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Bioengineering

टाइप-1 मधुमेह के लिए एक बायोफार्मा परीक्षार्थी वैक्सीन के लाल चुकंदर में क्षणिक अभिव्यक्ति

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59298
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biotechnology, University of Verona
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक खाद्य संयंत्र में टाइप 1 मधुमेह के खिलाफ एक मौखिक टीका उंमीदवार के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

पादप आण्विक कृषि, ब्याज के अणुओं का उत्पादन करने के लिए पादपों का उपयोग है । इस परिप्रेक्ष्य में, पौधों का उत्पादन और अंतिम उत्पाद के बाद शोधन के लिए बायोरिएक्टर के रूप में दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है और विषमजातीय प्रोटीन के प्रत्यक्ष मौखिक वितरण के लिए जब खाद्य संयंत्र प्रजातियों का उपयोग कर । इस काम में, हम प्रकार के खिलाफ एक उंमीदवार मौखिक वैक्सीन के विकास वर्तमान खाद्य संयंत्र प्रणाली में 1 मधुमेह (T1D) deconstructed संयंत्र वायरस आधारित पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी, वैक्यूम घुसपैठ के साथ दिया का उपयोग कर । हमारे परिणाम बताते है कि एक लाल चुकंदर एक मानव व्युत्पंन autoantigen T1D से जुड़े की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए एक उपयुक्त मेजबान है, एक T1D टीके के रूप में एक होनहार उंमीदवार माना जाता है । autoantigen उत्पादन पत्ते अच्छी तरह से गैस्ट्रिक पाचन के लिए उनके प्रतिरोध के लिए विशेषता थे, अवशिष्ट जीवाणु प्रभारी की उपस्थिति के लिए और उनके माध्यमिक चयापचय प्रोफ़ाइल के लिए, संभावित उपयोग के लिए प्रक्रिया के उत्पादन का अवलोकन दे एक विषमजातीय प्रोटीन की प्रत्यक्ष मौखिक डिलीवरी के लिए पौधों की । हमारे विश्लेषण एक नकली गैस्ट्रिक पाचन के बाद फ्रीज-सूखे उंमीदवार मौखिक वैक्सीन के लगभग पूरा ह्रास दिखाया, सुझाव है कि संयंत्र के निर्माण में एक encapsulation रणनीति-गाद वैक्सीन व्युत्पंन की आवश्यकता है ।

Introduction

1980 के दशक में संयंत्र आण्विक जीव विज्ञान क्रांति के बाद से, biopharmaceuticals के उत्पादन के लिए संयंत्र आधारित प्रणालियों माइक्रोबियल और स्तनधारी कोशिकाओं1पर आधारित पारंपरिक प्रणालियों के लिए एक विकल्प के रूप में माना जा सकता है । पौधों पारंपरिक प्लेटफार्मों पर कई फायदे, scalability के साथ प्रदर्शन, लागत प्रभावशीलता और सुरक्षा सबसे अधिक प्रासंगिक2जा रहा है । पुनः संयोजक उत्पाद रूपान्तरित संयंत्र ऊतक से शुद्ध किया जा सकता है और फिर प्रशासित, या तो या तो या मौखिक रूप से, और, इसके अलावा, बदल खाद्य संयंत्र सीधे ओरल डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मौखिक मार्ग एक साथ श्लैष्मिक और प्रणालीगत प्रतिरक्षा को बढ़ावा देता है, और यह सुई और विशेष चिकित्सा कर्मियों के लिए की जरूरत eliminates । इसके अलावा, मौखिक डिलीवरी जटिल बहाव प्रसंस्करण, जो आम तौर पर एक पुनः संयोजक प्रोटीन3की कुल विनिर्माण लागत का ८०% के लिए खातों eliminates । उन सभी लाभों के उत्पादन में बचत में अनुवाद किया जा सकता है, आपूर्ति और श्रम प्रत्येक खुराक की लागत को कम करने, वैश्विक जनसंख्या के सबसे करने के लिए सस्ती दवा बनाने.

दोनों स्थिर परिवर्तन और क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए कई रणनीतियों, पौधों में पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए विकसित किया गया । उनमें से, एक उच्च उपज deconstructed संयंत्र वायरस आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली (जैसे, magnICON) बेहतर प्रदर्शन प्रदान करता है अपेक्षाकृत कम timescales4पर पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च पैदावार अग्रणी । अस्थायी अभिव्यक्ति के कई उदाहरण संयंत्र वायरस आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग निकोटियाना बेन्थामियाना पौधों में, सोने के मानक उत्पादन की मेजबानी की जा रही रिपोर्ट कर रहे हैं. हालांकि, इस मॉडल संयंत्र एक खाद्य alkaloids और अंय विषाक्त चयापचयों है कि इसकी पत्तियों में जमा हो रहे है के कारण प्रजातियों के रूप में नहीं माना जाता है ।

इस काम में, हम दो खाद्य संयंत्र प्रणालियों के बीच तुलना का वर्णन, लाल चुकंदर (बीटा वल्गैस cv Moulin रूज) और पालक (spinacea ओलेरेसिया सीवी industria), के दो उंमीदवार रूपों की अभिव्यक्ति के लिए ६५ decarboxylase (GAD65), संयंत्र वायरस आधारित वैक्टर द्वारा किए गए5। GAD65 एक प्रमुख autoantigen प्रकार से संबंधित है 1 मधुमेह (T1D) और यह मानव नैदानिक परीक्षणों में जांच के अधीन है रोकने के लिए या सहिष्णुता उत्प्रेरण द्वारा T1D में देरी6। पौधों में GAD65 के उत्पादन को बड़े पैमाने पर मॉडल पादप प्रजातियों में निकोटियाना टैबेकम और एन बेन्थामियाना4,5,6,7के रूप में अध्ययन किया गया है । यहाँ, हम ऊतकों में अणु के उत्पादन के लिए खाद्य पादप प्रजातियों के उपयोग का वर्णन करते हैं जो प्रत्यक्ष मौखिक सुपुर्दगी के लिए अभिपे्रत हो सकते हैं । एक तकनीकी दृष्टि से, हम अध्ययन किया और संयंत्र agroinfiltration और GAD65 उत्पादन के लिए खाद्य संयंत्र मंच के लिए प्रणाली का चयन विभिन्न मापदंडों का मूल्यांकन द्वारा: पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर, संयंत्र में अवशिष्ट माइक्रोबियल प्रभारी ऊतक मौखिक वितरण के लिए, गैस्ट्रिक पाचन के लिए GAD65 के प्रतिरोध, और जंगली प्रकार के साथ बदल पौधों की bioequiसंयोजकता ।

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Protocol

1. लाल चुकंदर और पालक की खेती

  1. एक विकास कक्ष में लाल चुकंदर (बी. वल्गैर्स सीवी माउलिन रूज) और पालक (एस. ओलेरेसिया सीवी औद्योग) पौधे, क्रमशः 23/21 डिग्री सेल्सियस पर १५० μe प्रकाश तीव्रता, ६५% सापेक्ष आर्द्रता, 12 एच लाइट/डार्क चक्र का उपयोग करते हुए
  2. बीज अंकुरण के बाद, पौधों को एक सप्ताह में दो बार एक g/L समाधान के साथ एक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध उर्वरक (सामग्री की तालिका) को उपजाऊ बनाना । agroinfiltration के लिए पांच सप्ताह पुराने पालक और छह सप्ताह पुराने लाल चुकंदर पौधों का उपयोग करें ।

2. deconstructed संयंत्र वायरस आधारित प्रौद्योगिकी के माध्यम से क्षणिक अभिव्यक्ति

