نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج مرشح لقاح الفموي ضد داء السكري نوع 1 في مصنع للأكل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعبير عابر في البنجر الأحمر لقاح مرشح الصيدلانية البيولوجية لمرض السكري نوع 1
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الزراعة الجزيئية النباتية هو استخدام النباتات إنتاج جزيئات ذات الاهتمام. من هذا المنظور، النباتات قد تستعمل كالمفاعلات الحيوية لإنتاج وتنقية اللاحقة للمنتج النهائي والتسليم الشفوي المباشر من البروتينات مغايرة عند استخدام الأنواع النباتية الصالحة للأكل. في هذا العمل، نقدم تطوير اللقاح الفموي ضد داء السكري من النوع 1 (T1D) المرشح في النظم النباتية الصالحة للأكل باستخدام تكنولوجيا المستندة إلى فيروس الحمض النووي المؤتلف مصنع فككت تسليمها مع تسلل الفراغ. النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن بنجر أحمر مضيف مناسب للتعبير عابرة من أوتوانتيجين المشتقة البشرية المرتبطة T1D، يعتبر مرشح واعدة كلقاح T1D. اتسمت الأوراق المنتجة أوتوانتيجين دقة لمقاومتهم لهضم المعدة ووجود تهمة البكتيرية المتبقية لصورتهم الأيضية الثانوية، إعطاء لمحة عامة عن عملية الإنتاج للاستخدام المحتمل محطات للتسليم الشفوي المباشر بروتين مغايرة. وأظهر تحليل لدينا تدهور شبه كامل من اللقاح الفموي المرشح المعصوفه بعد هضم المعدة محاكاة، مما يوحي بأن استراتيجية تغليف في تصنيع اللقاح جاد المشتقة من النباتات مطلوب.
المقدمة
ومنذ ثورة البيولوجيا الجزيئية النباتية في الثمانينات، يمكن اعتبار الأنظمة المستندة إلى مصنع لإنتاج صيدلية كبديل للنظم التقليدية القائمة على الخلايا الجرثومية والثدييات1. عرض النباتات العديد من المزايا عبر الأنظمة الأساسية التقليدية، مع قابلية التطوير والفعالية من حيث التكلفة والسلامة هي الأكثر صلة بالموضوع2. يمكن تنقيته من الأنسجة النباتية تحول المنتج المؤتلف وثم إدارته، أما الحقن أو شفويا، وعلاوة على ذلك، تحولت النباتية الصالحة للأكل يمكن أن تستخدم مباشرة للتسليم عن طريق الفم. الطريق الفموي في الوقت نفسه يعزز حصانة المخاطية والجهازية، وأنه يلغي الحاجة للابر والموظفين الطبية المتخصصة. وعلاوة على ذلك، يلغي التسليم الشفوي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-أحمر زراعة البنجر والسبانخ
- زراعة البنجر الأحمر (الشائع باء-السيرة الذاتية مولان روج) والسبانخ (S. حمقاء السيرة الذاتية اندستريا) النباتات في غرفة لنمو، باستخدام µE 150 من شدة الضوء، 65% رطوبة نسبية، ح 12 دورة الضوء/الظلام في 23/21 درجة مئوية، على التوالي.
- بعد إنبات البذور، تسميد النباتات مرتين في أسبوع مع حل 1 غرام/لتر من الأسمدة المتاحة تجارياً (جدول المواد). أجروينفيلتراتيون استخدام السبانخ عمره خمسة في الأسبوع ونباتات البنجر الأحمر عمرها ست الأسبوع.
2-عابر التعبير من خلال التكنولوجيا المستندة إلى الفيروسات النباتية فككت
- بناء ناقلات التعبير النبات
- إدخال الناق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في هذا العمل، وسير العمل لتطوير لقاح الشفوي في الأنسجة النباتية الصالحة للأكل. أن التركيز في هذا العمل هو التعبير عن البروتين المستهدف في أنواع النباتية مضيف الصالحة للأكل، وتوصيف اللقاح الفموي المحتملة.
وشملت الخطوة الأولى في تقييم مدى ملاءمة التكنولوجيا التعبير المستندة إلى فيروس مصنع لإنتاج البروتينات المؤتلف في النظم النباتية الصالحة للأكل. لهذا الهدف، نستخدم أولاً اجفب بروتين نموذجي وأعربنا عن ذلك في زيوت الطعام النبات.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
واظهرنا في هذه الدراسة تحليل أولى لتصميم لقاح المرشح عن طريق الفم لمرض السكري المناعة الذاتية. البروتين المستهدف لهذه التجربة هو أحد أشكال كاتشين 65 البشرية Decarboxylase غلوتامات، هي الإنتاج والوظائف التي لا يمكن اكتشافها بسهولة وقابلة للقياس12المتحولة. في التعبير في الأنسجة النباتية الصالحة للأكل مختلفة توسط ناقلات5، التي تتوسط مستوى عال من إنتاج البروتين المؤتلف في غضون فترة زمنية قصيرة جداً. اختيار أفضل مرشح النبات المضيف الصالحة للأكل وأجرى استناداً إلى تعبير اجفب في ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها المشروع المشترك "استخدام النباتات لإنتاج لقاح للأكل لمرض السكري المناعة الذاتية (أديفا)" (معرف المشروع: 891854) ممولة من جامعة فيرونا في إطار نداء عام 2014.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.2-& مو ؛ م مرشحات غشاء Minisart RC4 | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2 & ndash ؛ mercaptoethanol | سيجما | M3148 | سامة ؛ 4٪ لجعل عازلة التحميل مع الجلسرين و SDS و Tris-HCl |
| 4-حمض مورفولين إيثان سلفونيك (MES) | سيجما | M8250 | درجة الحموضة 5.5 |
| لوحة 96 بئر | Sarstedt | 833924 | |
| حمض الخليك | Sigma | 27221 | أكالة |
| الأسيتونيتريل LC-MS الصف | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic & ndash ؛ مخزون 0.1 م في DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 جم / لتر لصنع LB متوسط (درجة الحموضة 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم) مع مستخلص الخميرة ، كلوريد الصوديوم والتربتون |
| فورمات الأمونيوم | Sigma | 70221 | |
| الجسم المضاد المضاد للأشعة فوق البنفسجية | ABCam | ab290 | |
| المضاد للهشاشة GAD 65/67 الأجسام المضادة | Sigma | G5163 | |
| الأجسام المضادة المضادة LHCB2 | Agrisera | AS01 003 | |
| الأزرق اللامع R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 العمود | Grace | - | Alltima HP C18 (150 مم × 2.1 مم ؛ 3 و مو ؛ م) العمود |
| C18 عمود الحراسة | Grace | ؛ - | Alltima HP C18 (7.5 مم × 2.1 مم ؛ 5 و مو ؛ م) الحراس عمود |
| CalMag Grower | بيتر إكسل | 15-5-15 | سماد |
| كاربينيسيلين ثنائي الصوديوم | دوشيفا بيوكيميمي | C0109 | |
| نظام تصوير التلألؤ الكيميائي | BioRad | 1708370 | التصوير باللمس |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| منظف | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| قارئ التألق | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS الصف | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15٪ لجعل التحميل عازل مع Tris-HCl و SDS و 2 & ndash ؛ mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| HILIC العمود | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 مم × 2.1 مم ؛ حجم الجسيمات 2.7 & mu ؛ م) عمود |
| عمود حراسة HILIC | Grace | ؛ - | Vision HT HILIC (7.5 مم × 2.1 مم ