Summary
该方法基于神经元前体的体外慢病毒工程,将其共同移植到野生型大脑中,并配对对"测试"和"控制"衍生物的形态学评价,从而能够精确建模新皮质的体内基因控制神经元形态,以简单和负担得起的方式。
Abstract
神经元细胞结构的基因控制是当前深入研究的对象。本文介绍了一种用于研究新皮质投影神经元形态的体内基因控制的简单方法。该方法基于(1)神经元前体的体外慢病毒工程作为"测试"和"控制"细胞,(2)它们共同移植到野生型大脑,和(3)对其神经元衍生物的成对形态评估。具体来说,来自具有遗传标记的遗传性捐赠者的E12.5的皮质前体被用于这一目的。它们被设计成利用选定的启动子和ttON/OFF技术,它们被徒手移植到新生儿侧心室。之后,在受体大脑的免疫荧光分析后,将移植神经元的轮廓输入NeurphlogyJ开源软件,提取其形态参数,并计算平均长度和分支指数。与其他方法相比,这种方法具有三个主要优点:它允许以负担得起的成本实现对转基因表达的精细控制,它只需要基本的外科技能,并且在分析有限的动物的数量。然而,由于其设计,它不足以解决神经结构的非细胞自主控制。此外,最好在神经元迁移完成后,将其用于研究中性石形态控制。在其目前的配方中,该方法经过精心调整,以研究谷胱甘肽新皮质神经元结构的基因控制。利用其他特定神经细胞类型中表达EGFP的转基因线,可以重新用于解决其结构的基因控制问题。
Introduction
在这里,我们描述了一个简单的方法,我们开发解剖神经元细胞结构的体内基因控制。基于神经元前体的体外工程,将其移植到新生儿大脑中,并配对对"测试"和"控制"细胞的形态评价,从而在快速且经济实惠的方式。为了研究神经元结构的体内基因控制,必须解决三个关键技术问题:(1)实现适当的模式性兴趣基因(GOI)表达和准确的定量控制;(2) 获得不同神经元轮廓的恰当分段可视化;(3) 在雇用有限数量的动物的同时,得出结果的统计意义。
如果可用,携带四环素(tt)控制的转基因的小鼠突变线可能是解决第一个问题1的最佳工具。或者,可以采用体细胞转因。在这种情况下,转基因通过电穿孔2或病毒转导3传递。接下来,它被保留为表皮体(例如,在标准电穿孔4)或它集成到基因组(随机,通过逆转录病毒整合5;或在一个定义的位置,通过CRISPR促进的同源重组(SLENDR)6).
其次,神经元轮廓可视化可以通过 (a) 稀疏均匀标记或 (b) 密集差分标记来实现。至于稀疏标记,先进的高尔基样方法可采用7种,选定的神经元小组可以由生物细胞蛋白8填充,而盐和胡椒标签可以通过稀疏表达的转基因获得。这种转基因可能显示变异转录(Thy-EGFP)9,或者可以通过随机重组(MORF)10激活。 至于(b),最先进的策略包括多絮荧光蛋白转基因阵列(Brainbow)11中的Cre介导随机重组,以及以前由猪Bac-转位酶驱动的荧蛋白基因基因组整合通过体细胞转发生(CLoNE)12.
