Summary
Her presenterer vi en protokoll for menneskelig Dental stamceller fra cellulose isolasjon og overføring for å vurdere prion protein uttrykk under neuronal differensiering prosessen.
Abstract
Bioetiske knyttet til manipulering av embryonale stamceller har hindret fremskritt innen medisinsk forskning. Derfor er det svært viktig å få voksen stilk celler fra ulike vev som liggende under adipose, navlestreng, bone margtransplantasjon og blod. Blant mulige kilder er tannlegekontoret masse spesielt interessant fordi det er lett å få tak i bioetiske hensyn. Faktisk menneskelig Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) er en type voksne stamceller kjøpedyktig skille ut i neuronal-lignende celler og kan fås fra den tredje molar sunn pasienter (13-19 aldre). Spesielt ble på tannlegekontoret masse fjernet med en gravemaskin, skjær i små sektorer, behandlet med collagenase IV og kultivert i en bolle. For å indusere neuronal differensiering, ble hDPSCs stimulert med EGF/bFGF i 2 uker. Tidligere har vi vist at under av differensiering innholdet i mobilnettet prion Protein (PrPC) i hDPSCs økt. Cytofluorimetric analyse viste tidlig uttrykk PRPC som økte etter neuronal differensiering. Ablasjon PRPC ved siRNA PrP forhindret neuronal differensiering av EGF/bFGF. I dette papiret illustrerer vi at som vi forbedret isolasjon, separasjon og i vitro dyrkingsmetoder for hDPSCs med flere lett prosedyrer, mer effektiv cellen kloner ble innhentet og store utvidelsen av mesenchymal stamceller (MSCs) ble observert. Vi viser også hvordan hDPSCs, med metoder i protokollen, er en utmerket eksperimentell modell neuronal differensiering prosessen med MSCs og påfølgende cellulære og molekylære prosesser.
Introduction
Mesenchymal stamceller har vært isolert fra flere vev, inkludert beinmargen, navlestrengsblod, menneskelige tannlegekontoret masse, fettvev og blod,1,,2,,3,,4,,5 , 6. som rapportert av flere forfattere, hDPSCs Vis plast tilslutning, en typisk fibroblast-lignende morfologi. Disse representerer en svært heterogen befolkning med forskjellige kloner og forskjeller i proliferativ og unike7,8. hDPSCs uttrykke spesifikke indikatorer for mesenchymal stamceller (dvs. CD44, CD90, CD73, CD105, slag-1), de er negativt for noen blodkreft markører (som CD14 og CD19) og er i vitro multilineage differensiering9, 10,11.
Flere forfattere har vist at disse cellene er i stand til å skille ut Nevron-lignende celler ved hjelp av forskjellige protokoller, inkludert tillegg av NGF, bFGF, EGF i kombinasjon med bestemt media og kosttilskudd7,12. Også mange proteiner er involvert i neuronal differensiering prosessen, og blant disse flere aviser viser en relevante rolle og betydelige uttrykket mobilnettet prion protein (PrPC), både i embryonale og voksen stamceller13, 14. PrPC representerer et pleiotropic molekyl i stand til å utføre ulike funksjoner i cellene som kobber metabolisme, apoptose, og motstand mot oksidativt stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
I vår forrige papir23undersøkt vi rollen PrPC i hDPSCs neuronal differensiering prosessen. Faktisk hDPSCs express precociously PrPC og etter neuronal differensiering, var det mulig å observere en ytterligere økning. Andre forfattere hypotese en mulig rolle PRPC i neuronal differensiering prosesser av stamceller. Faktisk kjører PrPC differensiering av menneskelige embryonale stamceller i nerveceller, oligodendrocytes og astrocyttene24. Formålet med denne studien var å understreke metodikken for å få stamceller fra tannlegekontoret masse, dens differensiering prosess og rollen PrPC under neuronal differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tredje molarer brukes i studien ble fjernet fra pasienter (13-19 år) med noen tidligere historie med narkotika eller alkoholforbruk, alle røykfrie og riktig munnhygiene. På dagen for forklaring, avdeling Science odontologiske og Maxillofacial av "Sapienza" Universitetet i Roma, ble informert samtykke innhentet fra pasienter eller foreldre. Informert samtykke ble innhentet basert på Etiske Betraktninger og godkjenning av den etiske komiteen.
1. tann og tannlegekontoret masse utvinning
-
Utarbeidelse av passende medium for bevaring eller transport.
- Forberede Dulbeccos endret Eagles middels lav konsentrasjon av glukose (DMEM-L) med L-glutamin (494.5 mL).
