Summary
Nous présentons ici un protocole pour produire un candidat vaccin oral contre le diabète de Type 1 dans une plante comestible.
Abstract
Moléculture végétale est l’utilisation des plantes pour produire des molécules d’intérêt. Dans cette perspective, plantes peuvent servir aussi bien comme des bioréacteurs pour la production et la purification ultérieure du produit final et la livraison directe par voie orale de protéines hétérologues lors de l’utilisation des espèces de plantes comestibles. Dans ce travail, nous présentons le développement d’un vaccin oral contre le diabète de Type 1 (T1D) dans les systèmes de plantes comestibles en utilisant la technologie de base de virus recombinant DNA plante déconstruite, livrée avec infiltration sous vide. Nos résultats montrent que la betterave rouge est un hôte approprié pour l’expression transitoire d’un auto-antigène dérivée humaine associée à T1D, considéré comme un candidat prometteur comme vaccin T1D. Feuilles produisant l’auto-antigène ont été soigneusement caractérisés pour leur résistance à la digestion gastrique, la présence d’une charge bactérienne résiduelle et leur profil métabolique secondaire, ce qui donne une vue d’ensemble de la production de processus pour l’utilisation potentielle des plantes pour la prestation orale directe d’une protéine hétérologue. Notre analyse a montré une dégradation presque complète du vaccin oral candidat lyophilisés après une digestion gastrique simulée, ce qui suggère qu’il faut une stratégie d’encapsulation dans la fabrication du vaccin GAD végétale.
Introduction
Depuis la révolution de la biologie moléculaire végétale dans les années 1980, les systèmes à base de plantes pour la fabrication de produits biopharmaceutiques peuvent être considérés comme une alternative aux systèmes traditionnels basés sur des cellules microbiennes et mammifères1. Plantes affichent plusieurs avantages sur les plateformes traditionnelles, avec l’évolutivité, de rentabilité et de sécurité étant les plus pertinents2. Le produit recombinant peut être purifié à partir de tissus végétaux transformés et ensuite administré, soit par voie parentérale ou par voie orale et, en outre, plante comestible transformée peut être utilisé directement pour administration par voie orale. Voie orale favorise simultanément l’immunité muqueuse et systémique, et il élimine le besoin d’aiguilles et de personnel médical spécialisé. En outre, prestation orale élimine le traitement complexe en aval, qui représente normalement 80 % du coût total de fabrication d’une protéine recombinante3. Tous ces avantages peuvent se traduire par des économies dans la production, des fournitures et du travail en réduisant les coûts de chaque dose, rendant la drogue abordables pour la plupart de la population mondiale.
Plusieurs stratégies, tant pour la transformation stable et expression transitoire, ont été développés pour la production de protéines recombinantes dans des plantes. Parmi eux, un système d’expression de base de virus de plante déconstruite à haut rendement (p. ex., magnICON) offre des performances supérieures entraînant des rendements élevés de protéines recombinantes des échelles de temps relativement court,4. Beaucoup d’exemples d’expression transitoire dans le système d’expression de base de virus de plante Nicotiana benthamiana plants est signalés, étant l’hôte de production de l’étalon-or. Cependant, cette plante de modèle n’est pas considérée comme une espèce comestible en raison des alcaloïdes et d’autres métabolites toxiques qui sont accumulent dans ses feuilles.
Dans ce travail, nous décrivons la comparaison entre deux systèmes de plantes comestibles, betterave rouge (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) et épinards (Spinacea oleracea cv Industria), pour l’expression de deux formes de candidat de l’isoforme 65 kDa de l’acide glutamique décarboxylase (GAD65), réalisée par l’usine base de virus vecteurs5. GAD65 est un auto-antigène majeur lié au diabète de Type 1 (T1D) et il est actuellement sous enquête dans des essais cliniques humains pour prévenir ou retarder T1D en induisant la tolérance6. La production de GAD65 chez les plantes a été étudiée chez les espèces de plantes modèle Nicotiana tabacum et N. benthamiana4,5,6,7. Nous décrivons ici l’utilisation d’espèces végétales comestibles pour la production de la molécule dans les tissus qui peut être signifié pour une livraison directe par voie orale. D’un point de vue technique, nous avons étudié et sélectionné le système plante agroinfiltration et la plate-forme de plantes comestibles pour la production de GAD65 en évaluant les différents paramètres : les niveaux de l’expression de protéine recombinante, la charge microbienne résiduelle en usine tissu destiné à l’administration orale, la résistance de GAD65 à la digestion gastrique et la bioéquivalence des plantes transformées avec le type sauvage.
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Protocol
1. rouge culture de betterave et des épinards
- Cultiver la betterave rouge (b. vulgaris cv Moulin Rouge) et épinards (S. oleracea cv Industria) plantes dans une chambre de croissance, à l’aide de 150 µE d’intensité lumineuse, 65 % d’humidité relative, cycle lumière/obscurité de 12 h à 23/21 ° C, respectivement.
- Après la germination des graines, fertiliser les plantes deux fois par semaine avec une solution de 1 g/L d’engrais disponible dans le commerce (Table des matières). Pour agroinfiltration utiliser cinq semaines aux épinards et plantes de betterave rouge de six semaines.
2. transitoire expression grâce à la technologie de base de virus de plante déconstruite
- Construction usine de vecteurs d’expression
- Introduire les vecteurs - le module 5' (pICH20111), les 3' modules (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut et pICH7410.eGFP), préparés comme décrit précédemment1,2,7et le module de l’intégrase (pICH14011)- chez Agrobacterium tumefaciens GV3101 souche selon les techniques habituelles. Poussent sur milieu LB contenant 50 rifampicine μg/mL et les antibiotiques appropriés de vecteur spécifique (50 carbénicilline μg/mL pour pICH20111, pICH14011 et pICH7410.eGFP), 50 kanamycine μg/mL pour pICH31070 pendant 2 jours à 28 ° C.
