Summary
Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de "teste" e "controle", este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.
Abstract
O controle do gene da Citoarquitetura neuronal é atualmente o assunto da investigação intensiva. Descrito aqui é um método simples desenvolvido para estudar o controle genético in vivo da morfologia do neurônio da projeção neokortikalny. Este método é baseado em (1) Engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais como células de "teste" e "controle", (2) seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e (3) avaliação morfométrica pareada de seus derivados neuronais. Especificamente, os precursores paliais E 12.5 dos doadores panneuronal, geneticamente rotulados, são empregados para este fim. São projetados para tirar proveito dos promotores selecionados e da tecnologia tetON/OFF, e são transplantados à mão livre em ventrículos laterais neonatais. Mais tarde, após a criação de perfil de imunofluorescência de cérebros destinatários, silhuetas de neurônios transplantados são alimentados em software de código aberto NeurphologyJ, seus parâmetros morfométricos são extraídos, e o comprimento médio e índice de ramificação são calculados. Comparado a outros métodos, este oferece três vantagens principais: permite conseguir do controle fino da expressão do transgene a custos disponíveis, ele exige somente habilidades cirúrgicas básicas, e fornece resultados estatisticamente confiáveis em cima da análise de um limitado número de animais. Por causa de seu projeto, entretanto, não é adequado endereçar o controle não Cell-Autonomous do neuroarchitecture. Além disso, deve ser usado preferencialmente para investigar o controle da morfologia do neurite após a conclusão da migração neuronal. Em sua formulação atual, este método é afinado primorosamente para investigar o controle do gene da arquitetura neokortikalny glutamatérgico do neurônio. Aproveitando-se de linhas transgênicas expressando EGFP em outros tipos específicos de células neurais, pode ser re-purposed para abordar o controle genético de sua arquitetura.
Introduction
Aqui nós descrevemos um método simples que nós desenvolvemos para dissecar in vivo o controle do gene da Citoarquitetura neuronal. Com base na engenharia in vitro de precursores neuronais, seu transplante em cérebro neonatal e avaliação morfométrica pareada de células de "teste" e "controle", permite desvendar as implicações funcionais dos genes de teste no controle fino da morfologia neuronal em um forma rápida e acessível. Para investigar o controle genético in vivo da arquitetura neuronal, três questões técnicas fundamentais devem ser abordadas: (1) alcançar uma expressão de gene-de-interesse (GOI) adequadamente padronizada e um controle quantitativo exato da mesma; (2) obtenção de uma visualização segmentada adequada de silhuetas neuronais distintas; (3) elicitar a significância estatística dos resultados, empregando um número limitado de animais.
Quando disponível, as linhas mutantes do rato que abriam transgenes controlados do tetraciclina (Tet) podem ser a melhor ferramenta para endereçar a primeira edição1. Alternativamente, a transgênese somática pode ser empregada. Nesses casos, o transgene é entregado através do Electroporation2 ou da transdução viral3. Em seguida, é mantido como um episome (por exemplo, em cima do Electroporation padrão4), ou está integrado no genoma (aleatòria, através da integrase retroviral5; ou em uma posição definida, através do recombinação homous-promovido crispr (slendr)6 ).
Em segundo lugar, a visualização da silhueta neuronal pode ser conseguida através de (a) rotulagem uniforme esparsa ou (b) rotulagem diferencial densa. Quanto à rotulagem esparsa, as metodologias avançadas do tipo Golgi podem ser empregadas7, minisets neuronais selecionados podem ser preenchidos por biocitina8, e a rotulagem de sal e pimenta pode ser obtida graças a um transgene escassamente expresso. Tal transgene pode exibir a transcrição variegada (thy-EGFP)9 ou pode ser ativada por recombinação estocástica (Morf)10. Quanto a (b), as estratégias de estado de arte incluem recombinação estocástica mediada por CRE dentro de uma matriz de transgenes de fluoroproteína multifloxed (Brainbow)11, bem como a integração genômica guiada por piggyBac-transposase de genes de fluoroproteína, anteriormente entregues via transgénese somática (CLoNE)12.
Quanto à terceira questão, o desfecho morfométrico é freqüentemente afetado por uma grande variabilidade aleatória, originando-se de diferenças entre animais e contingências de injeção celular. Devido a isso, um grande número de animais geralmente é empregado para atingir o poder estatístico necessário para avaliar a atividade morfométrica GOI.
As abordagens anteriormente descritas freqüentemente dependem de habilidades técnicas avançadas e exigem recursos financeiros evidentes, o que pode limitar sua difusão dentro da comunidade científica. Para contornar essas questões, concebemos um pipeline fácil e direto para dissecar o controle genético da neuroarquitetura in vivo de forma rápida e acessível. Isto é inspirado por um projeto similar do cotransplante desenvolvido previamente para a avaliação in vivo rápida da atividade a13do transgene.
