Summary
Здесь мы представляем протокол производить кандидат оральная вакцина против диабета типа 1 в съедобных растений.
Abstract
Завод молекулярных земледелие является использование растений для производства молекулы интерес. В этой перспективе растения могут использоваться как биореакторов для последующей очистки конечного продукта и производства и прямых перорального гетерологичных белков при использовании видов съедобных растений. В этой работе мы представляем развития кандидата оральная вакцина против диабета 1 типа (T1D) в системах съедобных растений с использованием деконструкции растений на основе вирус рекомбинатной технологии дна, поставляется с вакуумной инфильтрации. Наши результаты показывают, что красная свекла является подходящей принимающей для переходных выражение человека производные аутоантиген, связанные с T1D, считается перспективным кандидатом как T1D вакцина. Листья, производства аутоантиген были тщательно характерны для их сопротивление желудочного пищеварения, наличие остаточного заряда бактерий и их вторичного метаболизма профиля, давая обзор процесса производства для потенциального использования растений для прямого перорального гетерологичных белка. Наш анализ показал почти полной деградации лиофилизированной кандидат пероральной вакциной после имитации желудочного пищеварения, предполагая, что стратегию инкапсуляции в производстве вакцины растительного ГАД не требуется.
Introduction
После революции молекулярной биологии растений в 1980-х систем на базе завода для производства биофармацевтических препаратов может рассматриваться как альтернатива традиционным системам на основе клеток микробов и млекопитающих1. Растения отображать несколько преимуществ перед традиционными платформами, с масштабируемости, эффективности и безопасности, будучи наиболее релевантные2. Рекомбинантных продукта может быть очищенной от преобразованного растительной ткани и затем управлением, либо парентерально или устно и, Кроме того, преобразованные съедобных растений может использоваться непосредственно для перорального. Пероральном одновременно содействует слизистых оболочек и системного иммунитета, и это устраняет необходимость иглы и специализированного медицинского персонала. Кроме того перорального устраняет сложной обработке, который обычно приходится 80% от стоимости всего производство рекомбинантных белков3. Все эти преимущества могут быть переведены в экономии средств производства, поставок и труда, снижения расходов по каждой дозы, что делает препарат доступным для большинства мирового населения.
Несколько стратегий, как стабильная трансформации и переходных выражение, были разработаны для производства рекомбинантных белков в растениях. Среди них высокодоходные деконструкции завод на базе вирус выражение системы (например, magnICON) обеспечивает превосходную производительность ведущих высокие урожаи рекомбинантных белков в относительно короткие сроки4. Многие примеры переходных выражения с использованием системы на основе вирус выражение завод в растения Nicotiana benthamiana сообщается, будучи принимающей золотой стандарт производства. Однако эта модель завод не рассматривается как съедобных видов алкалоидов и других токсичных метаболитов, которые накапливаются в его листьях.
В этой работе, мы описываем сравнение между двумя системами съедобных растений, красная свекла (бета vulgaris cv Мулен Руж) и шпинат (Spinacea oleracea cv Industria), для выражения два кандидата форм 65 кДа изоформы глутаминовой кислоты Декарбоксилаза (GAD65), проведенного на заводе на базе вирус векторы5. GAD65 основных аутоантиген, связанные с диабетом 1 типа (T1D) и это в настоящее время под следствием в человека клинические испытания, чтобы предотвратить или отсрочить T1D, вызывая терпимости6. Производство GAD65 в растения широко учился в модель видов растений Nicotiana tabacum и н. benthamiana4,5,6,7. Здесь мы описывают использование видов съедобных растений для производства молекулы в тканях, которые могут быть предназначены для прямой доставки устные. С технической точки зрения, мы изучали и выбрали системы для agroinfiltration растений и съедобных растений платформы GAD65 производства путем оценки различных параметров: рекомбинантных белков уровнях, остаточная микробной заряд на заводе ткани, предназначенные для перорального, сопротивление GAD65 желудочного пищеварения и биоэквивалентности трансформированных растений с дикого типа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. красный выращивания свеклы и шпинатом
- Расти красной свеклы (B. vulgaris cv Мулен Руж) и шпината (S. oleracea cv Industria) растений в камере роста, используя 150 µE интенсивности света, относительная влажность 65%, 12 h свет/темно цикла в 23/21 ° C, соответственно.
- После прорастания семян Удобряйте растения дважды в неделю раствором 1 г/Л коммерчески доступные удобрения (Таблица материалов). Для agroinfiltration использования пяти недельных шпинат и 6 week-old свекла установок.
2. Переходное выражение через деконструкции завод вирус-технологии
- Строительство завода векторов выражения
- Представления векторов - 5' модуль (pICH20111), 3' модули (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut и pICH7410.eGFP), подготовленный как описано в1,2,7и интеграза модуля (pICH14011)- в Agrobacterium tumefaciens GV3101 штамма с использованием стандартных методов. Растут на LB среде, содержащей 50 мкг/мл рифампицин и соответствующий вектор конкретные антибиотики (50 мкг/мл carbenicillin для pICH20111, pICH14011 и pICH7410.eGFP), 50 мкг/мл канамицин для pICH31070 за 2 дня на 28 ° C.