- Les colonies colonie de PCR avec les amorces spécifiques suivants pour chaque vecteur de l’écran : 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' et 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' pour les 3' modules pICH31070.GAD65mut et pICH31070.∆87G65mut, avec une température de recuit de 55 ° C et un temps d’allongement de 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' et 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' pour la troisième 3' pICH7410.eGFP module, avec une température de recuit de 53 ° C et un temps d’élongation de 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' et 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' pour le module 5', avec une température de recuit de 53 ° C et un temps d’élongation de 20 s et 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' et 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' pour le module intégrase avec une température de recuit de 57 ° C et un temps d’allongement de 45 s.
- Effectuer la réaction de PCR dans un volume total de 20 μL en utilisant le cycle de réaction spécifique suivant : dénaturation initiale de 5 min à 95 ° C, 35 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à la température de recuit et l’étape d’élongation à 72 ° C (température et l’allongement des temps de recuit une re spécifique pour chaque couple d’amorce) et une étape d’élongation finale de 7 min à 72 ° C.
- Agroinfiltration seringue
- Inoculer les trois transformants d’a. tumefaciens dans 50 mL de LB moyen contenant 50 μg/mL la rifampicine et les vecteur spécifique des antibiotiques appropriés suivants : 50 carbénicilline μg/mL pour a. tumefaciens transformé avec pICH20111, pICH14011 ou pICH7410.eGFP ou 50 μg/mL kanamycine pour a. tumefaciens transformé avec pICH31070. Croître par agitation pendant la nuit à 28 ° C.
- Cultures bactériennes durant la nuit à pellets par centrifugation à 4 500 x g pendant 20 min et les remettre en suspension dans 100 mL (ou deux volumes de la culture bactérienne initiale) du tampon d’infiltration contenant de l’acide 4-morpholineethanesulfonic 10 mM (MES ; pH 5.5) et 10 mM MgSO4, sans tenir compte de l’OD600. Incuber les suspensions à température ambiante (RT) pendant 3 h.
- Mélanger des quantités égales de suspensions bactériennes contenant un des trois modules, GAD65mut, ∆87GAD65mut ou eGFP 3' module, avec 5' module et module de l’intégrase. Utiliser le mélange de suspension pour l’infiltration de la seringue de feuilles rouge de betterave et des épinards.
- Déposer 5 mL de la suspension dans une seringue sans l’aiguille. Appuyez sur l’extrémité de la seringue contre la face inférieure de la feuille pour les épinards et les usines de la betterave rouge et pendant ce temps appliquer une contrepression douce de l’autre côté de la feuille.
- S’infiltrer dans les trois premières feuilles complètement développées à partir de l’apex pour chaque plante. Les feuilles d’agroinfiltrated avec une étiquette en papier sur la tige de la feuille de l’étiquette. Retourner les plantes dans une chambre de croissance dans des conditions normales.
Remarque : Pour des raisons de santé et de sécurité, porter des lunettes de protection et des gants lors de l’infiltration. - Agroinfiltrated recueillir les feuilles de 4 à 14 jours après l’infection (dpi) et congelez-les dans l’azote liquide. Magasin des tissus végétaux à-80 ° C.
- Agroinfiltration sous vide
- Se développer séparément les trois transformants d’a. tumefaciens dans 50 mL de milieu LB contenant 50 rifampicine μg/mL et vecteur spécifique approprié antibiotique par agitation pendant la nuit à 28 ° C.
- Pellet nuit des cultures bactériennes par centrifugation à 4 500 x g pendant 20 min. resuspendre le culot dans 1 L de tampon d’infiltration à une OD600 de 0,35 et incuber les suspensions à ta pendant 3 h.
- Ajouter 0,01 % v/v du détergent (polysorbate 20) à chaque suspension. Mélanger des quantités égales de suspensions bactériennes contenant un des trois modules, GAD65mut, ∆87GAD65mut ou eGFP 3' module, avec 5' module et module de l’intégrase.
- Insérer une plante (six semaines betterave rouge planter, voir section 1) dans le support. Inverser le support et la placer sur un bécher contenant le bain d’infiltration (2 L) pour plonger les feuilles dans la suspension d’infiltration.
Remarque : Assurez-vous que toutes les feuilles sont complètement plongés dans la suspension bactérienne. Élever le niveau avec l’ajout de suspension infiltration supplémentaire si nécessaire. - Le bain d’infiltration avec la plante submergée de transfert à la chambre de l’infiltration et fermez-le. Mettre en marche la pompe à vide et ouvrir la soupape d’admission sous vide sur la chambre de l’infiltration.
- Une fois que la pression dans la chambre d’infiltration a réduit à 90 mbar, garder le vide pendant 3 min. sortie le vide pour 45 s. Une fois que la chambre de l’infiltration est revenue à la pression atmosphérique, ouvrir la chambre et enlever la plante infiltrée du bain bactérien.
- Retourner les plantes dans une chambre de croissance dans des conditions normales.
- Recueillent les feuilles agroinfiltrated l’expression maximale des jours, selon la protéine recombinante et congelez-les dans l’azote liquide. Magasin des tissus végétaux à-80 ° C.
3. analyse de l’expression recombinant protein
- Extraction des protéines solubles totales (TSP)
- Moudre la seringue ou vide infiltré des feuilles rouges d’épinards et de betterave, collectées lors des étapes 2.2.6 et 2.3.8, à poudre fine dans l’azote liquide à l’aide de mortier et un pilon. Transférer la poudre dans des tubes en plastique de 15 mL et de stocker les matériaux à-80 ° C.
- Ajouter 900 µL de tampon d’extraction (50 mM de phosphate de sodium de pH 8,0, métabisulfite de sodium 20 mM) à 300 mg de poudre de feuilles.
NOTE : Le rapport sélectionné entre plante tissus poids (mg) au volume (µL) de la mémoire tampon est de 1:3. - Homogénéiser le mélange au vortex pendant 1 min, puis centrifuger à 30 000 x g pendant 40 min à 4 ° C.
- Récupérer le surnageant dans un tube propre et conserver à-80 ° C.
- Plante eGFP visualisation et quantification
- Charger 100 µL de chaque extrait TSP obtenu d’eGFP exprimant des feuilles, en trois répétitions techniques, sur une plaque à 96 puits.
- Mettre la plaque de 96 puits en un lecteur de fluorescence et démarrer la mesure. Utilisez le 485/535 nm filtre requis pour la détection par fluorescence eGFP.
- Pour la quantification absolue, dans la même assiette préparer une courbe d’étalonnage des quantités différentes de chargement (62,5, 125, 500, 750 et 1 000 ng) d’un eGFP purifiée.
- Bicinchoninic dosage d’acide (BCA) pour la quantification de TSP
- Mélanger 50 parts de réactif A (Table des matières) avec 1 partie de réactif B (Table des matières). Préparer un volume suffisant de solution de travail BCA fraîche pour les échantillons à doser et les étalons.
Remarque : Le volume de solution de travail requis pour chaque échantillon de BCA est 1,9 mL. La procédure standard avec 9 étalons (y compris un blanc), 17,1 mL de solution de travail BCA est nécessaire. - Pipetter 0,1 mL de chaque norme (y compris un blanc) et d’extraits de c. à thé dans un tube marqué.
Remarque : Comme étalons, préparer une nouvelle série de l’albumine sérique bovine normes (BSA) dans la gamme de 10-1 000 μg/mL, préférence utilisant le diluant que les échantillons, tels que l’eau. Le blanc se compose de 0,1 mL de diluant utilisé pour la solution étalon et préparation des échantillons. - Ajouter 1,9 mL de solution de travail BCA et bien mélanger. Couvrir les tubes et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
- Refroidir les tubes RT. mesurer l’absorbance à 562 nm de tous les échantillons dans les 10 min.
Remarque : Même à la droite, continue le développement de la couleur. Aucune erreur significative ne sera introduit lorsque les mesures d’absorbance de tous les tubes sont effectuées en moins de 10 min. - Soustrayez la valeur d’absorbance 562 nm de la vierge d’après les relevés des normes et des extraits TSP.
- Intrigue le blanc-corrigé 562 nm de lecture pour chaque norme sa concentration. Déterminer la concentration de la protéine de chaque extrait TSP.
- Mélanger 50 parts de réactif A (Table des matières) avec 1 partie de réactif B (Table des matières). Préparer un volume suffisant de solution de travail BCA fraîche pour les échantillons à doser et les étalons.
- Effectuer le gel bleu de Coomassie coloration comme décrit précédemment dans Gecchele et al.,8.
- Analyse par Western blot
- Effectuer l’analyse par transfert western comme décrit dans Gecchele et al.,8.
- Après la séparation électrophorétique des protéines, transférez-les sur une membrane de nitrocellulose, selon les techniques habituelles. Préparez la solution de blocage par le mélange de lait de 4 % en (PBS) saline tamponnée au phosphate pH 7.4. Bloquer la membrane avec 10 mL de la solution de saturation à la droite pendant 1 h.
- Préparer l’anticorps primaire de lapin au 1/10 000 pour les anti-GAD65/67 et anti-LHCB2 et au 1/20 000 pour l’anti-eGFP dans 5 mL de solution de saturation avec 0,1 % de détergent. Incuber la membrane avec les solutions d’anticorps primaire préparés durant la nuit à 4 ° C ou de 4 h à RT avec agitation constante.
- Jeter l’anticorps primaire et laver la membrane 3 fois pendant 5 min chacun avec blocage solution contenant 0,1 % de détergent.
- Préparer la peroxydase de raifort (HRP)-des anticorps de anti-lapin conjugué au 1/10 000 en bloquant la solution avec 0,1 % de détergent. Incuber la membrane pendant 1,5 h à RT avec agitation constante.
- Jeter l’anticorps secondaire et laver la membrane 5 fois pour 5 min chacun avec PBS-T (PBS additionné de 0,1 % de détergent).
- Incubez la membrane avec une solution de luminol commercialement disponibles suivant les instructions du fabricant. Détecter le signal à l’aide d’un système d’imagerie de la chimiluminescence.
4. traitement des matériaux végétaux
- Récolte de la betterave rouge exprimant le ∆87GAD65mut d’agroinfiltrated sous vide laisse à l’apogée de l’expression (11 dpi) et congelez-les dans l’azote liquide.
- Lyophiliser les feuilles congelées pendant 72 h à-50 ° C et 0,04 mbar. Stocker à-80 ° C.
- Broyer les feuilles en poudre fine et stockez-le à ta dans un récipient hermétique avec gel de silice, d’exclure l’humidité.
5. analyse d’intégrité de simulation et de la cellule gastrique digestion
- Simulation de la digestion gastrique
- Peser 100 mg de feuilles de betterave rouge lyophilisée broyé et il resuspendre dans 6 mL de PBS (pH 7,4).
- Ajuster le pH de l’échantillon à 2 avec du HCl 6 M.
- Ajouter la pepsine 4 mg/mL de muqueuse gastrique de porc dans HCl pour obtenir une concentration finale de pepsine de 1 mg/mL soit un ratio de 01:20 pour les protéines solubles totales de 10 mM. Agiter l’échantillon à 37 ° C pendant 120 min.
- Ajuster les échantillons à pH 8 avec 1 NaOH M pour inactiver la pepsine.
- Centrifuger 750 µL d’extraits de chaque échantillon à 20 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Collecter séparément le surnageant et resuspendre le culot dans un seul volume de surnageant de tampon de chargement (1,5 M Tris HCl, pH 6,8, SDS de 3 %, 15 % de glycérol et 4 % de 2-mercaptoéthanol).
Remarque : Pour des raisons de santé et de sécurité, gants et travailler sous hotte aspirante pour la préparation de l’échantillon. - Analyser le surnageant et l’extrait concentré de tache occidentale analyse8.
- Analyse de l’intégrité cellulaire
- Préparer les deux échantillons de 100 mg de feuilles de betterave rouge lyophilisée broyé et resuspendre dans 6 mL de PBS (pH 7,4).
- Ajuster le pH de seulement un échantillon de 2 à 6 M HCl. secouer les deux échantillons à 37 ° C pendant 120 min.
- Centrifuger 750 µL d’extraits de chaque échantillon à 20 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Collecter séparément le surnageant et resuspendre le culot dans un seul volume de surnageant de tampon de chargement.
- Analyser le surnageant et l’extrait concentré en analyse par western blot.
6. dosage de la charge microbienne
- Peser 100 mg de feuilles de betterave rouge lyophilisée. Remettre en suspension de la poudre en 8 mL de PBS stérile (pH 7,4) et vortexer pendant 1 min.
- Préparer le milieu LB sans antibiotiques ni contenant i 50 rifampicine µg/mL, (ii) 50 µg/mL chacune de rifampicine et de carbénicilline, (iii) 50 µg/mL chacune de la rifampicine et la kanamycine ou (iv) 50 µg/mL chacune de rifampicine, carbénicilline et kanamycine.
- Plaque de 1 mL de chaque homogénat lyophilisé de feuilles dans l’une des géloses sélectives 5 LB.
- Incuber les plaques de tous pendant 3 jours à 28 ° C.
- Compter les colonies Agrobacterium sur chaque plaque.
- Calculer et définir la charge bactérienne résiduelle comme le nombre d’unités formant colonies (UFC) par mL de l’homogénat de feuilles lyophilisées (UFC/mL).
7. extraction de métabolite
- Extraction de métabolite primaire
- Peser de 30 mg de-80 ° C stocké, sous vide agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimant poudre de feuilles de betterave rouge dans un tube en plastique de 2 mL.
- Ajouter 750 µL de froid 70/30 (v/v) de méthanol/chloroforme et vortex pendant 30 s. incuber à-20 ° C pendant 2 h.
Remarque : Tous les solvants et additifs doivent être SM-grade. - Ajouter 600 µL d’eau froide et centrifuger à 17 900 x g à 4 ° C pendant 10 min. à frais virés et transfert de la phase supérieure hydroalcoolique dans un nouveau tube de 2 mL. Jeter la phase chloroformique inférieure et l’interphase.
- Placer les échantillons dans une pompe à vide pour évaporer les solvants pendant 3 h.
- Dissoudre le culot obtenu d’étape 7.1.4 dans 300 µL de 50/50 (v/v) d’acétonitrile/eau et laisser agir les échantillons pendant 3 min.
- Traverser les solutions 0,2 μm membranes filtrantes et mettez-les dans un transparent fixe 300 µL insérer des tubes de verre.
- Extraction de métabolites secondaires
- Peser 300 mg de-80 ° C stocké, sous vide agroinfiltrated exprimant ∆87GAD65mut poudre de feuilles de betterave rouge dans un tube en plastique de 15 mL.
- Ajouter 3 mL de méthanol, vortexer pendant 30 s et ultrasons 40 kHz pendant 15 min.
Remarque : Tous les solvants et additifs doivent être SM-grade. - Centrifuger les échantillons à 4 500 x g à 4 ° C pendant 10 min et transvaser le surnageant dans nouveaux tubes de 15 mL.
- Diluer 100 µL d’extrait 1:3 (v/v) avec de l’eau et passer la solution à travers un filtre à membrane 0,2 μm.
- Mettre la solution dans un tube de verre d’insertion de 300 µL fixe transparent.
- Extraction de lipides polaires
- Peser 200 mg de-80 ° C stocké, sous vide agroinfiltrated exprimant ∆87GAD65mut poudre de feuilles de betterave rouge dans un tube en plastique de 15 mL.
- Ajouter 200 µL d’eau, puis 2 mL de méthanol et puis continuez sur la glace pendant 1 h.
Remarque : Tous les solvants et additifs doivent être SM-grade. - Vortexer pendant 30 s et ultrasons 40 kHz pendant 15 min.
- Centrifuger les échantillons à 4 500 x g à 4 ° C pendant 25 min. collecter et transfert la phase chloroformique dans des tubes de 2 mL. Jeter la phase supérieure hydroalcoolique et l’interphase.
- Placer les échantillons dans une pompe à vide pour évaporer le solvant pendant 3 h.
- Dissoudre le culot obtenu à l’étape 7.3.5 avec 600 µL de méthanol.
- Diluer 100 µL d’extrait 1:5 (v/v) avec du méthanol et passer la solution à travers un filtre à membrane 0,2 μm.
- Mettre la solution dans un tube de verre d’insertion de 300 µL fixe transparent.
8. chromatographie à la spectrométrie de masse analyse et traitement des données
- Mettre en place le système SM-tel que recommandé par le fournisseur.
Remarque : La section LC se compose d’un échantillonneur automatique couplé avec HPLC équipé d’une précolonne C18 (75 x 2.1 mm, particule taille 5 µm) devant une colonne C18 (150 x 2.1 mm, particule taille 3 µm) pour l’analyse des métabolites secondaires et les lipides polaires , alors qu’avec une précolonne HILIC (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) devant une colonne HILIC (150 x 2.1 mm, particule taille 2,7 µm). La MS est un spectromètre de masse de piège à ions muni d’un ionisation par électrospray (ESI) ou d’une sources d’ionisation chimique (APCI) de la pression atmosphérique. - Préparer les solvants appropriés pour les gradients de CLHP. Pour l’analyse des métabolites primaires, utiliser le formiate d’ammonium 20 mM comme solvant A ; 95 % d’acétonitrile, 5 % d’eau plus formiate d’ammonium 10 mM comme solvant B. Pour l’analyse des métabolites secondaires, utiliser l’eau plus de 0.05 % d’acide formique (A) et de l’acétonitrile plus de 0.05 % d’acide formique (B). Pour l’analyse des lipides polaires, utiliser l’eau plus 0,05 % d’acide formique (A) et 100 % d’acétonitrile (B).
Remarque : Les solvants et additifs doivent être SM-grade. - Utilisez les gradients présentés au tableau 1 pour élution de métabolite. Ensemble le débit à 0,2 mL/min. injecter 10 µL de chaque échantillon pour les métabolites secondaires et les lipides polaires, considérant qu’injecter 5 µL de métabolites primaires.
- Préparer un échantillon de contrôle de la qualité (CQ) en mélangeant des parts égales de différents échantillons d’avoir un mélange représentatif de chaque condition expérimentale. Analyser l’échantillon QC pendant l’expérience pour surveiller l’efficacité de l’instrument. Plus précisément, insérez une analyse d’échantillon QC après chaque échantillon-lot de 10.
- Alternez les échantillons afin d’éviter les effets axée sur l’instrument.
- Après 9 analyses, insérer une colonne nettoyage méthode ainsi qu’une analyse vide immédiatement après.
Remarque : Effectuez un lent dégradé entre les deux solvants avec une élution isocratique à fort pourcentage de solvant plus fort. Le blanc se compose d’une injection d’un méthanol pur : l’eau (50/50, v/v) d’améliorer la reproductibilité de temps de rétention dans l’analyse qui suit. - Mettre en place l’instrument en vue d’acquérir des spectres de masse dans les modes de rechange ionisation positive et négative en utilisant les paramètres répertoriés dans le tableau 2.
Remarque : Autres paramètres dépendent de la plateforme spécifique. - Effectue le traitement de données suivant comme il est expliqué dans la Dal Santo et coll.9.
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Representative Results
Dans ce travail, le flux de travail pour l’élaboration d’un vaccin oral dans les tissus végétaux comestibles est présenté. L’objectif de ce travail est l’expression d’une protéine cible dans une espèce de plante hôte comestibles et la caractérisation du potentiel vaccin oral.
La première étape consistait à l’évaluation de la pertinence de la technologie d’expression à base de virus de plante pour produire des protéines recombinantes dans les systèmes de plantes comestibles. Pour cet objectif, nous utilisons tout d’abord l’eGFP comme protéine modèle et nous l’a exprimé en deux systèmes de plantes-feuilles comestibles : betterave rouge et les épinards. Les plantes ont été manuellement agroinfiltrated avec des suspensions de a. tumefaciens transportant des vecteurs d’expression recombinants eGFP. L’expression de la protéine fluorescente a été visualisée par analyse par western blot (Figure 1 a, B, D, E) et quantifiée sous la lumière UV. Résultats ont montré que le système de la betterave rouge se caractérise par une expression plus élevée d’eGFP, atteignant 544,9 ± 10,9 µg/g de poids de feuilles fraîches (FLW) à 9 dpi (Figure 1), que les épinards, les niveaux maximum eGFP (113,4 ± 0,3 µg/g FLW) ont été mesurées à 11 PPP ( Figure 1F). Pour ces raisons la betterave rouge a été choisi comme hôte d’expressions pour toutes les expériences ultérieures.
Selon Chen et al.10, l’expression transitoire eGFP a été testée par une méthode vide pour l’infiltration, qui est plus adaptée pour la production de vaccin à grande échelle. Différentes dilutions de la nuit a. tumefaciens culture, allant de 10-1 à 10-3et à différentes concentrations de détergent (0,005 à 0,05 %) ont été testés en comparant le niveau d’accumulation eGFP à la plus haute expression dpi (dpi 9). Les résultats ont montré que des titres bactériens supérieurs produit des rendements accrus d’eGFP (10-1 ~ 0,35). Cependant, aucune différence significative n’ont été trouvés à l’aide de différentes concentrations de détergent (données non présentées).
Puis, les plantes étaient vide infiltré avec une suspension d’a. tumefaciens à 0,35 OD600 et 0,01 % de détergent. Une fois que la plateforme d’expression et le système de livraison ont été établis, l’expression de deux formes de GAD65, GAD65mut et un N-terminale tronqué forme (∆87GAD65mut), a été comparé au jour de la plus haute expression, dpi 5 et 11, respectivement, comme précédemment mis en place11. Après que l’extraction de c. à thé d’agroinfiltrated feuilles, tous les échantillons ont été analysés par western blot et la protéine recombinante a été relativement quantifiée par une analyse de la densitométrie (Figure 2). Résultats mis en évidence la performance 20 fois plus élevée de la forme ∆87GAD65mut sur le GAD65mut. La forme tronquée fut donc choisie comme candidat vaccin oral préféré, accumulant aussi haut que légèrement supérieur à 201,4 ± 29,3 µg/g FLW dans les feuilles de betterave rouge à 11 dpi.
Enfin, les paramètres pour le développement d’un vaccin oral potentiel ont été évalués. L’intégrité de la protéine recombinante après lyophilisation du vide se sont infiltrés dans les feuilles de betterave rouge exprimant le ∆87GAD65mut a été évaluée par comparaison avec le non traitées (seulement congelé) tissu, par analyse par western blot. Comme le montre la Figure 3 a, la protéine cible a démontré être stable après le processus de lyophilisation.
La simulation de la digestion gastrique a été réalisée sur le matériel lyophilisé en ajoutant la pepsine porcine enzyme gastrique à une concentration finale de 1 mg/mL ou à un rapport de 01:20 à FST. Les deux conditions de traitement digestive a entraîné la dégradation de la protéine recombinante, tel que démontré par l’analyse par western blot (Figure 3, D, E, rapporte des données uniquement pour la concentration finale de pepsine de 1 mg/mL). L’absence d’un signal spécifique dans les échantillons de granulés après digestion pepsique (pepsine lanes, p 1-3), a suggéré qu’après lyophilisation de traitement, les cellules de la plante a perdu leur intégrité, conduisant à la dégradation des protéines cibles.
L’évaluation de l’intégrité cellulaire a montré que quand tissus de la plante séchée a été remis en suspension dans la solution tampon pH neutre (pH 7,4), ∆87GAD65mut est partiellement solubilisée, ce qui laisse supposer qu’au moins certaines cellules ont été brisées au cours de la feuille de broyage et séchage. La remise en suspension des tissus de la plante séchée dans des conditions acides, au lieu de cela, a conduit à la détection de le ∆87GAD65mut seulement dans la fraction insoluble. C’était probablement dû à la précipitation de ∆87GAD65mut causée par le faible pH, en plus de la teneur en protéines des cellules ininterrompue11. Ces tests indiquent que lyophilisation pourrait être choisie comme traitement pour la préparation du candidat vaccin.
En outre, la charge microbienne résiduelle dans les feuilles de betterave rouge d’agroinfiltrated a été évaluée.
Le test de charge microbienne affiché que les traitements exploités pour la préparation du vaccin candidat éliminé la charge bactérienne11.
La bioéquivalence métabolique des plantes de betterave rouge ∆87GAD65mut et le contrôle a été évaluée par les empreintes digitales des métabolites primaires et secondaires et des lipides polaires produits des neuf usines de betterave rouge exprimant ∆87GAD65mut, neuf agroinfiltrated contrôles par LC-MS et neuf des contrôles de type sauvage. Statistique de l’APC a révélé une grappe de plante sauvage séparée de tous les autres échantillons. Aucune différence significative n’était plutôt mis en évidence entre les ∆87GAD65mut et les plantes témoins infiltrés et négatif. En outre, aucune différence significative entre les trois groupes de plantes en termes de profils de lipides polaires n’a identifié11.
Figure 1 : comparaison des niveaux d’expression eGFP dans agroinfiltrated rouge betterave et des épinards feuilles. Western blot analyse (A, D) et contrôles de chargement correspondants (RuBisCO grande sous-unité) colorées au bleu de Coomassie brillant bleu (B, E) des extraits protéiniques d’exprimant eGFP échantillons de feuilles collectées lors de l’analyse de l’évolution temporelle de 4 à 14 jours après l’infection (dpi). Le contenu d’eGFP de chaque extrait de protéines des feuilles a été quantifié par la mesure de la fluorescence (C, F). Les résultats des échantillons de feuilles de betterave rouge agroinfiltrated sont affichent dans le panneau de gauche, où les échantillons d’épinards agroinfiltrated figurent dans celle de droite. Des quantités égales d’extraits protéiques ont été chargés, 3,5 µg pour la tache occidentale et 30 µg pour la coloration de Coomassie. Un anticorps anti-eGFP a été utilisé comme une sonde dans l’analyse par western blot. Côté chiffres indiquent des marqueurs moléculaires de massives en kDa. c.p., contrôle positif, 10 ng de commercial GAD65 humaine recombinante ; n.c., témoin négatif, extrait de feuilles infiltrés uniquement avec a. tumefaciens transportant la 5'- et les modules de l’intégrase. Barres d’erreur représentent l’écart de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié par Bertini et al.11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : niveaux d’expression GAD65mut et Δ87GAD65mut dans les feuilles de betterave rouge. Analyse par Western blot (A) et contrôle de chargement correspondant (RuBisCo grande sous-unité) colorent au bleu de Coomassie brillant bleu (B) des extraits protéiniques de feuilles de betterave rouge trois exprimant Δ87GAD65mut (à gauche) et GAD65mut (à droite). Un anticorps anti-GAD a été utilisé comme une sonde dans l’analyse par western blot (les voies ont été chargés avec 20 μL d’extrait pour GAD65mut et 1 μL d’extrait de Δ87GAD65mut). Dans le bleu de Coomassie teinté de gel, le même volume d’extraits protéiques (10 μL/lane) a été chargé pour GAD65mut et Δ87GAD65mut. Côté chiffres indiquent des marqueurs moléculaires de massives en kDa. c.p., contrôle positif, 10 ng de commercial GAD65 humaine recombinante ; n.c., témoin négatif, extrait obtenu à partir des feuilles infiltrés seulement avec a. tumefaciens transportant la 5'- et les modules de l’intégrase. (C) en utilisant le contrôle positif de tache occidentale comme une référence pour une analyse densitométrique, les niveaux d’expression relative des formes deux protéines sont tracés. Barres d’erreur représentent l’écart de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié par Bertini et al.11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de candidat vaccin oral. Sur le côté gauche, les analyses de stabilité des protéines après lyophilisation traitement (A, B). Analyse par Western blot (A) et le gel correspondant colorent au bleu de Coomassie brillant bleu (B) ce qui représente trois indépendants extraits de feuilles exprimant Δ87GAD65mut. Les feuilles récoltées étaient directement congelés (fraîche) ou lyophilisés à-50 ° C, 0,04 mbar pendant 72 h (lyophilisées). Ratios de différents tissus : tampon ont été utilisés lors de l’extraction de c. à thé afin de tenir compte de la perte d’eau due à une déshydratation. Un volume égal d’extraits étaient chargés, 0,25 et 10 µL et tache occidentale et de bleu de Coomassie coloration respectivement. Un anticorps anti-GAD a été utilisé pour la tache occidentale sonder côté chiffres indiquent des marqueurs moléculaires de massives en kDa. n.c., témoin négatif, extrait de feuilles infiltrated uniquement avec a. tumefaciens transportant la 5'- et les modules de l’intégrase. Sur le côté droit, vitro simulé la digestion gastrique de Δ87GAD65mut (C, D, E). Buvardage de Western (C, D) et le gel correspondant colorent au bleu de Coomassie brillant bleu (E) représentant les trois indépendants extraits des feuilles exprimant Δ87GAD65mut après la digestion gastrique simulée. 1 mg/mL de pepsine a été ajoutée à 100 mg de tissu lyophilisé, tandis que d’un échantillon de contrôle sans enzyme a été utilisé. µL 24 et 16 µL, de surnageants (s) ainsi que des boulettes (p) respectivement obtenues à l’étape finale de centrifugation, ont été utilisés pour l’analyse SDS-PAGE. Anti-GAD (C) et les anticorps anti-LHCB2 (D) ont été utilisés comme sondes dans l’analyse par western blot. Côté chiffres indiquent des marqueurs moléculaires de massives en kDa. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Métabolites primaires (100 min) | Temps (min) | % A | % B | Durée (min) | Type de |
