Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering, förökning och Prion proteinuttryck under Neuronal differentiering av mänskliga Tandpulpan stamceller

Published: March 18, 2019 doi: 10.3791/59282
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,2, 3, 3, 2, 2, 1,2
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för mänskliga Dental massa stamceller isolering och förökning för att utvärdera uttrycket prion protein under neuronal differentiering process.

Abstract

Bioetiska frågor som rör manipulering av embryonala stamceller har hindrat framsteg inom området för medicinsk forskning. Därför är det mycket viktigt att få stamceller från olika vävnader såsom adipose, navelsträng, benmärg och blod. Bland de möjliga källorna är tandpulpan särskilt intressant eftersom det är lätt att få när det gäller bioetiska överväganden. Faktiskt mänskliga Dental massa stamceller (hDPSCs) är en typ av adulta stamceller kan skilja i neuronala-liknande celler och kan erhållas från den tredje molar av friska patienter (13-19 åldrar). I synnerhet var tandpulpan bort med en grävmaskin, skuren i små skivor, behandlas med kollagenas IV och odlade i en kolv. För att framkalla den neuronal differentieringen, stimuleras hDPSCs med EGF/bFGF i 2 veckor. Vi har tidigare visat att under processen differentiering innehållet i cellulära prion Protein (PrPC) i hDPSCs ökade. Den cytofluorimetric analysen visade ett tidigt uttryck för PrPC som ökade efter neuronal differentiering processen. Ablation av PrPC av siRNA PrP hindrade neuronal differentiering induceras av EGF/bFGF. I detta papper illustrera vi att som vi förstärkt isolering, separation och in vitro- odlingsmetoder för hDPSCs med flera enkla procedurer, effektivare cell kloner var införskaffad och storskalig utbyggnad av de mesenkymala stamcellerna (MSC) observerades. Vi visar också hur de hDPSCs, erhålls med metoder som beskrivs i protokollet, är en utmärkt experimentell modell att studera processen neuronal differentiering av MSCs och efterföljande cellulära och molekylära processer.

Introduction

Bindvävsstamceller har isolerats från flera vävnader, inklusive benmärg, navelsträngsblod, mänskliga tandpulpan, fettvävnad och blod1,2,3,4,5 , 6. som rapporterats av flera författare, hDPSCs Visa plast följsamhet, en typisk fibroblast-morfologi. Dessa representerar en ytterst heterogen befolkning med distinkta kloner och skillnader i proliferativ och särskiljande kapacitet7,8. hDPSCs express specifika markörer för mesenkymala stamceller (dvs CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), de är negativa för vissa hematopoetiska markörer (såsom CD14 och CD19) och klarar av in vitro-multilinjärt differentiering9, 10,11.

Flera författare har visat att dessa celler kan differentieras till neuron-liknande celler använder olika protokoll, som inkluderar tillägg av NGF, bFGF, EGF i kombination med den särskilda medier och kosttillskott7,12. Också, många proteiner är involverade under neuronal differentiering och bland dessa flera papper Visa en relevant roll och betydande uttryck av cellulära prionproteinet PrP (C), både i embryonala och vuxna stamceller13, 14. PrPC representerar en pleiotropiska molekyl som kan utföra olika funktioner inuti cellerna som koppar metabolism, apoptos, och motstånd mot oxidativ stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

I vår tidigare papper23undersökte vi rollen av PrPC i processen hDPSCs neuronal differentiering. I själva verket hDPSCs express precociously PrPC och efter neuronal differentiering, det var möjligt att observera en ytterligare ökning. Andra författare hypotes om en möjlig roll för PrPC i neuronal differentiering processer av stamceller. Faktiskt, PrPC kör differentiering av mänskliga embryonala stamceller in i nervceller, oligodendrocyter och astrocyter24. Syftet med denna studie var att betona metoden för att erhålla stamceller från tandpulpan, sin differentiering process och rollen av PrPC under neuronal differentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tredje molarer som användes i studien var censurerade från patienter (13-19 år gamla) med ingen tidigare historia av drog eller alkoholkonsumtion, samtliga rökfria och med lämpliga munhygien. På dagen för förklaring, vid institutionen för naturvetenskap odontologi och Maxillofacial av ”Sapienza”-universitetet i Rom, erhölls informerat samtycke från patienten eller föräldrarna. Informerat samtycke erhölls utifrån etiska överväganden och godkännande av etikkommittén.

