Summary
Baseret på in vitro lentiviral engineering af neuronal prækursorer, deres Co-transplantation til vild-type hjerner og parret morphometrisk evaluering af "test" og "kontrol" derivater, denne metode giver præcis modellering af in vivo gen kontrol af neocortical neuron morfologi på en enkel og overkommelig måde.
Abstract
Genkontrol af neuronal cytoarchitecture er i øjeblikket genstand for intensiv efterforskning. Beskrevet her er en simpel metode udviklet til at studere in vivo gen kontrol af neocortical projektion neuron morfologi. Denne metode er baseret på (1) in vitro lentiviral engineering af neuronal prækursorer som "test" og "kontrol" celler, (2) deres medtransplantation til vild-type hjerner, og (3) parret morfometrisk vurdering af deres neuronal derivater. Specifikt, E 12.5 pallial prækursorer fra panneuronal, genetisk mærkede donorer, er ansat til dette formål. De er konstrueret til at drage fordel af udvalgte promotorer og tetON/OFF-teknologi, og de er frihånds planteret til neonatal laterale ventrikler. Senere, efter immunofluorescens profilering af modtager hjerner, silhuetter af transplanterede neuroner er fodret med NeurphologyJ open source-software, deres morphometriske parametre udvindes, og gennemsnitlig længde og forgrenings indeks beregnes. Sammenlignet med andre metoder, denne ene giver tre vigtigste fordele: det giver mulighed for at opnå en fin kontrol af transgene ekspression til overkommelige omkostninger, det kræver kun grundlæggende kirurgiske færdigheder, og det giver statistisk pålidelige resultater ved analyse af en begrænset antal dyr. På grund af sit design, dog, det er ikke tilstrækkeligt til at løse ikke-celle-autonome kontrol af neuroarchitecture. Desuden bør det fortrinsvis anvendes til at undersøge neurite morfologi kontrol efter afslutning af neuronal migration. I sin nuværende formulering, denne metode er udsøgt tunet til at undersøge genkontrol af glutamaterge neortikale neuron arkitektur. Ved at drage fordel af transgene linjer, der udtrykker EGFP i andre specifikke neurale celletyper, kan det genbruges til at adressere genkontrol af deres arkitektur.
Introduction
Her beskriver vi en simpel metode, vi udviklede til at dissekere in vivo gen kontrol af neuronal cytoarchitecture. Baseret på in vitro-engineering af neuronal prækursorer, deres transplantation i neonatal hjerne og parret morfometrisk evaluering af "test" og "kontrol" celler, det gør det muligt at afsløre funktionelle konsekvenser af test gener i fin kontrol af neuronal morfologi i en hurtig og overkommelig måde. For at undersøge in vivo-genkontrol af neuronal arkitektur skal der tages fat på tre centrale tekniske spørgsmål: (1) opnåelse af et tilstrækkeligt mønstret udtryk for gen-of-Interest (GOI) og en nøjagtig kvantitativ kontrol af det; (2) opnåelse af en korrekt segmenteret visualisering af særskilte neuronal silhuetter; (3) fremkalde Statistisk signifikans af resultater, mens der anvendes et begrænset antal dyr.
Når de er tilgængelige, kan mus mutant linjer husly tetracyclin (tet)-kontrollerede transgener være det bedste værktøj til at løse det første spørgsmål1. Alternativt kan der anvendes somatisk transgenese. I sådanne tilfælde leveres transgenet via elektroporation2 eller viral transduktion3. Dernæst bevares det som et episome (f. eks. ved standard elektroporation4), eller det er integreret i genomet (tilfældigt, via antiretroviral integrasehæmmer5; eller på et defineret sted via crispr-forfremmet homologe rekombination (slendr)6 ).
Anden, neuronal silhuet visualisering kan opnås via (a) sparsomme ensartet mærkning eller (b) tætte differentiel mærkning. Med hensyn til sparsomme mærkning, avancerede Golgi-lignende metoder kan anvendes7, udvalgte neuronal minisets kan fyldes med biocytinel8, og salt-og-peber mærkning kan opnås takket være en tyndt udtrykt transgen. En sådan transgene kan vise variegeret transkriptionen (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveres ved stokastiske rekombination (morf)10. Med hensyn til (b), state of art strategier omfatter CRE-medieret stokastiske rekombination inden for en multi-floxed fluoroprotein transgene array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-drevet genomisk integration af fluoroprotein gener, tidligere leveres via somatisk transgenese (klon)12.
Med hensyn til det tredje spørgsmål påvirkes det morphometriske resultat ofte af en stor tilfældig variation, der stammer fra forskelle mellem dyr og celle Indsprøjtnings uforudsete hændelser. Derfor anvendes et stort antal dyr sædvanligvis til at opnå den statistiske effekt, der er nødvendig for at vurdere den indiske morphometriske aktivitet.
De tidligere beskrevne tilgange beror ofte på avancerede tekniske færdigheder og kræver iøjnefaldende finansielle ressourcer, hvilket kan begrænse deres udbredelse inden for forskersamfundet. For at omgå disse problemer, vi udtænkt en nem og ligetil pipeline til at dissekere gen kontrol af neuroarchitecture in vivo på en hurtig og overkommelig måde. Dette er inspireret af en lignende Co-transplantation design tidligere udviklet til hurtig in vivo evaluering af antiblastic transgene aktivitet13.
Specifikt, det menes, at medtransplantation af in vitro manipuleret "grønne" neurale prækursorer ("test" og "kontrol" celler) i en "sort" modtager neonatal hjerne kan samtidig løse de tre centrale spørgsmål, der er anført ovenfor. I virkeligheden, in vitro lentiviral engineering af prækursorer, i velkontrollerede forhold, tillader vedligeholdelse af variabilitet af neuronal transgene udtryk på et minimum, langt under, at der normalt er forbundet med in vivo somatiske manipulationer (udført tidligere 14 , 15 og i vores ikke offentliggjorte resultater). Den resulterende nøjagtige kontrol af genekspression er sammenlignelig med den, der opnås ved tet-kontrollerede transgene modeller. Omkostningerne ved denne procedure er dog langt under dem, der stammer fra vedligeholdelsen af en transgene muse linje. Næste, fri-hånd celle injektion er let og kræver minimal træning. Desuden kan mængden af mærkede prækursorer, der injiceres i hver hjerne, let justeres for at opnå et tilstrækkeligt kumulativt antal tyndt fordelte prækursorer, samtidig med at det samlede antal transplanterede dyr holdes på et minimum. Sidst, men ikke mindst, modvirker Co-injektion af forskellige fluor-mærkede, "test" og "kontrol" prækursorer og efterfølgende parvis statistisk analyse af resultaterne virkningerne af interdyrs eksperimentelle variabilitet, hvilket gør det muligt at nå Statistisk signifikans af resultater, selv ved analyse af et begrænset antal personer13.
Det skal understreges, at, omend hurtig og billig, denne metode har to hovedbegrænsninger. For det første er det designet til at undersøge celle-autonome gen kontrol af neuronal arkitektur, og det er ikke hensigtsmæssigt at behandle miljøkontrol. For det andet, som transplanterede neuronal prækursorer nå deres endelige placering af en heterokronisk tidsplan, denne metode er at foretrække frem for model neuroarchitectonics kontrol sker tidligere migration færdiggørelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de metoder og procedurer, der er beskrevet her, er godkendt af SISSA Organismo preposto al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. generering af konstruerede "grønne" progenitorpuljer
- Forberedelse af den "grønne" pulje
- Mate en vild-type CD1 kvinde med en Mtaptegfp/+ grundlægger16. Euthanize den gravide dæmning ved livmoderhals dislokation på 12,5 dage post-coitum (dag 0 bestemmes ved vaginal stik inspektion) og høst embryonale dag 12,5 (E 12.5) embryoner. Sæt dem i individuelle brønde af en 24 multiwell plade i kold PBS opløsning.
- Hurtigt genotype embryonerne ved visuel inspektion under en blå lampe, kontrol for grøn fluorescens emission i hjernen.
- Placer de "grønne" embryoner i en 10 cm diameter Petri skål fyldt med kold 1x PBS med 0,6% glucose og overføre det til under et stereomicroskop.
- Skær Foster hovederne ved hjælp af standard saks og uddrag telencephalon fra dem ved hjælp af #3 og #5 pincet.
- Adskil de to telencephalic vesikler og dissekere neorticerne ved hjælp af pincet; Sørg for at fjerne hippocampus og basal basale ganglier17.
- Saml neocortices ved at overføre dem med en P1000-pipette til et 1,5 mL rør, der holdes på is.
- Lad de dissekted neocortices bosætte sig i bunden af røret.
- Aspirer supernatanten så meget som muligt.
- Resuspension af neocorticerne i 400 μL frisk proliferativ medium [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL bovin serumalbumin (BSA), 0,6% glucose, 2 μg/mL heparin, 20 ng/mL grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF), 20 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF), 1X pen-STREP, og 10 PG/mL amphotericin B].
- Pipettér forsigtigt neocorticerne op og ned, sekventielt med P1000-, P200-og P20-spidser, 4X pr. spids, for at opnå en uklar cellesuspension.
Bemærk: E 12.5 neocortical væv er meget blødt; dissociering det til enkeltceller kræver ikke enzymatisk fordøjelse overhovedet; gentagen pipettering er tilstrækkelig. - Lad meninges og resterende neokortiske klumper slå sig ned i 2 min.
- Overfør 150 μL fra toppen af cellesuspensionen (hovedsageligt indeholdende enkeltceller) til et nyt 1,5 mL sterilt rør.
- Tilsæt 150 μL frisk proliferativt medium og Gentag trin 1.1.10-1.1.12 indtil der ikke er flere vævs klumper synlige. Mens du gør dette, bør du udelade trinnet P1000-pipettering (i trin 1.1.10).
