Summary
Hier presenteren we een protocol voor de productie van een kandidaat van de orale vaccin tegen Type 1 diabetes in een eetbare plant.
Abstract
Plant moleculaire landbouw is het gebruik van planten voor de productie van moleculen van belang. In dit perspectief moet kunnen planten gebruikt worden als bioreactoren voor de productie en de daaropvolgende zuivering van het eindproduct en de directe mondelinge levering van heterologe eiwitten bij het gebruik van eetbare plantensoorten. In dit werk presenteren wij de ontwikkeling van een kandidaat-orale vaccin tegen Type 1 Diabetes (T1D) in de eetbare plant-systemen die gebruikmaken van gedeconstrueerd plant virus gebaseerde recombinant DNA-technologie, geleverd met vacuüm infiltratie. Onze resultaten tonen aan dat een rode biet een geschikte gastheer voor de voorbijgaande expressie van een mens afgeleide autoantigen gekoppeld aan T1D is, beschouwd als een veelbelovende kandidaat als een T1D vaccin. Bladeren produceren de autoantigen werden grondig gekenmerkt voor hun verzet tegen de maag spijsvertering, de aanwezigheid van residuele bacteriële lading en hun secundaire metabole profiel, met een overzicht van het productie proces voor de potentiële gebruik van planten voor de directe mondelinge aflevering van een heteroloog eiwit. Onze analyse toonde bijna volledige afbraak van het gevriesdroogd kandidaat-orale vaccin na een gesimuleerde maag spijsvertering, suggereert dat een strategie van de inkapseling bij de vervaardiging van de GAD plantgerelateerde vaccin vereist is.
Introduction
Sinds de plant moleculaire biologie revolutie in de jaren 1980, kunnen plant gebaseerde systemen voor de productie van biofarmaceutica worden beschouwd als een alternatief voor traditionele systemen gebaseerd op microbiële en zoogdieren cellen1. Planten display verscheidene voordelen over traditionele platformen, met schaalbaarheid, kosteneffectiviteit en veiligheid wordt de meest relevante2. De recombinante product kan worden gezuiverd van getransformeerde plant weefsel en vervolgens beheerd, ofwel parenteraal of mondeling en, bovendien, getransformeerde eetbare plant direct voor mondelinge levering kan worden gebruikt. Orale toediening bevordert tegelijkertijd mucosal en systemische immuniteit, en het elimineert de noodzaak voor naalden en gespecialiseerde medisch personeel. Bovendien elimineert mondelinge levering de complexe downstream processing, die normaal goed is voor 80% van de totale productiekosten van een recombinant eiwit3. Al deze voordelen kunnen worden vertaald in besparingen in leveringen, productie en arbeid reduceert de kosten van elke dosis, waardoor de drug betaalbaar voor de meeste van de wereldbevolking.
Verschillende strategieën, zowel voor stabiele transformatie en voorbijgaande expressie, werden ontwikkeld voor de productie van recombinante eiwitten in planten. Onder hen biedt een hoog rendement gedeconstrueerd plant virus gebaseerde expressie systeem (bijvoorbeeld magnICON) superieure prestaties leidt hoge opbrengsten van recombinante eiwitten over relatief korte tijdschalen4. Vele voorbeelden van voorbijgaande expressie met behulp van de plant virus gebaseerde expressie systeem in Nicotiana benthamiana planten worden gerapporteerd, wordt de goudstandaard productie host. Deze plant model wordt echter niet beschouwd als een eetbare soorten als gevolg van de alkaloïden en andere giftige metabolieten die zijn verzameld in zijn bladeren.
In dit werk, beschrijven we de vergelijking tussen twee eetbare plant systemen, rode biet (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) en spinazie (oleracea Spinacea cv Industria), voor de expressie van twee kandidaat-vormen van de isovorm 65 kDa van glutaminezuur decarboxylase (GAD65), uitgevoerd door de plant virus gebaseerde vectoren5. GAD65 is een grote autoantigen geassocieerd met Type 1 Diabetes (T1D) en het wordt momenteel onderzocht in klinische testen te voorkomen of vertragen T1D door inducerende tolerantie6. De productie van GAD65 in planten is uitgebreid onderzocht bij model plantensoorten als Nicotiana tabacum en N. benthamiana4,5,6,7. Hier beschrijven we het gebruik van eetbare planten voor de productie van de molecule in weefsels die kunnen worden bedoeld voor een mondelinge bericht direct te bezorgen. Vanuit een technisch oogpunt, we onderzocht en geselecteerd van het systeem voor agroinfiltration van de plant en de eetbare plant-platform voor de productie van GAD65 met een evaluatie van verschillende parameters: de recombinant eiwit expressie niveaus, de resterende microbiële lading in plant weefsels bedoeld voor mondelinge levering, de weerstand van GAD65 naar de maag spijsvertering, en de biologische equivalentie van de getransformeerde planten met de wild-type.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de rode bieten en spinazie teelt
- Rode biet groeien (B. vulgaris cv Moulin Rouge) en spinazie (S. oleracea cv Industria) planten in een zaal van de groei, met 150 µE van lichtintensiteit, 65% relatieve vochtigheid, 12 h licht/donker cyclus bij 23/21 ° C, respectievelijk.
- Na de ontkieming van zaad, bevrucht de planten twee keer per week met een oplossing van 1 g/L van een commercieel beschikbare kunstmest (Tabel van materialen). Gebruik de vijf weken oude spinazie en zes weken oude rode biet planten voor agroinfiltration.
2. Pre-steady expressie via de gedeconstrueerde plant virus gebaseerde technologie
- Bouw van plant expressievectoren
- Invoering van de vectoren - de 5' module (pICH20111), de 3' modules (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut en pICH7410.eGFP), bereid als hierboven beschreven1,2,7, en de integrase module (pICH14011)- met behulp van standaard technieken bij Agrobacterium tumefaciens GV3101 stam. Groeien op LB medium met 50 μg/mL rifampicine en geschikte vector-specifieke antibiotica (50 μg/mL carbenicillin voor pICH20111, pICH14011 en pICH7410.eGFP), 50 μg/mL kanamycine voor pICH31070 voor 2 dagen bij 28 ° C.