- Legge til 5 mL av penicillin/streptomycin (1%) og 0,5 mL amfotericin (0,1%).
- Pakk den tredje molar fra pasienten, raskt skylle den med PBS, satt i en 15 mL reagensglasset med mediet og overføre den til laboratoriet i mindre enn 2 timer.
- Under biohazard hette, åpne tannen med kniv av koronale kutte pass parallelle og tangenten gjennom taket av cellulose kammeret.
- Forsiktig fjerne massen med en liten gravemaskin og plasser den i et reagensrør.
- Vask med PBS tre ganger og sentrifuge 2500 x g i 10 min på RT.
2. behandling av tannlegekontoret masse og stamcelleforskningen utgivelsen
- Fjerne nedbryting, resuspend pellet i Hanks løsning og plasserer den i en Petriskål. Inkuber 2 h på 37 ° C i 5% CO2.
-
Skriv inn IV collagenase løsning forberedelse.
- Forberede 0,8 mL av DMEM-L.
- Smelt 1 mg av type IV collagenase på 0,8 mL av DMEM-L og vortex i flere minutter.
- Legge til DMEM-L opptil 1 mL å ha en siste konsentrasjon 1 mg/mL.
- Filtrere løsningen med filtere 0.22 µM.
- Fjerne Hanks løsning med sentrifugering 2500 x g i 10 min på RT og del massen i små sektorer approximatively 1 mm har disponibel skalpell.
- Plasser masse skiver i en Petriskål og ruge med 1 mL av type IV collagenase i 15 min på 37 ° C i 5% CO2.
-
Middels kultur forberedelse (500 mL).
- Til 445 mL av DMEM-L med L-glutamin.
- Legge til 50 mL av Fetal bovin Serum (FBS) (10%).
- Legge til 5 mL av penicillin/streptomycin (1%).
- Sentrifuge prøven 2500 x g i 10 min på RT, fjerne nedbryting, resuspend pellets i medium (trinn 2.5) og kultur i T25 kolbe spesifikke for stamcelleforskningen på 37 ° C i 5% CO2.
3. stamcelleforskningen kultur og forplantning
- Hver dag sjekker kultur og, etter 3 dager for vekst, observere forskjellige kloner av tilhenger celler i flasken.
- Hver 3 dager endre kultur medium.
- Mellom 7 og 12 dager, når tilhenger cellene har nå samløpet, koble dem ved å behandle cellene med 1 mL av trypsin-EDTA i 3 minutter på 37 ° C eller forsiktig celle skraper.
- Legge 4 ml (forhold 1:5) kultur medium (trinn 2.5) å stoppe trypsin handling.
- Sentrifuge celle suspensjon for 6 min 259 x g, fjerne nedbryting og plasserer cellene i en T25 bolle overføres.
Merk: Hver 3 dager cellene nå samløpet. - Overføre cellene til 21 eller 28 dager (ca 6-8 passasjer) å unngå tilstedeværelsen av ikke-stammen som celler i kulturen.
- Koble cellene med 1 mL av trypsin-EDTA i 3 minutter på 37 ° C eller forsiktig skrape. Sentrifuge celle suspensjon for 6 min 259 x g.
- Fjerne nedbryting og test celler for cytofluorimetric analyse (trinn 6).
4. forbigående PrPC Silencing av siRNA
- Kultur hDPSCsin 6-vel plater (2 x 105 cellen/mL) med 2 mL kultur medium (trinn 2.5) for 24 timer.
-
Dagen etter, forberede siRNA PrP medium (400 µL).
- Et sterilt reagensrør, legge til 384 µL DMEM-L.
- Legge til 1 µL for hver siRNA PrP DMEM-L å ha en siste konsentrasjon av 5 nM (4 siRNA PrP ble brukt og bekreftet av leverandøren garantere en knockdown effektivitetsprosenten for ≥70).
- Legge til 12 µL av transfectionreagent DMEM-L.
- Virvle blandingen og Inkuber i 10 min på RT at dannelsen av transfection komplekser.
- Legge til 400 μL siRNA PrP medium hvert utvalg og ruge 6 h på 37 ° C.
- Uten forkaster siRNA PrP medium, legger du til 1,6 mL (forholdet mellom 1-5) kultur medium (trinn 2.5).
- Lar celler for 72 h på 37 ° C.
- Fjerne nedbryting og vask 3 ganger med 2 mL PBS på RT.
- Legg 2 mL neuronal kultur medium for 7 og/eller 14 dager (trinn 5.1).