| Initiales | 0 | 100 | - | Condition initiale | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Isocratique | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | Gradient | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | Isocratique | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | Gradient | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | Isocratique | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | Gradient | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | Isocratique (re-équilibre) | |
| Métabolites secondaires (60 min) | Temps (min) | % A | % B | Durée (min) | Type de |
| Initiales | 98 | 2 | - | Condition initiale | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | Gradient | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | Gradient | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | Gradient | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | Gradient | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | Isocratique | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | Gradient | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | Isocratique | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | Gradient | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | Isocratique (re-équilibre) | |
| Lipides polaires (90 min) | Temps (min) | % A | % B | Durée (min) | Type de |
| Initiales | 50 | 50 | - | Condition initiale | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Gradient | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | Isocratique | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | Gradient | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | Isocratique (re-équilibre) |
Tableau 1 : Les conditions de Gradient d’élution du métabolite en analyse LC-MS.
| Composants de spectromètre de masse | Fonction | Paramètres | ||||
| Métabolites primaires | Métabolites secondaires | Lipides polaires | ||||
| Source d’ionisation (ESI) électrospray | Nébulisation de gaz | 50 lb/po2, 350 ° C | 50 lb/po2, 350 ° C | - | ||
| Séchage des gaz | 10 L min-1 | 10 L min-1 | ||||
| Source d’ionisation chimique (APCI) pression atmosphérique | Nébulisation de gaz | - | - | 50 lb/po2, 350 ° C | ||
| Séchage des gaz | 10 L min-1 | |||||
| Vaporisateur | 450 ° C | |||||
| Piège à ions et scan de détecteur | Mode de balayage complet | m/z 13 000 par seconde | m/z 13 000 par seconde | m/z 13 000 par seconde | ||
| 50-1 500 m/z | 50-1 500 m/z | 50-1 500 m/z | ||||
| Plage de balayage | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| Cibler la masse | ||||||
| Gaz de collision | Hélium | |||||
| Pression de vide | 1,4 x 10-5 mbar | |||||
| Source capillaire | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| Extrémité de la plaque offset | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| Écumoire | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| Sortie de cap | 106 V | -121 V | 143,5 V | |||
| Oct 1 DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| Oct 2 DC | 1.7 V | -1,7 V | 2 V | |||
| Objectif 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| Objectif 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| ICC pour le mode d’ionisation positive | 20 | |||||
| ICC pour le mode d’ionisation négative | 7 | |||||
Tableau 2 : Paramètres pour l’acquisition de spectres de masse dans les modes de rechange ionisation positive et négative.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons montré une analyse préliminaire pour la conception d’un candidat-vaccin oral pour diabète auto-immun. La protéine cible pour cette expérience a été une forme mutante de l’humain 65 kDa Glutamate Décarboxylase, dont la production et la fonctionnalité sont facilement détectable et mesurable12. Son expression dans des tissus différents végétaux comestibles a été véhiculée par les vecteurs5, qui véhiculent un haut niveau de production de protéines recombinantes dans un laps de temps très court. La sélection de la meilleure plante candidat hôte comestible s’est déroulée basé sur l’expression eGFP dans la betterave rouge et feuilles d’épinards par agroinfiltration manuelle. Cette étape pourrait être critique pour l’intensification industrielle en raison de la procédure longue d’agroinfiltration manuelle et la dureté à l’infiltration des tissus foliaires épinards.
L’identification de la dpi spécifique de récolte qui donne le plus haut niveau de l’accumulation de protéine recombinante pour une protéine recombinante est une étape critique et doivent être testés et sélectionnés sur une base de cas-par-cas. L’analyse de l’expression de la protéine fluorescente à différent PPP (à partir de 4 à 12), a permis d’identifier le jour de la plus haute expression dans chaque système plante. La comparaison entre la concentration d’eGFP µg/g (FLW), en ces jours de grande expression, mis en évidence que le rouge betterave est la plus performante plateforme en termes de rendements de la protéine recombinante.
Pour cette raison, betterave rouge a été également testé pour la livraison des vecteurs de base de virus de plante par un système d’aspiration, qui est considéré comme plus convenable pour la production industrielle à grande échelle de vaccins13.
Étant donné que le protocole standard d’infiltration sous vide est optimisé pour les espèces de tabac5, la mise en place d’une gamme de paramètres pour le réglage de la procédure à l’espèce végétale considérée est un point critique. Ensuite, la betterave rouge sous vide agroinfiltration protocole a été optimisé. Nos éléments de preuve montraient que la dilution d’Agrobacterium est cruciale pour améliorer les niveaux d’expression de protéine, alors que la concentration du détergent pour améliorer la perméabilité de la feuille. Les résultats montrent que le système d’usine et de la technologie cadrent avec cette fin de travaux.
