Summary
Здесь мы представляем протокол для человека зубной пульпы стволовые клетки изоляции и распространения для того, чтобы оценить прионных белков процессе нейрональных дифференциации.
Abstract
Биоэтические вопросы, связанные с манипуляции эмбриональных стволовых клеток затрудняли прогресс в области медицинских исследований. По этой причине очень важно для получения стволовых клеток из различных тканей, таких как жировая, пуповины, костного мозга и крови. Среди возможных источников пульпы зуба, особенно интересно, потому что это легко получить отношении биоэтических соображений. Действительно зубной пульпы стволовых клеток (hDPSCs) представляют собой тип взрослых стволовых клеток, способный к различать в нейрональных подобных клеток и могут быть получены из третьего моляра здоровых пациентов (13-19 лет). В частности пульпы зуба была удалена с помощью экскаватора, разрезать на мелкие кусочки, относились с коллагеназы IV и культивировали в колбу. Чтобы побудить нейрональных дифференциации, hDPSCs были стимулируется с EGF/bFGF за 2 недели. Ранее мы показали, что во время процесса дифференцировки содержание сотовой прионных белков (ОТРC) в hDPSCs увеличено. Cytofluorimetric анализ показал выражение ранних ОТРC , усилилось после нейрональных дифференциации процесса. Абляция ОТРC помощью siRNA PrP помешали нейрональных дифференциации, вызванных EGF/bFGF. В этой статье мы показываем, что как мы усиленной изоляции, разделения и в пробирке методы культивирования hDPSCs с несколько легко процедур, более эффективным клеток клоны были получены и крупномасштабного расширения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) было отмечено. Мы также показывают, как hDPSCs, полученных с помощью методов, подробно изложены в протоколе, являются отличным экспериментальной модели для изучения процесса нейрональных дифференциация MSCs и последующие процессы на клеточном и молекулярном.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки были изолированы от нескольких тканей, включая костный мозг, пуповинная кровь, человека пульпы зуба, жировой ткани и крови1,2,3,4,5 , 6. Как сообщили несколько авторов, hDPSCs Показать пластиковые присоединения, типичный фибробластоподобных морфологии. Они представляют собой весьма разнородных населения с различных клонов и различия в пролиферативных и отличительные способности7,,8. hDPSCs Экспресс определенных маркеров для мезенхимальных стволовых клеток (то есть, CD44, CD90, CD73, CD105, УВСР-1), они являются негативными для некоторых гемопоэтических маркеров (например CD14 и CD19) и способны в пробирке мультилинейного дифференциация9, 10,11.
Некоторые авторы показали, что эти клетки способны дифференцироваться в нейроноподобных клеток с использованием различных протоколов, которые включают добавление ФРН, bFGF, EGF в сочетании с конкретных средств массовой информации и дополнения7,12. Кроме того многие белки участвуют в процессе дифференциации нейронов, и среди них несколько документов Показать соответствующую роль и значительное проявление сотовой прионных белков (PrPC), оба в эмбриональных и взрослых стволовых клеток13, 14. PrPC представляет плейотропный молекулы, способные выполнять различные функции внутри клетки как медный метаболизм, апоптоз, и сопротивление Оксидативный стресс15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
В наших предыдущих бумаги23мы исследовали роль ОТРC в процессе hDPSCs нейронов дифференциации. В самом деле hDPSCs express благосклонностью PrPC и, после нейрональных дифференциации, было можно наблюдать увеличение дополнительных. Другие авторы предположили возможной роли ОТРC в процессах нейрональных дифференцировки стволовых клеток. Действительно ОТРC диски дифференциация человеческих эмбриональных стволовых клеток в нейронах, олигодендроциты и астроциты24. Целью данного исследования было подчеркнуть методологии для получения стволовых клеток из пульпы зуба, его процесс дифференциации и роль ОТРC во время нейрональных дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Третьи моляры, используемые в исследовании были иссечена от больных (13-19 лет) без предварительного история наркотиков или алкоголя, все номера для некурящих и с соответствующей гигиены полости рта. В день объяснение, на Департамент науки стоматологии и челюстно-лицевой, университета «Сапиенца» Рима осознанного согласия был получен от пациентов или родителей. Информированное согласие было получено на основе этических соображений и одобрения Комитета по этике.
1. зуб и пульпы зуба добычи
-
Подготовка соответствующего носителя для сохранения или транспорт.
- Подготовьте Дульбекко изменение Eagle средних низкой концентрации глюкозы (DMEM-L) с L-глютамин (494.5 мл).
- Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (1%) и 0,5 мл амфотерицин (0,1%).