Bemærk: tre iteration af trin 1.1.10-1.1.12 er normalt tilstrækkelige til at opnå fuld vævs dissociation. - Tæl celler ("grøn" pool) med trypan og et blå udelukkelsesmetode i en Bürker kammer17 og tilsæt frisk proliferativ medium til at justere koncentrationen til 103 celler/μl.
Bemærk: trin 1.1.7-1.1.14 skal udføres under en steril laminar flow hætte, der desinficeres med 70% ethanol og holdes ventileret i mindst 20 minutter.
- Engineering de "grønne" sub-puljer
- Underopdele den "grønne" pulje i to sub-puljer i to særskilte 1,5 mL rør til lentiviral infektion.
- Inficere sub-puljer uafhængigt med de to dedikerede lentiviral blandinger. Hver blanding indeholder "Red label" virus (Pgk1_mCherry) eller "Black" virus (pCAG_lacZ) som en kontrol, samt vira for tetOFF driven transgene (Pgk1p_tTA og TRE_transgene) eller kontrol (Pgk1p_tTA og TRE_PLAP) udtryk.
Forsigtig: manipulere lentivira i et BLS-2 miljø med alle de beskyttende målinger foreskrevet af gældende regler og love.
Bemærk: hver lentivirus skal administreres ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 8, som (som tidligere vist14) er tilstrækkelig til at overføre langt størstedelen af neurale celler under sådanne forsøgsforhold (figur 1). Den lentivirus husly tet transaktivatorer kan bygges ved at ansætte forskellige neuronal promotorer kørsel TTA/rtta udtryk (f. eks, ptα1, psyn, pcamkii, pGAD1, etc.) (Figur 2). MOI er forholdet mellem (a) antallet af infektiøse virale partikler leveret til (b) antallet af deres målceller. Her beregnes den tidligere (a) efter den konventionelle procedure, der er beskrevet andetsteds14, og sidstnævnte (b) evalueres blot ved hjælp af et bürker-kammer. - Plade 600.000 celler af hver inficeret sub-pulje pr brønd af en 12 multiwell plade, i 600 μL proliferativt medium med 2 μg/mL doxycyclin.
Bemærk: her er brønde ikke forbehandlet med poly-lysin, som forhindrer neurale celle fastgørelse til deres bunde. - Overfør cellerne til inkubator i 5% CO2 ved 37 °c.
- Efter 2 dage, for at vurdere effektiviteten af infektionen og differentialmærkningen af de fremstillede puljer, inspicere cellerne under et konventionelt fluorescerende mikroskop. De to sub-puljer skal fremstå som suspensioner af små Neuro kugler, homogen udtrykker det røde fluorescerende protein ("kontrol" prøve) eller ej ("test" prøve). Inden for disse Neuro kugler er Mtaptegfp -transgenet aktiv begrænset til et mindretal af celler (post-mitotiske neuroner) og tavs i de fleste af dem (prolifererende prækursorer) (figur 3).
2. opsætning af de kirurgiske instrumenter og driftsområdet
-
Klargøring af borosilikat nåle
- Brug borosilicatglas kapillærer med udvendig og indvendig diameter, som svarer til henholdsvis 1,5 mm og 1,12 mm.
- Træk kapillar med en P 1000 Puller.
- Indstil træk programmet. Typiske programparametre er: Heat = 614; vel = 60; Time = 1; Tryk = 600. De skal justeres i henhold til aftrækker model og varme modstand ansat.
- Placer kapillær i pullerholdere og stram dem.
- Start programmet og tage de to trak mikrokapillærer.
- Skær kapillar spidsen i hånden med en skalpel under stereomicroskop for at få et tip med en udvendig diameter på ~ 200-250 μm.
- Placer kapillærer på en modellering ler (f. eks, plasticine) støtte i en lukket Petri skål og overføre det til underkøler hjelmen.
-
Opsætning af hætten og klargøring af celle Tracer-opløsningen
- Rengør den vandrette strømnings hætte omhyggeligt og Desinficer den med 70% ethanol.
- Desinficer optiske fibre med 70% ethanol, og Placer dem underkøler hjelmen.
- Bland 10 μL 125 mM EGTA-opløsning og 10 μL hurtigt grønt for at tilberede "Cell Tracer-opløsningen", og Placer den underkøler hjelmen.
- Skær små stykker (4 cm x 2 cm størrelse) af laboratorie tætnings folie til cellesuspension spotting.
- Forbered en opløsning på 1 mg/mL steril doxycyclin og Aspirer den til en 0,3 mL sprøjte.
- Tænd for hætten og hold laminar strømmen tændt i 20 minutter før operationen.
-
Montering af Indsprøjtnings røret
- Tag et mundstykke med hård plastik, to latex-rør (hver ca. 30 cm lang) og en kapillær holder fra et aspiratorrørmonteringssæt til kalibrerede mikrokapillar pipetter.