- Экран колоний колонии PCR, используя следующие конкретные Праймеры для каждого вектора: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3 "и 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' модули pICH31070.GAD65mut и pICH31070.∆87G65mut, с отжига Температура 55 ° C и удлинение время 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' и 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' для третьего 3' модуль pICH7410.eGFP, отжига Температура 53 ° C и удлинение время 30 сек, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' и 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' для 5' модуля, с отжига Температура 53 ° C и удлинения времени 20 s и 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3 "и 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' для модуля интеграза отжига температура 57 ° C и удлинение время 45 s.
- Осуществлять реакции PCR в общем объеме 20 мкл, используя следующие конкретные реакции цикла: первоначальный денатурации 5 мин при температуре 95 ° C, 35 циклов 30 сек при 95 ° C, 30 s при отжиге температуре и удлинение шаг в 72 ° C (отжига температура и удлинение времени ре, специфические для каждой пары праймера) и удлинение окончательный шаг 7 мин при 72 ° C.
- Шприц agroinfiltration
- Прививать три A. tumefaciens трансформантов в 50 мл LB средних содержащие 50 мкг/мл рифампицин и следующие соответствующие антибиотики вектор конкретных: 50 мкг/мл carbenicillin для A. tumefaciens преобразована с pICH20111, pICH14011 или pICH7410.eGFP или 50 мкг/мл канамицин для A. tumefaciens преобразована с pICH31070. Расти путем встряхивания в ночь на 28 ° C.
- Пелле ночи бактериальных культур центрифугированием на 4500 x g 20 мин и Ресуспензируйте их в 100 мл (или два тома первоначальных бактериальной культуры) инфильтрации буфер, содержащий 10 мм 4-morpholineethanesulfonic кислота (MES; рН 5,5) и 10 мм MgSO4, без учета ОД600. Инкубируйте суспензий при комнатной температуре (RT) за 3 ч.
- Смесь равных объемов бактериальных суспензий, содержащий один из трех модулей, GAD65mut, ∆87GAD65mut или eGFP 3' модуль, с 5' модуль и модуль интегразы. Израсходовать подвеска для проникновения шприц красных листьев свеклы и шпинат.
- Место 5 мл суспензии в шприц без иглы. Прижмите кончик шприца против нижней части листьев шпината и красная свекла установок и тем временем применять нежные противодавления на другую сторону листа.
- Проникнуть в первые три полностью расширенной листья, начиная от вершины для каждого растения. Метка agroinfiltrated листья с тегом бумаги на стебле листья. Возвращение растения в камере роста при стандартных условиях.
Примечание: По соображениям охраны здоровья и безопасности, носите защитные очки и перчатки во время процесса инфильтрации. - Сбор agroinfiltrated листья от 4 до 14 дней после заражения (dpi) и заморозить их в жидком азоте. Магазин тканей растений-80 ° c.
- Вакуумный agroinfiltration
- Растут отдельно три A. tumefaciens трансформантов в 50 мл LB среде, содержащей 50 мкг/мл рифампицин и соответствующий вектор конкретного антибиотика путем встряхивания в ночь на 28 ° C.
- Пелле ночи бактериальных культур центрифугированием на 4500 x g 20 мин Ресуспензируйте гранулы в 1 Л инфильтрации буфера ОД600 0,35 и инкубировать суспензий в РТ за 3 ч.
- Добавьте 0,01% v/v моющего средства (Полисорбат 20) для каждого подвеска. Смесь равных объемов бактериальных суспензий, содержащий один из трех модулей, GAD65mut, ∆87GAD65mut или eGFP 3' модуль, с 5' модуль и модуль интегразы.
- Вставьте один завод (6 week-old свекла растений, см. раздел 1) в держатель. Инвертируйте держателем и наложить на стакан, содержащие инфильтрации баня (2 Л), чтобы погрузить листья в инфильтрации подвеска.
Примечание: Убедитесь, что все листья полностью погружают в бактериальных подвеска. Поднимите уровень с добавлением дополнительных инфильтрации подвеска, если требуется. - Передача инфильтрации Ванна с погруженной завод в палату инфильтрации и закройте его. Включите вакуумный насос и открыть клапан вакуумного всасывания на проникновение камеры.
- После того, как давление в камере инфильтрации сократилось до 90 мбар, держите пылесос на 3 мин релиз вакуума для 45 s. После проникновения палата вернулся в атмосферном давлении, открыть камеру и удалить проникли растение от бактериальных бани.
- Возвращение растения в камере роста при стандартных условиях.
- Собирают листья agroinfiltrated на максимальное выражение ДОИ, в зависимости от рекомбинантных белков и заморозить их в жидком азоте. Магазин тканей растений-80 ° c.
3. Рекомбинантный белок анализ выражения
- Общая растворимого белка (TSP) добыча
- Растереть шприц или вакуум проникли красной свеклы и шпинат листья, собранные в шаги 2.2.6 и 2.3.8, для мелкого порошка в жидком азоте, используя ступку и пестик. Передача порошка в 15 мл пластиковых трубок и хранить материал в-80 ° C.
- Мкл 900 извлечения буфера (50 мм натрия фосфат рН 8,0, метабисульфит натрия 20 мм) до 300 мг порошка листьев.
Примечание: Выбранный соотношение вес ткани растений (мг) объем буфера (мкл) составляет 1:3. - Гомогенизации смеси, vortexing за 1 мин, а затем центрифуги на 30000 x g 40 мин при 4 ° C.
