudally (figur 4b). Sist, cellen suspensjon er delikat kastet inn i lateral ventrikkel hulrom, der den danner en lett gjenkjennelig, lys blå "Sky" (figur 4c).
Figur 4 : Skjema av de tre trinnene som brukes til celle injeksjon i den nyfødte hjernen. (A) kapillær er inngått den laterale ventrikkel gjennom frontal neocortical veggen. Deretter, (B) det roteres medialward, for å hindre skade av ganglionic dominans. Endelig (C), er cellen suspensjonen forsiktig injisert i lateral ventrikkel, der den danner en lys blå Sky. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som for (5), den analytiske prosedyren omfatter fire viktigste trinnene. Først optiske konfokalmikroskopi deler av transplantert Nevron-rike felt er flatet, ifølge MAX Z-projeksjon modalitet så genererer RGB. TIFF-filer. Her, som et eksempel, bare "grønn test" neurons og "gul kontroll" neurons, stammer fra co-transplanterte forløpere, kan lett skilles (det bør bemerkes at mCherry kan alternativt brukes til å merke "test" neurons) (figur 5a). Så, en idealisert, skeletonized kameraet Lucida versjon av avbildningen er utviklet av en passende grafikkprogramvare (se steg 4.2.6) (skikkelsen 5B) av en betjene blind av rød kanalen. Blindhet av rød kanal er av overordnet betydning for å forhindre utilsiktet skjevhet i data evaluering. Neste, Single-neuronal silhuetter er matet inn i NeurphologyJ programvare som svart-hvitt bilder og verdier av de tre primære parametrene "Totalt antall exitpoints" (attachment_points), "Totalt antall endepunkter" (endepunkt) og "total neurite lengde "(neurite_length) samles inn (figur 5c). Til slutt, sekundære parametre for hver Nevron er beregnet, gjennomsnitt og statistisk evaluert av Excel-programvare (figur 5D).
Figur 5 : Representative flytdiagram av morphometric analyse av transplanterte hjerner. Øvre rad paneler viser: (a) A Max z-projeksjon. TIFF bilde av midtre mektig, fast 10 dager etter konstruert celle transplantasjon (grønn = Mtapt-drevet, Nevron-begrenset EGFP; rød = mCherry, constitutively merking "kontroll" celler; blå = DAPI), det grønne kanalsignalet og (B) dens skeletonized e-Camera Lucida rendering. Vektstenger: 50 μm. Den nederste raden inkluderer: (C) primær morphometric parametere Hentet fra neuronal skjeletter av NeurphologyJ Software Analysis (neurite_length som Σli, attachment_points som Nexit og endepunktene som Nend) og (D) sekundære parametere beregnet på deres basis. Dette tallet er blitt modifisert fra Chiola et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spesifikke aspekter/trinn i denne prosedyren er kritiske og krever spesiell oppmerksomhet. Først (a) operatørene må være tilstrekkelig pretrained å trygt manipulere lentiviruses i en BSL-2 kompatibel lab miljø. For det andre, (b) før blande "test" og "kontroll" neural preparater, er det obligatorisk å nøye vaske de to tilsvarende neurosphere suspensjoner som beskrevet, for å hindre eventuelle forsinket kryss-smitte av de to forberedelsene på grunn av uønskede lentiviral bære over. For det tredje, (c) mens transplantere celler, må forsiktighet plasseres mens rettet mot ventrikkel hulrom; i denne forbindelse, er fast Green Tracer inkludert i cellen suspensjon er av betydelig hjelp. I tillegg (d) for å hindre kannibalisme, må transplanterte valper bli re-overført til moren først etter deres fulle utvinning fra anestesi (vanligvis 10 min er tilstrekkelig). (e) fryse-snitting av det transplanterte vevet skal utføres ved 60 μm; Faktisk, denne tykkelsen samtidig gir en enkel antistoff penetrasjon inn i vevet og begrenser tap av informasjon som stammer fra artifactual Nevron fragmentering. Til slutt, (f) for å hindre eventuelle utilsiktede bias i data evaluering, understreker vi at Nevron skeletonization må utføres av en operatør blind for rød kanal.
Protokollen som beskrives her refererer til GOF gen manipulasjoner. Alternativt kan "test" neurons være konstruert for å downregulate GOI funksjon ved hjelp av lentiviruses koding for RNAi effekt Orer. Deretter bruker vi vanligvis mCherry å merke "kontroll" nevrale celler; men mCherry/"Control" og LacZ/"test" ordningen kan være åpenbart invertert. Sist, protokollen beskrevet her refererer til intraventricular celle injeksjoner; "test" og "kontroll" neurons kan alternativt co-injisert i neural parenchima21.
Til tross for sine fordeler, har denne metoden to hoved grenser. Mens tillater å undersøke celle-autonome gen kontroll av neuroarchitecture, gjelder det ikke for miljøkontroll av det. Videre, som transplantert neuronal prekursorer migrere fra ventrikkel aspektet av kortikale veggen til sin endelige laminær plassering etter fødselen (dvs. innenfor en ikke-fysiologiske tidsramme), bør denne metoden fortrinnsvis ansatt for å modellere neuroarchitectonics kontroll etter at overføringen er fullført.
Sist men ikke minst, bør spesiell oppmerksomhet rettes mot kritisk tolkning av resultatene. Spesielt hvis X-genet gjenstand for etterforskning reduserer morfologiske kompleksiteten av "test" neurons, dette kanskje ikke spesifikt reflekterer dens ekte innvirkning på Nevron arkitektur. Snarere kan et slikt fenomen være en ikke-spesifikk indeks over neuronal Kader elicited av X overuttrykte. For å løse dette problemet, kan det være nyttig å sammenligne lokale tettheten av transplantert, "test" og "kontroll" neurons, så se etter mulige numeriske krymping av "test" befolkning, som en indeks over neuronal lidelse indusert av X [Dette krymping bør være enda mer uttalt ved ytterligere forsinket analyse av transplanterte hjerner]. I slike tilfeller kan det løse problemet ved å senke overepression nivå i X-genet eller flytte til en funksjon for redusert funksjonalitet.
Vår metode legger til et bredt spekter av teknologier som brukes til å undersøke gen kontroll av neuronal morfologi i vivo1,2,3,4,7,8, 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12. som tilbakekalt i innledningen, disse teknologiene stole på en rekke ad hoc genetiske manipulasjoner som mål å forurolige GOI uttrykks nivåer og lette utvinning av morfologiske informasjon fra de biologiske prøvene. Disse teknologiene tillater vanligvis nøyaktig Disseksjon av denne kontrollen; men de krever ikke verdifulle eksperimentelle ferdigheter og økonomiske ressurser. I denne forbindelse tilbyr metoden tre viktige fordeler. Den tillater en nøyaktig kontroll av GOI uttrykks nivåer som kan sammenlignes med de som er særegne for transgene-modeller; men i fravær av mutant koloni vedlikeholdskostnader. Det krever ikke sofistikerte eksperimentelle (kirurgiske) ferdigheter. Det oppnår ofte statistisk betydning av resultatene på analyse av et relativt begrenset antall dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Mihn Duc do for hans bidrag til tidlig oppsett av denne prosedyren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