  1. संयंत्र अभिव्यक्ति वैक्टर का निर्माण
    1. वैक्टर परिचय-5 ' मॉड्यूल (pICH20111), 3 ' मॉड्यूल (pICH31070. GAD65mut, pICH31070. ∆ 87g65mut और pICH7410. egfp), पहले वर्णित के रूप में तैयार1,2,7, और integrase मॉड्यूल (pICH14011)- में एगरोबैक्टीरियम tumefaciens GV3101 तनाव मानक तकनीकों का उपयोग कर । ५० μg/एमएल रिफंपिसिन और उपयुक्त वेक्टर-विशिष्ट एंटीबायोटिक्स (pICH20111, pICH14011 और pICH7410 के लिए ईजीएफपी, ५० μg/एमएल कनामाइसिन) से 28 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए पौंड मीडियम पर बढ़ें ।
    2. कालोनी से कालोनियों की स्क्रीन पीसीआर प्रत्येक वेक्टर के लिए निंनलिखित विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर: 5 '-atctaagctagggtacctcg-3 ' और 5 '-acaccgtaagtctatctcttc-3 ' दोनों के लिए 3 ' मॉड्यूल pICH31070. GAD65mut और pICH31070. ∆ 87g65mut, ५५ डिग्री सेल्सियस के एक अनीलन तापमान के साथ और ११० के एक बढ़ाव समय एस, 5 '-tgaagttcatctgcaccac-3 ' और 5 '-acaccgtaagtctatctcttc-3 ' के लिए तीसरे 3 ' मॉड्यूल pICH7410 । egfp, ५३ डिग्री सेल्सियस और 30 एस, 5 '-aatgtcgatagtctcgtacg-3 ' और 5 '-tccacctttaacgaagtctg-3 ' के एक बढ़ाव समय के एक अनीलन तापमान के साथ 5 ' मॉड्यूल के लिए, ५३ डिग्री सेल्सियस के एक अनीलन तापमान और 20 एस और 5 के एक बढ़ाव समय के साथ-ggcaaccgttatgcgaatcc-3 ' और 5 '-gatgcgttccgcaacgaact ' अधिनियम-3 ' के लिए ५७ डिग्री सेल्सियस के एक अनीलन तापमान और ४५ एस के एक बढ़ाव समय के साथ integrase मॉड्यूल
    3. निम्नलिखित विशिष्ट अभिक्रिया चक्र का प्रयोग करते हुए 20 μL की कुल मात्रा में पीसीआर अभिक्रिया को पूरा करें: 5 मिनट ९५ डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृत्करण, ९५ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के ३५ चक्र, अनीलन तापमान पर 30 एस और ७२ डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाव चरण (अनीलन तापमान और बढ़ाव समय प्रत्येक प्राइमरी जोड़ी के लिए विशेष पुनः) और ७२ डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट की एक अंतिम बढ़ाव कदम ।
  2. सिरिंज एगरोघुसपैठ
    1. तीन ए tumefaciens परिवर्तनकारियों ५० मिलीलीटर में ५० μg/मिलीलीटर रिफंपिसिन और निम्नलिखित उपयुक्त वेक्टर-विशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं के लिए: ५० Μg/मिलीलीटर carbenicillin के लिए एक. Tumefaciens pICH20111 के साथ बदल गया, pICH14011 या pICH7410. egfp, या ५० μg/मिलीलीटर कनमीसिन के लिए एक. tumefaciens pICH31070 के साथ बदल गया. 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मिलाते हुए बढ़ने ।
    2. गोली रात बैक्टीरियल संस्कृतियों ४,५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा 20 मिनट के लिए और उंहें १०० मिलीलीटर (या प्रारंभिक बैक्टीरियल संस्कृति के दो संस्करणों) घुसपैठ बफर के 10 मिमी 4-morpholineethanesulfonic एसिड (एमईएस, पीएच ५.५) और 10 मिमी में resuspend MgSO4, आयुध डिपो ६०० पर विचार के बिना। 3 ज के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर निलंबन सस्पेंशन ।
    3. 5 ' मॉड्यूल और integrase मॉड्यूल के साथ तीन मॉड्यूल, GAD65mut, ∆ 87GAD65mut या eGFP 3 ' मॉड्यूल में से एक युक्त बैक्टीरियल निलंबन के बराबर मात्रा में मिक्स । लाल चुकंदर और पालक के पत्तों की सिरिंज घुसपैठ के लिए सस्पेंशन मिक्स का प्रयोग करें ।
    4. सुई के बिना एक सिरिंज में निलंबन के 5 मिलीलीटर प्लेस । दोनों पालक और लाल चुकंदर पौधों के लिए पत्ती के नीचे के खिलाफ सिरिंज की नोक दबाएँ, और इस बीच पत्ती के दूसरे पक्ष के लिए एक कोमल counterpressure लागू होते हैं ।
    5. पहले तीन पूरी तरह से विस्तारित प्रत्येक संयंत्र के लिए शीर्ष से शुरू पत्तियों घुसपैठ । पत्ता स्टेम पर एक कागज टैग के साथ agroघुसपैठियों पत्ते लेबल । मानक शर्तों के तहत एक विकास कक्ष में पौधों को वापस ।
      नोट: स्वास्थ्य और सुरक्षा कारणों से, घुसपैठ की प्रक्रिया के दौरान आंख की सुरक्षा और दस्ताने पहनते हैं ।
    6. 4 से 14 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) से agroघुसपैठियों पत्ते ले लीजिए और उंहें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज । स्टोर संयंत्र ऊतक-८० डिग्री सेल्सियस पर ।
  3. निर्वात एगोरोधी
    1. अलग से तीन ए tumefaciens के ५० मिलीलीटर पौंड मध्यम में ५० μg/मिलीलीटर रिफाम्पिसिन और उपयुक्त वेक्टर विशिष्ट एंटीबायोटिक 28 डिग्री सेल्सियस पर रात में मिलाते हुए से बढ़ने ।
    2. गोली रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृतियों ४,५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा 20 मिनट के लिए. Resuspend में गोली के 1 एल में घुसपैठ बफर के एक आयुध डिपो६०० करने के लिए ०.३५ और 3 एच के लिए आरटी पर निलंबन को इनसेटे ।
    3. प्रत्येक निलंबन करने के लिए डिटर्जेंट (polysorbate 20) का ०.०१% v/v जोड़ें । 5 ' मॉड्यूल और integrase मॉड्यूल के साथ तीन मॉड्यूल, GAD65mut, ∆ 87GAD65mut या eGFP 3 ' मॉड्यूल में से एक युक्त बैक्टीरियल निलंबन के बराबर मात्रा में मिक्स ।
    4. एक पौधा डालें (छः सप्ताह पुराने लाल चुकंदर का पौधा, धारक में अनुभाग 1 देखें) । घुसपैठ के निलंबन में पत्तियों को जलमग्न करने के लिए घुसपैठ के स्नान (2 L) युक्त बीकर के शीर्ष पर धारक और स्थान को उलटाकर ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सभी पत्ते पूरी तरह से बैक्टीरियल निलंबन में डूबा हुआ है । यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त घुसपैठ के निलंबन के साथ स्तर को बढ़ाएं ।
    5. घुसपैठ कर डूबे हुए पौधे को घुसपैठ कर चैंबर में ट्रांसफर कर उसे बंद कर देते हैं । वैक्यूम पंप चालू करें और घुसपैठ चैंबर पर वैक्यूम सेवन वाल्व खोलें ।
    6. एक बार घुसपैठ चैंबर में दबाव ९० mbar के लिए कम हो गया है, 3 मिनट के लिए निर्वात रखो । ४५ एस के लिए वैक्यूम रिलीज । एक बार जब घुसपैठ चैंबर वायुमंडलीय दबाव में लौट आया है, चैंबर खुला और जीवाणु स्नान से घुसपैठ संयंत्र को हटा दें ।
    7. मानक शर्तों के तहत एक विकास कक्ष में पौधों को वापस ।
    8. पुनः संयोजक प्रोटीन पर निर्भर करता है, अधिकतम अभिव्यक्ति डीपीआई पर agroघुसपैठियों पत्ते लीजिए, और तरल नाइट्रोजन में उन्हें फ्रीज । स्टोर संयंत्र ऊतक-८० डिग्री सेल्सियस पर ।

3. पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. कुल घुलनशील प्रोटीन (टीएसपी) निष्कर्षण
    1. सीरिंज या वैक्यूम घुसपैठ लाल चुकंदर और पालक के पत्तों, कदम 2.2.6 और 2.3.8 में एकत्र, तरल नाइट्रोजन में ठीक पाउडर के लिए मोर्टार और मूसल का उपयोग कर । पाउडर 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में स्थानांतरण और सामग्री-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. निष्कर्षण बफर की ९०० μL जोड़ें (५० मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच ८.०, 20 मिमी सोडियम मेटामिसल्फाइट) करने के लिए ३०० मिलीग्राम पत्ती पाउडर ।
      नोट: संयंत्र ऊतक वजन (मिलीग्राम) के लिए बफर मात्रा (μL) के बीच चयनित अनुपात 1:3 है ।
    3. 1 मिनट के लिए vortexing द्वारा मिश्रण Homogenize, तो ३०,००० एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर ४० मिनट के लिए ।
    4. एक साफ ट्यूब में supernatant लीजिए और यह दुकान-८० डिग्री सेल्सियस पर ।
  2. संयंत्र egfp विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणन
    1. लोड १०० μL प्रत्येक टीएसपी eGFP व्यक्त पत्तियों से प्राप्त की, तीन तकनीकी replicates में, एक ९६-well थाली पर.
    2. एक प्रतिदीप्ति पाठक में ९६-well थाली रखो और माप शुरू करते हैं । eGFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए आवश्यक 485/535 एनएम फिल्टर सेट का उपयोग करें ।
    3. निरपेक्ष परिमाणन के लिए, एक ही थाली में एक अंशांकन वक्र एक शुद्ध eGFP के विभिन्न मात्रा (६२.५, १२५, ५००, ७५० और १,००० एनजी) लोड हो रहा है तैयार करते हैं ।
  3. बिकीनचोनिनिक अम्ल (बीसीए) टीएसपी के लिए परख परिमाणन
    1. अभिकर्मक बी (सामग्रियों की तालिका) के 1 भाग के साथ रीएजेंट A (सामग्रियों की तालिका) के ५० भागों को मिलाएं । नमूने के लिए ताजा बीसीए काम कर समाधान की पर्याप्त मात्रा तैयार करने के लिए बीएसए और अंशांकन मानकों ।
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक बीसीए कार्य समाधान की मात्रा १.९ मिलीलीटर है । मानक प्रक्रिया के लिए 9 मानकों के साथ (एक रिक्त सहित), बीसीए कार्य समाधान के १७.१ मिलीलीटर की आवश्यकता है ।
    2. प्रत्येक मानक के पिपेट ०.१ मिलीलीटर (एक खाली सहित), और टीएसपी एक लेबल ट्यूब में निकालता है ।
      नोट: अंशांकन मानकों के रूप में, 10-1000 μg/mL रेंज में गोजातीय सीरम एल्ब्युम (BSA) मानकों का एक नया सेट तैयार, अधिमानतः नमूने के रूप में एक ही मंदन का उपयोग, जैसे पानी. खाली अंशांकन मानक और नमूना तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया मंदिकी के ०.१ मिलीलीटर के होते हैं ।
    3. बीसीए काम कर रहे समाधान के १.९ मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिक्स । ट्यूबों को कवर और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    4. आर टी करने के लिए ट्यूबों शांत. 10 मिनट के भीतर सभी नमूनों की ५६२ एनएम पर अवशोषण उपाय ।
      नोट: RT पर भी, रंग विकास जारी है । कोई महत्वपूर्ण त्रुटि शुरू की जाएगी अगर सभी ट्यूबों के अवशोषण माप 10 मिनट के भीतर किया जाता है ।
    5. मानकों और टीएसपी के अर्क के रीडिंग से खाली की ५६२ एनएम absorbance मान घटाना ।
    6. प्लाट अपनी एकाग्रता पर प्रत्येक मानक के लिए खाली-सही ५६२ एनएम रीडिंग । प्रत्येक टीएसपी निकालने के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।
  4. Coomassie जेल धुंधला के रूप में पहले Gecchele एट अल.8में वर्णित प्रदर्शन ।
  5. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण
    1. पहले Gecchele एट अल.8में वर्णित के रूप में पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण करते हैं ।
    2. प्रोटीन के इलेक्ट्रोफोरेटिक जुदाई के बाद, उन्हें मानक तकनीकों का उपयोग कर एक नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली पर स्थानांतरित । फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) पीएच ७.४ में 4% दूध मिश्रण से अवरुद्ध समाधान तैयार करते हैं । 1 ज के लिए आरटी पर अवरुद्ध समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ झिल्ली ब्लॉक ।
    3. एंटी-GAD65/67 और anti-LHCB2 के लिए 1:10000 पर खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें, और ०.१% डिटर्जेंट के साथ ब्लॉकिंग समाधान के 5 मिलीलीटर में एंटी-eGFP के लिए 1:20000 पर । तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी समाधानों के साथ झिल्ली को 4 ° c पर रात भर के लिए या लगातार आंदोलन के साथ आरटी में 4 h के लिए सेते ।
    4. प्राथमिक एंटीबॉडी छोड़ें और 5 मिनट के लिए 3 बार झिल्ली धोने ०.१% डिटर्जेंट युक्त समाधान अवरुद्ध के साथ प्रत्येक ।
    5. (HRP)-संयुग्मी एंटी-खरगोश एंटीबॉडी को 1:10000 में ०.१% डिटर्जेंट के साथ समाधान अवरुद्ध में तैयार । लगातार आंदोलन के साथ आरटी में १.५ एच के लिए झिल्ली सेते ।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी छोड़ें और 5 मिनट के लिए 5 बार झिल्ली धो PBS-टी के साथ (PBS ०.१% डिटर्जेंट के साथ पूरक) ।
    7. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध luminol समाधान के साथ झिल्ली को सेते हैं । एक chemiluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर संकेत का पता लगाने ।

4. संयंत्र सामग्री प्रसंस्करण

  1. निर्वात एकरोदित ∆ 87GAD65mut-एक्सप्रेशन पीक (11 dpi) पर लाल चुकंदर के पत्तों को व्यक्त करने और उन्हें द्रव नाइट्रोजन में स्थिर करने के लिए फसल ।
  2. ७२ ज पर-५० डिग्री सेल्सियस और ०.०४ mbar के लिए जमे हुए पत्ते Lyophilize । उंहें-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. महीन पाउडर के पत्ते पीस लें और इसे सीलिका जेल के साथ एक सीलबंद कंटेनर में नमी को बाहर करने के लिए आरटी पर स्टोर करें ।

5. गैस्ट्रिक पाचन सिमुलेशन और सेल अखंडता विश्लेषण

  1. गैस्ट्रिक पाचन सिमुलेशन
    1. वजन १०० मिलीग्राम grinded फ्रीज-सूखे लाल चुकंदर के पत्ते और यह PBS के 6 मिलीलीटर में resuspend (पीएच ७.४) ।
    2. नमूना पीएच 6 एम एचसीएल के साथ 2 को समायोजित करें ।
    3. 4 मिलीग्राम/मिलीलीटर पेप्सिन 10 मिमी एचसीएल में सुअर का गैस्ट्रिक म्यूकोसा से 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर की एक अंतिम पेप्सिन एकाग्रता या कुल घुलनशील प्रोटीन के लिए 1:20 का अनुपात प्राप्त करने के लिए जोड़ें । १२० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना हिला ।
    4. 1 एम naoh के साथ पीएच 8 के लिए नमूनों को समायोजित करने के लिए पेप्सिन सूचनाको ।
    5. सेंट्रीफ्यूज ७५० μL प्रत्येक नमूने के aliquots २०,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए । अलग से supernatant लीजिए और लोड हो रहा है बफर (१.५ मीटर Tris एचसीएल, पीएच ६.८, 3% एसडीएस, 15% ग्लिसरोल, और 4% 2-mercaptoethanol) की एक supernatant मात्रा में गोली resuspend ।
      नोट: स्वास्थ्य और सुरक्षा कारणों के लिए, दस्ताने पहनते हैं और नमूना तैयार करने के लिए धूआं हुड के तहत काम करते हैं ।
    6. दोनों supernatant और पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण8द्वारा सस्पेंड गोली का विश्लेषण ।
  2. कोशिका अखंडता विश्लेषण
    1. १०० मिलीग्राम grinded फ्रीज के दो नमूने तैयार-सूखे लाल चुकंदर के पत्ते और दोनों PBS के 6 मिलीलीटर में resuspend (पीएच ७.४) ।
    2. 6 एम एचसीएल के साथ 2 के लिए केवल एक नमूने के पीएच समायोजित करें । १२० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर दोनों नमूनों हिला ।
    3. सेंट्रीफ्यूज ७५० μL प्रत्येक नमूने के aliquots २०,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए । अलग से supernatant लीजिए और लोड हो रहा है बफर की एक supernatant मात्रा में गोली resuspend ।
    4. दोनों supernatant और पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण द्वारा सस्पेंड गोली का विश्लेषण ।

6. Bioburden परख

  1. फ्रीज-सूखे लाल चुकंदर के पत्तों का वजन १०० मिलीग्राम । बाँझ PBS के 8 मिलीलीटर (पीएच ७.४) और 1 मिनट के लिए भंवर में पाउडर Resuspend ।
  2. एंटीबायोटिक्स के बिना पौंड मीडियम तैयार करें या (i) ५० μg/mL रिफंपिसिन युक्त, (ii) रिफंपिसिन और कार्बेन्सिलिन (iii) ५० μg/एमएल प्रत्येक के ५० μg/एमएल रिफंपिसिन और कनामाइसिन, या (iv) ५० μg/एमएल प्रत्येक रिफंपिसिन, कार्बोनिसिलिन और कनामाइसिन ।
  3. थाली प्रत्येक फ्रीज के 1 मिलीलीटर-5 चुनिंदा पौंड मीडिया में से एक में पत्ते homogenate सूख ।
  4. सभी प्लेटों को 28 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन के लिए सेते हैं ।
  5. प्रत्येक प्लेट पर उगाए गए एग्रोबैक्टीरियम कालोनियों की गणना ।
  6. परिकलित करें और स्थिर-सूखे पत्ती homogenate (CFU/mL) की प्रति मिलीलीटर कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) की संख्या के रूप में अवशिष्ट जीवाणु चार्ज को परिभाषित करते हैं ।

7. मेटालाइट निष्कर्षण

  1. प्राथमिक मेटालाइट निष्कर्षण
    1. वजन 30 मिलीग्राम-८० डिग्री सेल्सियस संग्रहीत, निर्वात agroघुसपैठियों ∆ 87GAD65mut-एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में लाल चुकंदर पत्ती पाउडर व्यक्त ।
    2. 2 ज के लिए कोल्ड 70/30 (v/v) मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म और 30 एस के लिए भंवर-20 डिग्री सेल्सियस पर ७५० μL जोड़ें ।
      नोट: सभी सॉल्वैंट्स और additives LC-MS ग्रेड होना चाहिए ।
    3. 10 मिनट के लिए 4 ° c पर १७,९०० x g पर ठंडे पानी और सेंट्रीफ्यूज के ६०० Μl जोड़ें । लीजिए और एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब में ऊपरी hydroalcoholic चरण स्थानांतरित । निचले क्लोरोफॉर्मिक चरण और इंटरफेज को छोड़ें.
    4. सॉल्वैंट्स वाष्पीकरण के लिए 3 ज के लिए एक वैक्यूम सांद्रक में नमूनों रखो ।
    5. चरण 7.1.4 से प्राप्त गोली को भंग 50/50 के ३०० μL में (v/v) एसीटोनिटरइल/पानी और 3 मिनट के लिए नमूने sonicate.
    6. ०.२ μm झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान पास और उंहें एक पारदर्शी निश्चित ३०० μL डालने ग्लास ट्यूबों में डाल दिया ।
  2. द्वितीयक मेटालाइट निष्कर्षण
    1. वजन ३०० मिलीग्राम-८० डिग्री सेल्सियस संग्रहीत, निर्वात agroघुसपैठियों ∆ 87GAD65mut-एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में लाल चुकंदर पत्ती पाउडर व्यक्त ।
    2. मेथनॉल, 30 एस के लिए भंवर के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और 15 मिनट के लिए ४० kHz पर sonicate ।
      नोट: सभी सॉल्वैंट्स और additives LC-MS ग्रेड होना चाहिए ।
    3. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४,५०० एक्स जी पर नमूनों सेंट्रीफ्यूज और नए 15 मिलीलीटर ट्यूबों में supernatants हस्तांतरण ।
    4. पानी के साथ निकालने 1:3 (v/v) के १०० μL पतला और एक ०.२ μm झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान पास ।
    5. एक पारदर्शी निर्धारित ३०० μL ग्लास ट्यूब डालने में समाधान रखो ।
  3. ध्रुवीय लिपिड निष्कर्षण
    1. वजन २०० मिलीग्राम-८० डिग्री सेल्सियस संग्रहीत, निर्वात agroघुसपैठियों ∆ 87GAD65mut-एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में लाल चुकंदर पत्ती पाउडर व्यक्त ।
    2. पानी की २०० μL जोड़ें और फिर मेथनॉल के 2 मिलीलीटर, और फिर 1 एच के लिए बर्फ पर रखें ।
      नोट: सभी सॉल्वैंट्स और additives LC-MS ग्रेड होना चाहिए ।
    3. 15 मिनट के लिए ४० kHz पर 30 एस और sonicate के लिए भंवर ।
    4. 25 मिनट के लिए 4 ° c पर ४,५०० x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज । लीजिए और क्लोरोफॉर्म चरण को 2 मिलीलीटर ट्यूबों में अंतरित कीजिए । ऊपरी hydroalcoholic चरण और अंत चरण छोड़ें ।
    5. 3 ज के लिए एक वैक्यूम सांद्रक में नमूनों रखो विलायक लुप्त हो जाना ।
    6. चरण 7.3.5 से प्राप्त गोली को भंग मेथनॉल के ६०० μL के साथ ।
    7. मेथनॉल के साथ निष्कर्षण 1:5 (v/v) के १०० μL पतला और एक ०.२-μm झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान पारित ।
    8. एक पारदर्शी निर्धारित ३०० μL ग्लास ट्यूब डालने में समाधान रखो ।

8. तरल क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण और डेटा प्रोसेसिंग

  1. आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित के रूप में LC-MS प्रणाली की स्थापना की ।
    नोट: नियंत्रण रेखा अनुभाग एक autosampler के साथ मिलकर एक C18 गार्ड कॉलम (७५ x २.१ mm, कण आकार 5 μm) एक C18 कॉलम के सामने (१५० x २.१ मिमी, कण आकार 3 μm) माध्यमिक चयापचयों और ध्रुवीय रक्तदाब के विश्लेषण के लिए सुसज्जित के साथ मिलकर शामिल , जबकि एक HILIC गार्ड कॉलम के साथ (७.५ x २.१ मिमी, 3 μm) एक HILIC कॉलम के सामने (१५० x २.१ मिमी, कण आकार २.७ μm). एमएस एक आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर या तो एक electrospray आयनन (ईएसआई) या एक वायुमंडलीय दबाव रासायनिक आयनन (apci) स्रोतों के साथ प्रदान की जाती है ।
  2. HPLC gradients के लिए उपयुक्त सॉल्वैंट्स तैयार करें । प्राथमिक metabolite विश्लेषण के लिए, 20 मिमी अमोनियम फोरमेट विलायक ए के रूप में उपयोग; ९५% एसीटोनिटरइल, 5% पानी प्लस 10 एमएम अमोनियम फॉरमेट के रूप में सॉल्वेंट बी. माध्यमिक metabolite विश्लेषण के लिए, पानी प्लस ०.०५% चींटी एसिड (ए) और एसिटोनिटरइल प्लस ०.०५% चींटी एसिड (बी) का उपयोग करें । ध्रुवीय लिपिड विश्लेषण के लिए, जल प्लस ०.०५% फॉर्मिक अम्ल (ए) और १००% एसीटोनिट्रिले (बी) का उपयोग करें ।
    नोट: सॉल्वैंट्स और additives LC-MS ग्रेड होना चाहिए ।
  3. मेटाबालाइट elution के लिए तालिका 1 में सूचित gradients का उपयोग करें । ०.२ मिलीलीटर/मिनट पर प्रवाह की दर सेट करें । द्वितीयक चयापचयों और ध्रुवीय लिपिड दोनों के लिए प्रत्येक नमूने के 10 μL सुई, जबकि प्राथमिक चयापचयों के लिए 5 μL इंसेक्ट ।
  4. एक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) नमूना तैयार विभिंन नमूनों के बराबर भागों मिश्रण से प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत का एक प्रतिनिधि मिश्रण है । उपकरण दक्षता की निगरानी करने के लिए प्रयोग के दौरान QC नमूने का विश्लेषण करें । विशेष रूप से, प्रत्येक 10 नमूना-बैच के बाद एक QC नमूना विश्लेषण सम्मिलित करें ।
  5. नमूने Randomize साधन संचालित प्रभाव से बचने के लिए ।
  6. 9 विश्लेषण के बाद, एक कॉलम सफाई विधि और एक खाली विश्लेषण के तुरंत बाद डालें ।
    नोट: सबसे मजबूत विलायक के उच्च प्रतिशत पर एक समघात रेफरेंस के साथ दो सॉल्वैंट्स के बीच एक धीमी ढाल प्रदर्शन । रिक्त एक शुद्ध मेथनॉल का एक इंजेक्शन के होते हैं: पानी (50/50, v/v) निंनलिखित विश्लेषण में प्रतिधारण समय reproducibility में सुधार करने के लिए ।
  7. तालिका 2में सूचीबद्ध पैरामीटर्स का उपयोग करके वैकल्पिक धनात्मक और ऋणात्मक आयनीकरण मोड में मास स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए उपकरण सेट करें ।
    नोट: अन्य पैरामीटर विशिष्ट प्लेटफ़ॉर्म पर निर्भर करते हैं ।
  8. दाल सैंटो एट अल.9में समझाया के रूप में अगले डेटा प्रसंस्करण प्रदर्शन ।