Especificamente, pensa-se que o cotransplante de in vitro projetado "verde" precursores neurais ("teste" e "controle" células) em um "preto" receptor neonatal cérebro pode simultaneamente corrigir as três principais questões listadas acima. De fato, a engenharia lentivirais in vitro de precursores, em condições bem controladas, permite a manutenção da variabilidade da expressão neuronal transgênica no mínimo, muito abaixo do que geralmente está associado com manipulações somáticas in vivo (realizadas anteriormente 14 anos de , 15 e em nossos resultados inéditos). O controle exato resultante da expressão gênica é comparável com o obtido por modelos transgênicos controlados por Tet. No entanto, os custos deste procedimento são muito inferiores àqueles provenientes da manutenção de uma linha de rato transgénica. Em seguida, a injeção livre da pilha da mão é fácil e exige o treinamento mínimo. Além disso, a quantidade de precursores rotulados injetado em cada cérebro pode ser facilmente ajustada para alcançar um número cumulativo suficiente de precursores esparsamente distribuídos, ao mesmo tempo que mantém o número total de animais transplantados no mínimo. Por último, mas não menos importante, a coinjeção de precursores de "teste" e "controle" de forma diferente, com rótulo de fluoro, e posterior análise estatística pareada dos resultados neutram os efeitos da variabilidade experimental interanimal, permitindo o alcance de significância estatística dos resultados, mesmo após a análise de um número limitado de indivíduos13.
Ressalta-se que, embora rápido e barato, esse método tem duas limitações principais. Primeiramente, é projetada investigar o controle Cell-Autonomous do gene da arquitetura neuronal, e não é apropriado endereçar o controle ambiental. Em segundo lugar, como precursores neuronais transplantados chegar a sua localização final por um cronograma heterocrônico, este método é preferível para modelar neuroarchitectonics controle ocorrendo após a conclusão da migração.
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Protocol
Todos os métodos e procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo SISSA organismo preposto Al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. geração de pools de progenitor "verdes" projetados
- Preparação da piscina "verde"
- Mate uma fêmea CD1 de tipo selvagem com um fundador do MtaptEGFP/+ 16. Eutanizar a represa grávida por luxação cervical em 12,5 dias após o coitum (o dia 0 é determinado pela inspeção de plugue vaginal) e colher os embriões embrionários do dia 12,5 (E 12.5). Ajuste-os em poços individuais de uma placa de 24 na solução fria de PBS.
- Rapidamente genótipo os embriões por inspeção visual uma lâmpada de luz azul, verificando a emissão de fluorescência verde no cérebro.
- Coloc os embriões verdes em um prato de Petri do diâmetro de 10 cm enchido com o frio 1X PBS com 0,6% glicose e transfira-o a um stereomicroscope.
- Corte as cabeças do embrião usando a tesoura padrão e extraia o telencéfalo deles por meio de #3 e #5 fórceps.
- Separe as duas vesículas telencefálica e dissecar os neocortices usando fórceps; Certifique-se de remover o hipocampo e os gânglios basais17.
- Colete os neocortices transferindo-os com uma pipeta P1000 em um tubo de 1,5 mL mantido no gelo.
- Deixe os neocortices dissecados estabelecir-se à parte inferior do tubo.
- Aspirar o sobrenadante, tanto quanto possível.
- Resuspend os neocortices em 400 μL do meio proliferative fresco [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA), 0,6% de glicose, 2 μg/mL de heparina, 20 ng/mL fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), 1X caneta-strep, e 10 pg/mL de anfotericina B].
- Gentilmente pipeta os neocortices para cima e para baixo, seqüencialmente com P1000, P200, e P20 dicas, 4x por ponta, para obter uma suspensão de células nebulosos.
Nota: o tecido neokortikalny e 12.5 é muito macio; dissociando-se a células individuais não requer digestão enzimática em todos os; a pipetagem repetida é suficiente. - Deixe que as meninges e os aglomerados neokortikalny residuais se acalmem por 2 min.
- Transferir 150 μL do topo da suspensão celular (principalmente contendo células individuais) para um novo tubo estéril de 1,5 mL.
- Adicione 150 μL de meio proliferativo fresco e repita as etapas 1.1.10-1.1.12 até que não mais aglomerantes de tecido sejam evidentes. Ao fazer isso, omita a etapa de pipetagem P1000 (na etapa 1.1.10).
Nota: três iteração das etapas 1.1.10-1.1.12 são geralmente suficientes para conseguir a dissociação cheia do tecido. - Células de contagem (piscina "verde") com o método de exclusão azul de Tripan em uma câmara de Bürker17 e adicionar meio proliferativo fresco para ajustar a concentração para 103 células/μl.
Nota: as etapas 1.1.7-1.1.14 devem ser executadas uma capa de fluxo laminar estéril desinfectada pelo etanol 70% e mantida ventilada por pelo menos 20 minutos.