至于第三个问题,形态学结果往往受到来自动物间差异和细胞注射意外性的巨大随机变异的影响。因此,通常使用大量的动物来达到评估GOI形态活动所需的统计能力。
前面提到的方法往往依靠先进的技术技能,需要明显的财政资源,这可能限制它们在科学界的传播。为了规避这些问题,我们设想了一个简单明了的管道,以快速、经济的方式解剖体内神经结构的基因控制。其灵感来自于以前为快速体内评估抗冲击转基因活性13而开发的类似联合移植设计。
具体来说,人们认为,将体外工程"绿色"神经前体("测试"和"控制"细胞)共同移植到"黑色"受体新生儿大脑中可以同时解决上述三个关键问题。事实上,前体的体外慢病毒工程,在控制良好的条件下,允许保持神经元转基因表达的可变性至少,远远低于通常与体内体细胞操作(以前执行14,15和我们未发布的结果)。由此产生的基因表达的准确控制与tt控制的转基因模型相比。然而,这个程序的成本远远低于那些源于转基因小鼠生产线的维护。其次,手部细胞注射很容易,需要最少的训练。此外,可以很方便地调整注入每个大脑的标记前体的数量,以达到足够多分布的前体累积数量,同时将移植动物的总数保持在最低限度。最后但并非最不重要的,共同注射不同含氟标记的"测试"和"控制"前体,以及随后对结果的成对统计分析,抵消了动物间实验变异性的影响,使统计意义的结果,即使分析人数有限的个人13。
应该强调的是,这种方法虽然快速而便宜,但主要有两个局限性。首先,它旨在研究神经元结构的细胞自主基因控制,并不适合解决环境控制问题。其次,当移植的神经元前体通过异形时间安排到达其最终位置时,这种方法比模型神经架构控制更可取。
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Protocol
此处描述的所有方法和程序均已获得 SISSA 生物前库 (SISSA IACUC) 的批准。
1. 生成工程"绿色"祖细胞池
- "绿色"游泳池的准备
- 交配野生型CD1女性与Mtapt EGFP/+创始人16 。在阴膜后12.5天(第0天由阴道塞检查确定)通过宫颈错位对怀孕的大坝实施安乐死,并收获胚胎日12.5(E12.5)胚胎。将它们放在冷PBS溶液中24个多孔板的单独井中。
- 通过在蓝光灯下目视检查,快速基因化胚胎,检查大脑中的绿色荧光发射。
- 将"绿色"胚胎放入一个直径为10厘米的培养皿中,里面装满了0.6%葡萄糖的冷1x PBS,并将其转移到立体显微镜下。
- 用标准剪刀切割胚胎头,用#3和#5钳子从胚胎头中提取端脑。
- 分离两个端脑囊泡,并用钳子解剖新皮质;一定要删除海马和基底神经节17。
- 收集新皮质,用P1000移液器将其转移到冰上保存的1.5 mL管中。
- 让解剖的新皮质沉降到管的底部。
- 尽可能多地吸进上清。
- 在400 μL的新鲜增殖介质中重新悬浮新皮质[DMEM-F12,1x Glutamax,1X N2,1mg/mL牛血清白蛋白(BSA),0.6%葡萄糖,2微克/mL肝素,20纳克/mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF),20纳克/mL表皮生长因子(EGF),1X笔和 10 皮克/mL 五聚基林 B*。
- 用 P1000、P200 和 P20 尖端(每头 4x)依次移移新皮质,以获得多云细胞悬浮液。
注:E12.5新皮质组织非常柔软;将其分离到单个细胞中,根本不需要酶消化;重复移液就足够了。 - 让脑膜炎和残留的新皮质团稳定2分钟。
- 将150 μL从细胞悬浮液顶部(主要包含单个细胞)转移到新的1.5 mL无菌管中。
- 加入150 μL的新鲜增殖介质,重复步骤1.1.10-1.1.12,直到不再明显组织团块。执行此操作时,省略 P1000 移液步骤(在步骤 1.1.10 中)。
注: 步骤 1.1.10-1.1.12 的三次迭代通常足以实现完全组织分离。 - 在Bürker室17中用锥蓝色排除法计数细胞("绿色"池),并添加新的增殖培养基,以将浓度调整到103个细胞/μL。
注:步骤1.1.7-1.1.14必须在无菌层流罩下进行,由70%乙醇消毒,并保持至少20分钟的通风。
- 工程"绿色"子池
- 将"绿色"池细分为两个子池,在两个不同的 1.5 mL 管中进行慢病毒感染。