- Fastgør den hårde plastik mundstykket til den ene ende af et latex rør.
- Fastgør kapillar holderen til den ene ende af et andet latex-rør.
- Forbind de frie ender af de to latex-rør med et 0,45 μm sterilt filter, som en barriere mod operatør bakterier.
- Anbring den resulterende aspiratorrørmontering på en modellerings holder, der skal holdes underkøler hjelmen.
3. celle blanding og intraventrikulær transplantation
- Blande "test" og "Control" grønne celle sub-puljer
- Saml "test" og "Control" Neuro kugler (Se trin 1.2.5) i separate 1,5 mL rør.
- Centrifuge Neuro kugler suspension ved 200 g i 5 min.
- Saml og kassér supernatanten, undgå forstyrrelse af celle pellet.
- Resuspender forsigtigt Neuro kugler i 500 μL 1x PBS.
- Centrifugeres dem ved 200 g i 1 min.
- Fjern supernatanten.
- Gentag trin 3.1.4-3.1.6 to gange mere.
- Resuspension forsigtigt kugler i 200 μL 2x trypsin opløsning (2x trypsin, 1x PBS) og pipette celle pellet op og ned 4X-5x.
Bemærk: Vær opmærksom på ikke at lave luftbobler. - Efterlad cellerne i inkubator i 5 min ved 37 °C for at opnå en enkelt cellesuspension.
- Blok trypsin med 200 μL trypsin-inhibitor opløsning (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse I, 0,28 mg/mL trypsin-hæmmer) ved pipettering op og ned 4X-5x.
- Centrifuge cellerne ved 200 x g i 5 min. og resuspension i 1 ml frisk proliferativ medium (DMEM-F12, 1X glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glucose, 2 μg/ml heparin, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 1x pen-STREP, 10 pg/ml amphotericin B).
- Tæl cellerne i de to puljer med trypan og et blå udelukkelsesmetode i et Bürker kammer.
- Juster deres koncentration til 100.000 celler/μL i proliferativt medium.
- Bland 1:1 "test" celler med "Control" dem.
- Kontrollér det resulterende mix under et fluorescens mikroskop (objektivforstørrelse: 10x) for at sikre, at blandingen er en enkelt cellesuspension af de to puljer (figur 3c).
- Placer blandingen på is underkøler hjelmen.
- Intraventrikulær transplantation
- Forbered buret med moderen og p0 unger på et bord langt væk fra det kirurgiske operatoriske område.
- Placer et restitutions bur på en vogn tæt på hætten.
- Sæt en blanding af savsmuld taget fra moderens bur på bunden af restitutions buret og Placer den under en lampe.
- Til side, sæt en isboks dækket af en aluminiumsfolie til bedøvelse af p0 pup.
- Lige før transplantation tilsættes 1/10 volumen af celle Tracer opløsning (fra trin 2.2.3) til 1 volumen af cellesuspension (fra trin 3.1.16) og spot 3 μL af den resulterende "injektion mix" på et stykke laboratorie forsegling film.
- Placer pup på den kølige aluminiumsfolie i 1 min og kontrollere, at det er fuldt bedøvet.
Bemærk: for at bekræfte anæstesi skal du forsigtigt klemme en pote og overvåge hvalpen for manglende bevægelser, mens du stadig trækker vejret. - I mellemtiden, aspirere 3 μL injektion mix (fra trin 3.2.5) i glasset kapillar.
- Forsigtigt tørre hovedet af bedøvet pup med 70% ethanol.
- Placer hvalpen hage på spidsen af den optiske fiber til klart at identificere de kortikale halvkugler.
Bemærk: på p0-P1 er hoved huden meget tynd, hvilket giver mulighed for ligetil visuel identifikation af halvsfærerne lige over øjeæblerne og bag de olfaktoriske pærer. - Opbevar kapillar (læsset som beskrevet i trin 3.2.7) i enten et af de to Mid-parasagittal-planer (venstre eller højre), over den olfaktoriske pære, og punktere pande huden i skæringspunktet med det frontalplan, der indeholder øjekuglerne. Vær opmærksom på ikke at beskadige blodkarrene. Indtast kapillær i den forreste cortex og få adgang til ventrikel hulen (figur 4a).
- For at forhindre utilsigtet beskadigelse af den ganglioniske eminence, drej nålen sideværts med 30 grader, peger spidsen caudal-medial-Ward (figur 4b).
- Injicer forsigtigt cellerne i ventrikel hulen og overvåger deres diffusion ved hjælp af hurtigt grønt (figur 4c).
- Vent 5-10 s.
- Fjern glas nålen og pas på, at du ikke aspirerer cellesuspensionen, og kassér den i en passende affaldsspand.
- Før pup opsving fra anæstesi injicere 150 μl doxycyclin opløsning intraperitonealt at holde transgenekspression stadig ud efter transplantation.
- Efter injektionen placeres hvalpen straks under lampen til nyttiggørelse.
- Lad hvalpene under lampen for 5-10 min og, når fuldt vågen, placere dem i buret med moderen.
- Overhold de betjente pup for 2-3 h, for at sikre, at moderen accepterer dem.
- Bur med drikkevand indeholdende 0,5 mg/mL doxycyclin og 50 g/L saccharose for at opretholde transgenekspression.
- Udskift det doxycyclinholdige vand med Doxy-frit vand 4 dage efter transplantationen, hvilket aktiverer transgenet i post-mitotiske neuroner. Hold mus i en Doxy-fri ordning for 6 dage og aflive dem ved P10 ved kuldioxid indånding efterfulgt af halshugning.
4. analyse af transplanterede hjerner
-
Histologi og immunofluorescens
- Euthanize de transplanterede pup 10 dage efter celletransplantation ved indånding af kuldioxid efterfulgt af decapitation. Fix hjerner af aflives pup i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved 4 °c natten over.
Forsigtig: PFA er meget giftig; håndtere det med omhu, strengt overholdelse af fabrikantens forskrifter, under en kemisk røg Hood; Kassér PFA-løsningens rest i en mærket affaldsbeholder. - Fjern PFA-opløsningen, og Udskift den med 30% saccharoseopløsning.
- Lad hjernen være ved 4 °C, eller indtil de synker ned i hætteglasset.
- Overfør hjernen til en engangs indlejrings form, der er ca. halvt fyldt med kryo-inklusions medium.
- Fastfryse den medfølgende hjerne ved-80 °C.
- Skær 60 μm tykke koronale sektioner ved hjælp af en kryostat.
Bemærk: undgå at anvende tyndere sektioner, da dette kan resultere i uacceptabelt tab af information om hele arkitekturen af enkelt neuroner. - Proces sektioner for immunofluorescens18,19ved hjælp af anti-gfp [1:400] og anti-RFP (mcherry) [1:500] antistoffer. Counterstain kerner med 1 mg/ml dapi-opløsning [1:200].
- Euthanize de transplanterede pup 10 dage efter celletransplantation ved indånding af kuldioxid efterfulgt af decapitation. Fix hjerner af aflives pup i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved 4 °c natten over.
-
Morfometri
- Angiv arbejds parametre for Konfokal mikroskop på følgende måde: z-stakhøjde = 40 μm; trin = 2 μm.
- Saml billeder af immunassayed skiver ved at vælge GFP positive neuron-rige fotografiske felter, blinde for RFP-signal fordeling.
- Eksporter billederne som. ND2 filer.
- Generer maksimum Z-projektioner af dem som. TIFF-filer (figur 5a).
- For at tillade sub-sekventiel neuronal skeletonization blind til celler genotype, skjule det røde signal. Det gør du ved at åbne hver. TIFF-fil med en egnet software og tilføje et justeringslag. Vælg "levels", "rød", og indstil derefter "output" til nul. Gem filen som sådan.
Bemærk: Skeletonization udføres efterfølgende af en ny operatør, der ikke havde nogen tidligere adgang til originale plain Red-filer. - For hver skjult rød fil skal du føje et tegne lag til det primære billede og vælge blyantværktøjet (hvid farve). Spore Soma på grundlag af GFP signal, derefter spore neurites.
Bemærk: blyantværktøjet kan indstilles til 40 pixels for Soma og tre pixels for neurites. - Gem den flerlags fil, herunder neuronal silhuetter (figur 5b).
Bemærk: efterfølgende analyse af neuronal skelet kan udføres af enten operatør. - Opret en ny 1024 x 1024 16-bit gråtone-fil med sort baggrund, én pr. neuron.
- Kopiér og Indsæt enkelt neuronal silhuetter fra det primære billede til den nye gråtone-fil. Komme tilbage til flerlags fil og slukke for justeringslag til at afsløre neuronal genotyper. Gem 16-bit gråtone-filen, som ankommenterer den tilsvarende neuronale genotype.
- Importer gråtonebilleder i ImageJ én efter én og analysér skeletter af NeurphologyJ plugin af ImageJ software20 (figur 5c).
- Kopier neurphologyj primære data (neurite_length, attachment_points og endpoints; for hver, tage "total område" værdier), indsætte dem i et regneark og ansætte dem til at beregne sekundære morfometrisk parametre ( Gennemsnitlig neurite længde, forgrenings indeks) (figur 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er fem primære datasæt, som giver nyttige oplysninger om de vigtigste aspekter af proceduren, hvoraf den første er (1) effektiviteten af de neurale prækursorer og co-transduktion af lentiviral vektorer. (2) et eksempel på de vigtigste træk ved de initiativtagere, der anvendes til at drive "test genet". (3) et eksempel på manipulerede celler, som er klar til transplantation. (4) en tegneserie, herunder centrale proceduremæssige detaljer om celle mikroinjektion i den neonatal hjerne. (5) en sammenfatning af hele den morpometriske rørledning.