1. tand och Tandpulpan utvinning

  1. Beredning av lämpligt medium för bevarande eller transport.
    1. Förbereda Dulbeccos modifierade örnens medium låg koncentration av glukos (DMEM-L) med L-glutamin (494,5 mL).
    2. Tillsätt 5 mL av penicillin/streptomycin (1%) och 0,5 mL av amfotericin (0,1%).
  2. Extrahera den tredje molar från patienten snabbt skölja med PBS, sätta i en 15 mL provrör med mediet och överföra det till laboratoriet i mindre än 2 h.
  3. Under en biohazard huva, öppna tanden med en fräs genom koronalt skärande pass parallellt och tangens genom taket på massa avdelningen.
  4. Försiktigt ta bort fruktköttet med en liten grävmaskin och placera det i ett provrör.
  5. Tvätta med PBS tre gånger och centrifugera 2500 x g under 10 minuter vid RT.

2. behandling av Tandpulpan och Stem Cell Release

  1. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i Hanks lösning, placera den i en petriskål. Inkubera i 2 h vid 37 ° C i 5% CO2.
  2. Typ IV kollagenas lösning förberedelse.
    1. Förbereda 0,8 mL DMEM-L.
    2. Smält 1 mg av typ IV kollagenas i 0,8 mL DMEM-L och vortex under flera minuter.
    3. Lägg till DMEM-L till 1 mL ha en slutlig koncentration 1 mg/mL.
    4. Filtrera lösningen med 0,22 µM filter.
  3. Ta bort Hanks lösning genom centrifugering vid 2500 x g i 10 min på RT och dela fruktköttet i små skivor approximativt 1 mm var och en med en disponibel skalpell.
  4. Placera massa skivor i en petriskål och inkubera i 1 mL av typ IV kollagenas under 15 minuter vid 37 ° C i 5% CO2.
  5. Medelstora kultur beredning (500 mL).
    1. 445 ml DMEM-L med L-glutamin.
    2. Tillsätt 50 mL fetalt bovint serum (FBS) (10%).
    3. Tillsätt 5 mL av penicillin/streptomycin (1%).
  6. Centrifugera provet vid 2500 x g under 10 minuter vid RT, avlägsna supernatanten, återsuspendera pelleten i mediet (steg 2.5) och kultur i T25-kolv som är specifika för stamceller vid 37 ° C i 5% CO2.

3. Stem Cell kultur och förökning

  1. Varje dag kontrollerar kulturen och efter 3 dagar av tillväxt, iaktta olika kloner av vidhäftande celler inom kolven.
  2. Varje 3 dagar ändra odlingssubstratet.
  3. Mellan 7 och 12 dagar, när vidhäftande cellerna har reach sammanflödet, lossa dem genom att behandla cellerna med 1 mL av trypsin-EDTA under 3 minuter vid 37 ° C eller försiktigt med en cell skrapa.
  4. Tillsätt 4 ml (baserat på 1:5) av odlingssubstratet (steg 2.5) att stoppa trypsin åtgärd.
  5. Centrifugera cellsuspensionen i 6 min vid 259 x g, avlägsna supernatanten och placera cellerna i en T25 kolv att propagera.
    Obs: Varje 3 dagar cellerna nå sammanflödet.
  6. Sprida cellerna upp till 21 eller 28 dagar (cirka 6-8 passager) för att undvika förekomst av icke-stammen som celler i kulturen.
  7. Lossa cellerna med 1 mL av trypsin-EDTA under 3 minuter vid 37 ° C eller försiktigt skrapa. Centrifugera cellsuspensionen i 6 min vid 259 x g.
  8. Avlägsna supernatanten och testa cellerna för cytofluorimetric analys (steg 6).

4. övergående PrPC Silencing av siRNA

  1. Kultur hDPSCsin 6-väl plattorna (2 x 105 celler/mL) med 2 mL odlingsmedium (steg 2,5) för 24 h.
  2. Dagen efter, förbereda siRNA PrP medium (400 µL).
    1. Ett sterilt provrör, lägga till 384 µL DMEM-L.
    2. Tillsätt 1 µL för varje typ av siRNA PrP DMEM-l har en slutkoncentration på 5 nM (4 siRNA PrP användes och verifierade av leverantören garanterar en knockdown effektivitet ≥70%).
    3. Tillsätt 12 µL av transfectionreagent till DMEM-L.
    4. Vortex blandningen och inkubera i 10 min vid RT att tillåta bildandet av transfection komplex.
  3. Tillsätt 400 μL av siRNA PrP medium till varje prov och inkubera i 6 timmar vid 37 ° C.
  4. Utan att kasta siRNA PrP medium, tillsätt 1,6 mL (förhållandet mellan 1 till 5) odlingsmedium (steg 2.5).
  5. Lämna cellerna för 72 timmar vid 37 ° C.
  6. Avlägsna supernatanten och tvätta 3 gånger med 2 mL PBS på RT.
  7. Tillsätt 2 mL av neuronala odlingsmedium för 7 eller 14 dagar (steg 5.1).
  8. Ändra det neuronala odlingsmediet efter 3 dagar.
    Obs: Ersätta siRNA PrP lösning varje gång Ersätt neuronala odlingssubstratet.
  9. Slutet av tiden, tvätta 3 gånger med 2 mL PBS på RT och testa neuronala ytantigener genom Western Blot analys.

5. neuronala induktion processen för hDPSCs

  1. Neuronala odlingsmedium beredning (500 mL).
    1. Bereda 444,7 mL basala media framtagen till neuronala celler.
    2. Tillsätt 50 mL serum-gratis tillägg som används för att stödja den långsiktiga livskraften hos embryonala och vuxen neuronala stamceller (10%) till medium.
    3. Tillsätt 200 µL av basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (slutlig koncentration 40 ng/mL) och 100 µL av Epidermal Growth Factor (EGF) till medium (slutlig koncentration 20 ng/mL).
    4. Tillsätt 5 mL av penicillin/streptomycin (1%) till medium.
  2. Kultur hDPSCs i 6-väl tallrikar (2 x 105 celler/mL) upp till 28 dagar från massa separation och stimulera dem med 2 mL neuronala odlingsmedium.
  3. Varje 3 dagar avlägsna supernatanten, tvätta 3 gånger med 2 mL PBS på RT och ersätta 2 mL av neuronala odlingssubstratet.
  4. Efter 7 eller 14 dagar, lossa cellerna med 1 mL av trypsin-EDTA under 3 minuter vid 37 ° C eller försiktigt med en skrapa.
  5. Tillsätt 4 mL (baserat på 1:5) odlingsmedium (steg 2.5) att stoppa trypsin åtgärd.
  6. Test för förekomst av neuronala ytantigener (steg 6) eller prion proteinuttryck (steg 7) av flödescytometri flödesanalys.

6. karakterisering av hDPSCs av Flow flödescytometri

  1. Välj mesenkymala stromaceller (MSC)-specifika eller neuronala ytantigener.
  2. Kultur hDPSCs i 6-väl plattor (2 x 105 celler/mL) med 2 mL odlingsmedium (steg 2.5).
  3. Lossa hDPSCs på 28 dagar från tandpulpan separation eller efter 14 dagar av neuronala odlingsmedium (steg 5.1) med 1 mL av trypsin-EDTA under 3 minuter vid 37 ° C eller försiktigt skrapa.
  4. Tillsätt 4 ml (baserat på 1:5) odlingsmedium (steg 2.5) att stoppa trypsin åtgärder och centrifugate på 259 x g i 6 min på RT. tvätta en annan 2 gånger med 2 mL PBS på RT.
  5. Fixa den obehandlade eller behandlade hDPSCs med 4% paraformaldehyd i PBS under 10 minuter vid 4 ° C.
  6. Permeabilize hDPSCS med 0,1% (v/v) icke-jonisk tensid i PBS för ytterligare 10 min vid RT.
  7. Utföra blockering med 5% fettfri torrmjölk i 1 mL PBS för 1 h på RT.
  8. Tvätta 3 gånger med 1 mL PBS och inkubera cellerna med anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti β3-Tubulin (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 celler) och anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 celler) mAb för 1 h på RT.
  9. Tvätta cellerna 3 gånger med 1 mL PBS och inkubera med antimus PE (1:50 / 5 x 105 celler) eller anti-kanin CY5 (1:50 / 5 x 105 celler) mAb för ytterligare 1 h på RT.
  10. Använd de sekundära antikropparna för gating immunopositive celler (antimus PE eller anti-kanin CY5 mAb) och analysera alla prover med en flödescytometer och förvärva minst 20.000 evenemang.