- Het scherm van de kolonies door met behulp van de volgende specifieke primers voor elke vector PCR van de kolonie: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' en 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' voor zowel de 3' modules pICH31070.GAD65mut en pICH31070.∆87G65mut, met een onthardende temperatuur van 55 ° C en de tijd van een rek van 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' en 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' voor de derde 3' module pICH7410.eGFP, met een onthardende temperatuur van 53 ° C en de tijd van een rek van 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' en 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' voor de 5' module, met een onthardende temperatuur van 53 ° C en een rek tijd van 20 s en 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' en 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' voor de integrase-module met een onthardende temperatuur van 57 ° C en een rek tijd van 45 s.
- Verrichten van de PCR-reactie in een totaal volume van 20 μL met behulp van de volgende cyclus van de specifieke reactie: 5 min eerste denaturatie bij 95 ° C, 35 cycli van 30 bij 95 ° C, 30 s s bij de onthardende temperatuur en de rek stap bij 72 ° C (onthardende temperatuur en rek tijd een Re specifiek voor elk paar primer) en een definitieve rek stap van 7 minuten bij 72 ° C.
- Spuit-agroinfiltration
- Enten van de drie transformants van A. tumefaciens in 50 mL LB middellange met 50 μg/mL rifampicine en de volgende geschikte vector-specifieke antibiotica: 50 μg/mL carbenicillin voor A. tumefaciens getransformeerd met pICH20111, pICH14011 of pICH7410.eGFP, of 50 μg/mL kanamycine voor A. tumefaciens getransformeerd met pICH31070. Groeien door 's nachts schudden bij 28 ° C.
- Pellet overnachting bacteriële culturen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 20 min en resuspendeer hen in 100 mL (of twee volumes van de initiële bacteriecultuur) van infiltratie buffer met 10 mM 4-morpholineethanesulfonic zuur (MES; pH 5.5) en 10 mM MgSO4, zonder te overwegen de OD600. Incubeer de schorsingen op kamertemperatuur (RT) gedurende 3 uur.
- Meng gelijke hoeveelheid bacteriële suspensies met een van de drie modules, GAD65mut, ∆87GAD65mut of eGFP 3' module, met 5' module en integrase. Gebruik de schorsing mix voor spuit infiltratie van rode bieten en spinazie bladeren.
- Plaats 5 mL van de suspensie in een injectiespuit zonder de naald. Druk op het puntje van de spuit tegen de onderkant van het blad voor zowel de spinazie en de rode biet planten, en ondertussen een zachte tegendruk van toepassing op de andere kant van het blad.
- De eerste drie volledig uitgevouwen bladeren vanaf de apex voor elke plant te infiltreren. Label de bladeren van de agroinfiltrated met een papier-tag op de steel van het blad. De planten in een kamer van de groei onder standaardomstandigheden retourneren
Opmerking: Om redenen van gezondheid en veiligheid, draag een veiligheidsbril en handschoenen tijdens infiltratie. - Verzamelen agroinfiltrated laat van 4 tot 14 dagen na infectie (dpi) en bevriezen ze in vloeibare stikstof. Winkel plant weefsel bij-80 ° C.
- Vacuüm agroinfiltration
- Afzonderlijk de drie A. tumefaciens transformants in 50 mL LB opslagmedium met 50 μg/mL rifampicine en geschikte vector-specifieke antibiotica groeien door 's nachts schudden bij 28 ° C.
- Pellet overnachting bacteriële culturen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 20 min. resuspendeer de pellet in 1 L voor infiltratie buffer een OD-600 voor 0.35 en Incubeer de schorsingen op RT gedurende 3 uur.
- 0,01% (v/v) van het wasmiddel (Polysorbaat 20) aan elk schorsing toevoegen. Meng gelijke hoeveelheid bacteriële suspensies met een van de drie modules, GAD65mut, ∆87GAD65mut of eGFP 3' module, met 5' module en integrase.
- Invoegen van een plant (zes weken oude rode biet plant, zie paragraaf 1) in de houder. Omkeren van de houder en plaats op de top van een bekerglas van de infiltratie-bad (2 L) te dompelen de bladeren in de schorsing van de infiltratie.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle bladeren volledig worden ondergedompeld in de bacteriële suspensie. Het beter met de toevoeging van extra infiltratie schorsing te verhogen indien nodig. - De infiltratie bad met de verzonken plant overbrengen in de zaal van de infiltratie, en sluit het. Zet de vacuümpomp en open de klep van de vacuüm inname op de kamer van de infiltratie.
- Zodra de druk in de infiltratie kamer heeft beperkt tot 90 mbar, houden het vacuüm voor 3 min. Release het vacuüm voor 45 s. Zodra de infiltratie kamer is teruggekeerd naar de atmosferische druk, de zaal open en verwijderen van de geïnfiltreerde plant uit het bacteriële bad.
- De planten in een kamer van de groei onder standaardomstandigheden retourneren
- Agroinfiltrated bladeren op de maximale expressie dpi, afhankelijk van de recombinante eiwitten, verzamelen en bevriezen ze in vloeibare stikstof. Winkel plant weefsel bij-80 ° C.
3. recombinant eiwit expressie analyse
- Totale oplosbaar eiwit (TSP) extractie
- Slijpen van de spuit of vacuüm geïnfiltreerd rode bieten en spinazie bladeren, verzameld in stappen 2.2.6 en 2.3.8, tot fijn poeder in vloeibare stikstof met mortier en een stamper. Breng het poeder in 15 mL plastic buizen en op te slaan van het materiaal bij-80 ° C.
- Voeg 900 µL van extractie buffer (50 mM natriumfosfaat pH 8.0, 20 mM Natriummetabisulfiet) tot 300 mg blad poeder.
Opmerking: De geselecteerde verhouding tussen plant weefsel gewicht (mg) buffervolume (µL) is 1:3. - Meng het mengsel door de vortexing voor 1 min en centrifugeer bij 30.000 x g gedurende 40 min bij 4 ° C.
- De bovendrijvende vloeistof in een schone buis verzamelen en opslaan bij-80 ° C.
- Plant eGFP visualisatie en kwantificering
- Laden 100 µL van elke TSP-extract verkrijgbaar bij eGFP bladeren, in drie technische replicaten, uiten op een 96-wells-plaat.
- Leg de 96-wells-plaat in een fluorescentie-lezer en begin van de meting. Gebruik de 485/535 nm filter nodig voor de detectie van eGFP fluorescentie instellen.
- Voor de absolute kwantificering, in de dezelfde plaat bereiden een kalibratiekromme laden verschillende hoeveelheden (62,5, 125, 500, 750 en 1000 ng) van een gezuiverde eGFP.
- Bicinchoninic zuur (BCA) assay voor Theelepel kwantificering
- Meng 50 delen van reagens A (Tabel of Materials) met 1 deel van reagens B (Tabel van materialen). Voldoende hoeveelheid verse BCA werkoplossing voorbereiden op de monsters te worden bepaald en de normen van de kalibratie.
Opmerking: Het volume van de BCA werkoplossing vereist voor elk monster is 1.9 mL. Voor de standaardprocedure met 9 normen (inclusief een spatie), is 17.1 mL van de werkoplossing BCA vereist. - Pipetteer 0,1 mL van elk standaard (inclusief een spatie) en Theelepel extracten in een gelabelde buis.
Opmerking: Als kalibratie standaarden, bereiden een verse set van bovien serumalbumine (BSA) normen in de 10-1000 μg/mL bereik, bij voorkeur met hetzelfde verdunningsmiddel als monsters, zoals water. De blanco bestaat uit 0,1 mL van het oplosmiddel gebruikt voor ijkstandaard en bereiding van de monsters. - Voeg 1.9 mL van de werkoplossing BCA en meng. Bedek de buizen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Koel de buizen aan RT. maatregel de absorptie bij 562 nm van alle monsters binnen 10 min.
Opmerking: Zelfs bij RT, de ontwikkeling van kleur blijft. Geen significante tekortkomingen zullen worden ingevoerd indien de absorptie metingen van alle buizen zijn gedaan binnen 10 min. - Aftrekken van de 562 nm extinctie waarde van de blanco uit de lezingen van de normen en de TSP-extracten.
- Plot de blanco-gecorrigeerde 562 nm lezen voor elke standaard op de concentratie ervan. Bepaal de eiwitconcentratie voor elke TSP-extract.
- Meng 50 delen van reagens A (Tabel of Materials) met 1 deel van reagens B (Tabel van materialen). Voldoende hoeveelheid verse BCA werkoplossing voorbereiden op de monsters te worden bepaald en de normen van de kalibratie.
- Coomassie gel kleuring zoals eerder is beschreven in Gecchele et al.8uit te voeren.
- Westelijke vlekkenanalyse
- De westelijke vlekkenanalyse zoals eerder beschreven in Gecchele et al.8uit te voeren.
- Na de elektroforetische scheiding van proteïnen, kunt u dat overbrengt naar een membraan van de nitrocellulose met standaardtechnieken. Bereid de blokkerende oplossing door het mengen van 4% melk in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7.4. Het blokkeren van het membraan met 10 mL van de blokkerende oplossing bij RT gedurende 1 uur.
- Het primaire antilichaam van konijn op 1:10,000 voor de anti-GAD65/67 en anti-LHCB2 en op 1:20,000 voor de anti-eGFP in 5 mL van blokkerende oplossing met 0,1% wasmiddel voor te bereiden. Incubeer het membraan met de oplossingen van de bereid primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C of gedurende 4 uur bij RT met constante agitatie.
- Het primaire antilichaam negeren en wassen van het membraan 3 keer voor elke 5 min met blokkerende oplossing die 0,1% wasmiddel.
- Bereiden de horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerde antilichaam van de anti-konijn op 1:10,000 in het blokkeren van de oplossing met 0,1% wasmiddel. Incubeer het membraan gedurende 1,5 uur op RT met constante agitatie.
- Het secundaire antilichaam negeren en het membraan 5 keer voor 5 min met PBS-T (PBS aangevuld met 0,1% afwasmiddel) wassen.
- Incubeer het membraan met een oplossing van de verkrijgbare luminol na instructies van de fabrikant. Het signaal dat met behulp van een chemiluminescentie imaging systeem te detecteren.
4. plant materiaalverwerking
- Oogst de vacuüm agroinfiltrated uiten van ∆87GAD65mut rode biet verlaat op het hoogtepunt van de expressie (11 dpi) en bevriezen ze in vloeibare stikstof.
- Lyophilize de bevroren bladeren gedurende 72 uur bij-50 ° C en 0,04 mbar. Bewaar ze bij-80 ° C.
- De bladeren tot fijn poeder vermalen en sla het op RT in een verzegelde container met silica gel filter uit te sluiten van het vocht.
5. de maag spijsvertering simulatie en cel integriteit analyse
- Maag spijsvertering simulatie
- Weeg 100 mg van gemalen gevriesdroogde rode biet bladeren en resuspendeer het in 6 mL PBS (pH 7.4).
- Breng de pH van de steekproef op 2 met 6 M HCl.
- Voeg 4 mg/mL pepsine van varkens maagslijmvlies in 10 mM HCl een definitieve pepsine concentratie van 1 mg/mL of een verhouding van 1:20 tot totale oplosbare eiwitten te verkrijgen. Schud het monster bij 37 ° C gedurende 120 minuten.
- Aanpassen van de monsters naar pH 8 met 1 M NaOH aan de inactivering van de pepsine.
- Centrifugeer 750 µL aliquots van elk monster bij 20.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verzamelen afzonderlijk het supernatant en resuspendeer de pellet in één supernatant volume van het laden van de buffer (1,5 M Tris-HCl, pH 6.8, 3% SDS, 15% glycerol en 4% 2-mercaptoethanol).
Opmerking: Om redenen van gezondheid en veiligheid, Draag handschoenen en werken onder de zuurkast voor de bereiding van de monsters. - Zowel het supernatant en de geresuspendeerde pellet analyseren met westelijke vlek analyse8.
- Cel integriteit analyse
- Bereiden van twee monsters van 100 mg van gemalen gevriesdroogde rode biet bladeren en resuspendeer zowel in 6 mL PBS (pH 7.4).
- Breng de pH van alleen een sample 2 met 6 M HCl. schudden beide monsters bij 37 ° C gedurende 120 minuten.
- Centrifugeer 750 µL aliquots van elk monster bij 20.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verzamel afzonderlijk het supernatant en resuspendeer de pellet in één supernatant volume van het laden van de buffer.
- Zowel het supernatant en de geresuspendeerde pellet analyseren met westelijke vlekkenanalyse.
6. Bioburden test
- Weeg 100 mg van gevriesdroogde rode biet bladeren. Resuspendeer de poeder in 8 mL steriel PBS (pH 7.4) en vortex voor 1 min.
- Bereiden de LB-medium zonder antibiotica of met (i) 50 µg Mo/mL rifampicine, (ii) 50 µg/mL elke van rifampicine en carbenicillin, (iii) 50 µg/mL elke rifampicine en kanamycine of (iv) 50 µg/mL elke rifampicine, carbenicillin en kanamycine.
- Plaat 1 mL van elk gevriesdroogd blad homogenaat in één van de 5 selectieve LB-media.
- Alle platen Incubeer gedurende 3 dagen bij 28 ° C.
- Tellen de Agrobacterium koloniën verbouwd op elke plaat.
- Berekenen en de resterende bacteriële lading definiëren als het aantal kolonie vormende eenheden (kve) per mL van het gelyofiliseerde blad homogenaat (CFU/mL).
7. metaboliet extractie
- Extractie van de primaire metaboliet
- Weeg 30 mg-80 ° C opgeslagen, vacuüm ∆87GAD65mut-uiting van agroinfiltrated rode biet blad poeder in een plastic buis van 2 mL.
- Voeg 750 µL van koude 70/30 (v/v) methanol/chloroform en vortex voor 30 s. Incubate bij-20 ° C gedurende 2 uur.
Opmerking: Alle oplosmiddelen en additieven moet LC-MS rang. - Voeg 600 µL van koud water en centrifugeer bij 17,900 x g bij 4 ° C gedurende 10 min. verzamelen en overdracht van de bovenste hydroalcoholic fase in een nieuwe 2 mL-buis. De lagere chloroformic fase en de interfase negeren.
- Zet de monsters in een vacuüm concentrator voor 3 h te verdampen de oplosmiddelen.
- Los van de pellet verkregen stap 7.1.4 in 300 µL van 50/50 (v/v) acetonitril/water en bewerk ultrasone trillingen ten de monsters gedurende 3 minuten.
- De oplossingen passeren 0.2 micrometer membraanfilters en zet ze in een transparante vaste 300 µL invoegen glazen buizen.
- Secundaire metaboliet extractie
- Weeg 300 mg-80 ° C opgeslagen, vacuüm ∆87GAD65mut-uiting van agroinfiltrated rode biet blad poeder in een plastic tube van 15 mL.
- Voeg 3 mL methanol, vortex voor 30 s, en bewerk de ultrasone trillingen ten op 40 kHz voor 15 min.
Opmerking: Alle oplosmiddelen en additieven moet LC-MS rang. - Centrifugeer de monsters bij 4.500 x g bij 4 ° C voor 10 min en breng het supernatant in nieuwe 15 mL buizen.
- Verdunde 100 µL extract 1:3 (v/v) met water en laat de oplossing door een membraanfilter van 0.2 micrometer.
- Zet de oplossing in een transparante vaste 300 µL invoegen glazen buis.
- Polar lipide extractie
- Weeg 200 mg-80 ° C opgeslagen, vacuüm ∆87GAD65mut-uiting van agroinfiltrated rode biet blad poeder in een plastic tube van 15 mL.
- Voeg 200 µL van water en vervolgens 2 mL methanol, en dan houd op ijs gedurende 1 uur.
Opmerking: Alle oplosmiddelen en additieven moet LC-MS rang. - Vortex voor 30 s en bewerk ultrasone trillingen ten op 40 kHz voor 15 min.
- Centrifugeer de monsters bij 4.500 x g bij 4 ° C voor 25 min. verzamelen en de overdracht de chloroformfase in 2 mL buizen. De bovenste hydroalcoholic fase en de interfase negeren.
- Zet de monsters in een vacuüm concentrator voor 3 h te verdampen van het oplosmiddel.
- Los de pellet verkregen stap 7.3.5 met 600 µL van methanol.
- Verdunde 100 µL extract 1:5 (v/v) met methanol en laat de oplossing door een membraanfilter van 0,2-μm.
- Zet de oplossing in een transparante vaste 300 µL invoegen glazen buis.
8. vloeistofchromatografie massaspectrometrie analyse en verwerking van gegevens
- Opzetten van de LC-MS-systeem, zoals aanbevolen door de leverancier.
Opmerking: De LC-sectie bestaat uit een combinatie met HPLC uitgerust met een voorkolom C18 (75 x 2.1 mm, deeltje grootte 5 µm) tegenover een C18-kolom (150 x 2.1 mm, deeltje grootte 3 µm) voor de analyse van secundaire metabolieten en polar lipiden autosampler , overwegende dat met een HILIC voorkolom (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) tegenover een HILIC kolom (150 x 2.1 mm, deeltje grootte 2.7 µm). De MS is een ion trap massaspectrometer voorzien van ofwel een electrospray ionisatie (ESI) of een atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) bronnen. - De geschikte oplosmiddelen voorbereiden op de hellingen van HPLC. Voor de analyse van de belangrijkste metaboliet, 20 mM ammonium formate te gebruiken als oplosmiddel A; 95% acetonitril, 5% water plus 10 mM ammonium formate als oplosmiddel B. Gebruik secundaire metaboliet p.a., water plus 0.05% mierenzuur (A) en acetonitril plus 0.05% mierenzuur (B). Gebruik voor de analyse van de polar lipide, water plus 0.05% mierenzuur (A) en 100% acetonitril (B).
Opmerking: De oplosmiddelen en van additieven moet LC-MS rang. - Gebruik de verlopen gemeld in tabel 1 voor metaboliet elutie. De stroom snelheid 0,2 mL/min. injecteren 10 µL van elk monster voor zowel secundaire metabolieten en polar lipiden, overwegende dat verzameling injecteren 5 µL voor primaire metabolieten.
- Bereid een steekproef van de kwaliteitscontrole (QC) door het mengen van gelijke porties van verschillende monsters om een representatieve mengsel van elke experimentele voorwaarde. De QC-monsters analyseren tijdens het experiment om te controleren van de efficiëntie van het instrument. Specifiek, een analyse van het monster QC invoegen na elke 10 monster-partij.
- Randomize de monsters ter vermijding van instrument-gedreven effecten.
- Na 9 analyses, het invoegen van een kolom schoonmaak methode en een lege analyse onmiddellijk na.
Opmerking: Voer een traag verloop tussen de twee oplosmiddelen met een isocratic elutie op hoog percentage van het sterkste oplosmiddel. De blanco bestaat uit een injectie van een methanol, chemisch zuiver: water (50/50, v/v) ter verbetering van de retentie tijd reproduceerbaarheid in de volgende analyse. - Instellen van het instrument te verwerven massaspectra in alternatieve positieve en negatieve ionisatie modi met behulp van de parameters vermeld in tabel 2.
Opmerking: Andere parameters afhankelijk van de specifieke platform. - De volgende gegevensverwerking uitvoeren zoals uiteengezet in Dal Santo et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit werk, wordt de workflow voor de ontwikkeling van een orale vaccin in eetbare plantaardige weefsels gepresenteerd. De focus van dit werk is de uitdrukking van een doel-proteïne in een eetbare host plantensoorten en de karakterisatie van het potentiële orale vaccin.
De eerste stap bij de beoordeling van de geschiktheid van de plant expressie virus gebaseerde technologie voor de productie van recombinante eiwitten in eetbare plant systemen betrokken. Voor dit doel, we eerst de eGFP te gebruiken als een model-eiwit en we het uitdrukte in twee systemen van eetbare groene planten: rode biet en spinazie. Planten werden handmatig agroinfiltrated met schorsingen van A. tumefaciens eGFP recombinante expressievectoren uitvoering. De fluorescerende eiwituitdrukking werd gevisualiseerd door westelijke vlekkenanalyse (figuur 1A, B, D, E) en gekwantificeerd onder UV-licht. Resultaten toonden aan dat het systeem van de rode biet wordt gekenmerkt door een hogere expressie van eGFP, bereiken van 544.9 ± 10,9 µg/g vers blad gewicht (FLW) met 9 dpi (Figuur 1 c), dan de spinazie, welke maximale eGFP niveaus (113,4 ± 0,3 µg/g FLW) werden gemeten op 11 dpi ( Figuur 1F). Om deze redenen werd de rode biet geselecteerd als expressie gastheer voor alle latere experimenten.
Volgens Chen et al.10, werd de voorbijgaande expressie van eGFP getest door een vacuüm methode voor infiltratie, die meer geschikt is voor de grootschalige productie van vaccins. Verschillende verdunningen van de overnachting A. tumefaciens cultuur, variërend van 10-1 tot 10-3, en verschillende concentraties van wasmiddel (0.005-0,05%) zijn getest door het vergelijken van het niveau van de accumulatie van eGFP op de maximale expressie dpi (9 dpi). Uit de resultaten bleek dat hogere bacteriële titers geproduceerd grotere eGFP opbrengsten (10-1 ~ 0,35). Echter werden geen significante verschillen gevonden met behulp van verschillende wasmiddel concentraties (gegevens niet worden weergegeven).
Vervolgens werden de planten vacuüm geïnfiltreerd met een A. tumefaciens ophangingen 0.35 OD600 en 0,01% van wasmiddel. Zodra het expressie-platform en het uitvoeringssysteem werden opgericht, de uitdrukking van de twee vormen van GAD65, GAD65mut en een N-terminaal afgekapt formulier (∆87GAD65mut), werd vergeleken bij de dag van maximale expressie, 5 en 11 dpi, respectievelijk als eerder opgericht11. Nadat de TSP-extractie van agroinfiltrated verlaat, alle monsters werden geanalyseerd door westelijke vlek en de recombinante eiwitten was relatief gekwantificeerd door een densitometrie analyse (Figuur 2). Resultaten gemarkeerd de 20-fold hogere prestaties van de vorm van de ∆87GAD65mut over de GAD65mut. De afgeknotte vorm werd daarom geselecteerd als kandidaat van voorkeur orale vaccin, accumuleren zo hoog als 201.4 ± 29,3 µg/g FLW in rode biet bladeren met 11 dpi.
Tot slot, de parameters voor de ontwikkeling van een potentiële orale vaccin werden beoordeeld. De integriteit van de recombinant eiwit nadat vriesdrogen van vacuüm geïnfiltreerd rode biet bladeren uiting van ∆87GAD65mut in vergelijking met de onbehandelde (alleen bevroren) evalueerden weefsel, door westelijke vlekkenanalyse. Zoals blijkt uit figuur 3A, het doel eiwit aangetoond dat zij stabiel na het proces van lyofilisatie.
De simulatie van de maag spijsvertering werd uitgevoerd op het gevriesdroogd materiaal door varkens maag enzym pepsine toe te voegen aan een definitieve concentratie van 1 mg/mL of bij een verhouding van 1:20 tot Theelepel. Beide voorwaarden spijsvertering behandeling resulteerde in de recombinant eiwit-afbraak, zoals blijkt uit de westelijke vlekkenanalyse (Figuur 3 c, D, E, gegevens gerapporteerd, alleen voor de pepsine-eindconcentratie van 1 mg/mL). Het ontbreken van een specifieke signaal in de pellet monsters nadat de pepsine spijsvertering (rijstroken pepsine, p 1-3), gesuggereerd dat na het vriesdrogen behandeling, de plantencellen verloren hun integriteit, wat leidt tot de afbraak van doel eiwit.
De evaluatie van cel integriteit is gebleken dat wanneer gedroogde plant weefsel was geresuspendeerde in buffer met neutrale pH (pH 7.4), ∆87GAD65mut was gedeeltelijk ontbindend, suggereren dat op zijn minst enige cellen werden gebroken tijdens blad slijpen en drogen. De resuspensie van weefsel van de gedroogde plant in zure omstandigheden, in plaats daarvan geleid tot de opsporing van de ∆87GAD65mut alleen in de onoplosbare Fractie. Dit was waarschijnlijk te wijten aan de precipitatie van de ∆87GAD65mut veroorzaakt door de lage pH, naast het eiwitgehalte van ongebroken cellen11. Deze tests geven aan dat freeze drogen kan worden geselecteerd als behandeling voor de voorbereiding van de kandidaat vaccin.
Bovendien, de resterende microbiële lading in de agroinfiltrated rood-bieten bladeren werd geëvalueerd.
De bepaling van indicatoren weergegeven dat de behandelingen gebruikt voor de voorbereiding van kandidaat vaccin geëlimineerd de bacteriële verontreiniging11.
De metabole bio-equivalentie van ∆87GAD65mut en controle rode biet planten werd beoordeeld door vingerafdrukken van primaire en secundaire metabolieten en polar lipiden gegenereerd door LC-MS uit negen rode biet planten uiting van ∆87GAD65mut, negen agroinfiltrated controles en negen wild-type besturingselementen. PCA statistiek bleek een cluster van de wild-type plant gescheiden van alle andere monsters. Geen significante verschillen waren in plaats daarvan gewezen op tussen de ∆87GAD65mut en de geïnfiltreerde en negatieve controle planten. Bovendien werd geen significant verschil tussen de drie groepen van planten in termen van polar lipidenprofielen geïdentificeerde11.
Figuur 1: vergelijking van eGFP expressie niveaus in agroinfiltrated rode bieten en spinazie verlaat. Western blot analyse (A, D) en bijbehorende laden besturingselementen (RuBisCO grote subeenheid) gekleurd met Coomassie briljant blauw (B, E) van eiwit extracten uit te drukken van eGFP blad monsters verzameld tijdens de analyse tijdsverloop van 4 tot en met 14 dagen post infectie (dpi). Het eGFP gehalte van elk blad eiwit extract werd gekwantificeerd door fluorescentie-meting (C, F). De resultaten van agroinfiltrated rood-bieten bladeren monsters worden weergegeven in het linker paneel, waar de agroinfiltrated spinazie monsters worden getoond in de juiste is. Gelijke hoeveelheden van eiwithoudende extracten zijn geladen, 3,5 µg voor de westelijke vlek en 30 µg voor de Coomassie kleuring. Een anti-eGFP antilichaam is gebruikt als een sonde in de westelijke vlekkenanalyse. Kant aantallen wijzen op moleculaire massa merkers in kDa. pct., positieve controle, 10 ng van commerciële recombinante menselijke GAD65; n.c., negatieve controle, extract van bladeren geïnfiltreerd uitsluitend met A. tumefaciens uitvoering de 5'- en integrase modules. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Bertini et al.11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: GAD65mut en Δ87GAD65mut expressie niveaus in rode biet bladeren. Westelijke vlekkenanalyse (A) en bijbehorende laden besturingselement (RuBisCo grote subeenheid) gekleurd met Coomassie briljant blauw (B) van eiwithoudende extracten uit drie rode biet bladeren Δ87GAD65mut (links) en GAD65mut (rechts). Een anti-GAD antilichaam is gebruikt als een sonde in de westelijke vlekkenanalyse (de rijstroken waren geladen met 20 μL van extract voor GAD65mut en 1 μL van extract voor Δ87GAD65mut). Dezelfde hoeveelheid eiwit extracten (10 μL/lane) werd de Coomassie gel gekleurd, geladen voor GAD65mut en Δ87GAD65mut. Kant aantallen wijzen op moleculaire massa merkers in kDa. pct., positieve controle, 10 ng van commerciële recombinante menselijke GAD65; n.c., negatieve controle, verkregen uit bladeren geïnfiltreerd alleen met A. tumefaciens uitvoering de 5' extract- en integrase modules. (C) gebruiken de westelijke vlek positieve controle als een referentie voor een densitometric analyse, de relatieve expressie-niveaus van de twee eiwitten vormen worden getekend. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Bertini et al.11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Orale vaccin kandidaat-evaluatie. Aan de linkerzijde, analyses van eiwitstabiliteit na vriesdrogen behandeling (A, B). Westelijke vlekkenanalyse (A) en bijbehorende gel gekleurd met Coomassie briljant blauw (B) drie onafhankelijke extracten uit bladeren uiting van Δ87GAD65mut vertegenwoordigen. Geoogste bladeren werden direct bevroren (vers) of gelyofiliseerd bij-50 ° C, 0,04 mbar voor 72 h (gevriesdroogde). Verschillende weefsel: buffer ratio's werkten tijdens de TSP-winning om te overwegen het waterverlies als gevolg van uitdroging. Gelijk volume van fragmenten werden geladen, 0,25 en 10 µL, voor westelijke vlek en Coomassie respectievelijk kleuring. Een anti-GAD antilichaam is gebruikt voor de westelijke vlek indringende kant aantallen wijzen op moleculaire massa merkers in kDa. n.c., negatieve controle, uittreksel van de bladeren infiltrated uitsluitend met A. tumefaciens uitvoering de 5'- en integrase modules. Aan de rechterkant, in vitro gesimuleerde maag spijsvertering van Δ87GAD65mut (C, D, E). Westelijke vlek-analyses (C, D) en bijbehorende gel gekleurd met Coomassie briljant blauw (E) vertegenwoordigen drie onafhankelijke extracten van bladeren Δ87GAD65mut uiten na gesimuleerde maag spijsvertering. 1 mg/mL pepsine is toegevoegd aan 100 mg gelyofiliseerd weefsel, terwijl een controlemonster zonder enzym is gebruikt. 24 µL en 16 µL, voor supernatant (s) en pellets (p) respectievelijk verkregen in de definitieve centrifugeren stap, zijn gebruikt voor de analyse van de SDS-pagina. Anti-GAD (C) en anti-LHCB2 (D) antistoffen werden gebruikt als sondes in de westelijke vlekkenanalyse. Kant aantallen wijzen op moleculaire massa merkers in kDa. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Primaire metabolieten (100 min) | Tijd (min) | % A | % B | Duur (min) | Type |
| Eerste | 0 | 100 | - | Eerste voorwaarde | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Isocratic | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | Verloop | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | Isocratic | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | Verloop | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | Isocratic | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | Verloop | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | Isocratic (re-evenwicht) | |
| Secundaire metabolieten (60 min) | Tijd (min) | % A | % B | Duur (min) | Type |
| Eerste | 98 | 2 | - | Eerste voorwaarde | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | Verloop | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | Verloop | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | Verloop | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | Verloop | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | Isocratic | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | Verloop | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | Isocratic | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | Verloop | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | Isocratic (re-evenwicht) | |
| Polar lipiden (90 min) | Tijd (min) | % A | % B | Duur (min) | Type |
| Eerste | 50 | 50 | - | Eerste voorwaarde | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Verloop | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | Isocratic | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | Verloop | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | Isocratic (re-evenwicht) |
Tabel 1: Verloop voorwaarden metaboliet elutie in LC-MS-analyse.
| Massaspectrometer onderdelen | Functie | Parameters | ||||
| Primaire metabolieten | Secundaire metabolieten | Polar lipiden | ||||
| Electrospray ionisatie (ESI) bron | Nebulizing gas | 50 psi, 350 ° C | 50 psi, 350 ° C | - | ||
| Drogen van gas | 10 L min-1 | 10 L min-1 | ||||
| Luchtdruk chemische ionisatie (APCI) bron | Nebulizing gas | - | - | 50 psi, 350 ° C | ||
| Drogen van gas | 10 L min-1 | |||||
| Vaporizer | 450 ° C | |||||
| Ion trap en detector scannen | Volledige scanmodus | 13.000 m/z per seconde | 13.000 m/z per seconde | 13.000 m/z per seconde | ||
| 50-1.500 m/z | 50-1.500 m/z | 50-1.500 m/z | ||||
| Scan bereik | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| Doel van de massa | ||||||
| Botsing gas | Helium | |||||
| Vacuüm druk | 1.4 x 10-5 mbar | |||||
| Capillaire bron | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| De verschuiving van de eind-plaat | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| Skimmer | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| GLB afsluiten | 106 V | -121 V | 143,5 V | |||
| Okt 1 DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| 2 oktober DC | 1.7 V | -1,7 V | 2 V | |||
| Lens 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| Lens 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| ICC voor positieve ionisatie-modus | 20 | |||||
| ICC voor negatieve ionisatie-modus | 7 | |||||
Tabel 2: Parameters voor massaspectra acquisitie in alternatieve positieve en negatieve ionisatie modi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie toonden we voorlopige analyse voor het ontwerp van een kandidaat-orale vaccin voor auto-immuunziekte diabetes. De proteïne van de doelgroep voor dit experiment was een gemuteerde vorm van het menselijke 65 kDa glutamaat Decarboxylase, welke productie en functionaliteit zijn dan gemakkelijk waarneembare en meetbare12. De expressie in de weefsels van verschillende eetbare plant was gemedieerd door de vectoren5, die een hoog niveau van de productie van recombinante eiwitten in een zeer kort tijdsbestek bemiddelen. De selectie van de beste kandidaat plant eetbare host werd uitgevoerd op basis van de expressie van eGFP in rode biet en spinazie bladeren door handmatige agroinfiltration. Deze stap kan worden cruciaal voor industriële schaal-up vanwege de tijdrovende procedure voor handmatige agroinfiltration en de hardheid in spinazie blad weefsel infiltratie.
De identificatie van de specifieke dpi van de oogst die het hoogste niveau van recombinante eiwitten accumulatie geeft voor een recombinant eiwit is een cruciale stap en moeten worden getest en geselecteerd op basis van de case-by-case. De analyse van de fluorescerende eiwit expressie op verschillende dpi (van 4 tot en met 12), mag de dag van maximale expressie identificeren in elk systeem van de plant. De vergelijking tussen de concentratie van eGFP (µg/g FLW), in deze dagen van maximale expressie, benadrukt dat rode bieten is de best presterende platform op het gebied van recombinante eiwitten opbrengsten.
Om deze reden werd rode biet verder getest voor de levering van plant virus gebaseerde vectoren door een vacuümsysteem, die wordt beschouwd als meer geschikt voor vaccin industriële productie op grote schaal13.
Gezien het feit dat het protocol van de standaard vacuüm infiltratie is geoptimaliseerd voor tabak soorten5, is de opzet van een aantal parameters voor de aanpassing van de procedure aan de plantensoorten beschouwd als een kritiek punt. Vervolgens is het rode biet vacuüm agroinfiltration protocol geoptimaliseerd. Ons bewijs bleek dat de Agrobacterium verdunning cruciaal is voor het verbeteren van de eiwitniveaus voor expressie, terwijl de wasmiddel concentratie te vergroten van de permeabiliteit van het blad. De resultaten toonden aan dat het systeem van de plant en de technologie die passen bij het doel van dit werk.
Twee verschillende vormen van GAD65, GAD65mut en ∆87GAD65mut, die eerder werden gekenmerkt voor hun uitdrukking in de N. benthamiana7, weergeven van verschillende sub cellulaire lokalisatie, werden uitgedrukt in rode biet door vacuüm infiltratie. Drie biologische replicatieonderzoeken waren voorbereid op elke steekproef. Elke biologische repliceren bestaat uit een pool van drie geïnfiltreerde bladeren van verschillende planten, bemonsterd van 2 tot 14 dpi voor zowel de GAD65 vormen. Schakel het hoogste accumuleren eiwit in plantaardige weefsels was ten opzichte van hun niveau van expressie.
De relatieve kwantificering door densitometrie analyse blijkt dat de ∆87GAD65mut een 20-fold hoger niveau van expressie dan haar intact tegenhanger heeft. Dit zou kunnen worden als gevolg van haar cytosolische lokalisatie terwijl GAD65mut, als gevolg van de residuen die verankeren van dit formulier aan de celmembraan, heeft een lagere opbrengst van7, als gevolg van een lagere eiwitstabiliteit. ∆87GAD65mut gemiddelde accumulatie niveau van rode biet blad weefsel was 201.4 ± 29,3 µg/g FLW, die voldoende is om te beginnen met de ontwikkeling van de orale vaccin T1D.
Ten slotte, na de selectie van de meest geschikte platform, de technologie en de eiwitten vorm, we overgegaan door het opzetten van een behandeling na de oogst van de besmette bladeren. Omdat blad weefsel voor 95% water bestaat, is een behandeling van uitdroging nuttig om verontreiniging van het micro-organisme te voorkomen. Onze resultaten aangetoond dat een freeze-drying behandeling kan worden toegepast op het voorbeeld, zonder dat de niveaus van recombinante eiwitten in de bladeren. Het 10-fold water verwijderen door lyofilisatie elimineert de bacteriële besmetting (bioburden), met inbegrip van de recombinante A. tumefaciens gebruikt voor de agroinfiltration procedure.
Bovendien, de analyse van eiwit bio inkapseling bleek dat de ∆87GAD65mut wordt volledig verteerd na een gesimuleerde maag spijsvertering. Dit suggereert dat de freeze-drying behandeling schadelijk is voor de celwand van de planten, de recombinante eiwitten aan de samenstelling van het zuur en enzymatische van de maag omgeving bloot.
De handhaving van de proteïne of peptide molecuul integriteit over de overgang van de gastro-intestinale tractus naar de site van absorptie vertegenwoordigt een probleem voor mondelinge drug delivery14. Vandaar, na uitdroging behandeling, de mogelijke vaccin moet worden correct geformuleerd om te overwinnen de maag omgeving zonder verlies van zijn integriteit. Bij de vervaardiging van de GAD plantgerelateerde vaccin, worden de inkapseling in een relatief stabiele shell als een systeem ter verbetering van haar efficiëntie toestaand het om te worden beschermd en stabiele langs de mondelinge levering route15toegepast.
Verschillende technologieën werden onderzocht om te overwinnen van de problemen in verband met de mondelinge levering van macromoleculen zoals sommige recente studies over kleurverandering van synthetische hydrogel met insuline die een hoge inkapseling efficiëntie toonde en snelle insuline laat in de darm van een pH-afhankelijke manier16,17.
Zowel de primaire en secundaire metaboliet bio-equivalentie van planten uiting van ∆87GAD65mut in vergelijking met geïnfiltreerde en niet-geïnfiltreerd besturingselementen werd onderzocht met behulp van statistieken van de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst. De verschillen tussen de geïnfiltreerde planten uiting van ∆87GAD65mut en de geïnfiltreerde besturingselementen waren niet significant, overwegende dat de niet-geïnfiltreerd wild-type planten gevormd een afzonderlijk cluster. Deze resultaten suggereren dat de geïnfiltreerde planten worden onderscheiden van onbehandeld planten door de analyse van de LC-MS dankzij bacteriële metabolieten of metabolieten door planten geproduceerde vanwege de infiltratie, zoals reeds in de literatuur13. Over het algemeen deze analyse aangetoond dat de accumulatie van ∆87GAD65mut weinig invloed op de algehele stofwisseling heeft.
Over het geheel genomen suggereren deze resultaten dat het potentiële orale vaccin, vertegenwoordigd door gevriesdroogde rode biet blad weefsel uitdrukken ∆87GAD65mut verkregen van de plant expressie virus gebaseerde technologie, leent zich voor experimentele T1D mondelinge immunotherapie proeven. De plant virus expressie vector technologie is zeer aantrekkelijk geworden in de voorbijgaande expressieveld, vanwege haar vermogen om vreemde eiwitten produceren zowel snel en op een hoog niveau. Deze technologie is gebaseerd op een gedeconstrueerd vector die alleen de RNA-afhankelijke RNA-polymerase en verkeer eiwit5 draagt en dus verliest zijn besmettelijkheid in planten; Dientengevolge, moet zijn potentiële overdracht op de mens worden uitgesloten.
Het experimentele protocol gemeld hier zou kunnen worden uitgebreid tot vele verschillende eetbare soorten, zoals sla, Chenopodium capitatum en Tetragonia expansa. Sinds de bladeren van deze soorten, met inbegrip van rode biet en spinazie, waarvan werd al eerder gedetecteerd als goede expressie plant systemen5, kan worden gebruikt als ongekookt voedsel, de hier voorgestelde technologie kan worden gebruikt voor de productie eetbare vaccins of voor productie van minimaal verwerkte functionele levensmiddelen of diervoeders.
De combinatie van recombinante eiwitten/plantensoorten, dpi van oogsten, waarmee het hoogste niveau van recombinante eiwitten accumulatie moet nog steeds worden empirisch bepaald op een geval per geval afhankelijk van het recombinant eiwit uitgedrukt en op de host plant soorten18.
De toepassing van deze technologie voor de productie van orale vaccin houden grote potentie om een alternatief aan conventionele vaccins in de nabije toekomst, naast bestrijding oncolytische virussen, autologe vaccins voor lymfomen en solide tumoren, en Monoclonal antilichamen tot doel kanker19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het gezamenlijke Project "Het gebruik van planten voor de productie van een auto-immuunziekte diabetes eetbare vaccin (eDIVA)" (Project-ID: 891854) door de Universiteit van Verona, in het kader van de oproep 2014 gefinancierd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
References
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
- Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
- Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
- Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
- Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
- Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
- Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
- Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
- Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
- Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
- Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
- Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
- Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
- Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
- Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
- Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).