- Endre neuronal kultur medium hver tredje dag.
Merk: Erstatte siRNA PrP løsning hver tid erstatte neuronal kultur medium. - På slutten av tiden, vask 3 ganger med 2 mL PBS på RT og teste neuronal overflaten antigener ved Western Blot analyse.
5. neuronal induksjon prosessen med hDPSCs
-
Neuronal kultur medium forberedelse (500 mL).
- Forberede 444.7 mL av basale media formulert neuronal celler.
- Legge til 50 mL av serum-free supplement brukes for å støtte den langsiktige levedyktigheten til embryonale og voksen nevrale stamceller (10%) medium.
- Legge til 200 µL av grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) (siste konsentrasjon 40 ng/mL) og 100 µL av Epidermal vekstfaktor (EGF) til medium (siste konsentrasjon 20 ng/mL).
- Legge til 5 mL av penicillin/streptomycin (1%) til medium.
- Kultur hDPSCs i 6-vel plater (2 x 105 cellen/mL) opp til 28 dager fra cellulose separasjon og stimulere dem med 2 mL neuronal kultur medium.
- Hver 3 dager forkaste nedbryting, vask 3 ganger med 2 mL PBS på RT og erstatte 2 mL neuronal kultur medium.
- Etter 7 og/eller 14 dager, kan du koble cellene med 1 mL av trypsin-EDTA i 3 minutter på 37 ° C eller forsiktig skraper.
- Legge 4 mL (forhold 1:5) kultur medium (trinn 2.5) å stoppe trypsin handling.
- Test for tilstedeværelsen av neuronal overflaten antigener (trinn 6) eller prion protein uttrykk (trinn 7) ved flyt cytometri analyse.
6. karakterisering av hDPSCs av Flow cytometri
- Velg mesenchymal stromal (MSC)-spesifikke eller neuronal overflaten antigener.
- Kultur hDPSCs i 6-vel plater (2 x 105 cellen/mL) med 2 mL kultur medium (trinn 2.5).
- Løsne hDPSCs på 28 dager fra tannlegekontoret masse separasjon eller etter 14 dager av neuronal kultur medium (trinn 5.1) med 1 mL av trypsin-EDTA i 3 minutter på 37 ° C eller forsiktig skrape.
- legge 4 ml (forhold 1:5) kultur medium (trinn 2.5) å stoppe trypsin handling og centrifugate 259 x g for 6 min på RT. vask en annen 2 ganger med 2 mL PBS på RT.
- Fastsette hDPSCs ubehandlet eller behandlet med 4% paraformaldehyde i PBS i 10 min på 4 ° C.
- Permeabilize hDPSCS med 0,1% (v/v) ikke-ioniske surfactant i PBS i ytterligere 10 minutter på RT.
- Utføre blokkering med 5% nonfat tørket melk i 1 mL av PBS 1t på RT.
- Vask 3 ganger med 1 mL av PBS og ruge cellene med anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-slag-1 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti β3-Tubulin (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 celler) og anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 celler) mAb 1t på RT.
- Vask cellene 3 ganger med 1 mL av PBS og ruge med anti-musen PE (1:50 / 5 x 105 celler) eller anti-kanin CY5 (1:50 / 5 x 105 celler) mAb ekstra 1t på RT.
- Bruke sekundære antistoffer for gating immunopositive cellene (anti-musen PE eller anti-kanin CY5 mAb) og analysere alle prøver med en Flow cytometer og få minst 20.000 hendelser.
7. evaluering av PrPC uttrykk i hDPSCs av Flow cytometri analyse
- Kultur hDPSCsin 6-vel plater (2 x 105 cellen/mL) med 2 mL kultur medium (trinn 2.5).
- Løsne hDPSCs 21 og 28 dager fra tannlegekontoret masse separasjon og etter 7 og/eller 14 dager med neuronal kultur medium (trinn 5.1) med 1 mL av trypsin-EDTA og stoppe handlingen trypsin som beskrevet i trinn 6.4. Fikse de med 4% paraformaldehyde i PBS i 10 min på 4 ° C.
- Permeabilize med 0,1% (v/v) ikke-ioniske surfactantin PBS i 10 min på rett fjerne nedbryting og flekken cellene med kanin anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 celler) mAb 1t på RT. Incubate med anti-kanin CY5 (1:50 / 5 x 105 celler) mAb for ytterligere 1 h på RT.