Med hensyn til (1) blev kapaciteten af de prototypiske lentivirale vektorer, der blev leveret på forskellige Moer (2, 4, 8) til effektivt at transducere neortikale prækursorer, evalueret. I den første analyse blev neurale prækursorer, som stammer fra tidlige vildtype neocortices, inficeret af en lentiviral reporter, der harkedeligt mCherry-kodnings sekvensen (CDS) under kontrol af den neuronogene-Lineage-specifikke pTα1-promotor, ved MOI = 2, 4, 8 og derefter mulighed for at differentiere. Co-immunoproindberetning af deres afkom til mCherry og pan-neuronal markør Tubb3 viste, at neuroner effektivt blev transduceret ved frekvenser på henholdsvis 64%, 69% og 78% (figur 1a). I en anden analyse var neortiske prækursorer akut coinficerede af to lentiviral reportere, der udtrykte EGFP og mCherry, under kontrol af konstitutiv pPgk1 Promoter, ved MOIs = (2, 2), (4, 4) og (8, 8). Et par dage senere viste Co-immunoproarkivering af deres derivater, at forholdet mellem EGFP +mcherry+ og egfp+mcherry± celler var henholdsvis 80%, 88% og 93% (figur 1b). Disse data tyder på, at ved levering af den tekniske protokol, der er planlagt til nærværende undersøgelse (a), er langt størstedelen af neuronerne transducerede, og (b) næsten alle transducerede neuroner modtog det fulde lentiviral sæt, der var nødvendigt for deres karakterisering.
Figur 1 : Effektivitet af neurale prækursorceller transduktion af lentiviral vektorer. Paneler rapporterer en evaluering af effektiviteten, hvormed E 12.5 neokortiske prækursorceller er transducerede (eller co-transducerede) ved levering af dedikerede lentiviral reportere ved forskellige multiplikation byer (MOIs). I førstnævnte tilfælde (A) blev cellerne akut inficeret med lentivirus (LV) pTα1-mcherry ved Moi = 2, 4, 8, dyrket i proliferativt medium i 2 dage, overført til differentiativt medium og tilladt at differentiere i 1 uge. Ved fiksering på dag in vitro (DIV) 9, kulturer var Co-immunoprofiled for mCherry og pan-neuronal markør Tubb3. mCherry og EGFP signaler blev detekteret af anti-RFP og anti-EGFP primære antistoffer og afsløret af Alexa-594-og Alexa-488-konjugeret sekundære antistoffer, hhv. Endelig blev mCherry+Tubb3+/mCherryTubb3+ ratio beregnet, gennemsnitligt og plottet mod de tilsvarende Mois. I sidstnævnte tilfælde (B) blev cellerne akut inficeret med en 1:1 blanding af to lentivira, kodning for de konstitutivt aktive Ppgk-mcherry og PPGK-egfp Trans Genes, på forskellige Mois (2, 4, 8 for hver virus). Cellerne blev dyrket i proliferativt medium i 4 dage, trypsinseret og, ved fiksering, profileret for mcherry og egfp immunofluorescenstest som ovenfor. Endelig blev mCherry+egfp+/mcherryegfp+ ratio beregnet, gennemsnitligt og plottet mod de tilsvarende Mois. Fejllinjer repræsenterer S.E.M. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Med hensyn til (2) kan pTα1-og pSyn-aktivitetsmønstre udledes på grundlag af udtryks profilerne for fluoroprotein-gener under deres kontrol. I dette eksempel er en sådan kontrol direkte i tilfælde af mCherry (figur 2a) og indirekte [dvs. medieret af en Teton andengenerations grænseflade (figur 2E)] for Egfp (figur 2b, C, D). Begge initiativtagere er specifikt aktive inden for Tubb3+ postmitotiske neuroner (figur 2b, C, D), men ptα1 brande også i en delmængde af Ki67+ intermitotiske (neuronogene) prækursorer (figur 2a). Her, for at give en idé om begrænset variation af promotoren aktivitet, når celler er konstrueret i henhold til disse standardbetingelser (figur 2E), Ptα1-og psyn-DREVNE egfp ekspressionsniveauer inden for Tubb3+ neuroner blev kvantificeret ved Plugin til Photoshop CS6-histogram. Derefter blev rå data normaliseret mod medianer og plottet mod initiativtagere (figur 2F). Bemærkelsesværdigt, enkelt celle fluorescens niveauer var tæt grupperet omkring medians: første og tredje kvartiler svarede 0,86 og 1,16, samt 0,89 og 1,12 i tilfælde af ptα1 og psyn, hhv.