7. utvärdering av PrPC uttrycket i hDPSCs av Flow flödescytometri analys

  1. Kultur hDPSCsin 6-väl plattorna (2 x 105 celler/mL) med 2 mL odlingsmedium (steg 2.5).
  2. Lossa hDPSCs på 21 och 28 dagar från tandpulpan separation och efter 7 eller 14 dagar med neuronala odlingsmedium (steg 5.1) med 1 mL av trypsin-EDTA och stoppa den trypsin åtgärden som beskrivs i steg 6,4. Fixa exemplaren med 4% paraformaldehyd i PBS under 10 minuter vid 4 ° C.
  3. Permeabilize med 0,1% (v/v) icke-joniskt surfactantin PBS i 10 min på RT. ta bort supernatanten och färga cellerna med kanin anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 celler) mAb för 1 h på RT. Inkubera med anti-kanin CY5 (1:50 / 5 x 105 celler) mAb för ytterligare 1 h på RT.
  4. Analysera alla prover med en flödescytometer och förvärva minst 20.000 evenemang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering och separation förfarandena av hDPSCs från tandpulpan, erhålls från den tredje molar, är komplexa processer där små förändringar kan leda ett förödande resultat. I detta papper använder vi protokollet av Arthur et al. 12 med flera förbättringar. Ett representativt system av procedurer visas i figur 1.

hDPSCs representerar en heterogen population av celler med olika kloner och skillnader i proliferativ och särskiljande kapacitet7,8. Efter massa separation och sådd av små fragment av massa, observerat vi kluster av celler som expanderar i periferin. Figur 2 visar ett litet kluster av celler på 1 dag (till vänster), 4 (central panel) och 7 dagar (höger panel) från tandpulpan separation. Generellt, dessa kluster av celler växer upp till sammanflödet ungefärligt mellan 7 och 12 dagar.

Dessa celler, efter neuronal differentiering induceras av EGF/bFGF, minska deras tillväxt och efter två veckor var det möjligt att observera betydande förändringar i cell morfologi och neuriter utväxten (figur 3).

I figur 4visar vi att obehandlade hDPSCs express Multipotenta mesenkymala stromaceller specifika ytantigener såsom CD44, CD90, CD105, CD73 och STRO-15,9. Annars efter lämpliga neuronala induktion stimuli uttrycka hDPSCs särskilda neuronala markörer såsom β3-Tubulin, NFH och GAP43. hDPSCs, obehandlade eller behandlade med neuronala induktion stimuli, uttrycker inte hematopoetiska markörer såsom CD14 och CD19.

I figur 5visar vi att hDPSCs express precociously PrPC (21 och 28 dagar) och, efter neuronal differentiering process induceras av EGF/bFGF för ytterligare 7-14 dagar, PrPC innehåll ökat (figur 5A). Eftersom flera författare rapporterat att PrPC är inblandade i den cellulära neuronal differentieringen, utvärderade vi rollen av endogena PrPC i denna process. Därför tillämpades en liten störande RNA (siRNA PrP) för att ablatera PrPC och dess funktion. Förbehandling med siRNA för 72 h innan EGF/bFGF stimuli för 14 dagar förhindrar uttrycket av neuronala markörer B3-tubulin och NHF (figur 5B). Data visar att tystande av PrPC av siRNA påverkas processen neuronal differentiering av hDPSCs, inducerad av EGF/bFGF efter 2 veckor.