- Извлечения третьего моляра от пациента, быстро промойте его с PBS, положить в 15 мл пробирку со средой и перенести его в лабораторию в менее чем 2 ч.
- Под капотом биологической откройте зуб с резцом, корональных резки проходят параллельно и касательной через крышу пульпарной камеры.
- Аккуратно удалите мякоть с небольшой экскаватор и поместите его в пробирку.
- Вымойте с PBS три раза и центрифуги на 2500 x g 10 мин на RT.
2. обработка пульпы зуба и выпуск стволовых клеток
- Удалить супернатант, Ресуспензируйте гранул в растворе Хэнка и поместите его в чашку Петри. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C в 5% CO2.
-
Тип IV коллагеназы раствора препарата.
- Подготовить 0,8 мл DMEM-L.
- Расплавьте 1 мг типа IV коллагеназы в 0,8 мл DMEM-L и вихревые за несколько минут.
- Добавить DMEM-L до 1 мл иметь окончательный концентрации 1 мг/мл.
- Фильтр решение с 0,22 мкм фильтром.
- Удалить решение Хэнка центрифугированием в 2500 x g 10 мин на RT и разделить пульпы на мелкие кусочки около 1 мм каждый из которых скальпель одноразовый.
- Поместите кусочки мякоти в чашку Петри и проинкубируйте с 1 мл раствора типа IV коллагеназы 15 минут при 37 ° C в 5% CO2.
-
Подготовка среднего культуры (500 мл).
- До 445 мл DMEM-л с L-глютамина.
- Добавьте 50 мл плода бычьим сывороточным (ФБС) (10%).
- Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (1%).
- Центрифугуйте образцы на 2500 x g 10 мин на RT, удалить супернатант, Ресуспензируйте гранулы в среде (шаг 2.5) и культуры в T25 колбу для стволовых клеток при 37 ° C в 5% CO2.
3. стволовых клеток культуры и распространения
- Каждый день проверить культуры и после 3 дней роста, наблюдать различные клоны адэрентных клеток внутри колбы.
- Каждые 3 дня изменить питательной среды.
- От 7 до 12 дней после того как адэрентных клеток достичь слияния, отсоедините их лечение клетки с 1 мл раствора трипсина ЭДТА на 3 мин при 37 ° C или аккуратно с помощью скребка ячейки.
- Добавьте 4 мл (соотношение 1:5) из питательной среды (шаг 2,5) прекратить действие трипсина.
- Центрифуга суспензию клеток для 6 мин на 259 x g, удалить супернатант и место клетки в колбе T25 для распространения.
Примечание: Каждые 3 дня клетки достичь слияния. - Распространять клетки до 21 или 28 дней (примерно 6-8 ходов) чтобы избежать присутствия не стволовых как клетки в культуре.
- Отсоедините клетки с 1 мл трипсина-ЭДТА за 3 мин при 37 ° C или мягко очищая. Центрифуга суспензию клеток для 6 мин на 259 x g.
- Удалить супернатант и испытание клеток для cytofluorimetric анализа (шаг 6).
4. Переходное PrPC глушителя на малых интерферирующих РНК
- Культура hDPSCsin 6-ну пластины (2 x 105 клеток/мл) с 2 мл питательной среды (шаг 2,5) за 24 ч.
-
На следующий день после, подготовить siRNA PrP среднего (400 мкл).
- В стерильные пробирки, 384 мкл DMEM-L.
- 1 мкл метки для каждого типа siRNA PrP DMEM-l иметь окончательный концентрации 5 Нм (4 siRNA ОТР были использованы и проверены поставщиком гарантировать нокдаун эффективность ≥70%).
- 12 мкл transfectionreagent в среде DMEM-L.
- Вихревой смеси и проинкубируйте втечение 10 мин на RT, чтобы позволить образование комплексов transfection.
- Добавить 400 мкл siRNA PrP среднего для каждой выборки и инкубировать в течение 6 ч при 37 ° C.
- Без отбрасывания малых интерферирующих РНК PrP среднего, добавьте 1,6 мл (отношение от 1 до 5) питательной среды (шаг 2.5).
- Оставьте клетки для 72 ч при 37 ° C.
- Удалить супернатант и мыть 3 раза с 2 мл PBS на RT.
- Добавьте 2 мл нейрональных питательной среды на 7 или 14 дней (шаг 5.1).
- Изменение нейрональных питательной среды каждые 3 дня.
Примечание: Замените siRNA PrP решение заменить каждый раз нейрональных питательной среды. - В конце времени мыть 3 раза с 2 мл PBS в RT и испытания для нейронов поверхностных антигенов на западной помарке анализа.