- Собирать супернатант в чистой трубку и храните его при температуре-80 ° C.
- Завод eGFP визуализации и количественная оценка
- Загрузите 100 мкл каждого Ч.Л. экстракта полученные от eGFP, выражая листья, в трех технических реплицирует, на 96-луночных тарелку.
- Положите пластину 96-луночных флуоресценции читателя и начать измерение. Используйте фильтр 485/535 Нм, набор необходимых для eGFP флуоресценции обнаружения.
- Для абсолютного количественной оценки, в том же пластины подготовить калибровочной кривой загрузки различных количествах (62,5, 125, 500, 750 и 1000 нг) из очищенного eGFP.
- Bicinchoninic кислота (BCA) assay для квантификации TSP
- Смешайте 50 частей реагента A (Таблица материалов) с 1 частью реагент Б (Таблица материалов). Подготовьте достаточный объем свежего BCA рабочего раствора для образцов быть assayed и калибровки стандартов.
Примечание: Объем BCA рабочего раствора, необходимых для каждой выборки составляет 1,9 мл. Для стандартной процедурой с 9 стандартов (в том числе пустым) 17.1 мл BCA рабочего раствора не требуется. - Пипетка 0,1 мл каждого стандарта (в том числе пустым), и TSP экстрактов в маркированных трубку.
Примечание: Как стандарты калибровки, подготовить свежий набор бычьим сывороточным альбумином (БСА) стандарты в диапазоне 10-1000 мкг/мл, предпочтительно с использованием тех же разбавителя как образцы, такие как вода. Пустые состоит из 0,1 мл растворителя используется для калибровки стандартных и пробоподготовки. - Добавить 1.9 мл BCA рабочего раствора и тщательно перемешать. Обложка трубы и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.
- Прохладный трубы для RT. измерения поглощения в 562 Нм всех образцов в течение 10 мин.
Примечание: Даже на RT, продолжается разработка цвет. Существенные ошибки не будут вводиться если измерения поглощения всех труб производится в течение 10 мин. - Вычтите значение поглощения 562 Нм заготовки из чтений стандартов и экстракты Ч.Л.
- Участок заготовки исправлены 562 Нм чтения для каждого стандарта на его концентрации. Определите концентрацию белка каждого Ч.Л. экстракта.
- Смешайте 50 частей реагента A (Таблица материалов) с 1 частью реагент Б (Таблица материалов). Подготовьте достаточный объем свежего BCA рабочего раствора для образцов быть assayed и калибровки стандартов.
- Выполняйте Кумасси гель окрашивание как описано в Gecchele et al.8.
- Западный анализ помаркой
- Выполните анализ Западная помарка, как описано в Gecchele et al.8.
- После электрофоретического разделения белков перенести их на нитроцеллюлозную мембрану с использованием стандартных методов. Подготовьте блокировки решение путем смешивания 4% молока в фосфат амортизированное saline (PBS) рН 7,4. Блокировать мембраны с 10 мл блокировки раствора в РТ за 1 час.
- Подготовка основного антитела кролика мэм анти GAD65/67 и анти LHCB2 и топографической для анти eGFP в 5 мл раствора блокировки с 0.1% моющего средства. Проинкубируйте мембрану с подготовленной основное антитело решения на ночь при 4 ° C или 4 h на RT с постоянным перемешиванием.
- Отказаться от основного антитела и промойте мембрану 3 раза за 5 мин блокировки раствор, содержащий 0.1% моющего средства.
- Подготовьте пероксидазы (ПХ)-конъюгата антитела анти кролик на мэм блокировать решение с 0.1% моющего средства. Проинкубируйте мембрану за 1,5 часа на RT с постоянным перемешиванием.
- Отменить вторичные антитела и промойте мембрану 5 раз за 5 мин с PBS-T (PBS с 0,1% моющего средства).
- Проинкубируйте мембрану с коммерчески доступных luminol решения следуя инструкциям производителя. Обнаружение сигнала, используя систему визуализации хемилюминесценции.
4. завод обработки материалов
- Урожай вакуумной agroinfiltrated ∆87GAD65mut-выражая свекла оставляет на выражение пик (11 dpi) и заморозить их в жидком азоте.
- Lyophilize замороженные листья за 72 ч-50 ° C и 0,04 мбар. Хранить их при температуре-80 ° C.
- Измельчить листья для мелкого порошка и хранить его на RT в запечатанном контейнере с силикагель исключить влаги.
5. желудочного пищеварения моделирования и ячейки анализ целостности
- Моделирование желудочного пищеварения
- Вешу 100 мг листьев шлифованный лиофилизированной красной свеклы и Ресуспензируйте в 6 мл PBS (рН 7,4).
- Настройка образца pH 2 с 6 М HCl.
- Добавьте 4 мг/мл пепсин из свиных слизистой оболочки желудка в 10 мм HCl для получения окончательного пепсин концентрации 1 мг/мл или в соотношении 1:20 до всего растворимые белки. Встряхните образца при 37 ° C для 120 мин.
- Настройка образцов до pH 8 с 1 M NaOH в Инактивирует пепсин.
- Центрифуга 750 мкл аликвоты каждого образца на 20000 x g 20 мин при 4 ° C. Собирают отдельно супернатант и Ресуспензируйте гранулы в одном супернатанта объем загрузки буфера (1,5 М трис HCl, pH 6.8, SDS 3%, 15% глицерина и 2-меркаптоэтанол 4%).