Deux formes différentes de GAD65, GAD65mut et ∆87GAD65mut, qui ont été précédemment caractérisées par leur expression en N. benthamiana7, affichant différente localisation subcellulaire, ont été exprimées dans la betterave rouge par infiltration sous vide. Trois réplicats biologiques ont été préparées pour chaque échantillon. Chaque réplicat biologique comprend une piscine de trois feuilles de différentes plantes, échantillonnées entre 2 et 14 dpi pour les formes GAD65 d’infiltrés. Leur niveau d’expression a été comparée pour sélectionner la protéine plus forte accumulation dans les tissus végétaux.
La quantification relative par densitométrie analyse a démontré que le ∆87GAD65mut a un niveau expression 20 fois supérieur à son homologue intact. Cela pourrait être en raison de sa localisation cytosolique tandis que GAD65mut, en raison de ses résidus qui concrétisent cette forme à la membrane cellulaire, a une faible rendement7, reflétant une plus faible stabilité protéique. ∆87GAD65mut niveau de moyen d’accumulation dans les tissus foliaires de betterave rouge était légèrement supérieur à 201,4 ± 29,3 µg/g FLW, qui est suffisant pour démarrer avec le développement de vaccin oral T1D.
Enfin, après le choix de la forme de plate-forme, de technologie et de protéines plus approprié, nous avons procédé en mettant en place un traitement après récolte des feuilles infectées. Puisque les tissus foliaires sont composé de 95 % d’eau, un traitement de déshydratation est utile pour prévenir la contamination du micro-organisme. Nos résultats ont montré qu’un traitement de lyophilisation pourrait être appliqué à l’échantillon, sans affecter les niveaux de protéines recombinantes dans les feuilles. L’élimination de l’eau 10 fois par lyophilisation élimine la contamination bactérienne (charge microbienne), y compris la recombinaison a. tumefaciens utilisé pour la procédure agroinfiltration.
En outre, l’analyse de l’encapsulation de protéines bio a montré que le ∆87GAD65mut est complètement digérée après une digestion gastrique simulée. Ceci suggère que le traitement de lyophilisation endommage la paroi cellulaire végétale, exposant ainsi la protéine recombinante à la composition des acide et enzymatique du milieu gastrique.
Le maintien de l’intégrité de molécule protéique ou peptidique au cours de la transition du tractus gastro-intestinal au site d’absorption représente un problème pour la livraison de médicament par voie orale14. C’est pourquoi, après le traitement de la déshydratation, le vaccin potentiel devrait être correctement formulé pour surmonter le milieu gastrique sans perdre son intégrité. Dans la fabrication du vaccin GAD végétale, l’encapsulation dans une coquille relativement stable puisse être appliquée comme un système pour améliorer son efficacité, lui permettant d’être protégé et stable le long de la route d’administration par voie orale15.
Diverses technologies ont été explorées pour surmonter les problèmes liés à l’administration orale de macromolécules telles que des études récentes sur la complexation d’hydrogel synthétique avec l’insuline qui a montré une efficacité élevée encapsulation et d’insuline rapide libérer dans l’intestin dans une manière dépendante du pH16,17.
Les deux la bioéquivalence de métabolites primaires et secondaires des plantes exprimant ∆87GAD65mut par comparaison avec des témoins infiltrés et non infiltrées a été étudiée à l’aide de statistiques de l’APC. Les différences entre les plantes infiltrés exprimant les ∆87GAD65mut et les contrôles infiltrés n’étaient pas significatives, tandis que les plantes de type sauvage non infiltrées forment un groupe distinct. Ces résultats suggèrent que les plantes infiltrés sont distinguent des plantes non traitées par l’analyse de LC-MS grâce à des métabolites bactériens ou des métabolites produits par les plantes en raison de l’infiltration, comme déjà indiqué dans la littérature13. Dans l’ensemble, cette analyse a démontré que l’accumulation de ∆87GAD65mut a peu d’impact sur le métabolisme général.
Au total, ces résultats suggèrent que le vaccin oral potentiel, représenté par les tissus foliaires lyophilisé betterave rouge exprimant ∆87GAD65mut obtenu exploitant la technologie d’expression à base de virus de plante, caractère pour experimental T1D immunothérapie par voie orale essais. La technologie de vecteur d’expression de plante virus est devenu très attractive dans le domaine de l’expression transitoire, en raison de sa capacité à produire des protéines étrangères rapidement et à des niveaux élevés. Cette technologie est basée sur un vecteur déconstruit qui contient uniquement les ARN polymérase RNA dépendante et mouvement protéine5 et donc il perd son infectiosité chez les plantes ; en conséquence, son éventuelle transmission à l’homme doit être exclue.
Le protocole expérimental rapporté ici pourrait être étendu à plusieurs différentes espèces comestibles, comme la laitue, Chenopodium capitatum et expansa Tetragonia. Depuis les feuilles de ces espèces, y compris les betteraves rouges et épinards, dont a été détectée précédemment comme expression bonne plante systèmes5, peuvent être utilisés comme aliments non cuits, la technologie proposée ici pourrait être utilisée pour la fabrication de vaccins comestibles ou pour production d’aliments fonctionnels minimalement transformés ou aliments pour animaux.
La combinaison de la protéine recombinante/plante, dpi de récolte qui donne le plus haut niveau d’accumulation de la protéine recombinante besoin reste à déterminer empiriquement au cas par cas selon la protéine recombinante exprimée et sur l’hôte Plantez des espèces18.
L’application de cette technologie pour la production du vaccin oral tenir grand potentiel pour devenir une alternative aux vaccins classiques dans un avenir proche, en plus de virus oncolytiques combat, vaccins autologues pour les lymphomes et les tumeurs solides, et anticorps monoclonaux pour cible les cancers19,20.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet commun « L’utilisation des plantes pour la production d’un vaccin comestible de diabète auto-immun (eDIVA) » (projet ID : 891854) financé par l’Université de Vérone, dans le cadre de l’appel de 2014.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
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