5. нейронной индукции процесс hDPSCs
-
Подготовка нейрональных питательной среды (500 мл).
- Подготовьте 444.7 мл базальной СМИ, сформулированы в нейрональных клеток.
- Средний добавьте 50 мл сыворотки бесплатные дополнения, используемые для поддержки долгосрочной жизнеспособности эмбрионов и взрослых нейрональных стволовых клеток (10%).
- Добавьте 200 мкл из основной фактор роста фибробластов (bFGF) (конечная концентрация 40 нг/мл) и 100 мкл эпидермального фактора роста (EGF) средний (конечная концентрация 20 нг/мл).
- Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (1%) в среду.
- Культура hDPSCs в 6-ну пластины (2 x 105 клеток/мл) до 28 дней от разделения пульпы и стимулировать их с 2 мл нейрональных питательной среды.
- Каждые 3 дней отбросить супернатанта, мыть 3 раза с 2 мл PBS на RT и заменить 2 мл нейрональных питательной среды.
- После 7 или 14 дней отсоедините клетки с 1 мл раствора трипсина ЭДТА на 3 мин при 37 ° C или аккуратно скребком.
- Добавьте 4 мл (соотношение 1:5) из питательной среды (шаг 2,5) прекратить действие трипсина.
- Проверить наличие нейрональных поверхностных антигенов (шаг 6) или прионных белков (шаг 7), анализ цитометрия потоков.
6. характеристика hDPSCs, поток цитометрии
- Выберите мезенхимальных стромальных (MSC)-конкретных или нейронов поверхностных антигенов.
- Культура hDPSCs в 6-ну пластины (2 x 105 клеток/мл) с 2 мл питательной среды (шаг 2.5).
- Отсоединение hDPSCs в 28 дней от разделения пульпы зуба или после 14 дней нейрональных питательной среды (шаг 5.1) с 1 мл раствора трипсина ЭДТА за 3 мин при 37 ° C или слегка скребок.
- Добавьте 4 мл (соотношение 1:5) из питательной среды (шаг 2,5) прекратить действие трипсина и центрифугировать на 259 x g 6 мин на RT. мыть еще 2 раза с 2 мл PBS на RT.
- Исправить hDPSCs необработанных или обработанных с параформальдегида 4% в PBS 10 мин при 4 ° C.
- Разрушения hDPSCS с 0,1% (v/v) неионных ПАВ в PBS для дополнительных 10 мин на RT.
- Выполнять блокирование с 5% обезжиренное сухое молоко в 1 мл PBS для 1 h на RT.
- Вымойте 3 раза с 1 мл раствора PBS и инкубировать клетки с анти CD105 (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клеток), анти CD44 (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клеток), анти STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 клеток), анти CD90 (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клеток), анти CD73 (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клетки), анти β3-тубулина (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клеток), анти NFH (1: 100 / 5 x 105 клеток) и анти GAP43 (1: 100 / 5 x 105 клеток) МАБ 1 h на RT.
- Вымыть клетки 3 раза с 1 мл раствора PBS и проинкубируйте с анти мыши PE (1:50 / 5 x 105 клеток) или анти кролик CY5 МАБ (1:50 / 5 x 105 клеток) для дополнительного 1 ч на RT.
- Используйте вторичные антитела для стробирования immunopositive клетки (анти мыши PE или анти кролик CY5 МАБ) и анализировать все образцы с проточный цитометр и приобрести по крайней мере 20 000 событий.
7. Оценка выражения ОТРC в hDPSCs, поток Cytometry анализ
- Культура hDPSCsin 6-ну пластины (2 x 105 клеток/мл) с 2 мл питательной среды (шаг 2.5).
- Отсоединение hDPSCs на 21 и 28 дней от пульпы зуба разделения и после 7 или 14 дней с нейронов питательной среды (шаг 5.1) с 1 мл раствора трипсина ЭДТА и остановить действие трипсина, как описано в пункте 6.4. Исправить образцы с параформальдегида 4% в PBS 10 мин при 4 ° C.
- Разрушения с 0,1% (v/v) неионных surfactantin PBS 10 мин на RT. удалить супернатант и запятнать клетки с кролик анти PrP МАБ EP1802Y (1:50 / 5 x 105 клеток) МАБ 1 h на RT. инкубировать с анти кролик CY5 (1:50 / 5 x 105 клеток) МАБ для Дополнительные 1 ч на RT.