- Engenharia das subpiscinas "verdes"
- Subdivida a associação "verde" em duas subpools em dois tubos distintos de 1,5 ml para a infecção lentivirais.
- Infecte as subpiscinas de forma independente com as duas misturas lentivirais dedicadas. Cada mistura contém "Red Label" vírus (Pgk1_mCherry) ou "Black" vírus (pCAG_lacZ) como um controle, bem como vírus para tetOFF conduzido transgene (Pgk1p_tTA e TRE_transgene) ou controle (Pgk1p_tTA e TRE_PLAP) expressão.
Cuidado: manipule Lentivirus em um ambiente BLS-2 com todas as medidas protetoras prescritas pelas regras e leis aplicáveis.
Nota: cada Lentivirus deve ser administrado em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 8, que (como mostrado anteriormente14) é suficiente para transduce a grande maioria das células neurais nessas condições experimentais (Figura 1). O Lentivirus abrigando os ativadores do Tet pode ser construído empregando os promotores neuronal diferentes que conduzem a expressão de TTA/rtta (por exemplo, ptα1, psyn, pcamkii, pGAD1, etc.) (Figura 2). O MOI é a proporção de (a) o número de partículas virais infecciosas entregues a (b) o número de suas células-alvo. Aqui, o primeiro (a) é calculado de acordo com o procedimento convencional descrito em outro lugar14, o último (b) é simplesmente avaliado usando uma câmara de Bürker. - Placas 600.000 células de cada subpool infectado por poço de 12 placas multipoços, em 600 μL de meio proliferativo com 2 μg/mL de doxiciclina.
Nota: aqui, os poços não são pré-tratados com poli-lisina, o que impede a fixação de células neurais em suas partes inferiores. - Transfira as células para a incubadora em 5% CO2 a 37 ° c.
- Após 2 dias, para avaliar a eficiência da infecção e a marcação diferencial das piscinas projetadas, inspecione as células um microscópio fluorescente convencional. As duas subpiscinas devem aparecer como suspensões de pequenas neuroesferas, homogeneamente expressando a proteína fluorescente vermelha (amostra de "controle") ou não (amostra de "teste"). Dentro dessas neuroesferas, o transgene MtaptEGFP é ativo limitado a uma minoria de células (neurônios pós-mitóticos) e silencioso na maioria deles (proliferating precursores) (Figura 3).
2. criação dos instrumentos cirúrgicos e da área de operação
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Preparando agulhas de borosilicato
- Utilize os capilares de vidro de borosilicato com diâmetro externo e interno igualando 1,5 mm e 1,12 mm, respectivamente.
- Puxe o capilar com um extrator P 1000.
- Configurar o programa de puxar. Os parâmetros típicos do programa são: Heat = 614; vel = 60; tempo = 1; pressão = 600. Devem ser ajustados de acordo com o modelo do extrator e o resistor de aquecimento empregado.
- Coloque o capilar nos suportes de puxador e aperte-os.
- Inicie o programa e tome os dois microcapilares puxados.
- Cortar a ponta capilar à mão, com um bisturi, o estereomicroscópio para obter uma ponta com um diâmetro externo de ~ 200-250 μm.
- Coloque os capilares em uma argila de modelagem (por exemplo, plasticina) suporte em um prato de Petri fechado e transferi-lo para debaixo do capô.
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Configurando o capô e preparando a solução de traçador de células
- Limpe a capa de fluxo horizontal com cuidado e Desinfecte-a usando 70% de etanol.
- Desinfete fibras ópticas usando 70% de etanol e coloque-as o capô.
- Misture 10 μL de solução de 125 mM EGTA e 10 μL de verde rápido para preparar a solução de traçador de células e coloque-a o capô.
- Corte pedaços pequenos (4 cm x 2 cm de tamanho) de película de vedação de laboratório para detecção de suspensão celular.
- Prepare uma solução de doxiciclina estéril de 1 mg/mL e aspire-a numa seringa de 0,3 mL.
- Ligue a capota e mantenha o fluxo laminar ligado durante 20 minutos antes da operação.
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Montagem do tubo de injecção
- Pegue um bocal de plástico duro, dois tubos de látex (cada um com cerca de 30 cm de comprimento) e um suporte capilar de um kit de montagem de tubo aspirador para pipetas microcapilares calibradas.
- Fixe o bocal de plástico duro numa extremidade de um tubo de látex.
- Fixar o suporte capilar a uma extremidade de outro tubo de látex.
- Conecte as extremidades livres dos dois tubos de látex com um filtro estéril de 0,45 μm, como uma barreira contra os germes do operador.
- Coloc o conjunto resultante do tubo do aspirador em um suporte de modelagem da argila a ser mantido a capa.
3. mistura celular e transplante intraventricular
- Misturando "teste" e "controle" sub-pools de células verdes
- Colete as neuroesferas "teste" e "controle" (ver etapa 1.2.5) em tubos separados de 1,5 mL.
- Suspensão de neuroesferas centrífuga a 200 g por 5 min.
- Recolher e descartar o sobrenadante, evitando a perturbação do pellet celular.
- Suspender suavemente as neuroesferas em 500 μL de 1X PBS.
- Centrifugue-os a 200 g durante 1 min.
- Retire o sobrenadante.
- Repita os passos 3.1.4-3.1.6 mais duas vezes.
- Reressuscite as esferas em 200 μL de solução de tripsina 2x (2x tripsina, 1X PBS) e a pelota da pilha da pipeta acima e para baixo 4x-5x.
Nota: Preste atenção para não fazer bolhas de ar. - Deixe as pilhas na incubadora por 5 minutos em 37 ° c para conseguir uma suspensão da único-pilha.
- Tripsina de bloco com 200 μL de solução de inibidor de tripsina (DMEM-F12, 10 μg/mL de DNAse I, inibidor da tripsina 0,28 mg/mL) pipetando para cima e para baixo 4x-5x.
- Células centrífugas a 200 x g durante 5 min e ressuscitem-nas em 1 ml de meio proliferativo fresco (DMEM-F12, 1x glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glicose, 2 μg/ml heparina, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 1x caneta-strep, 10 PG/ml anfotericina B).
- Contagem de células das duas piscinas com Tripan método de exclusão azul em uma câmara de Bürker.
- Ajuste a sua concentração para 100.000 células/μL em meio proliferativo.
- Misture 1:1 "teste" células com "controle" queridos.
- Verifique a mistura resultante um microscópio de fluorescência (ampliação objetiva: 10x) para garantir que a mistura é uma suspensão de uma única célula das duas piscinas (Figura 3C).
- Coloque a mistura no gelo o capô.
- Transplante intraventricular
- Prepare a gaiola com a mãe e os filhotes P0 em uma tabela Faraway da área pós-operatório cirúrgica.
- Coloque uma gaiola de recuperação em um carrinho perto do capô.
- Coloque uma mistura de serragem retirado da gaiola da mãe na parte inferior da gaiola de recuperação e colocá-lo uma lâmpada.
- Além disso, defina uma caixa de gelo coberta por uma folha de alumínio para a anestesia de PUPs P0.
- Pouco antes da transplantação, adicione 1/10 volume da solução do Tracer da pilha (da etapa 2.2.3) a 1 volume de suspensão da pilha (da etapa 3.1.16) e do ponto 3 μL da mistura resultante da "injeção" em uma parte de película de selagem do laboratório.
- Coloque o filhote na folha de alumínio fria por 1 min e verifique se ele está totalmente anestesiado.
Nota: para confirmar a anestesia, aperte suavemente uma pata e monitore o filhote por falta de movimentos, enquanto ainda respira. - Enquanto isso, aspirar o 3 μL de mistura de injeção (a partir do passo 3.2.5) para o capilar de vidro.
- Limpe suavemente a cabeça do filhote anestesiado com 70% de etanol.
- Coloque o queixo do filhote na ponta da fibra óptica para identificar claramente os hemisférios corticais.
Nota: em P0-P1, a pele da cabeça é muito fina, permitindo a identificação visual direta dos hemisférios logo acima dos globos oculares e atrás dos bulbos olfactory. - Mantenha o capilar (carregado como descrito na etapa 3.2.7) em qualquer um dos dois planos de meio parasagittal (esquerda ou direita), acima do bulbo olfativo, e perfure a pele da testa em sua interseção com o plano frontal contendo os centros oculares. Preste atenção para não danificar os vasos sanguíneos. Entrar o capilar no córtex frontal e acessar a cavidade ventricular (figura 4a).
- Para evitar danos acidentais da Eminência gangliónica, gire a agulha lateralmente em 30 graus, apontando sua ponta caudal-medial-Ward (Figura 4B).
- Injete suavemente as células na cavidade ventricular e monitore sua difusão por meio de fast Green (Figura 4C).
- Aguarde 5-10 s.
- Retire a agulha de vidro, tomando cuidado para não aspirar a suspensão da célula e descartá-la em um compartimento de descarte adequado.
- Antes que a recuperação do filhote da anestesia injete 150 μl da solução do doxiciclina via intraperitoneal para manter a expressão do transgene ainda fora após a transplantação.
- Após a injeção, coloque o filhote imediatamente a lâmpada para a recuperação.
- Deixe os filhotes a lâmpada por 5-10 min e, uma vez totalmente acordado, coloque-os na gaiola com a mãe.
- Observe os filhotes operados para 2-3 h, para garantir que a mãe aceita-los.
- Fornecer a gaiola com água potável contendo 0,5 mg/mL de doxiciclina e 50 g/L de sacarose para manter a expressão transgênica fora.
- Substitua a água Doxycycline-contendo pela água Doxy-livre 4 dias após a transplantação, assim ativando o transgene em neurônios borne-mitotic. Mantenha os ratos em um regime Doxy-livre por 6 dias e eutanize-os no P10 pela inalação do dióxido de carbono seguida pela decapitação.
4. análise de cérebros transplantados
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Histologia e imunofluorescência
- Eutanizar os filhotes transplantados 10 dias após a transplantação da pilha pela inalação do dióxido de carbono seguida pela decapitação. Corrigir cérebros de filhotes eutanasiados em 4% paraformaldeído (PFA) a 4 ° c durante a noite.
Atenção: a PFA é altamente tóxica; Manuseie com cuidado, cumprindo rigorosamente as prescrições do fabricante, uma capa de fumaça química; descartar a solução de PFA residual em um recipiente de resíduos rotulado. - Retire a solução de PFA e substitua-a por uma solução de sacarose a 30%.
- Deixe o cérebro a 4 ° c ou até que eles afundam na parte inferior do frasco.
- Transfira os cérebros em um molde de incorporação descartável aproximadamente metade-enchido com o meio da Cryo-inclusão.
- Congele os cérebros incluídos em-80 ° c.
- Corte 60 μm cortes coronais grossos usando um criostat.
Nota: Evite empregar seções mais finas, pois isso pode resultar em perda inaceitável de informações sobre toda a arquitetura de neurônios únicos. - Seções do processo para a imunofluorescência18,19, usando anticorpos do anti-GFP [1:400] e do anti-RFP (mcherry) [1:500]. Núcleos de contratura com solução DAPI de 1 mg/mL [1:200].
- Eutanizar os filhotes transplantados 10 dias após a transplantação da pilha pela inalação do dióxido de carbono seguida pela decapitação. Corrigir cérebros de filhotes eutanasiados em 4% paraformaldeído (PFA) a 4 ° c durante a noite.
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Morfometria
- Defina os parâmetros de trabalho do microscópio confocal da seguinte forma: z-Stack Height = 40 μm; Passo = 2 μm.
- Colete imagens de fatias imunoensaiadas selecionando campos fotográficos ricos em Neuron GFP positivos, cegos de distribuição de sinal RFP.
- Exporte as imagens como arquivos. ND2.
- Gere as projeções Z máximas deles como arquivos. TIFF (Figura 5a).
- Para permitir a esqueletização neuronal subsequencial cega ao genótipo das células, oculte o sinal vermelho. Para fazer isso, abra cada arquivo. TIFF por um software adequado e adicione uma camada de ajuste. Selecione "níveis", "vermelho", em seguida, defina "saída" para zero. Guarde o ficheiro como tal.
Observação: a esqueletização é posteriormente executada por um novo operador que não tinha acesso prévio a arquivos originais de vermelho simples. - Para cada arquivo vermelho oculto, adicione uma camada de desenho à imagem principal e selecione a ferramenta lápis (cor branca). Trace o soma com base no sinal de GFP, a seguir Trace os neurites.
Nota: a ferramenta lápis pode ser ajustada em 40 pixéis para o soma e em três pixéis para neurites. - Salve o arquivo multicamada, incluindo silhuetas neuronais (Figura 5b).
Nota: a análise subseqüente do esqueleto neuronal pode ser executada por um ou outro operador. - Crie um novo arquivo de escala de cinza de 1024 x 1024 16 bits com fundo preto, um por Neuron.
- Copie e cole silhuetas neuronais únicas da imagem principal para o novo arquivo de escala de cinza. Volte para o arquivo multicamada e desligue a camada de ajuste para desvendar genótipos neuronais. Salve o arquivo de escala de cinza de 16 bits anotando o genótipo neuronal correspondente.
- Importe imagens em tons de cinza no ImageJ um por um e analise esqueletos pelo plugin NeurphologyJ do software ImageJ20 (Figura 5C).
- Copie os dados primários do NeurphologyJ (neurite_length, attachment_points e Endpoints; para cada um, tome os valores de "área total"), Cole-os em uma planilha e empregue-os para calcular parâmetros morfométricos secundários ( comprimento médio de neurite, índice de ramificação) (Figura 5D).
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Representative Results
Há cinco conjuntos de dados primários que fornecem informações úteis sobre os principais aspectos do procedimento, sendo a primeira (1) eficiência da transdução de precursores neurais e a cotransdução por vetores lentivirais. (2) um exemplo de características-chave dos promotores empregados para conduzir o "gene de teste". (3) um exemplo de células de engenharia prontas para transplante. (4) uns desenhos animados que incluem detalhes processuais chaves da microinjeção da pilha no cérebro neonatal. (5) uma sinopse de todo o oleoduto morfométrico.
Quanto a (1), avaliou-se a capacidade dos vetores de Lentivirus prototípicos entregues em diferentes Mois (2, 4, 8) para transduce efetivamente precursores neokortikalny. No primeiro ensaio, os precursores neurais originados de neocortices de tipo selvagem precoce foram infectados por um repórter lentivirais, abrigando a seqüência de codificação de mcherry (CDs) o controle do promotor ptα1 neuronogênico-linhagem-específico, em moi = 2, 4, 8, então permitido diferenciar. O co-immunoprofiling de suas progênies para mCherry e o marcador Pan-neuronal Tubb3 mostraram que os neurônios estiveram transados eficazmente nas freqüências de 64%, de 69%, e de 78%, respectivamente (Figura 1a). Em um segundo ensaio, os precursores neokortikalny foram coinfectados agudamente por dois repórteres lentivirais, expressando EGFP e mcherry, o controle do promotor pPgk1 constitutivo, em Mois = (2, 2), (4, 4), e (8, 8). Alguns dias mais tarde, o coimunoperfilamento de seus derivados mostrou que a razão entre ascélulas EGFP + mcherry+ e EGFP+mcherry± foi de 80%, 88% e 93%, respectivamente (Figura 1b). Esses dados sugerem que, após a entrega do protocolo de engenharia previsto para o presente estudo, (a) a grande maioria dos neurônios é transvitada, e (b) quase todos os neurônios transviados receberam o conjunto lentivirais completo necessário para sua caracterização.
Figura 1 : Eficiência da transdução de células precursor neural por vetores lentivirais. Os painéis relatam uma avaliação da eficiência pela qual as células precursoras e 12.5 neokortikalny são transacadas (ou cotransgemadas) após a entrega de repórteres lentivirais dedicados em diferentes multiplicidades de infecção (Mois). No caso anterior (a), as pilhas foram infectadas aguda com o LENTIVIRUS (LV) pTα1-MCHERRY em moi = 2, 4, 8, cultivados no meio proliferative por 2 dias, transferidos ao meio diferenciador, e permitidos diferenciar-se por 1 semana. Após a fixação no dia in vitro (DIV) 9, as culturas foram coimunoperfiladas para mCherry e o marcador Tubb3. os sinais de mCherry e de EGFP foram detectados por anti-RFP e por anticorpos preliminares do anti-EGFP e revelados por Alexa-594-e por Alexa-488-anticorpos secundários conjugados, respectivamente. Finalmente, foram calculadas as relações mCherry+Tubb3+/mCherryTubb3+ , médias e plotadas em relação aos Mois correspondentes. No último caso (B), as pilhas foram infectadas agudamente com uma mistura 1:1 de dois Lentivirus, codificando para o transgenes constitutivamente ativos de PPGK-mcherry e de PPGK-EGFP, em Mois diferentes (2, 4, 8 para cada vírus). As células foram cultivadas em meio proliferativo por 4 dias, tripsinizadas e, após fixação, perfiladas para a imunofluorescência de mcherry e EGFP como acima. Finalmente, foram calculadosos índices de mcherry + EGFP+/mcherryegfp+ , em média e plotados contra os Mois correspondentes. Barras de erro representam M.E.V. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como para (2), os testes padrões da atividade de pTα1 e de pSyn podem ser inferidos com base nos perfis da expressão de genes do fluoroprotein seu controle. Neste exemplo, esse controle é direto em caso de mCherry (Figura 2a) e indireto [ou seja, mediado por uma interface de segunda geração Teton(figura 2e)], no caso do EGFP (Figura 2b, C, D). Ambos os promotores são especificamente ativos dentro de Tubb3+ neurônios pós-mitóticos (Figura 2b, C, D), mas ptα1 também dispara em um subconjunto de 67+ intermitotic (Neuronogenic) precursores (Figura 2a). Aqui, para fornecer uma ideia de variabilidade limitada da atividade do promotor quando as células são projetadas de acordo com essas condições padrão (Figura 2e), os níveis de expressão de EGFP orientados para Ptα1 e psyn dentro de neurônios Tubb3+ foram quantificados por Photoshop CS6 plugin histograma. Em seguida, os dados brutos foram normalizados contra medianas e plotados contra promotores (Figura 2F). Notavelmente, os níveis de fluorescência de uma única célula foram densamente agrupados em torno de medianas: primeiro e terceiro quartis igualaram 0,86 e 1,16, assim como 0,89 e 1,12 nos casos de pTα1 e pSyn, respectivamente.
Figura 2 : Criação de perfis de promotores específicos do tipo precursor neural adequados para impulsionar a superexpressão do GOI. Os painéis referem-se à caracterização dos promotores de tubulin Alpha 1 (pTα1) e Synapsin (pSyn), especificamente ativos dentro de toda a linhagem neuronal e neurônios pós-mitóticos, respectivamente. O teste foi executado em precursores neokortikalny colhidos em diferentes idades embrionárias (En), infectadas aguda com misturas lentivirais dedicadas [ptα1-mcherry em (A); ptα1-rtta, Tret-EGFP em (B); psyn-rtta, Tret-EGFP in (C, D); 2μg /ml Doxy ab initio], e cultivadas em meio proliferativo (A), proliferativa (2 dias) seguida por meio diferenciador (B, C), ou diferencial (D) médio. Em cima da fixação no dia in vitro (div) n, os neurônios células foram identificados por αtubb3 e por precursores intermitotic pela imunofluorescência de αki67; mCherry e EGFP foram detectados como mostrado na Figura 1. Os sinais foram revelados como mostrado na Figura 1. Barras de escala: 100 μm em (A, B) e 50 μm em (C, D). São mostradas (E) misturas lentivirais dedicadas utilizadas neste estudo com referências aos painéis de figura. Mostrado é um (F) um gráfico de dispersão de pTα1-e sinal de EGFP orientado por psyn em células Tubb3+ referidas em (B) e (D), respectivamente. Encaixotado são as pilhas que caem entre 25th e 75th percentis; os bigodes referem-se a 10º e 90º percentis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quanto a (3), 3 dias após a transdução lentivirais, as neuroesferas "verdes" de mtaptEGFP/+ expressam a proteína fluorescente vermelha do promotor de Pgk1p, mcherry (esferas do "controle") ou não (esferas do "teste") (Figura 3a, B). Todas as esferas são dissociadas para células individuais, garantindo que não haja fendas de aglomerados, e as suspensões correspondentes são misturadas 1:1. A mistura resultante (Figura 3C) é colocada no gelo e usada dentro de 20 min para o transplante.
Figura 3 : Exemplo de teste ("apenas verde") e controle ("verde-vermelho") DIV2 neuroesferas e suspensão celular pronto para transplante. (A, B) Estas esferas foram obtidas de mtaptEGFP/+e 12,5 precursores neokortikalny, infectados acutamente por misturas lentivirais "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (A) e "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (B), respectivamente, cada LV em moi = 8, e mantido em meio proliferativo. (C) a suspensão celular foi obtida por meio da dissociação das neuroesferas "teste" e "controle" (a, B) para as células únicas e misturando-as 1:1. Barras de escala: 200 μm em (A, B) e 100 μm em (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quanto a (4), o procedimento para a injeção da pilha no cérebro neonatal inclui três etapas chaves. O capilar, colocado no plano médio-parasagittal, é entrado na cavidade ventricular lateral através da parede cortical frontal (figura 4a). Em seguida, para evitar danos da Eminência gangliónica, o capilar é girado 30 ° dentro do plano horizontal, de modo que a ponta aponta medialmente/caudally (Figura 4B). Por último, a suspensão celular é delicadamente ejetado na cavidade ventricular lateral, onde forma uma "nuvem" de fácil diferenciação, azul claro (Figura 4C).
Figura 4 : Esquemas do procedimento de três etapas empregados para a injeção da pilha no cérebro neonatal. (A) o capilar é entrado no ventrículo lateral através da parede neokortikalny frontal. Então, (B) é girado medialward, para impedir dano da Eminência ganglionic. Finalmente (C), a suspensão da pilha é injetada delicadamente no ventrículo lateral, onde dá forma a uma nuvem azul clara. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quanto a (5), o procedimento analítico inclui quatro etapas principais. Primeiro, seções confocais ópticas de campos ricos em neurônios transplantados são achatado, de acordo com a modalidade de projeção Z MAX, gerando arquivos RGB. TIFF. Aqui, como exemplo, apenas os neurônios "teste verde" e os neurônios de "controle amarelo", originários de precursores cotransplantados, podem ser facilmente distinguidos (deve-se notar que mCherry pode alternativamente ser usado para rotular os neurônios de "teste") (Figura 5a). Então, uma versão idealizada, esqueletizado da câmera lucida da imagem é gerada por um software gráfico adequado (ver passo 4.2.6) (Figura 5b) por um operador cego de canal vermelho. A cegueira da canaleta vermelha é da importância primordial a fim impedir todo o viés não intencional na avaliação de dados. Em seguida, as silhuetas single-neuronal são alimentadas no software de NeurphologyJ como retratos e valores preto e branco dos três parâmetros preliminares "número total de exitpoints" (attachment_points), "número total de valores-limite" (valores-limite) e "total comprimento do neurite "(neurite_length) são coletadas (Figura 5C). Finalmente, os parâmetros secundários de cada neurônio são calculados, avaliados em média e estatisticamente pelo software Excel (Figura 5D).
Figura 5 : Fluxograma representativo da Análise morfométrica de cérebros transplantados. Os painéis superiores da fileira mostram: (a) uma imagem máxima de z-Projection. TIFF do neocortex medial, fixa 10 dias após a transplantação projetada da pilha (verde = mtapt-conduzido, EGFP-restrito Neuron; vermelho = mcherry, rotulando constitutivamente pilhas do "controle"; azul = DAPI), o sinal do canal verde, e (B) sua composição esqueletizado da lucida da e-câmera. Barras de escala: 50 μm. A linha inferior inclui: (C) parâmetros morfométricos primários extraídos de esqueletos neuronais pela análise de software do neurphologyj (neurite_length como Σli, attachment_points comosaída N e Endpoints como Nend) e (D) parâmetros secundários calculados em sua base. Este número foi modificado de Chiola et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aspectos específicos/etapas deste procedimento são críticos e exigem atenção especial. Primeiro, (a) os operadores devem ser adequadamente treinados para manipular com segurança Lentivirus em um ambiente de laboratório compatível com BSL-2. Em segundo lugar, (b) antes de misturar "teste" e "controle" preparações neurais, é obrigatório lavar cuidadosamente as duas suspensões de neuroesfera correspondentes, como descrito, a fim de evitar qualquer atraso na infecção cruzada das duas preparações devido a Lentivirus indesejados transportar. Terceiro, (c) ao transplantar as pilhas, o cuidado deve ser coloc ao alvejar a cavidade ventricular; a este respeito, o Tracer verde rápido incluído na suspensão da pilha é da ajuda substancial. Adicionalmente, (d) para prevenir o canibalismo, os filhotes transplantados devem ser retransferidos para a mãe somente após a recuperação total da anestesia (geralmente 10 min é suficiente). e) a Criosecção do tecido transplantado deve ser realizada a 60 μm; de facto, esta espessura permite simultaneamente uma penetração fácil do anticorpo no tecido e limita a perda de informação que origina da fragmentação vesícula do neurônio. Finalmente, (f) para evitar qualquer viés não intencional na avaliação dos dados, enfatizamos que a esqueletização do neurônio deve ser realizada por um operador cego de canal vermelho.
O protocolo descrito aqui refere-se às manipulações do gene GOF. Alternativamente, os neurônios de "teste" podem ser projetados para reduzir a função GOI por meio da codificação de Lentivirus para efetores de RNAi. Em seguida, costumamos empregar mCherry para rotular células neurais de "controle"; no entanto, o esquema de mCherry/"Control" e LacZ/"Test" pode ser obviamente invertido. Por último, o protocolo descrito aqui refere-se a injeções de células intraventricular; os neurônios do "teste" e do "controle" podem alternativamente ser coinjetados no fígado neural21.
Apesar de suas vantagens, este método tem dois limites principais. Embora permitindo investigar o controle genético celular-autônomo da neuroarquitetura, não se aplica ao controle ambiental do mesmo. Além disso, como os precursores neuronal transplantados migram do aspecto ventricular da parede cortical a sua posição laminar final após o nascimento (isto é dentro de um período de tempo não fisiológico), este método deve preferivelmente ser empregado para modelar controle de neuroarchitectonics após a conclusão da migração.
Por último, mas não menos importante, deve ser prestada especial atenção à interpretação crítica dos resultados. Em particular, se o tema do gene X da investigação reduz a complexidade morfológica dos neurônios de "teste", isso pode não refletir especificamente seu impacto genuíno na arquitetura do neurônio. Em vez disso, tal fenômeno pode ser um índice não-específico de dano neuronal eliciado pela superexpressão X. Para abordar esta questão, pode ser útil para comparar as densidades locais de transplantados, "teste" e "controle" neurônios, em seguida, procurar possível encolhimento numérico da população "teste", como um índice de sofrimento neuronal induzido por X [este encolhimento deve ser ainda mais pronunciado em cima da análise atrasada mais adicional de cérebros transplantados]. Nesses casos, reduzir o nível de overepression do gene X ou mover para um design de perda de função pode corrigir o problema.
Nosso método contribui para uma ampla gama de tecnologias empregadas para investigar o controle genético da morfologia neuronal in vivo1,2,3,4,7,8, 9 anos de , 10 de , 11 anos de , 12. como recordado na introdução, estas tecnologias dependem de uma variedade de manipulações genéticas ad hoc destinadas a perturbar os níveis de expressão de Goi e facilitar a extração de informações morfológicas das amostras biológicas. Estas tecnologias permitem geralmente a dissecção exata deste controle; no entanto, eles exigem habilidades experimentais não valiosas e recursos financeiros. A este respeito, o método oferece três vantagens chave. Permite um controle exato dos níveis de expressão de GOI comparáveis àqueles peculiares aos modelos transgênicos; Entretanto, na ausência de custos de manutenção da colônia do mutante. Não exige habilidades experimentais (cirúrgicas) sofisticadas. Muitas vezes, atinge a significância estatística dos resultados após a análise de um número relativamente limitado de animais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Mihn Duc do pela sua contribuição para a criação precoce deste procedimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
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