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Representative Results

इस कार्य में, खाद्य पादप ऊतकों में मौखिक टीके के विकास के लिए कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया जाता है । इस काम का ध्यान एक खाद्य मेजबान संयंत्र प्रजातियों में एक लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति और संभावित मौखिक टीके के लक्षण वर्णन है ।

पहला कदम खाद्य संयंत्र प्रणालियों में पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए संयंत्र वायरस आधारित अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी की उपयुक्तता का मूल्यांकन शामिल है । इस उद्देश्य के लिए, हम पहले एक मॉडल प्रोटीन के रूप में eGFP का उपयोग करें और हम इसे दो खाद्य पत्तेदार संयंत्र प्रणाली में व्यक्त: लाल चुकंदर और पालक । पौधों को मैन्युअल रूप से एजीएफपी रीकम्पेनिजेंट एक्सप्रेशन वैक्टर ले जाने वाले एक. tumefaciens के निलंबन के साथ agroated किया गया. फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण द्वारा कल्पना था (चित्रा 1a, बी, डी, ई) और यूवी प्रकाश के तहत मात्रा निर्धारित । परिणाम से पता चला कि लाल चुकंदर प्रणाली एक उच्च eGFP अभिव्यक्ति की विशेषता है, 9 डीपीआई (चित्रा 1 सी) में ताजा पत्ती वजन (flw) के ५४४.९ ± १०.९ μg/g तक पहुंचने, पालक, जो अधिकतम egfp स्तर (११३.४ ± ०.३ μg/g flw) पर मापा गया 11 डीपीआई ( चित्रा 1F) । इन कारणों के लिए लाल चुकंदर सभी अनुवर्ती प्रयोगों के लिए अभिव्यक्ति होस्ट के रूप में चुना गया था.

चेन एट अल.10के अनुसार, egfp क्षणिक अभिव्यक्ति घुसपैठ के लिए एक वैक्यूम विधि द्वारा परीक्षण किया गया था, जो बड़े पैमाने पर टीका उत्पादन के लिए अधिक उपयुक्त है. रातोंरात एक. tumefaciens संस्कृति, 10-1 से लेकर 10-3, और डिटर्जेंट के विभिंन सांद्रता (0.005-0.05%) अधिकतम अभिव्यक्ति dpi (9 dpi) पर eGFP संचय स्तर की तुलना करके परीक्षण किया गया है । परिणाम में पाया गया कि उच्च बैक्टीरियल titers अधिक eGFP पैदावार (10-1 ~ ०.३५) का उत्पादन किया । हालांकि, कोई महत्वपूर्ण अंतर अलग डिटर्जेंट सांद्रता (नहीं दिखाया गया डेटा) का उपयोग कर पाया गया ।

इसके बाद, संयंत्रों में ०.३५ आयुध डिपो६०० और ०.०१ प्रतिशत डिटर्जेंट के साथ घुसपैठ की गई । एक बार अभिव्यक्ति मंच और वितरण प्रणाली की स्थापना की गई, GAD65 के दो रूपों की अभिव्यक्ति, GAD65mut और एक N-टर्ली छोटा रूप (∆ 87GAD65mut), अधिकतम अभिव्यक्ति के दिन की तुलना में था, 5 और 11 डीपीआई, क्रमशः, के रूप में पहले 11की स्थापना की । agroघुसपैठ की पत्तियों से टीएसपी निष्कर्षण के बाद, सभी नमूनों पश्चिमी ब्लॉट द्वारा विश्लेषण किया गया और पुनः संयोजक प्रोटीन अपेक्षाकृत एक densitometry विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित (चित्रा 2) था । परिणामों ने GAD65mut की तुलना में ∆ 87GAD65mut फार्म के 20-गुना ऊंचे प्रदर्शन पर प्रकाश डाला । कटा हुआ फार्म इसलिए पसंदीदा मौखिक टीका उंमीदवार के रूप में चुना गया था, लाल चुकंदर में 11 डीपीआई में २०१.४ ± २९.३ μg/g FLW के रूप में उच्च के रूप में जमा ।

अंत में, एक संभावित मौखिक टीके के विकास के लिए मापदंडों का मूल्यांकन किया गया । पुनः संयोजक प्रोटीन अखंडता के बाद फ्रीज सुखाने-वैक्यूम घुसपैठ लाल चुकंदर के पत्ते ∆ 87GAD65mut व्यक्त (केवल जमे हुए) ऊतक के साथ तुलना में मूल्यांकन किया गया था, पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण द्वारा । चित्रा 3Aमें दिखाया गया है, लक्ष्य प्रोटीन lyophilization प्रक्रिया के बाद स्थिर होने का प्रदर्शन किया ।

गैस्ट्रिक पाचन का अनुकरण फ्रीज-सूखे सामग्री पर किया गया था एक अंतिम एकाग्रता के लिए सुअर का गैस्ट्रिक एंजाइम पेप्सिन जोड़कर 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर या 1:20 के अनुपात में टीएसपी । दोनों पाचन उपचार की स्थिति पुनः संयोजक प्रोटीन क्षरण के परिणामस्वरूप, के रूप में पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण द्वारा प्रदर्शित (चित्रा 3 सी, डी, ई, डेटा केवल पेप्सिन 1 मिलीग्राम के अंतिम एकाग्रता के लिए रिपोर्ट/ पेप्सिन पाचन के बाद गोली के नमूनों में एक विशिष्ट संकेत के अभाव (लेन पेप्सिन, पी 1-3), सुझाव दिया कि फ्रीज-सुखाने उपचार के बाद, संयंत्र कोशिकाओं को अपनी अखंडता खो दिया है, लक्ष्य प्रोटीन क्षरण के लिए अग्रणी ।

कोशिका अखंडता के मूल्यांकन से पता चला है कि जब सूखे संयंत्र ऊतक तटस्थ पीएच (पीएच ७.४) के साथ बफर में सस्पेंड था, ∆ 87gad65mut आंशिक रूप से सॉल्बिकृत किया गया था, सुझाव है कि कम से कुछ कोशिकाओं को पत्ती पीस और सुखाने के दौरान टूट गया । अम्लीय परिस्थितियों में सूखे पौधे के ऊतकों की पुनर्पेंशन, इसके बजाय, केवल अघुलनशील अंश में ही ∆ 87GAD65mut का पता लगाने के लिए प्रेरित किया । यह संभवत: कम पीएच के कारण होने वाली ∆ 87GAD65mut अवक्षेपण के कारण हुआ, जो कि खंडित कोशिकाओं की प्रोटीन सामग्री के अतिरिक्त11है । इन assays संकेत मिलता है कि फ्रीज सुखाने वैक्सीन उंमीदवार की तैयारी के लिए उपचार के रूप में चुना जा सकता है ।

इसके अलावा, agroघुसपैठियों लाल चुकंदर पत्तियों में अवशिष्ट माइक्रोबियल प्रभारी का मूल्यांकन किया गया ।

bioburden परख प्रदर्शित कि उपचार उंमीदवार वैक्सीन की तैयारी के लिए शोषण जीवाणु लोड11सफाया ।