Примечание: Из соображений безопасности и здоровья надевайте перчатки и работать под зонт для пробоподготовки. - Вестерн-блот анализ8анализировать супернатант и ресуспензированы гранул.
- Анализ целостности ячейки
- Подготовка двух образцов 100 мг листьев шлифованный лиофилизированной красной свеклы и Ресуспензируйте оба в 6 мл PBS (рН 7,4).
- Отрегулируйте pH только один образец 2 с 6 М HCl. Shake обоих образцов при 37 ° C для 120 мин.
- Центрифуга 750 мкл аликвоты каждого образца на 20000 x g 20 мин при 4 ° C. Собирают отдельно супернатант и Ресуспензируйте гранулы в одном супернатанта объем загрузки буфера.
- Анализировать супернатант и ресуспензированы гранул, Западный анализ помаркой.
6. микрофлоры пробирного
- Вешу 100 мг лиофилизированных красной свеклы листьев. Ресуспензируйте порошок в 8 мл стерильного PBS (рН 7,4) и вихревые за 1 мин.
- Подготовка среднего фунтов без антибиотиков или содержащие рифампицин (i) 50 мкг/мл, (ii) 50 мкг/мл каждый, рифампицин и carbenicillin, (iii) 50 мкг/мл каждый рифампицин и канамицин или (iv) 50 мкг/мл каждый рифампицин, carbenicillin и канамицин.
- Плита 1 мл каждого лиофилизированной листьев огневки в одном из 5 избирательного LB средств массовой информации.
- Инкубируйте все пластины для 3 дней на 28 ° C.
- Граф Agrobacterium колоний, выращенных на каждой пластине.
- Рассчитать и определить остаточного заряда бактериальных как число единиц образуя колонии (CFU) мл лиофилизированной лист огневки (кое/мл).
7. метаболит добыча
- Основной метаболит добыча
- Весят 30 мг-80 ° c хранится, вакуумные, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-выражая Свекла порошок листьев в пластиковую трубку 2 мл.
- Мкл 750 холодный 70/30 (v/v) метанол/хлороформе и вихревые для 30 s. инкубировать в-20 ° C в течение 2 ч.
Примечание: Все растворители и добавки должны быть класса LC-MS. - Мкл 600 холодной водой и центрифуги на 17 900 x g при 4 ° C на 10 мин сбор и передача этапа верхней водноспиртовой в новом 2-мл пробирку. Отказаться от этапа нижнего chloroformic и интерфазе.
- Поместите образцы в вакуумной концентратор для 3 h для испарения растворителей.
- Растворяют гранулы, полученные из шаг 7.1.4 в 300 мкл представленности (v/v) Ацетонитрил/воды и sonicate образцы для 3 мин.
- Передайте решения через мембранные фильтры 0,2 мкм и положить их в прозрачной фиксированной 300 мкл Вставка стеклянных трубок.
- Вторичные метаболиты добыча
- Весят 300 мг-80 ° c хранится, вакуумные, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-выражая Свекла порошок листьев в пластиковой трубке 15 мл.
- Добавить 3 мл метанола, вихрь 30 сек и sonicate на 40 кГц на 15 мин.
Примечание: Все растворители и добавки должны быть класса LC-MS. - Центрифугуйте образцы на 4500 x g при 4 ° C на 10 мин и передачи supernatants в новые трубы 15 мл.
- Разбавляют 100 мкл экстракта 1:3 (v/v) с водой и передать решение через мембранный фильтр 0.2 мкм.
- Положите раствор в прозрачной фиксированной 300 мкл вставить стеклянную трубку.
- Экстракция полярных липидов
- Весят 200 мг-80 ° c хранится, вакуумные, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-выражая Свекла порошок листьев в пластиковой трубке 15 мл.
- Добавить 200 мкл воды, а затем 2 мл метанола и затем сохранить на льду за 1 час.
Примечание: Все растворители и добавки должны быть класса LC-MS. - Вихрь 30 s и sonicate на 40 кГц на 15 мин.
- Центрифугуйте образцы на 4500 x g при 4 ° C на 25 мин сбор и передача этапа хлороформ в 2 мл пробирок. Отказаться от верхней водноспиртовой фазы и интерфазе.
- Поместите образцы в вакуумной концентратор для 3 h для испарения растворителя.
- Растворяют гранулы, полученные из шага 7.3.5 с 600 мкл метанола.
- Разбавляют 100 мкл экстракта 1:5 (v/v) с метанолом и передать решение через мембранный фильтр 0,2 мкм.
- Положите раствор в прозрачной фиксированной 300 мкл вставить стеклянную трубку.
8. жидкостной хроматографии масс-спектрометрии анализ и обработка данных
- Настройка системы LC-MS, как рекомендованный поставщик.