- Analysere alle prøver med en Flow cytometer og få minst 20.000 hendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolasjon og separasjon prosedyrene for hDPSCs fra tannlegekontoret masse, fra den tredje molar, er komplekse prosesser som små endringer kan føre et ødeleggende resultat. I dette papiret bruker vi protokollen med Arthur et al. 12 med flere forbedringer. En representant ordningen prosedyrer er vist i figur 1.
hDPSCs representerer en heterogen befolkning av celler med forskjellige kloner og forskjeller i proliferativ og unike7,8. Etter masse separasjon og såing av små fragmenter av papirmasse, observerte vi klynger av celler utvide på periferi. Figur 2 viser en liten klynge av celler på 1 dag (venstre panel), 4 dager (sentrale panel) og 7 dager (høyre panel) fra tannlegekontoret masse separasjon. Vanligvis vokse disse klyngene av cellene opp å nå samløpet ca mellom 7 og 12 dager.
Disse cellene, etter neuronal differensiering av EGF/bFGF, redusere deres vekst, og etter to uker var det mulig å observere betydelige endringer i celle morfologi og neurites resultatet (Figur 3).
I Figur 4viser vi at ubehandlet hDPSCs uttrykke multipotent mesenchymal stromal bestemt overflaten antigener som CD44, CD90, CD105, CD73 og slag-15,9. Ellers etter riktig neuronal induksjon stimuli uttrykke hDPSCs bestemt neuronal indikatorer som β3-Tubulin, NFH og GAP43. hDPSCs, ubehandlet eller behandlet med neuronal induksjon stimuli, uttrykke ikke blodkreft markører som CD14 og CD19.
I figur 5viser vi at hDPSCs express precociously PrPC (21 og 28 dager), og etter neuronal differensiering prosessen indusert av EGF/bFGF flere 7 og 14 dager, PrPC innhold økt (figur 5A). Siden flere forfattere rapporterte at PrPC er involvert i differensiering neuronal, vurdert vi rollen som endogene PrPC i denne prosessen. Derfor ble en liten forstyrrende RNA (siRNA PrP) brukt for å ablate PrPC og dets funksjon. Forbehandling med siRNA 72 h før EGF/bFGF stimuli i 14 dager forhindrer at uttrykket for neuronal B3-tubulin og NHF (figur 5B). Dataene viser at stanse PRPC ved siRNA påvirket neuronal differensiering prosessen med hDPSCs, indusert av EGF/bFGF etter 2 uker.
Figur 1 : Ordningen tannlegekontoret masse atskillelse fra den tredje molar. Tannen er åpnet med kniv av koronale kutte pass parallelle og tangenten gjennom taket av cellulose kammeret og masse var forsiktig fjernet under sterile forhold med en liten gravemaskin og plassert i et reagensrør. Massen, etter hank's løsning behandling, ble skåret i skiver og behandlet med collagenase IV i 15 min og overført i en T25 bolle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : hDPSCs morfologi på ulike dager fra tannlegekontoret masse separasjon av fase kontrast mikroskopet. Morfologi av hDPSCs fra tannlegekontoret masse på ulike dager (1, 4, 7) fra tannlegekontoret masse separasjon. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Neurite utvekst av hDPSCs av fase kontrast mikroskopet. Morfologi av hDPSCs fra dental masse ubehandlet eller behandlet med EGF/bFGF i 14 dager. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : hDPSCs karakterisering. Flow cytometri analyse av CD44, CD90, CD105, CD73, slag-1, CD14, CD19, β3-Tubulin, NFH og GAP43 uttrykk i hDPSCs ubehandlet eller behandlet med EGF/bFGF i 14 dager. Histogrammer representerer Logg fluorescens vs celle nummer, gated på celle befolkningen i et side scatter fremover scatter (SS/FS) histogrammet. Hvert panel ble sammenlignet med tilsvarende sekundære antistoffer som en negativ kontroll. En representant eksperiment blant 3 vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Rolle PRPC under neuronal differensiering av hDSPCs. (A) Cytofluorimetric analyse av PrPC uttrykk ubehandlet (21 og 28 dager fra tannlegekontoret masse separasjon) og etter ytterligere 7 og 14 dager med neuronal induksjon media EGF/bFGF. Hvert panel ble sammenlignet med tilsvarende IgG negative isotype kontrollen. En representant eksperiment blant 3 vises. (B) Western blot analyse av neuronal markører β3-Tubulin og NFH uttrykk (28 dager fra tannlegekontoret masse separasjon) og etter ytterligere 14 dager med neuronal induksjon media EGF/bFGF i tilstedeværelse eller fravær av siRNA PrP. Dette tallet 5 (A, B) er endret fra "Rolle Prion protein-EGFR multimolecular komplekset under neuronal differensiering av menneskelig dental masse-avledet stilk celler" 23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet fokuserte vi på metodikk for isolasjon og neuronal differensiering av hDPSCs; Videre har vurdert vi rollen PrPC i denne prosessen. Det er adskillige metoder å isolere og skille hDPSCs i Nevron-lignende celler og avgjørende skritt i prosessen. hDPSCs kan skille i flere linjene som chondroblasts, adipocytter, osteoblasts og neurons. I vår avis undersøkt vi virkningsmekanismer neuronal differensiering og tilstedeværelsen av PrPC. Som drøftet over, uttrykke disse celler typisk mesenchymal stromal-spesifikke overflaten antigener som CD44, CD90, CD105, CD73 og slag-110,25,26.