∆ 87GAD65mut तथा नियंत्रण वाले लाल चुकंदर पादपों की उपापचयी जैव-संयोजकता का मूल्यांकन प्राथमिक एवं द्वितीयक चयापचयों के उंगलियों के निशान तथा नौ लाल चुकंदर पादपों से प्राप्त ध्रुवीय लिपिड को 9 रेड बीट संयंत्रों से उत्पन्न किया गया था जो ∆ 87GAD65mut को व्यक्त करते हुए, नौ एकरोदित नियंत्रण तथा नौ वन्य-प्रकार नियंत्रण । पीसीए सांख्यिकीय एक जंगली प्रकार संयंत्र अंय सभी नमूनों से अलग क्लस्टर से पता चला । इसके बजाय ∆ 87GAD65mut और घुसपैठ और ऋणात्मक नियंत्रण संयंत्रों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं डाला गया । इसके अलावा, ध्रुवीय लिपिड प्रोफाइल के संदर्भ में पौधों के तीन समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर11की पहचान की गई थी ।

Figure 1
चित्रा 1: agroघुसपैठियों लाल चुकंदर और पालक के पत्तों में eGFP अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना। पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण (ए, डी) और इसी लोड हो रहा है नियंत्रण (रुबिस्को बड़ी subunit) के साथ दाग Coomassie शानदार नीले (बी, ई) से प्रोटीन निष्कर्षों egfp-पत्ती के नमूनों को व्यक्त समय के दौरान एकत्र-पाठ्यक्रम विश्लेषण से 4 से 14 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) । प्रत्येक पत्ती प्रोटीन निकालने की egfp सामग्री प्रतिदीप्ति माप (सी, एफ) द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था. agroघुसपैठियों लाल चुकंदर के नमूने से परिणाम बाएं पैनल में प्रदर्शित कर रहे हैं, जहां agroघुसपैठियों पालक नमूने सही में दिखाया जाता है । प्रोटीन निष्कर्षों के बराबर मात्रा में लोड किया गया है, पश्चिमी ब्लॉट के लिए ३.५ μg और Coomassie धुंधला करने के लिए 30 μg । एक विरोधी eGFP एंटीबॉडी पश्चिमी ब्लाटर विश्लेषण में एक जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया है । पक्ष संख्या केडीए में आणविक द्रव्यमान मार्करों का संकेत है । पीसी, सकारात्मक नियंत्रण, 10 वाणिज्यिक पुनः संयोजक मानव GAD65 के एनजी; नेकां, नकारात्मक नियंत्रण, पत्ते से निकालने केवल एक. tumefaciens 5 '-और integrase मॉड्यूल ले जाने के साथ घुसपैठ की । त्रुटि पट्टियां तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । यह आंकड़ा बर्टिनी एट अल.11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लाल चुकंदर के पत्तों में GAD65mut और Δ87GAD65mut अभिव्यक्ति का स्तर । वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण (एक) और इसी लोडहोरहा है नियंत्रण (रुबिस्को बड़ी उपइकाई) Coomassie के साथ सना हुआ शानदार नीले (बी) प्रोटीन निष्कर्षों के तीन लाल चुकंदर से Δ87GAD65mut व्यक्त पत्ते (बाएं) और GAD65mut (दाएं) । एक विरोधी गाद एंटीबॉडी पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण में एक जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया है (लेन GAD65mut और Δ87GAD65mut के लिए निकालने के 1 μL के लिए निकालने के 20 μL के साथ भरी हुई थी) । Coomassie दाग जेल में, प्रोटीन निष्कर्षों की एक ही मात्रा (10 μL/GAD65mut और Δ87GAD65mut के लिए लोड किया गया था । पक्ष संख्या केडीए में आणविक द्रव्यमान मार्करों का संकेत है । पीसी, सकारात्मक नियंत्रण, 10 वाणिज्यिक पुनः संयोजक मानव GAD65 के एनजी; नेकां, नकारात्मक नियंत्रण, निकालने के पत्तों से प्राप्त केवल एक. tumefaciens के साथ घुसपैठ की 5 '-और integrase मॉड्यूल ले । (ग) एक डेन्सिमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक संदर्भ के रूप में पश्चिमी ब्लॉट सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करते हुए, दो प्रोटीन रूपों के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर की साजिश रची जाती है । त्रुटि पट्टियां तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । यह आंकड़ा बर्टिनी एट अल.11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मौखिक वैक्सीन उंमीदवार मूल्यांकन। बाईं ओर, फ्रीज के बाद प्रोटीन स्थिरता का विश्लेषण-सुखाने उपचार (ए, बी) । वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण (क) और इसी जेल Coomassie शानदार नीले रंग के साथ दाग (ख) Δ87GAD65mut व्यक्त पत्तियों से तीन स्वतंत्र निष्कर्षों का प्रतिनिधित्व । काटा पत्ते सीधे जमे हुए थे (ताजा) या lyophilized पर-५० डिग्री सेल्सियस, ७२ एच के लिए ०.०४ mbar (फ्रीज सूख) । विभिन्न ऊतक: बफर अनुपात टीएसपी निष्कर्षण के दौरान नियोजित किया गया ताकि निर्जलीकरण के कारण पानी की हानि पर विचार करने के लिए । अर्क के बराबर मात्रा, ०.२५ और 10 μL, पश्चिमी ब्लॉट और Coomassie धुंधला क्रमशः के लिए लोड किया गया । एक एंटी-गैड एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी ब्लॉट की जांच के लिए किया गया है, जो केडीए में आणविक द्रव्यमान मार्कर का संकेत देता है । नेकां, नकारात्मक नियंत्रण, पत्ते से निकालने केवल एक. tumefaciens 5 '-और integrase मॉड्यूल ले जाने के साथ घुसपैठ की । दाईं ओर, विट्रो में Δ87GAD65mut (सी, डी, ई) के गैस्ट्रिक पाचन कृत्रिम । पश्चिमी ब्लाटर विश्लेषण (सी, डी) और इसी जेल Coomassie शानदार नीले रंग के साथ दाग (ई) नकली गैस्ट्रिक पाचन के बाद Δ87GAD65mut व्यक्त पत्तियों के तीन स्वतंत्र अर्क का प्रतिनिधित्व । 1 मिलीग्राम/पेप्सिन के मिलीलीटर को lyophilized ऊतक के १०० मिलीग्राम जोड़ा गया है, जबकि एंजाइम के बिना एक नियंत्रण नमूना इस्तेमाल किया गया है । 24 μL और 16 μL, supernatants (ओं) और छर्रों (पी) के लिए क्रमशः अंतिम केंद्रापसारक चरण में प्राप्त की, एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । एंटी-गैड (C) और ANTI-LHCB2 (D) एंटीबॉडी पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण में जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया । पक्ष संख्या केडीए में आणविक द्रव्यमान मार्करों का संकेत है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्राथमिक चयापचयों (१०० मिनट) समय (min) % A % B अवधि (min) प्रकार
प्रारंभिक 0 १०० - प्रारंभिक अवस्था
0 0 १०० 10 समघात
10 15 ८५ 15 ग्रैडिएंट
25 15 ८५ 5 समघात
30 ५० ५० 10 ग्रैडिएंट
४० ५० ५० 30 समघात
७० 0 १०० 1 ग्रैडिएंट
७१ 0 १०० 29 समघात (पुनः साम्य)
द्वितीयक चयापचयों (६० मिनट) समय (min) % A % B अवधि (min) प्रकार
प्रारंभिक ९८ 2 - प्रारंभिक अवस्था
0 ९० 10 2 ग्रैडिएंट
2 ८० 20 10 ग्रैडिएंट
12 ७५ 25 2 ग्रैडिएंट
14 30 ७० 7 ग्रैडिएंट
21 30 ७० 5 समघात
26 10 ९० 1 ग्रैडिएंट
27 10 ९० 14 समघात
४१ ९८ 2 1 ग्रैडिएंट
४२ ९८ 2 18 समघात (पुनः साम्य)
ध्रुवीय रक्तदाब (९० min) समय (min) % A % B अवधि (min) प्रकार
प्रारंभिक ५० ५० - प्रारंभिक अवस्था
0 0 १०० 10 ग्रैडिएंट
10 0 १०० ६५ समघात
७५ ५० ५० 1 ग्रैडिएंट
७६ ५० ५० 14 समघात (पुनः साम्य)

तालिका 1: नियंत्रण रेखा-MS विश्लेषण में metabolite रेफरेंस के लिए ग्रेडिएंट शर्तें ।

द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर अवयव समारोह पैरामीटर
प्राथमिक चयापचयों द्वितीयक चयापचयों ध्रुवीय रक्तदाब
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत नेब्युलाइज़िंग गैस ५० साई, ३५० डिग्री सेल्सियस ५० साई, ३५० डिग्री सेल्सियस -
शुष्कन गैस 10 L min-1 10 L min-1
वायुमंडलीय दाब रासायनिक आयनीकरण (APCI) स्रोत नेब्युलाइज़िंग गैस - - ५० साई, ३५० डिग्री सेल्सियस
शुष्कन गैस 10 L min-1
Vaporizer ४५० डिग्री सेल्सियस
आयन ट्रैप और डिटेक्टर स्कैन पूर्ण स्कैन मोड १३,००० m/z प्रति सेकंड १३,००० m/z प्रति सेकंड १३,००० m/z प्रति सेकंड
50-1500 m/z 50-1500 m/z 50-1500 m/z
स्कैन रेंज २०० एम जेड/ ४०० एम जेड/ ७०० एम जेड/
लक्ष्य द्रव्यमान
संघट्ट गैस हीलियम
निर्वात दाब १.४ x 10-5 mbar
केशिका स्रोत + ४,५०० वी + ४,५०० वी + ४,००० वी
अंत्य पट् टिका ऑफसेट -५०० वी -५०० वी -५०० वी
पौना ४० वी -४० वी ४० वी
टोपी से बाहर निकलें १०६ वी -१२१ वी १४३.५ वी
अक्टूबर 1 डीसी १२ वी -12 वी १२ वी
अक्टूबर 2 डीसी १.७ वी -१.७ वी २ वी
लेंस 1 -5 वी ५ वी -5 वी
लेंस 2 -६० वी ६० वी -६० वी
सकारात्मक आयनन मोड के लिए आईसीसी 20
नकारात्मक आयनन मोड के लिए आईसीसी 7

तालिका 2: वैकल्पिक सकारात्मक और नकारात्मक आयनन मोड में मास स्पेक्ट्रा अधिग्रहण के लिए पैरामीटर ।

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Discussion

इस अध्ययन में हम स्व-प्रतिरक्षित मधुमेह के लिए एक उंमीदवार मौखिक वैक्सीन के डिजाइन के लिए प्रारंभिक विश्लेषण दिखाया । इस प्रयोग के लिए लक्षित प्रोटीन मानव ६५ केडीए ग्लूटैमेट डीकार्बोक्सिलेस का एक उत्परिवर्तन रूप था, जो उत्पादन और कार्यक्षमता आसानी से detectable और मापने योग्य12है । विभिन्न खाद्य पौधों के ऊतकों में इसकी अभिव्यक्ति को वैक्टर5द्वारा मध्यस्थता किया गया था, जो बहुत ही कम समय में पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन का एक उच्च स्तर मध्यस्थता करता है । सर्वश्रेष्ठ उंमीदवार संयंत्र खाद्य मेजबान के चयन लाल चुकंदर और पालक की पत्तियों में eGFP अभिव्यक्ति के आधार पर मैनुअल agroinfiltration द्वारा प्रदर्शन किया गया । यह कदम औद्योगिक पैमाने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है क्योंकि समय लेने वाली प्रक्रिया में हाथ से घुसपैठ और पालक पत्ती ऊतक घुसपैठ में कठोरता ।

एक पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए सबसे अधिक पुनः संयोजक प्रोटीन संचय स्तर देता है कि फसल के विशिष्ट डीपीआई की पहचान एक महत्वपूर्ण कदम है और परीक्षण किया है और एक मामले दर मामले के आधार पर चयन करने की आवश्यकता है । अलग डीपीआई (4 से 12) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण, प्रत्येक संयंत्र प्रणाली में अधिकतम अभिव्यक्ति के दिन की पहचान करने की अनुमति दी । इन अधिकतम अभिव्यक्ति दिवसों में eGFP सांद्रता (μg/g FLW) के बीच तुलना में यह रेखांकित किया गया है कि रिकम्बैन्ड प्रोटीन पैदावार के संदर्भ में लाल चुकंदर सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाला मंच है ।

इस कारण से, लाल चुकंदर आगे एक वैक्यूम प्रणाली है, जो अधिक वैक्सीन औद्योगिक बड़े पैमाने पर उत्पादन13के लिए उपयुक्त माना जाता है द्वारा संयंत्र वायरस आधारित वैक्टर की डिलीवरी के लिए परीक्षण किया गया था ।

यह देखते हुए कि मानक वैक्यूम घुसपैठ प्रोटोकॉल तंबाकू प्रजातियों के लिए अनुकूलित है5, संयंत्र प्रजातियों पर विचार करने के लिए प्रक्रिया समायोजन के लिए मापदंडों की एक सीमा के सेट अप एक महत्वपूर्ण बिंदु है । फिर, लाल चुकंदर वैक्यूम agroinfiltration प्रोटोकॉल अनुकूलित किया गया था । हमारे साक्ष्य से पता चला है कि एगरोबैक्टीरियम कमजोर पड़ने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में सुधार महत्वपूर्ण है, जबकि डिटर्जेंट एकाग्रता पत्ती पारगम्यता को बढ़ाने के लिए । परिणामों से पता चला है कि संयंत्र प्रणाली और इस काम के उद्देश्य के साथ प्रौद्योगिकी फिट ।

GAD65, GAD65mut और ∆ 87GAD65mut के दो विभिंन रूपों, जो पहले एन benthamiana7में उनकी अभिव्यक्ति के लिए विशेषता थे, विभिंन उप सेलुलर स्थानीयकरण प्रदर्शित, वैक्यूम घुसपैठ द्वारा लाल चुकंदर में व्यक्त किए गए । हर नमूने के लिए तीन जैविक प्रतिकृति तैयार की गई । प्रत्येक जैविक प्रतिकृति अलग पौधों से तीन घुसपैठ की पत्तियों का एक पूल शामिल है, दोनों GAD65 रूपों के लिए 2 से 14 डीपीआई से जांचा । उनकी अभिव्यक्ति स्तर पौधों के ऊतकों में सबसे अधिक जमा प्रोटीन का चयन करने के लिए तुलना की गई थी ।

डेन्साइटमिति विश्लेषण द्वारा सापेक्ष परिमाणन ने दर्शाया है कि ∆ 87GAD65mut की अक्षुण्ण समकक्ष से 20-गुना उच्च व्यंजक स्तर है । यह अपने cytosolic स्थानीयकरण whilst GAD65mut के कारण हो सकता है, अपने अवशेषों कि सेल झिल्ली के लिए इस फार्म का लंगर के कारण, एक कम उपज7है, एक कम प्रोटीन स्थिरता को दर्शाती है । ∆ 87GAD65mut लाल चुकंदर पत्ती ऊतक में औसत संचय स्तर २०१.४ ± २९.३ μg/g FLW, जो T1D मौखिक टीके के विकास के साथ शुरू करने के लिए पर्याप्त है ।

अंत में, सबसे उपयुक्त मंच, प्रौद्योगिकी और प्रोटीन फार्म के चयन के बाद, हम संक्रमित पत्तियों का एक फसल के बाद उपचार की स्थापना के द्वारा आगे बढ़ा । चूंकि पत्ती ऊतक पानी के ९५% से बना है, एक निर्जलीकरण उपचार सूक्ष्मजीव संदूषण को रोकने के लिए उपयोगी है । हमारे परिणामों का प्रदर्शन किया है कि एक फ्रीज-सुखाने उपचार के नमूने के लिए लागू हो सकता है, पत्तियों में पुनः संयोजक प्रोटीन के स्तर को प्रभावित किए बिना । lyophilization द्वारा 10-गुना पानी हटाने जीवाणु संदूषण (bioburden) को समाप्त करता है, सहित एक प्रकार का वृक्ष घुसपैठ प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया पुनः संयोजक ए tumefaciens .