Figure 1
Figur 1 : Systemet av tandpulpan separation från den tredje molar. Tanden har öppnats med en fräs av koronalt skärande pass parallellt och tangens genom taket på massa avdelningen och massan var försiktigt bort under sterila förhållanden med en liten grävmaskin och placerade i ett provrör. Massan, efter hank's lösning behandling, var skuren i skivor och behandlade med kollagenas IV för 15 min och sprids i en T25 kolv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : hDPSCs morfologi på olika dagar från tandpulpan separation av fas kontrast mikroskopet. Morfologi av hDPSCs från tandpulpan på olika dagar (1, 4, 7) från tandpulpan separation. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Neurite utväxt av hDPSCs av fas kontrast mikroskopet. Morfologi av hDPSCs från dental massa obehandlade eller behandlade med EGF/bFGF i 14 dagar. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. 

Figure 4
Figur 4 : hDPSCs karakterisering. Flödesanalys för flödescytometri av CD44, CD90, CD105, CD73, STRO-1, CD14, CD19, β3-Tubulin, NFH och GAP43 uttryck i hDPSCs obehandlade eller behandlade med EGF/bFGF för 14 dagar. Histogram representerar log fluorescens vs mobilnummer, gated cell befolkningen i en side scatter/framåt scatter (SS/FS) histogram. Varje panel jämfördes med motsvarande sekundära antikropparna som en negativ kontroll. Ett representativt experiment bland 3 visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Rollen av PrPC under neuronal differentiering av hDSPCs. (A) Cytofluorimetric analys av PrPC uttryck obehandlad (21 och 28 dagar från tandpulpan separation) och efter ytterligare 7-14 dagar med neuronala induktion media EGF/bFGF. Varje panel jämfördes med motsvarande IgG negativa isotypen kontroll. Ett representativt experiment bland 3 visas. (B) Western blot analys av neuronala markörer β3-Tubulin och NFH uttryck (28 dagar från tandpulpan separation) och efter ytterligare 14 dagar med neuronala induktion media EGF/bFGF på närvaron eller frånvaron av siRNA PrP. Denna figur 5 (A, B) har ändrats från ”roll Prion protein-EGFR multimolecular komplexet under neuronal differentiering av mänskliga dental massa-derived stamceller” 23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete fokuserade vi på metodik för isolering och neuronal differentiering av hDPSCs; Dessutom utvärderade vi rollen av PrPC i denna process. I området i närheten finns det flera metoder att isolera och differentiera hDPSCs i neuron-liknande celler och kritiska steg under processen. hDPSCs kan skilja i flera härstamningar som chondroblasts, adipocyter, osteoblaster och nervceller. I våra papper undersökte vi mekanismerna för neuronal differentiering och förekomsten av PrPC. Som diskuterats ovan, uttrycker dessa celler typisk mesenkymala stromaceller-specifika ytantigener såsom CD44, CD90, CD105, CD73 och STRO-110,25,26.

I protokollet, kan flera kritiska steg orsaka fel i avskiljandetillvägagångssättet. Ett första viktigt steg representeras av valet av patienter27. Vår erfarenhet, Vi hittade det ökande åldern av givare (> 20) gradvis minskar förmåga proliferation och differentiering av stamceller. I vårt experiment använde vi tredje molarer censurerade från patienter i åldern 13-19 år gamla, med ingen tidigare historia av drog eller alkoholkonsumtion, samtliga rökfria och med lämpliga munhygien.

Den andra kritiska steget representeras av valet av enzymet att separera celler från massa vävnad, som kunde representera det huvudsakliga hot steget av stamceller avskiljandetillvägagångssättet. I själva verket insåg vi att en bred användning av kollagenas I och II, enzymer som kan vara alltför aggressiv, kan skada cellerna i massa vävnaden under separationsprocessen. Därför beslutade vi att använda kollagenas IV eftersom denna typ av kollagenas som lägre tryptic aktivitet än kollagenas typ I och II. Efter exakt förfarandet är det möjligt att få stamceller i 90% av de behandlade tänderna.

Efter avskiljandet, är lösningen innehållande hDPSCs odlade i lämpliga behållare tills 6° passagen (approximativt 21-28 dagar) att undvika förekomsten av icke-stamceller i kulturen. 28 dagar, de testas för närvaro av typiska mesenkymala antigener (som det hänvisas till ovan) och används i djurförsök endast när de var positiva. I själva verket, trots de framsteg som gjorts under åren på hDPSCs, finns det fortfarande viktiga begränsningar representeras av de extrema heterogena befolkningen.