Примечание: LC Секция состоит из Автоматический пробоотборник, в сочетании с ВЭЖХ, оборудованы со столбцом C18 гвардии (75 x 2,1 мм, частиц размером 5 мкм) перед C18 столбец (150 x 2,1 мм, частиц размером 3 мкм) для анализа вторичных метаболитов и полярных липидов , тогда как со столбцом HILIC гвардии (7,5 x 2,1 мм, 3 мкм) перед столбцом HILIC (150 x 2,1 мм, размер 2.7 частиц мкм). MS-ионная ловушка масс-спектрометр с электроспрей ионизации (ESI) или химические ионизации (ИУППА) источников атмосферного давления. - Подготовьте соответствующие растворители для ВЭЖХ градиентов. Для анализа основной метаболит используйте 20 мм аммония формате как растворителя; Ацетонитрил 95%, 5% воды плюс 10 мм аммония формате как растворитель б. Для анализа вторичных метаболитов используйте воду плюс 0,05% муравьиной кислоты (A) и ацетонитриле плюс 0,05% муравьиной кислоты (B). Для анализа полярных липидов используйте воду плюс 0,05% муравьиной кислоты (A) и 100% Ацетонитрил (B).
Примечание: Растворители и добавки должны быть класса LC-MS. - Используйте градиенты, сообщается в таблице 1 для элюции метаболит. Набор скорости расхода на 0,2 мл/мин Inject 10 мкл каждого образца для вторичных метаболитов и полярных липидов, тогда как придать 5 мкл для первичных метаболитов.
- Подготовьте образец контроля качества (КК), смешивая равными долями различных образцов, чтобы иметь представительный смесь каждого экспериментальные условия. Анализ образца КК в ходе эксперимента для мониторинга эффективности инструмент. В частности вставьте анализа образцов КК после каждого 10 образец пакета.
- Случайном порядке образцы избежать инструмент driven эффектов.
- После 9 анализов, вставьте столбец очистки метод и пустых анализа сразу же после.
Примечание: Выполните медленный градиент между двумя растворителей с Изократические элюции в высокий процент сильнейших растворителя. Пустые состоит из инъекция чистого метанола: вода (представленности, v/v) для улучшения удержания время воспроизводимости при следующем анализе. - Настройка инструмента для получения массового спектры в альтернативный положительной и отрицательной ионизации режимах с помощью параметров, перечисленных в таблице 2.
Примечание: Другие параметры зависят от конкретной платформы. - Выполните следующий обработки данных, как описано в Dal Santo et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой работе представлен рабочий процесс для развития устной вакцины в тканях съедобных растений. В центре внимания этой работы является выражением целевого белка в съедобных принимающей видов растений и характеристика потенциальных пероральной вакциной.
Первый шаг участие оценки пригодности технологии на основе вирус выражение завода для получения рекомбинантных белков в системах съедобных растений. Для этой цели, мы сначала использовать eGFP как модель белка и мы выразили в две системы съедобные лиственных растений: красная свекла, шпинат. Растения были вручную agroinfiltrated с суспензий A. tumefaciens перевозящих eGFP рекомбинантных выражение векторов. Флуоресцентный белок выражение визуализированное Западный анализ помаркой (рис. 1A, B, D, E) и количественно под УФ светом. Результаты показали, что красная свекла система характеризуется выражением выше eGFP, достигнув 544.9 ± 10,9 мкг/г свежих листьев веса (FLW) на 9 dpi (рис. 1 c), чем шпинат, какой максимальный eGFP уровни (113,4 ± 0,3 мкг/г FLW) были измерены в 11 dpi ( Рисунок 1F). По этим причинам красной свеклы был выбран в качестве принимающей выражение для всех последующих экспериментов.
По словам Чэнь et al.10eGFP переходных выражение была протестирована методом вакуумной для проникновения, которая больше подходит для крупномасштабного производства вакцины. Различных разведениях ночь A. tumefaciens культуры, начиная от 10-1 10-3и разные концентрации моющего средства (0,005-0,05%) были протестированы, сравнивая уровень накопления eGFP на максимальное выражение dpi (9 точек на дюйм). Найдено, что выше бактериальных титры производится более eGFP урожайности (10-1 ~ 0,35). Однако никаких существенных различий были найдены с помощью различных концентраций детергентов (данные не показаны).
Затем растения были вакуум, проникли с A. tumefaciens подвеска на 0,35 ОД600 и 0,01% моющего средства. После того, как были созданы выражение платформы и системы доставки, выражение две формы GAD65, GAD65mut и N-неизлечимо усечено формы (∆87GAD65mut), был по сравнению в день максимум выражения, 5 и 11 dpi, соответственно, как это было ранее Создано11. После Ч.Л. извлечения из agroinfiltrated листьев, все образцы были проанализированы иммуноблоттинга и рекомбинантных белков был относительно количественно анализ денситометрии (рис. 2). Результаты выявили кратной более высокой производительности ∆87GAD65mut формы над GAD65mut. Усеченная форма поэтому была выбрана в качестве предпочтительного устные вакцины-кандидата, накапливая как 201.4 ± 29,3 мкг/г FLW в листья красной свеклы на 11 dpi выше.
Наконец были оценены параметры для разработки потенциальных пероральной вакциной. Рекомбинантный белок целостности после того, как паром для лиофильной сушки вакуума проникли листья красной свеклы, выражая ∆87GAD65mut оценивалась в сравнении с необработанной (только замороженные) ткани, на Западный анализ помаркой. Как показано на рисунке 3A, целевого белка продемонстрировал быть стабильным после лиофилизации процесса.
Моделирование желудочного пищеварения была проведена на лиофилизированной материала путем добавления свиного желудочный фермент пепсин в конечной концентрации 1 мг/мл или в соотношении 1:20 до чайной ЛОЖКИ. Оба условия Пищеварительная Лечение привело к деградации рекомбинантных белков, как продемонстрировано Западный анализ помаркой (рис. 3 c, D, E, данные выводятся только для пепсин конечной концентрации 1 мг/мл). Отсутствие конкретного сигнала в Пелле образцах после пепсин пищеварения (полосы пепсин, p 1-3), предложил, что после для лечения, растительных клеток потеряли их целостность, ведет к деградации белка целевой.
При оценке целостности клеток показало, что когда сушеные растительной ткани был высокомобильна в буфере с нейтральным pH (pH 7,4), ∆87GAD65mut был частично солюбилизирован, предполагая, что по крайней мере некоторые клетки были разбиты во время лист измельчение и сушку. Ресуспендирования сушеные растительной ткани в кислых условиях, вместо этого, привели к обнаружению ∆87GAD65mut только в нерастворимые фракции. Это, вероятно, объясняется ∆87GAD65mut осадков, вызванных низким pH, помимо содержание белка непрерывной клетки11. Эти анализы показывают, что замораживание сушки может быть выбран в качестве лечения для подготовки вакцины-кандидата.
Кроме того была проведена оценка остаточной микробной заряда в agroinfiltrated листья красной свеклы.
Assay микрофлоры отображается, что лечения используют для приготовления вакцины кандидата ликвидировать бактериальной нагрузки11.
Метаболические биоэквивалентности ∆87GAD65mut и управления свекла установок был оценен отпечатки пальцев первичных и вторичных метаболитов и полярных липидов, порожденных LC-MS от девяти растения красной свеклы, выражая ∆87GAD65mut, девять agroinfiltrated элементы управления и девять одичал тип элементов управления. PCA статистика показали кластер одичал тип растений, отделены от всех других образцов. Вместо этого никаких существенных различий выделялись между ∆87GAD65mut и проникли и отрицательных контрольных растений. Кроме того никакого существенного различия между тремя группами растений с точки зрения полярных липидов профили был выявленных11.
Рисунок 1: сравнение уровней eGFP выражение в agroinfiltrated красной свеклы и шпинат листья. Западной помарке анализа (A, D) и соответствующих загрузки элементов управления (Рибулозобисфосфаткарбоксилаза большие субъединицы), окрашенных с Кумасси синим (B, E) белка экстрактов из eGFP выражая листьев проб во время курс анализа от 4 до 14 дней после заражения (dpi). EGFP содержание каждого листьев экстракт белка был количественно методом измерения флуоресценции (C, F). Результаты от agroinfiltrated листья красной свеклы образцы отображаются на левой панели, где образцы шпинат agroinfiltrated отображаются в правой. Равное количество белка экстрактов были загружены, 3,5 мкг для западной помарки и 30 мкг для Окрашивание Кумасси. Антитела анти eGFP использовалась как щуп в западном анализе помаркой. Стороне цифры указывают молекулярной массы маркеров в кДа. p.c., положительный контроль, 10 нг коммерческих рекомбинантного человеческого GAD65; Северная Каролина, отрицательный контроль, экстракт из листьев, проникли исключительно с A. tumefaciens перевозящих 5'- и интеграза модули. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена Бертини et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: GAD65mut и Δ87GAD65mut уровни выражения в листья красной свеклы. Западный анализ помаркой (A) и соответствующий контроль погрузки (Рибулозобисфосфаткарбоксилаза большие субъединицы) окрашенных Кумасси синим (B) белка экстрактов из листьев трех красной свеклы, выражая Δ87GAD65mut (слева) и GAD65mut (справа). Антитело против ГАД использовалась как щуп в западном анализе помаркой (полосы были загружены с 20 мкл экстракт для GAD65mut и 1 мкл экстракт для Δ87GAD65mut). В Кумасси, окрашенных гель такой же объем белка экстрактов (10 мкл/пер.) был загружен для GAD65mut и Δ87GAD65mut. Стороне цифры указывают молекулярной массы маркеров в кДа. p.c., положительный контроль, 10 нг коммерческих рекомбинантного человеческого GAD65; Северная Каролина, отрицательный контроль, экстракт, полученных из листьев, проникли только с A. tumefaciens перевозящих 5'- и интеграза модули. (C) использование иммуноблоттинга положительный контроль как ссылку для денситометрических анализа, относительное выражение уровня форм двух белка выводятся. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена Бертини et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Оральная вакцина оценки кандидата. На левой стороне, анализы стабильности белка после для лечения (A, B). Западный анализ помаркой (A) и соответствующие гель витражи с Кумасси синим (B) представляющих три независимых выдержки из листьев, выражая Δ87GAD65mut. Собранные листья непосредственно были заморожены (свежие) или лиофилизованный в-50 ° C, 0,04 мбар за 72 ч (лиофилизированный). Различные ткани: буфера коэффициенты были заняты во время извлечения TSP для того, чтобы рассмотреть потери воды из-за обезвоживания. Равный объем экстрактов были загружены, 0,25 и 10 мкл, для западной помарки и соответственно Окрашивание Кумасси. Антитело против ГАД был использован для западной помарки, зондирование стороне цифры указывают молекулярной массы маркеров в кДа. Северная Каролина, отрицательный контроль, экстракт из листьев infiltrated исключительно с A. tumefaciens, перевозящих 5'- и интеграза модули. На правой стороне, в пробирке моделируется желудочного пищеварения Δ87GAD65mut (C, D, E). Вестерн-блот анализ (C, D) и соответствующие гель витражи с Кумасси синим (E) представляющих три независимых экстракты листьев, выражая Δ87GAD65mut после имитации желудочного пищеварения. был добавлен 1 мг/мл пепсина в 100 мг лиофилизированные ткани, в то время как образец элемента управления без фермента был использован. 24 мкл и 16 мкл, supernatants (s) и окатышей (p), соответственно, полученные на этапе окончательного центрифугирования, были использованы для анализа SDS-PAGE. Анти ГАД (C) и антитела анти LHCB2 (D) были использованы как зонды в западном анализе помаркой. Стороне цифры указывают молекулярной массы маркеров в кДа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Первичных метаболитов (100 мин.) | Время (мин) | % A | % B | Длительность (мин) | Тип |
| Первоначальный | 0 | 100 | - | Исходное состояние | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Изократические | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | Градиент | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | Изократические | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | Градиент | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | Изократические | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | Градиент | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | Изократические (ре равновесия) | |
| Вторичные метаболиты (60 мин) | Время (мин) | % A | % B | Длительность (мин) | Тип |
| Первоначальный | 98 | 2 | - | Исходное состояние | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | Градиент | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | Градиент | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | Градиент | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | Градиент | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | Изократические | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | Градиент | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | Изократические | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | Градиент | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | Изократические (ре равновесия) | |
| Полярные липиды (90 мин) | Время (мин) | % A | % B | Длительность (мин) | Тип |
| Первоначальный | 50 | 50 | - | Исходное состояние | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Градиент | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | Изократические | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | Градиент | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | Изократические (ре равновесия) |
Таблица 1: Градиент условия элюции метаболит в анализе LC-MS.
| Масс-спектрометр компоненты | Функция | Параметры | ||||
| Первичных метаболитов | Вторичные метаболиты | Полярные липиды | ||||
| Электроспрей источник ионизации (ESI) | Небулайзерная газ | 50 psi, 350 ° C | 50 psi, 350 ° C | - | ||
| Сушка газа | 10 Л мин-1 | 10 Л мин-1 | ||||
| Атмосферное давление ионизация (ИУППА) источник | Небулайзерная газ | - | - | 50 psi, 350 ° C | ||
| Сушка газа | 10 Л мин-1 | |||||
| Испаритель | 450 ° C | |||||
| Ионные ловушки и детектор сканирования | Режим полного сканирования | 13000 m/z в секунду | 13000 m/z в секунду | 13000 m/z в секунду | ||
| 50-1500 м/z | 50-1500 м/z | 50-1500 м/z | ||||
| Сканировать диапазон | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| Целевая массы | ||||||
| Столкновение газ | Гелий | |||||
| Вакуумметрическое давление | 1.4 x 10-5 мбар | |||||
| Капиллярный источник | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| Концевая плита смещение | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| Скиммер | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| Крышка выход | 106 V | -121 V | 143.5 V | |||
| 1 октября DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| Oct 2 DC | 1.7 V | -1,7 V | 2 V | |||
| Объектив 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| Объектив 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| МТП для режима позитивные ионизации | 20 | |||||
| МТП для режима отрицательная ионизация | 7 | |||||
Таблица 2: Параметры для приобретения массового спектры в режимах альтернативный положительной и отрицательной ионизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы показали предварительный анализ для разработки кандидат оральная вакцина для аутоиммунного диабета. Целевого белка для этого эксперимента был мутировал форме человека 65 кДа Глутаматдекарбоксилаза, которых производство и функциональность являются легко обнаруживаемые и измеримые12. Его выражение в тканях различных съедобных растений был опосредовано векторов5, который посредником высокий уровень производства рекомбинантного белка в очень короткие сроки. Выбор Лучший кандидат завода, выполненных съедобные узла на основе eGFP выражения в красной свеклы и листья шпината, ручной agroinfiltration. Этот шаг может иметь решающее значение для промышленных масштабов вследствие длительная процедура ручной agroinfiltration и твердость в инфильтрации ткани листьев шпината.
Идентификация конкретных dpi уборки, дает наивысший уровень накопления рекомбинантных белков для рекомбинантных белков является важным шагом и должны быть проверены и отобраны на основе case-by-case. Анализ выражения флуоресцентный белок в разных точек на дюйм (от 4 до 12), позволил определить день максимальное выражение в каждой системе растений. Сравнение между eGFP концентрация (мкг/г FLW), в эти дни максимальное выражение, подчеркнул что красная свекла является лучшим выполнения платформы с точки зрения урожайности рекомбинантных белков.
По этой причине красной свеклы был далее проверена для доставки векторов на основе вирусов растений вакуумной системой, которая считается более подходящим для крупномасштабного промышленного производства вакцины против13.
Учитывая, что стандартные вакуумные инфильтрации протокол оптимизирован для табака видов5, создание целого ряда параметров для процедуры Настройка видов растений считается является критической точкой. Затем был оптимизирован протокол вакуумной agroinfiltration красной свеклы. Наши доказательства показали, что решающее значение для улучшения уровнях выражения протеина, а стиральный порошок концентрации для повышения проницаемости листьев Agrobacterium разрежения. Результаты показали, что системы растений и технологии, с этой целью работы.