इसके अलावा, प्रोटीन जैव encapsulation के विश्लेषण से पता चला कि एक नकली गैस्ट्रिक पाचन के बाद ∆ 87GAD65mut पूरी तरह से पच रहा है । यह पता चलता है कि फ्रीज-सुखाने उपचार संयंत्र कोशिका दीवार नुकसान, गैस्ट्रिक वातावरण की अम्लीय और एंजाइमी संरचना को पुनः संयोजक प्रोटीन को उजागर ।

अवशोषण की साइट के लिए जठरांत्र संबंधी मार्ग संक्रमण पर प्रोटीन या पेप्टाइड अणु अखंडता के रखरखाव मौखिक दवा वितरण के लिए एक मुद्दा का प्रतिनिधित्व करता है14. इसलिए, निर्जलीकरण उपचार के बाद, संभावित वैक्सीन सही ढंग से अपनी अखंडता को खोने के बिना गैस्ट्रिक वातावरण को दूर करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए । पादप-व्युत्पन्न गैड वैक्सीन के निर्माण में अपेक्षाकृत स्थिर शैल में संपुटिकरण को एक प्रणाली के रूप में लागू किया जा सकता है ताकि इसकी कार्यकुशलता में सुधार हो सके और मौखिक सुपुर्दगी मार्ग के साथ-साथइसे संरक्षित और स्थिर किया जा सके ।

इंसुलिन के साथ सिंथेटिक हाइड्रोजेल के संकुलन पर कुछ हाल ही में अध्ययन के रूप में अणुओं की मौखिक डिलीवरी से जुड़ी समस्याओं को दूर करने के लिए विभिन्न प्रौद्योगिकियों का पता लगाया गया है जो एक उच्च encapsulation दक्षता और तेजी से इंसुलिन दिखाया एक pH-निर्भर तरीके से आंत में छोड़ें16,17।

(i) पीसीए के आंकड़ों का प्रयोग करते हुए घुसपैठ और गैर-घुसपैठ वाले नियंत्रणों की तुलना में ∆ 87GAD65mut को व्यक्त करने वाले पादपों की प्राथमिक और द्वितीयक मेटाबिलाइट जैवसंयोजकता की जांच की गई । जब घुसपैठ किए गए संयंत्रों के बीच ∆ 87GAD65mut और घुसपैठ-नियंत्रण को अभिव्यक्त करने वाले अंतर महत्वपूर्ण नहीं थे, जबकि गैर-घुसपैठियों वाले वन्य-प्रकार के संयंत्रों ने एक पृथक समूह का गठन किया । इन परिणामों का सुझाव है कि घुसपैठ पौधों से अनुपचारित पौधों से अलग कर रहे है नियंत्रण रेखा से एमएस विश्लेषण बैक्टीरियल चयापचयों या क्योंकि घुसपैठ की वजह से पौधों द्वारा उत्पादित चयापचयों, के रूप में पहले से ही13साहित्य में दिखाया गया है । कुल मिलाकर इस विश्लेषण से यह दर्शाया गया है कि ∆ 87GAD65mut के संचय का समग्र चयापचय पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है ।

कुल मिलाकर इन परिणामों का सुझाव है कि संभावित मौखिक टीके, फ्रीज द्वारा प्रतिनिधित्व-सूखे लाल चुकंदर पत्ती ऊतक को व्यक्त करने के ∆ 87GAD65mut संयंत्र वायरस आधारित अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी का दोहन प्राप्त, प्रायोगिक T1D मौखिक immunotherapy के लिए उपयुक्त है परीक्षण. संयंत्र वायरस अभिव्यक्ति वेक्टर प्रौद्योगिकी परिवर्तनीय अभिव्यक्ति क्षेत्र में बहुत आकर्षक हो गया है, अपनी क्षमता के कारण दोनों तेजी से और उच्च स्तर पर विदेशी प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए । इस प्रौद्योगिकी के एक deconstructed वेक्टर है कि केवल rna पोलीमरेज़ आरएनए निर्भर और आंदोलन प्रोटीन5 और इसलिए यह पौधों में अपने संक्रामकता खो जाता है पर आधारित है; एक परिणाम के रूप में, मानव के लिए अपने संभावित संचरण बाहर रखा जाना चाहिए ।

प्रायोगिक प्रोटोकॉल यहां की रिपोर्ट कई विभिंन खाद्य प्रजातियों के लिए बढ़ाया जा सकता है, जैसे लेटिष, चेनोपोडियम कैपिटम और tetragoniaके रूप में विस्तार । के बाद से इन प्रजातियों के पत्ते, लाल चुकंदर और पालक, जिनकी पहले अच्छी अभिव्यक्ति संयंत्र5प्रणाली के रूप में पाया गया था सहित, कच्चा भोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां प्रस्तावित प्रौद्योगिकी खाद्य टीके के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या के लिए न्यूनतम संसाधित कार्यात्मक भोजन या फ़ीड का उत्पादन.

रीकॉम्बियंट प्रोटीन/पादप प्रजातियों का संयोजन, कटाई का डीपीआई जो उच्चतम रिकम्बीयंट प्रोटीन संचय स्तर देता है, को पुनः संयोजक प्रोटीन के आधार पर एक केस-दर-मामला आधार पर empirically निर्धारित किया जाना चाहिए और मेजबान पर पादप प्रजाति18.

मौखिक टीके के उत्पादन के लिए इस प्रौद्योगिकी के आवेदन के लिए निकट भविष्य में पारंपरिक टीकों के लिए एक विकल्प बनने के लिए महान क्षमता पकड़, oncolytic वायरस का मुकाबला करने के अलावा, lymphomas और ठोस ट्यूमर के लिए ऑटोलॉगस टीके, और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कैंसर को लक्षित करने के लिए19,20.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम संयुक्त परियोजना "एक स्व-प्रतिरक्षित मधुमेह खाद्य वैक्सीन के उत्पादन के लिए पौधों के उपयोग के द्वारा समर्थित किया गया था (एडिवा)" (परियोजना आईडी: ८९१८५४) कॉल २०१४ के ढांचे में verona के विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters Sartorius-Stedim 17764
2–mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma M8250 pH 5.5
96-well plate Sarstedt 833924
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade Sigma 34967
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate Sigma 70221
Anti-eGFP antibody ABCam ab290
Anti-GAD 65/67 antibody Sigma G5163
Anti-LHCB2 antibody Agrisera AS01 003
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
C18 Column Grace    - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column Grace    - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower Peter Excel 15-5-15 Fertilizer
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Chemiluminescence imaging system BioRad 1708370 ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform Sigma C2432
Detergent Sigma P5927 Polysorbate 20
Fluorescence reader Perkin-Elmer  1420-011 VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade Sigma 94318
Glycerol Sigma G5516 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase Promega M7841
HCl Sigma H1758 Corrosive
HILIC Column Grace    - Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column Grace    - Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler Beckman Coulter    - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter    - System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol Sigma 24137 Flamable
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
KCl Sigma P9541 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4 Sigma P9791 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution Ge Healthcare RPN2232 Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator 5Pascal LIO5P0000DGT
Mass Spectometer Bruker Daltonics   - Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol Sigma 32213
MgSO4 Sigma M7506
Milk-blocking solution Ristora    - 3 % in PBS
Na2HPO4 Sigma S7907 Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl Sigma S3014 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4 Sigma S8282  Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH Sigma S8045
Nitrocellulase membrane Ge Healthcare 10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7000
Peroxidase substrate ECL GE Healthcare RPN2235 Light sensitive material
Pump Vacuum Press VWR 111400000098
Reagent A Sigma B9643 Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B Sigma B9643 Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite Sigma 7681-57-4
Sonicator system Soltec 090.003.0003 Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe Terumo    -
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes Thermo Scientific 11573680
Trizma Base Sigma T1503 Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone Formedium TRP03 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator Heto 3878 F1-3 Speed-vac System
Water LC-MS grade Sigma 39253
Yeast extract Sigma Y1333 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

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References

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Santoni, M., Bertini, E., Zampieri, R., Cuccurullo, A., Commisso, M., Gecchele, E., Avesani, L. Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes. J. Vis. Exp. (145), e59298, doi:10.3791/59298 (2019).

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