Figur 2 : Profilering af neurale prækursorer typespecifikke initiativtagere egnet til at drive Goi over ekspression. Paneler refererer til karakterisering af Tubulin Alpha 1 (pTα1) og Synapsin (pSyn) initiativtagere, specifikt aktive inden for hele neuronal afstamning og postmitotiske neuroner, hhv. Test blev kørt i neortikale prækursorer høstet i forskellige embryonale (En) aldre, akut inficeret med dedikerede lentiviral blandinger [Ptα1-mcherry i (A); Ptα1-RTTA, tret-Egfp i (B); Psyn-RTTA, tret-EGFP i (C, D); 2μg /ml Doxy ab initio] og dyrkes i proliferativt medium (A), proliferativ (2 dage) efterfulgt af differentiativ medium (B, C) eller Differentiativ (D) medium. Ved fiksering på dag in vitro (DIV) n, postmitotiske neuroner blev identificeret ved αTubb3 og intermitotiske prækursorer ved αKi67 immunofluorescens; mCherry og EGFP blev påvist som vist i figur 1. Signaler blev afsløret som vist i figur 1. Skala stænger: 100 μm i (A, B) og 50 μm i (C, D). De viste er (E) dedikerede lentivirale blandinger, der anvendes i dette studie med henvisninger til figur panelerne. Vist er et (F) et punktplot af pTα1-og psyn-drevet egfp-signal i Tubb3+- celler, der er omhandlet i henholdsvis litraB) ogd). Boxed er celler, der falder mellem 25th og 75th percentiles; whiskers refererer til 10th og 90th percentiles. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Som for (3), 3 dage efter lentiviral transduction, Mtaptegfp/+ "grønne" Neuro kugler udtrykker Pgk1p promotor-drevet, mcherry rødt fluorescerende protein ("Control" kugler) eller ej ("test" kugler) (figur 3a, B). Alle sfærer adskilles fra enkeltceller, hvilket sikrer, at der ikke er klumper, og de tilsvarende suspensioner er blandede 1:1. Den resulterende blanding (figur 3c) er placeret på is og anvendes inden for 20 minutter til transplantation.
Figur 3 : Eksempel på test ("kun grøn") og kontrol ("grøn-rød") DIV2 Neuro kugler og cellesuspension klar til transplantation. (A, B) Disse sfærer blev opnået fra mtaptegfp/+E 12,5 neocortical prækursorer, akut inficeret med lentiviral blandinger "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (A) og "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (B) henholdsvis hver LV hos Moi = 8, og holdes i proliferativ medium. (C) cellesuspension blev opnået ved at dissociere "test" og "Control" Neuro kugler (A, B) til enkeltceller og blande dem 1:1. Skala stænger: 200 μm i (A, B) og 100 μm i (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Med hensyn til (4) omfatter proceduren for celle injektion i den neonatal hjerne tre vigtige trin. Kapillær, anbragt på midten af parasagittal flyet, er indtastet i den laterale ventrikel hulrum via den frontal kortikale væg (figur 4a). For at undgå beskadigelse af den ganglioniske eminence drejes kapillær derefter 30 ° inden for det vandrette plan, således at spids punkterne er medialt/caudally (figur 4b). Endelig skubbes cellesuspensionen forsigtigt ud i det laterale ventrikel hulrum, hvor den danner en let skelne, lyseblå "Sky" (figur 4c).
Figur 4 : Skematik af de tre trin procedure anvendes til celle injektion i den neonatal hjerne. A) kapillar er indtastet i den laterale ventrikel gennem den forreste neortikale væg. Derefter, (B) det er roteret medialward, for at forhindre beskadigelse af ganglione eminence. Endelig (C), cellesuspensionen er forsigtigt injiceres i den laterale ventrikel, hvor det danner en lyseblå Sky. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Hvad angår (5), omfatter den analytiske procedure fire hovedtrin. Første, optiske konfokale sektioner af transplanterede neuron-rige felter er fladtrykt, ifølge MAX Z-projektion modalitet så genererer RGB. TIFF-filer. Her, som et eksempel, kan kun "grønne test" neuroner og "gul kontrol" neuroner, der stammer fra Co-transplanterede prækursorer, let skelnes (det skal bemærkes, at mCherry Alternativt kan bruges til at mærke "test" neuroner) (figur 5a). Derefter, en idealiseret, skeletoniseret kamera Lucida version af billedet er genereret af en passende grafisk software (Se trin 4.2.6) (figur 5b) af en operatør blind af rød kanal. Blindhed af røde kanal er af afgørende betydning for at forhindre enhver utilsigtet bias i dataevaluering. Næste, single-neuronal silhuetter er fodret ind i NeurphologyJ software som sort-hvide billeder og værdier af de tre primære parametre "samlet antal exitpoints" (attachment_points), "samlet antal endepunkter" (endepunkter) og "total neurite-længde "(neurite_length) indsamles (figur 5c). Endelig beregnes sekundære parametre for hver Neuron, gennemsnit og statistisk evalueret af Excel-software (figur 5D).
Figur 5 : Repræsentativt rutediagram over morphometrisk analyse af transplanterede hjerner. Øvre række paneler viser: (a) en max z-projektion. TIFF billede af mediale neocortex, fast 10 dage efter manipuleret celletransplantation (grøn = mtapt-drevet, neuron-begrænset Egfp; rød = mcherry, konstitutivt mærkning "Control" celler; blå = DAPI), det grønne kanal signal og (B) dets skeleterede e-kamera Lucida-gengivelse. Skala stænger: 50 μm. Den nederste række omfatter: (C) primære morphometriske parametre ekstraheret fra neuronal skeletter ved neurphologyj software analyse (neurite_length som Σli, attachment_points som Nexit og endepunkter som Nend) og (D) sekundære parametre beregnet på grundlag heraf. Dette tal er blevet modificeret fra Chiola et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Specifikke aspekter/trin i denne procedure er kritiske og kræver særlig opmærksomhed. Først, (a) operatørerne skal være tilstrækkeligt foruddannet til sikkert at manipulere lentivira i et BSL-2-kompatibelt lab miljø. For det andet, (b) før mix "test" og "Control" neurale præparater, er det obligatorisk at omhyggeligt vaske de to tilsvarende Neuro Sphere suspensioner som beskrevet, for at forhindre enhver forsinket krydsinfektion af de to præparater på grund af uønskede lentiviral overføre. For det tredje, (c) mens transplantat celler, skal der udvises forsigtighed, mens de er rettet mod ventrikel hulen; i denne henseende er den hurtige grønne Tracer inkluderet i cellen suspension er af væsentlig hjælp. Derudover, (d) for at forhindre kannibalisme, transplanteret pup skal genover føres til moderen først efter deres fulde helbredelse fra anæstesi (normalt 10 min er tilstrækkelig). e) der skal udføres kryo skæring af det transplanterede væv ved 60 μm. faktisk, denne tykkelse samtidig tillader en nem antistof penetration i vævet og begrænser tab af oplysninger, som stammer fra artifaktuel neuron fragmentering. Endelig, (f) for at forhindre utilsigtet bias i dataevaluering, vi understreger, at neuron skeletonization skal udføres af en operatør blind af rød kanal.
Den protokol, der er beskrevet her, refererer til GOF-genmanipulationer. Alternativt, "test" neuroner kan være konstrueret til at nedregulere GOI funktion ved hjælp af lentivira kodning for RNAi efftorer. Næste, vi plejer at ansætte mCherry at mærke "kontrol" neurale celler; dog kan mCherry/"Control" og LacZ/"test" ordningen være åbenbart inverteret. Sidst, den protokol, der er beskrevet her refererer til intraventrikulære celle injektioner; "test" og "Control" neuroner kan alternativt Co-injiceres i neurale parentchima21.
På trods af sine fordele, denne metode har to hoved grænser. Samtidig gør det muligt at undersøge celle-autonome gen kontrol af neuroarchitecture, det gælder ikke for miljømæssig kontrol af det. Da transplanterede neuronale prækursorer desuden migrerer fra det ventrikulære aspekt af den kortikale væg til deres endelige laminar placering efter fødslen (dvs. inden for en ikke-fysiologisk tidsramme), bør denne metode fortrinsvis anvendes til model neuroarchitectonics-kontrol efter afslutning af overførslen.
Sidst, men ikke mindst, bør der lægges særlig vægt på en kritisk fortolkning af resultaterne. Især hvis X-genet genstand for undersøgelse reducerer den morfologiske kompleksitet af "test" neuroner, dette kan ikke specifikt afspejle sin reelle indvirkning på neuron arkitektur. Snarere, sådanne fænomen kan være en ikke-specifik indeks af neuronal skade fremkaldt af X overexpression. For at løse dette problem, kan det være nyttigt at sammenligne lokale tætheder af transplanterede, "test" og "Control" neuroner, derefter kigge efter mulige numeriske svind af "test" befolkning, som et indeks af neuronal lidelse induceret af X [denne svind bør være endnu mere udtalt ved yderligere forsinket analyse af transplanterede hjerner]. I sådanne tilfælde kan det løse problemet at sænke det overdrevne kompressionsniveau for X-genet eller flytte til et tab af funktionsdesign.
Vores metode tilføjer til en bred vifte af teknologier, der anvendes til at undersøge genkontrol af neuronal morfologi in vivo1,2,3,4,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. som nævnt i indledningen er disse teknologier afhængige af en række ad hoc -genetiske manipulationer, der har til formål at forstyrrer Goi ekspressionsniveauer og lette udvindingen af morfologiske oplysninger fra de biologiske prøver. Disse teknologier tillader normalt nøjagtig dissektion af denne kontrol; men de kræver ikke værdifulde eksperimentelle færdigheder og finansielle ressourcer. I denne henseende giver metoden tre vigtige fordele. Det giver mulighed for en nøjagtig kontrol af GOI ekspressionsniveauer svarende til dem, der er særegne for transgene modeller; Men, i mangel af mutant koloni vedligeholdelsesomkostninger. Det kræver ikke sofistikerede eksperimentelle (kirurgiske) færdigheder. Det opnår ofte Statistisk signifikans af resultater ved analyse af et relativt begrænset antal dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Mihn Duc for hans bidrag til en hurtig indførelse af denne procedure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