Две различные формы GAD65, GAD65mut и ∆87GAD65mut, которые ранее были характерны для их выражения в н. benthamiana7, отображение различных субклеточном локализации, были выражены в красной свеклы, вакуумные инфильтрации. Для каждого образца были подготовлены три биологических реплицирует. Каждый биологические репликации включает в себя совокупность трех проникли листья из различных растений, отобранных от 2 до 14 dpi для обеих форм GAD65. Уровень их выражения было по сравнению с выберите высокие накопления белка в тканях растений.
Относительно количественной оценки анализ денситометрии показал, что ∆87GAD65mut имеет кратной высокий уровень выражения, чем его коллега нетронутыми. Это может из-за его цитозольной локализации во время GAD65mut, благодаря его остатки, которые якорь эту форму клеточной мембраны, имеет более низкую доходность7, отражающие нижней белка стабильности. Уровень Средний накопление ∆87GAD65mut в ткани листьев красной свеклы был 201.4 ± 29,3 мкг/г FLW, который является достаточно, чтобы начать с развития пероральной вакциной T1D.
Наконец после выбора наиболее подходящей платформы, технологии и белка формы, мы исходили, создав послеуборочной обработки зараженных листьев. Так как листовой ткани состоит из 95% воды, лечение обезвоживания является полезным для предотвращения загрязнения микроорганизма. Наши результаты показывают, что Плаурайта лечения может применяться к образцу, не затрагивая уровень рекомбинантных белков в листья. Удаление десятикратного воды по лиофилизации устраняет бактериального загрязнения (микрофлоры), включая рекомбинантных A. tumefaciens используется для agroinfiltration процедуры.
Кроме того анализ белков био инкапсуляции показал, что ∆87GAD65mut полностью усваивается после имитации желудочного пищеварения. Это свидетельствует о том, что Плаурайта лечения повреждений завод клеточной стенки, подвергая рекомбинантных белков на кислых и ферментативные состав среды желудка.
Поддержание целостности молекулы белка или пептида над желудочно-кишечного тракта переход на сайт поглощения представляет проблема для доставки устные наркотиков14. Следовательно после лечения обезвоживания, потенциальные вакцины должны быть правильно сформулированы преодолеть среды желудка без потери целостности. В производстве растительного ГАД вакцины инкапсуляции в относительно стабильной оболочке может применяться как системы для повышения ее эффективности, позволяя ему быть защищены и стабильной вдоль маршрута перорального15.
Были изучены различные технологии для преодоления проблем, связанных с перорального макромолекулы как некоторые недавние исследования по комплексообразованию синтетических гидрогеля с инсулина, который показал высокий инкапсуляции эффективности и быстрого инсулина релиз в кишечнике в зависимости от рН16,17.
Первичных и вторичных метаболитов биоэквивалентности растений, выражая ∆87GAD65mut по сравнению с проникли и не проникли контроля исследовали с помощью PCA статистики. Различия между проникли растений, выражая ∆87GAD65mut и проникли элементы управления не были значительными, тогда как не проникли одичал типа растений формируется отдельный кластер. Эти результаты показывают, что проникли растения отличаются от необработанных растений LC-MS анализа благодаря бактериальных метаболитов или метаболитов, производимые растениями из-за проникновения, как уже показано в литературе13. В целом этот анализ показал, что накопление ∆87GAD65mut имеет незначительное воздействие на общий обмен веществ.
В целом эти результаты показывают, что потенциальные оральная вакцина, представленной ткани листа лиофилизированной красной свеклы, выражая ∆87GAD65mut полученные технологии на основе вирус выражение завод, подходит для экспериментальной T1D устные иммунотерапия испытания. Завод вирус выражение Векторный Технология стала очень привлекательной в переходных выражение поля, благодаря своей способности производить инородные белки быстро и на высоком уровне. Эта технология основана на деконструкции вектор, которая несет только РНК-зависимой РНК-полимеразы и движения белок5 и поэтому он теряет его инфективности в растениях; как следствие его потенциальной передачи людей должны быть исключены.
Экспериментальный протокол, сообщили здесь может быть продлен для многих различных съедобных видов, таких как салат, Марь головчатая и шпинат распростёртый. После листья этих видов, в том числе красной свеклы и шпинатом которого ранее был обнаружен как хорошее выражение завод систем5, может использоваться как сырой пищи, технологии, предлагаемые здесь могут быть использованы для производства съедобных вакцин или производство минимально обработанных функциональных продуктов питания или корма.
Сочетание видов рекомбинантных белков/растений, ДОИ уборки, что дает высокий уровень накопления Рекомбинантный белок нужно еще определяется эмпирически на дела на индивидуальной основе в зависимости от рекомбинантных белков выразили и на хост видов растений18.
Применение этой технологии для производства оральной вакциной держать большой потенциал, чтобы стать альтернативой для обычных вакцин в ближайшем будущем, в дополнение к боевой онколитического вирусы, аутологичные вакцин для лимфом и твердых опухолей, и Моноклональные антитела к целевой рака19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана совместного проекта «Использование растений для производства съедобных вакцины аутоиммунный диабет (eDIVA)» (проект ID: 891854) финансируется Веронский университет – в рамках вызова 2014.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
References
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
- Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
- Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
- Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
- Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
- Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
- Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
- Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
- Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
- Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
- Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
- Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
- Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
- Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
- Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
- Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).