- 使用两个专用的慢病毒混合物独立地感染子池。每个组合都包含"红色标签"病毒 (Pgk1_mCherry) 或"黑色"病毒 (pCAG_lacZ) 作为控件,以及 ttOFF 驱动转基因 (Pgk1p_tTA 和 TRE_转基因) 或控制 (Pgk1p_tTA 和 TRE_PLAP) 表达的病毒。
注意:在 BLS-2 环境中操作慢病毒,并按照适用的规则和法律规定的所有保护性测量。
注:每种慢病毒必须在8的多重感染(MOI)下施用,这(如前14所示)足以在此类实验条件下转导绝大多数神经细胞(图1)。携带tt转活化剂的慢病毒可以通过使用不同的神经元启动子来驱动tTA/rtTA表达(例如,pT+1、pSyn、pCaMKII、pGAD1等)来构建。(图2)MOI 是 (a) 传播至 (b) 其目标细胞数量的传染性病毒颗粒数的比率。在这里,前者(a)是根据其他地方描述的常规程序14计算的,后者(b)是简单地使用Bürker室进行评估的。 - 在600μL增殖介质中,用2μg/mL的多氧环素,每孔600,000个受感染子池的板600,000个细胞。
注:此处,孔未预处理多利地因,防止神经细胞附着到其底部。 - 在37°C下将细胞转移到5%CO2的培养箱中。
- 2天后,评估感染效率和工程池的差分标记,在常规荧光显微镜下检查细胞。两个子池必须显示为小神经球的悬浮物,同质表达红色荧光蛋白("控制"样本)或不("测试"样本)。在这些神经球中,MtaptEGFP转基因活性仅限于少数细胞(后造影神经元),并且在大多数细胞中处于静音状态(增殖前体)(图3)。
2. 手术器械和手术区域的设置
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准备硼硅酸盐针
- 使用外部和内部直径分别为 1.5 mm 和 1.12 mm 的硼硅酸盐玻璃毛细管。
- 使用 P 1000 拉拔器拉动毛细管。
- 设置拉取程序。典型的程序参数是:热 = 614;天鹅绒 = 60;时间 = 1;压力 = 600。它们必须根据使用的拉拔器型号和加热电阻器进行调整。
- 将毛细管放入拉拔器支架中并拧紧它们。
- 启动程序,并取两个拉微毛细血管。
- 在立体显微镜下用手切割毛细管尖端,以获得外径为±200-250 μm的毛细管尖端。
- 将毛细血管放在模拟粘土(例如,可塑性)支架上,放入封闭的培养皿中,并将其转移到发动机罩下。
-
设置发动机罩并准备细胞示踪液
- 仔细清洁水平流量罩,并使用 70% 乙醇对其进行消毒。
- 使用 70% 乙醇对光纤进行消毒,并将其置于引擎盖下。
- 混合 10 μL 的 125 mM EGTA 溶液和 10 μL 的快速绿色,准备"细胞示踪剂溶液"并将其置于发动机罩下。
- 切割实验室密封膜的小块(4 厘米 x 2 厘米大小),用于细胞悬浮液斑点。
- 制备1mg/mL无菌多西环素溶液,并将其吸进0.3 mL注射器中。
- 打开发动机罩,在操作前保持层流 20 分钟。
-
组装注射管
- 取一个硬塑料喉舌、两个乳胶管(每根约 30 厘米长)和一个毛细管支架,用于校准微毛细管移液器。
- 将硬塑料喉舌固定在乳胶管的一端。
- 将毛细管支架固定到另一根乳胶管的一端。
- 将两个乳胶管的自由端与 0.45 μm 无菌过滤器连接,作为防止操作者细菌的屏障。
- 将产生的吸气管组件放在要放在发动机罩下的建模粘土支架上。
3. 细胞混合和室内移植
- 混合"测试"和"控制"绿色单元子池
- 在单独的 1.5 mL 管中收集"测试"和"控制"神经球(参见步骤 1.2.5)。
- 离心神经球悬浮在200克5分钟。
- 收集和丢弃上清液,避免干扰细胞颗粒。
- 在 500 μL 的 1x PBS 中轻轻重新悬浮神经球。
- 在200克下离心1分钟。
- 拆下上清液。
- 重复步骤 3.1.4-3.1.6 两次。
- 在 200 μL 的 2x 胰蛋白酶溶液(2x 胰蛋白酶、1x PBS)和移液细胞颗粒上下 4x-5x 中轻轻重新悬浮球体。
注意:注意不要产生气泡。 - 在37°C下将细胞留在培养箱中5分钟,实现单细胞悬浮。
- 块胰蛋白酶与200 μL的胰蛋白酶抑制剂溶液(DMEM-F12,10μg/mL脱胶酶I,0.28毫克/mL胰蛋白酶抑制剂),通过上下移液4x-5倍。
- 200 x g的离心细胞在200 x g下5分钟,并在1mL的新鲜增殖培养基中重新悬浮(DMEM-F12,1x Glutamax,1x N2,1mg/mL BSA,0.6%葡萄糖,2微克/mL肝素,20纳克/mL bFGF,20纳克/mL EGF,1x笔链,10 pg/mL氨基苯基。
- 在 Bürker 腔室中使用锥蓝色排除方法对两个池的单元格进行计数。
- 在增殖培养基中将其浓度调整到100,000个细胞/μL。
- 将 1:1"测试"单元格与"控制"单元格混合。
- 在荧光显微镜下检查结果组合(客观放大倍率:10倍),以确保混合物是两个池的单细胞悬浮液(图3C)。
- 将混合物放在引擎盖下的冰上。
- 室内移植
- 准备笼子与母亲和P0小狗在远离手术操作区的桌子上。
- 将回收笼放在靠近发动机罩的推车上。
- 将从母笼中取下的锯屑混合物放在回收笼的底部,并将其放在灯下。
- 此外,设置一个用铝箔覆盖的冰盒,用于P0小狗的麻醉。
- 在移植之前,将1/10体积的细胞示踪液(从步骤2.2.3)添加到1卷细胞悬浮液(从步骤3.1.16)中,并在实验室密封膜上点3μL。
- 将小狗放在凉爽的铝箔上1分钟,并检查它是否完全麻醉。
注:要确认麻醉,请轻轻挤压爪子,并监测小狗缺乏运动,同时仍然呼吸。 - 同时,将注射混合物的3μL(从步骤3.2.5)吸入玻璃毛细管。
- 用70%乙醇轻轻擦拭麻醉小狗的头部。
- 将小狗的下巴放在光纤的尖端,以清楚地识别皮质半球。
注:在P0-P1,头部皮肤非常薄,允许直接直观地识别眼珠上方和嗅球后半球。 - 将毛细管(如步骤 3.2.7 中所述)放在两个中间寄生虫平面(左侧或右侧)之一的嗅觉球上方,并在其与包含眼球中心的前平面的交叉处刺穿前额皮肤。注意不要损害血管。将毛细管输入前额皮层并进入心室(图4A)。
- 为了防止坏石的意外损坏,将针的横向旋转30度,指向其尖端的圆角内向(图4B)。
- 轻轻地将细胞注入心室,并通过快速绿色监测其扩散(图4C)。
- 等待 5-10 s。
- 取出玻璃针,注意不要吸出细胞悬架并将其丢弃在合适的处置箱中。
- 在小狗从麻醉中恢复之前,在腹膜内注射150μL的多西环素溶液,以保持移植后转基因表达仍然关闭。
- 注射后,将小狗立即放在灯下进行恢复。
- 把小狗放在灯下5-10分钟,一旦完全清醒,把它们和妈妈放在笼子里。
- 观察操作的小狗2-3小时,以确保母亲接受他们。
- 向笼子供应含有0.5毫克/mL多西环素和50克/升蔗糖的饮用水,以保持转基因表达。
- 移植后4天用不含多氧环水代替含多氧环水,从而激活后线神经元的转基因。将小鼠保持无多氧系统6天,然后通过吸入二氧化碳在P10处安乐死,然后斩首。
4. 移植大脑的分析
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学会与免疫荧光
- 在细胞移植后10天通过吸入二氧化碳,然后斩首,对移植的幼崽实施安乐死。将安乐死幼崽的大脑固定在4%的甲醛(PFA)中过夜。
注意:PFA 是剧毒的;小心处理,严格遵守制造商的处方,在化学烟气罩下;丢弃在标记的废物容器中的 PFA 溶液残留物。 - 拆下 PFA 溶液,并将其替换为 30% 蔗糖溶液。
- 将大脑留在4°C或直到它们沉入小瓶底部。
- 将大脑转移到一次性嵌入模具中,大约半填充低温内含介质。
- 在-80°C冷冻包含的大脑。
- 使用低温切割 60 μm 厚的日冕部分。
注意:避免使用较薄的部分,因为这可能导致关于单个神经元的整个架构的信息丢失。 - 免疫荧光18、19、使用抗GFP[1:400]和抗RFP(mCherry)[1:500]抗体的工艺部分。反染色核与1毫克/mL DAPI溶液[1:200]。
- 在细胞移植后10天通过吸入二氧化碳,然后斩首,对移植的幼崽实施安乐死。将安乐死幼崽的大脑固定在4%的甲醛(PFA)中过夜。
-
莫普霍普特里
- 将共聚焦显微镜的工作参数设置如下:z-堆栈高度 = 40 μm;步数 = 2 μm。
- 收集免疫测定切片的图片,选择GFP阳性神经元丰富的摄影场,RFP信号分布的盲。
- 将图像导出为 .nd2 文件。
- 生成它们的最大 Z 投影作为 .tiff 文件 (图 5A)。
- 要允许亚序神经元骨架化对细胞基因型视而不见,请隐藏红色信号。为此,通过适当的软件打开每个 .tiff 文件并添加一个调整图层。选择"级别"和"红色",然后将"输出"设置为零。保存文件为此类。
注: 骨架化随后由以前无法访问原始普通红色文件的新操作员执行。 - 对于每个隐藏的红色文件,向主图像添加绘图图层并选择铅笔工具(白色)。根据GFP信号跟踪索马,然后追踪神经酸盐。
注: 铅笔工具可以设置为 40 像素的 soma 和三个像素为神经酸盐。 - 保存多层文件,包括神经元剪影 (图5B)。
注: 神经元骨架的后续分析可以由任一操作者执行。 - 创建一个带有黑色背景的 1024 x 1024 16 位灰度文件,每个神经元一个。
- 复制并粘贴从主图像到新的灰度文件的单个神经元剪影。回到多层文件并关闭调节层以揭开神经元基因型。保存 16 位灰度文件,以点名相应的神经元基因型。
- 在ImageJ中逐一导入灰度图像,并通过图像J软件20的NeurphologyJ插件分析骨架(图5C)。
- 复制NeurphologyJ主数据(中性光长度、附件点和端点;对于每个数据,取"总面积"值),将它们粘贴到电子表格中,并使用它们计算次生形态参数(平均神经酸盐长度,分支指数)(图 5D)
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Representative Results
有五个主要数据集提供有关程序关键方面的有用信息,第一个数据是 (1) 神经前体转导和慢病毒载体共转导的效率。(2) 驱动"测试基因"的促进者的主要特征示例。(3) 准备移植的工程细胞示例。(4) 包含细胞微注射到新生儿大脑的关键程序细节的漫画。(5) 整个形态管道的概要。
关于(1),评估了在不同MOI(2,4,8)中交付的原型慢病毒载体有效转导新皮质前体的能力。在第一次测定中,源自早期野生型新皮质的神经前体被慢病毒报告者感染,在神经原系特异性pT_1启动子的控制下,将mCherry编码序列(cds)藏匿在MOI =2、4、8,然后允许区分。mCherry和泛神经元标记图布3的祖传联合免疫化图显示,神经元在频率分别为64%、69%和78%时得到有效转导(图1A)。在第二次测定中,新皮质前体被两个慢病毒报告人急性联合感染,在组织pPgk1启动子的控制下,在MOIs =(2,2),(4,4)和(8,8)下,表达EGFP和mCherry。几天后,其衍生物的共同免疫分析显示,EGFP+mCherry+和 EGFP+mCherry]细胞之间的比率分别为80%、88%和93%(图1B)。这些数据表明,在交付本研究设想的工程协议后,(a) 绝大多数神经元是转导的,和(b) 几乎所有转导神经元都收到了其表征所需的全部慢病毒集。
图 1:神经前体细胞通过慢病毒载体转导的效率。小组报告对E12.5新皮质前体细胞在不同感染倍数(MOIs)交付专用慢病毒报告仪时转导(或共转导)的效率进行了评估。在前一例(A) 中,细胞在 MOI = 2、4、8 处严重感染慢病毒 (LV) pT_1-mCherry,在增殖培养基培养 2 天,转移到不同的培养基,并允许分化 1 周。在天体外 (DIV) 9 固定时,培养物为 mCherry 和泛神经元标记图布3 共同免疫。mCherry和EGFP信号分别通过抗RFP和抗EGFP原抗体检测,Alexa-594-和Alexa-488-结合二级抗体显示。最后,根据相应的MOI计算、平均和绘制了mCherry+Tubb3+/ mCherryTubb3+比率。在后一种情况下(B), 细胞被急性感染两种慢病毒的 1:1 混合, 编码为构成活性 pPgk-mCherry 和 pPgk-EGFP 转基因, 在不同的 MOIs (2, 4, 8 每个病毒).细胞在增殖培养基培养4天,胰蛋白酶化,并在固定后,为mCherry和EGFP免疫荧光分析,如上文所示。最后,根据相应的MOI计算、平均和绘制了mCherry+EGFP+/ mCherryEGFP+比率。错误栏代表 S.E.M.请点击这里查看此图的较大版本。
至于(2),pT_1和pSyn活性模式可以根据其控制下的荧蛋白基因的表达特征推断出来。在此示例中,这种控制在 mCherry(图 2A)的情况下是直接的,间接的 [即由 ttON 第二代接口(图 2E) 的中介],在 EGFP 的情况下(图 2B,C,D )。两个启动子在Tubb3+后分体神经元(图2B,C,D)中特别活跃,但pT_1也在Ki67+词源(神经性)前体(图2A)的子集中触发。 在这里,提供促进者活性的有限变异性的想法,当细胞根据这些标准条件(图2E),pT_1-和pSyn驱动的EGFP表达水平在Tubb3 + 神经元被量化Photoshop CS6 直方图插件。然后,对中间值对原始数据进行规范化,并针对启动子绘制图(图 2F)。值得注意的是,单细胞荧光水平密集地聚集在中位数周围:第一和第三四分位数分别等于0.86和1.16,pT+1和pSyn的浓度分别为0.89和1.12。
图 2:分析神经前体特定型促进剂,适合驱动GOI过度表达。面板是指图布林α1(pT_1)和Synapsin(pSyn)启动子的表征,分别在整个神经元系和后肌神经元中特别活跃。测试在不同胚胎(E n)年龄收获的新皮质前体中进行,急性感染专用慢病毒混合物[pT_1-mCherryin(A);pT_1-rtTA,TREt-EGFP(B);pSyn-rtTA,TREt-EGFP(C,D);/ml doxy ab initio,并在增殖介质 (A)、 增殖 (2 天) 中培养,然后是差别介质 (B,C) 或区分 (D) 介质。在天体外固定(DIV)n时,通过βTubb3和intermi-atinin前体通过βKi67免疫荧光识别后敏体神经元; mCherry和EGFP被检测到,如图1所示。信号显示如图1所示。刻度条:100 μm in(A、B)和 50 μm (C,D)。图中所示为 (E) 本研究中使用的专用慢病毒混合物,并参考了图形面板.图所示为 (F) 在 Tubb3和(D) 中分别引用的细胞中 pT_1- 和 pSyn 驱动的 EGFP 信号的散射图。盒装是落在25到75个百分位数的细胞;胡须是指第10和第90个百分位数。请点击此处查看此图的较大版本。
至于(3),在慢病毒转导后3天,Mtapt EGFP/+"绿色"神经球表达Pgk1p启动子驱动,mCherry红色荧光蛋白("控制"球)或不("测试"球)(图3A,B)。所有球体都分离到单个单元,确保没有团块留下,相应的悬浮液混合1:1。所得混合物(图3C)被放置在冰上,并在20分钟内用于移植。
图 3:测试示例("仅绿色")和控制("绿-红")DIV2神经球和细胞悬浮液准备移植。(A,B)这些球体是从MtaptEGFP/+E 12.5新皮质前体获得,严重感染慢病毒混合物"pCAG_lacZ,Pgk1p_tTA,TREt_GOI"(A)和"Pgk1p_mCherry,Pgk1p_tTA,TREt_PLAP"(B),分别,每个LV在MOI |8,并保持在增殖介质中。(C) 细胞悬浮液是通过将"测试"和"控制"神经球(A、B)分离到单个细胞,并将其混合1:1而获得的。刻度条:200 μm (A,B) 和 100 μm (C)。请点击此处查看此图的较大版本。
至于(4),细胞注射到新生儿大脑的程序包括三个关键步骤。毛细管,放置在中寄生平面上,通过前皮质壁进入侧心室腔(图4A)。接下来,为了防止坏角的损伤,毛细管在水平平面内旋转30°,使尖端点以两面为内/胆碱(图4B)。最后,细胞悬浮液被微妙地喷射到侧心室,在那里它形成了一个容易分辨的浅蓝色"云"(图4C)。
图 4:用于细胞注射到新生儿大脑的三个步骤的原理图。(A)毛细管通过前皮质壁进入侧心室。然后,(B)它向中旋转,以防止坏石的显性损伤。最后(C),细胞悬浮液被轻轻地注入侧心室,形成浅蓝色云。请点击此处查看此图的较大版本。
至于(5),分析程序包括四个主要步骤。首先,根据MAX Z投影模式,移植的神经元富源场的光学共聚焦部分被拼合,从而生成RGB .tiff文件。在这里,作为一个例子,只有"绿色测试"神经元和"黄色控制"神经元,源自共移植前体,可以很容易地区分(应该注意,mCherry可能被用来标记"测试"神经元) (图5A)。然后,一个理想化的,骨架化的相机清晰版本的图片是由一个合适的图形软件(见步骤4.2.6) (图5B)由一个操作者盲目的红色通道生成。对于防止数据评估中出现任何无意偏差,红色通道的盲目性至关重要。接下来,单神经元剪影作为黑白图片和三个主要参数的值"退出点总数"(附件_points)、"端点总数"(端点)和"总点"输入到NeurphologyJ软件中。收集神经酸盐长度(中性石长度)(图 5C)最后,通过Excel软件计算、平均和统计计算每个神经元的次参数(图5D)。
图 5:移植大脑的形态分析代表性流程图。上排面板显示: (A) 一个 MAX z 投影 .tiff 图像的中皮质, 修复 10 天后工程细胞移植 (绿色 + Mtapt驱动, 神经元受限 EGFP; 红色 = mCherry, 构成标记 "控制" 细胞; 蓝色 |DAPI),绿色通道信号, 和 (B) 其骨架化电子相机清晰渲染.刻度条:50 μm。底部行包括: (C) 主要形态参数从神经骨架提取通过神经学J软件分析 (神经学长度为+li,附件_点作为 N出口和端点作为N端)和 (D) 辅助参数,根据它们计算。这个数字已由奇奥拉等人21日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此过程的特定方面/步骤至关重要,需要特别注意。首先,(a) 操作员必须经过充分的预训练,才能在符合 BSL-2 标准的实验室环境中安全地操作慢病毒。其次,(b)在混合"测试"和"控制"神经制剂之前,必须按所述仔细清洗两个相应的神经圈悬浮液,以防止由于不需要的慢病毒引起的任何延迟交叉感染。进行。第三,(c)移植细胞时,在瞄准心室腔时必须进行护理;在这方面,快速绿色示踪剂包含在细胞悬浮液是实质性的帮助。此外,(d) 为了防止食人,移植的小狗必须在完全从麻醉中恢复后才能重新移植给母亲(通常10分钟就足够了)。(e) 移植组织的冷冻切片应在60 μm进行;事实上,这种厚度同时允许容易的抗体渗透到组织,并限制来自伪性神经元碎片的信息丢失。最后,(f)为了防止数据评估中出现任何无意偏差,我们强调神经元骨架化必须由红色通道盲的操作员执行。
此处描述的协议是指 GOF 基因操作。或者,"测试"神经元可以通过对RNAi效应器的慢病毒编码来降低GOI功能。接下来,我们通常使用mCherry来标记"控制"神经细胞;然而,mCherry/"控制"和LacZ/"测试"方案可能明显倒置。最后,本文所述方案指宫内细胞注射;"测试"和"控制"神经元可以交替地被共同注入神经parenchima21。
尽管这种方法有其优点,但具有两个主要限制。虽然允许研究细胞自主基因控制的神经结构, 它不适用于环境控制它.此外,由于移植的神经元前体从皮质壁的心室方面迁移到出生后的最终层压位置(即在非生理时间范围内),最好采用这种方法进行建模迁移完成后的神经架构控制。
最后但并非最不重要的一点,应特别注意对结果的关键解释。特别是,如果调查的X基因受试者降低了"测试"神经元的形态复杂性,这可能不能具体反映其对神经元结构的真正影响。相反,这种现象可能是X过度表达引起的神经元损伤的非特定指数。为了解决这个问题,比较移植的局部密度,"测试"和"控制"神经元的局部密度可能是有益的,然后寻找"测试"总体的可能数值收缩,作为X引起的神经元痛苦的指数——这种收缩应该更多在移植大脑的进一步延迟分析后发音*。在这种情况下,降低 X 基因的抑制水平或移动到功能丧失设计可能会解决此问题。
我们的方法增加了用于研究体内神经元形态的基因控制(1,2,3,4,7,8) 的广泛技术。9,10,11,12.如导言,这些技术依靠各种特殊的基因操作,旨在干扰GOI表达水平,并便于从生物样本中提取形态信息。这些技术通常允许精确解剖这种控制;然而,它们不需要宝贵的实验技能和财政资源。在这方面,该方法提供了三个关键优势。它允许精确控制与转基因模型所特有的GOI表达水平相媲美;然而,在没有突变菌群维护费用的情况下。它不需要复杂的实验(外科)技能。它往往在分析数量相对有限的动物时,达到结果的统计意义。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢米恩·杜克·多为早日建立这一程序所作的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
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