I protokollen, kan flere kritiske trinnene forårsake feil på separasjon prosedyren. Det første viktige steget er representert ved valg av pasienter27. I vår erfaring, fant vi at økende alder av givere (> 20) gradvis reduserer evne til spredning og differensiering av stamceller. I vårt forsøk brukte vi tredje molarer forbrukeravgift fra pasienter alderen 13-19 år gammel og med noen tidligere historie med narkotika eller alkoholforbruk, alle røykfrie og med riktig munnhygiene.
Andre kritiske trinn er representert ved valg av enzymet skille cellene fra cellulose vev, som kan representere de viktigste varme trinnet stamceller separasjon prosedyre. Faktisk, vi innså at en bruker av collagenase I og II, enzymer som kan være altfor aggressiv, kan skade cellene i masse vevet under separasjon prosessen. Derfor besluttet vi å bruke collagenase IV fordi denne typen collagenase som lavere tryptic aktivitet enn collagenase type I og II. Etter akkurat fremgangsmåten er det mulig å få stamceller i 90% av behandlet tennene.
Etter separasjon, er løsningen med hDPSCs kultivert i riktig flasker til 6° passasjen (approximatively 21 til 28 dager) å unngå tilstedeværelsen av ikke-stamceller i kulturen. På 28 dager, ble de testet for tilstedeværelsen av typiske mesenchymal antigener (som refererte ovenfor) og brukes for eksperimenter bare når de var positive. Faktisk, til tross for fremgangen som er gjort gjennom årene på hDPSCs, er det fortsatt viktig begrensninger representeres av den ekstreme heterogeniteten av befolkningen.
Som vist av flere forfattere, det er ulike celletyper befolkningen i dental cellulose og hittil har det ukjent hva er de beste fenotyper kjøpedyktig skille ut hver mesenchymal avstamning (chondroblasts, adipoblasts, osteoblasts eller nerveceller). For å unngå gjeldende begrensningene av vårt og andre prosedyrer, blir neste trinn å velge mobilnettet populasjoner med bestemte fenotyper ved hjelp av spesifikke monoklonale antistoffer.
I tidligere arbeid viste vi at PrPC uttrykkes fra hDPSCs. Det er faktisk mulig å observere en svak positivitet 21 dager og økte PrPC innhold på 28 dager. Videre har observert vi at under EGF/bFGF-mediert neuronal induksjon, PrPC innhold ble ytterligere økt. Videre har undersøkt vi rollen som endogene PrPC i neuronal induksjon prosessen med hDPSCs. Forbigående silencing PRPC forhindret differensiering prosessen av hDPSCs av EGF/bFGF23.
Vi finjustert og bedre metoder for isolasjon, separasjon og i vitro dyrking av hDPSCs med enkel og allsidig prosedyrer. Disse nyvinningene tillate mer effektiv cellen kloner og storskala utbygging av mesenchymal stamceller. Vi foreslår også at hDPSCs er en utmerket eksperimentell modell å studere cellulære og molekylære mekanismer av MSCs neuronal differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av "Fondazione Varrone" og Rieti University "Sabina Universitas" til Vincenzo Mattei.
Figur 5 (A, B) gjengitt med tillatelse fra utgiveren Taylor & Francis Ltd fra: rollen av Prion protein-EGFR multimolecular komplekset under neuronal differensiering av menneskelig dental masse-avledet stilk celler. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C. Santilli F. Piccoli L., Sorice M., Mattei V. Prion. 2018 4 mars. Taylor & Francis Ltd
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
- Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
- Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
- Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
- Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
- Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561 (2016).
- Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14 (2015).
- Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
- Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
- Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
- Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
- Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
- Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
- Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34 (2017).
- Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
- Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77 (2017).
- Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
- Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
- Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571 (2017).
- Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
- Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
- Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
- Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
- Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146 (2012).