- Анализировать все образцы с проточный цитометр и приобрести по крайней мере 20 000 событий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляции и разделение процедуры hDPSCs из пульпы зуба, полученные из третьего моляра, являются сложные процессы, в которых небольшие изменения могут вести губительный результат. В этой статье мы используем протокол Артур et al. 12 с несколькими улучшениями. Представитель схема процедур показана на рисунке 1.
hDPSCs представляет собой разнородные популяция клеток с различных клонов и различия в пролиферативных и отличительные способности7,,8. После разделения целлюлозы и заполнения крошечных фрагментов мякоти мы наблюдали кластеры клеток, расширение на периферии. Рисунок 2 показывает небольшое скопление клеток на 1 день (левая панель), 4 дней (Центральная панель) и 7 дней (правая панель) от разделения пульпы зуба. Как правило эти кластеры клеток растут достичь слияния приблизительно между 7 и 12 дней.
Эти клетки, после нейрональных дифференциации, вызванных EGF/bFGF, уменьшить их роста, и, после двух недель было можно наблюдать значительные изменения в ячейке морфологии и невритов нарост (рис. 3).
На рисунке 4мы покажем, что неочищенные hDPSCs Экспресс Multipotent с мезенхимальных стромальных конкретных поверхностных антигенов например, CD44, CD90, CD105, CD73 и СТРО-15,9. В противном случае после соответствующей нейронной индукции раздражители, hDPSCs Экспресс конкретные маркеров нейрональных β3-тубулина, NFH и GAP43. hDPSCs, необработанных или обработанных с нейронной индукции раздражителей, не выражают гемопоэтических маркеры например CD14 и CD19.
На рисунке 5мы показывают, что hDPSCs Экспресс благосклонностью PrPC (21 и 28 дней), и после процесса нейрональных дифференциация индуцированных EGF/bFGF для дополнительных 7 и 14 дней, ОТРC содержанием увеличение (рис. 5A). Поскольку некоторые авторы сообщили, что PrPC участвует в клеточной дифференциации нейронов, мы оценивали роль эндогенных PrPC в этот процесс. Таким образом малые интерферирующие РНК (siRNA PrP) был применен к удалять PrPC и его функции. Предварительной обработки с siRNA за 72 ч до EGF/bFGF стимулы для 14 дней предотвращает выражение маркеров нейрональных B3-тубулина и НФЗ (рис. 5B). Данные показывают, что глушителей ОТРC помощью siRNA затрагивает процесс нейрональных дифференциации hDPSCs, вызванных EGF/bFGF после 2 недель.
Рисунок 1 : Схема разделения пульпы зуба от третьего моляра. Зуб был открыт с помощью ножа для коронковой резки проходят параллельно и касательной через крышу пульпарной камеры и мякоть осторожно был удален в стерильных условиях с небольшой экскаватор и помещены в пробирке. Пульпы, после лечения решение Хэнка, было нарезать ломтиками и относиться с коллагеназы IV за 15 мин и распространяются в колбе T25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : морфология hDPSCs в разные дни от пульпы зуба разделения фазы контраста Микроскоп. Морфология hDPSCs от пульпы зуба в разные дни (1, 4, 7) от разделения пульпы зуба. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Neurite нарост hDPSCs фаза контраста Микроскоп. Морфология hDPSCs от зубной пульпы необработанных или обработанных с EGF/bFGF за 14 дней. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : hDPSCs характеристика. Cytometry анализ потока CD44 CD90, CD105, CD73, УВСР-1, CD14, CD19, β3-тубулина, NFH и GAP43 выражение в hDPSCs не лечить или лечить с EGF/bFGF за 14 дней. Гистограммы представляют флуоресценции против ячейки номер журнала, закрытом на популяции клеток гистограммы точечной (СС/FS) стороны точечной вперед. Каждая группа была по сравнению с соответствующим вторичные антитела как отрицательный контроль. Представитель эксперимент среди 3 показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Роль ОТРC во время нейрональных дифференциация hDSPCs. (A) Cytofluorimetric анализ ОТРC выражения лечить (21 и 28 дней от разделения пульпы зуба) и после дополнительных 7 и 14 дней с нейронной индукции СМИ EGF/bFGF. Каждая группа была по сравнению с соответствующего элемента управления IgG изотипа негативные. Представитель эксперимент среди 3 показано. (B) Западный анализ помаркой маркеров нейрональных β3-тубулина и NFH выражение (28 дней от разделения пульпы зуба) и после дополнительных 14 дней с СМИ EGF/bFGF нейронной индукции в наличие или отсутствие siRNA ОТР. Эта цифра 5 (A, B) был изменен с «Роль прионных белка EGFR мультимолекулярных комплекса во время нейрональных дифференциация зубной пульпы производные стволовых клеток человека» 23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе мы сосредоточились на методологии для изоляции и нейрональных дифференцировки hDPSCs; Кроме того мы оценивали роль ОТРC в этот процесс. Существует несколько способов изолировать и дифференцировать hDPSCs в нейроноподобных клеток и критические шаги во время процесса. hDPSCs возможность дифференцировать в несколько линий, таких как chondroblasts, адипоциты, остеобластов и нейронов. В нашей работе мы исследовали механизмы нейрональных дифференциации и присутствие ОТРC. Как указывалось выше, эти клетки выразить типичные мезенхимальных стромальных конкретных поверхностных антигенов например CD44, CD90, CD105, CD73 и СТРО-110,25,26.
В протоколе несколько критических шагов может вызвать сбой процедуры разделения. Первым важным шагом представляется выбор пациентов27. В нашем опыте, мы обнаружили, что повышение возраста доноров (> 20) постепенно уменьшает способность распространения и дифференцирования стволовых клеток. В наших экспериментах мы использовали третьих моляров, вырезан из пациентов в возрасте 13-19 лет и с без предварительного история наркотиков или алкоголя, все номера для некурящих и с соответствующей гигиены полости рта.
Второй важный шаг представлен выбор фермента для разделения клетки от ткани пульпы, который может представлять основные горячие шаг процедуры разделения стволовых клеток. В самом деле, мы поняли, что широкое использование коллагеназы I и II, ферменты, которые могут быть слишком агрессивным, могут повредить клетки присутствуют в ткани пульпы во время процесса разъединения. По этой причине мы решили использовать коллагеназы IV, потому что такого рода коллагеназы как нижняя tryptic активность, чем коллагеназы тип I и II. Именно в соответствии процедурой можно получить стволовые клетки в 90% лечение зубов.
После разделения раствор, содержащий hDPSCs культивировали в соответствующие колбы до 6° проход (приблизительно 21-28 дней) чтобы избежать присутствия стволовых клеток в культуре. На 28 дней они были проверены на наличие типичных мезенхимальные антигенов (как указано выше) и используется для экспериментов, только тогда, когда они были положительными. В самом деле, несмотря на прогресс, достигнутый на протяжении лет на hDPSCs, там по-прежнему важны ограничения представлены крайняя неоднородность населения.
Как показали несколько авторов, есть типы населения различных клеток в пульпы зуба и, на сегодняшний день, он имеет неизвестно, что такое лучшие фенотипы, способны дифференцироваться в каждой мезенхимальных линии (chondroblasts, adipoblasts, остеобласты или нейронов). Чтобы избежать текущих ограничений нашей и других процедур, следующим шагом будет выбрать клеточных популяций с конкретными фенотипов, с использованием специфических моноклональных антител.
В предыдущей работе мы показали, что PrPC выражается от hDPSCs. В самом деле это можно наблюдать слабое положительности в 21 дней и увеличение содержания ОТРC 28 дней. Кроме того мы отметили, что во время EGF/bFGF опосредованной нейронной индукции, ОТРC содержание далее увеличено. Кроме того мы исследовали роль эндогенных PrPC в нейронной индукции процесс hDPSCs. Переходных глушителей ОТРC предотвратить процесс дифференциации hDPSCs индуцированных EGF/bFGF23.
Мы доработаны и улучшены методы изоляции, разделения и в лабораторных условиях выращивания hDPSCs с простой и универсальный процедур. Эти нововведения позволяют получать более эффективным клоны клеток и широкомасштабное расширение мезенхимальных стволовых клеток. Кроме того мы предлагаем, что hDPSCs являются отличным Экспериментальная модель для изучения клеточном и молекулярном механизмы процесса MSCs нейрональных дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана «Fondazione Варроне» и Риети университета хаб «Sabina Universitas» для Vincenzo Mattei.
Рисунок 5 (A, B) перепечатана с разрешения издателя Тейлор & Фрэнсис Ltd от: роль китовая птичка белка EGFR мультимолекулярных комплекс в нейрональных дифференциация зубной пульпы производные стволовых клеток человека. V. Martellucci, S., Manganelli, Santacroce C., Santilli ф, Piccoli л, м. Sorice, Mattei V. китовая птичка. 4 марта 2018. Тейлор и Фрэнсис Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
- Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
- Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
- Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
- Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
- Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561 (2016).
- Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14 (2015).
- Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
- Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
- Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
- Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
- Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
- Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
- Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34 (2017).
- Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
- Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77 (2017).
- Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
- Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
- Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571 (2017).
- Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
- Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
- Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
- Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
- Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146 (2012).