Som framgår av flera författare, det finns olika celltyper för befolkningen i tandpulpan och, hittills har det okända som vad är de bästa fenotyperna kunna differentieras till varje mesenkymala härstamning (chondroblasts, adipoblasts, osteoblaster eller nervceller). För att undvika bristerna i vårt och andra förfaranden, blir nästa steg att välja cellulära populationer med specifika fenotyper med specifika monoklonala antikroppar.

I tidigare arbete visade vi att PrPC uttrycks från hDPSCs. I själva verket är det möjligt att observera en svag positivitet på 21 dagar och en ökning av PrPC innehåll på 28 dagar. Dessutom observerade vi att under EGF/bFGF-medierad neuronala induktion, PrPC innehåll höjdes ytterligare. Dessutom undersökte vi rollen av endogena PrPC i neuronala induktion av hDPSCs. Den övergående tystande av PrPC hindrade processen differentiering av hDPSCs induceras av EGF/bFGF23.

Vi finjusteras och förbättrade metoder för isolering, separation och in vitro-odling av hDPSCs med enkla och mångsidiga förfaranden. Dessa innovationer tillåter att få effektivare cell kloner och storskalig utbyggnad av mesenkymala stamceller. Vi föreslår också, att hDPSCs är en utmärkt experimentell modell att studera cellulära och molekylära mekanismer av MSCs neuronal differentiering process.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av ”Fondazione Varrone” och Rieti universitet Hub ”Sabina Universitas” till Vincenzo Mattei.

Figur 5 (A, B) omtryckt med tillåtelse av utgivaren Taylor & Francis Ltd från: rollen av Prion protein-EGFR multimolecular komplexet under neuronal differentiering av mänskliga dental massa-derived stamceller. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M. Mattei V. Prion. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B solution Sigma-Aldrich A2942 It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulin Cell Signaling Technology  #4466 One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105  BD Biosciences 611314 Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44 Millipore CBL154-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73  Cell Signaling Technology  13160 CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90 Millipore CBL415-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43  Cell Signaling Technology  #8945 Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE  Abcam ab7003 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH  Cell Signaling Technology  #2836 Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y  Abcam ab52604 Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5  Abcam ab6564 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1 Millipore MAB4315-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTS Gibco by life technologies A14867-01 B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer  BD Biosciences AC6531180187 Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software  BD Biosciences Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGF PeproThec, DBA 100-18B basic Fibroblast Growth Factor 
Centrifuge CL30R Termo fisher Scientific 11210908 it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541 Termo fisher Scientific 317527-185 it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV  Life Technologies 17104019 Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel  Swann-Morton 501 It is use to cut tissues
DMEM-L Euroclone ECM0060L Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGF PeproThec, DBA AF-100-15 Epidermal Growth Factor 
Fetal Bovine Serum Gibco by life technologies 10270-106 FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter Sarstedt 831,823,101 it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNP Qiagen GS5621 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1x Gibco by life technologies 240200083 The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent  Qiagen 301705 HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A  Gibco by life technologies 10888022 Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons 
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin  Euroclone ECB3001D  It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS) Euroclone ECB4004LX10  PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,F Sarstedt 833,920,300 It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap Sarstedt 833,910,302 Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100  Sigma-Aldrich 9002-93-1 Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA  Euroclone ECB3052D  Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
Tube Sarstedt 62,554,502 Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 Compact Steril ST-003009000 Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope Zeiss 3849000962 ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561 (2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14 (2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34 (2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77 (2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571 (2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146 (2012).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 145 tandpulpan vuxna stamceller Bindvävsstamceller differentiering process prionproteinet prioner.
Isolering, förökning och Prion proteinuttryck under Neuronal differentiering av mänskliga Tandpulpan stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martellucci, S., Santacroce, C.,… More

Martellucci, S., Santacroce, C., Manganelli, V., Santilli, F., Piccoli, L., Cassetta, M., Misasi, R., Sorice, M., Mattei, V. Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e59282, doi:10.3791/59282 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter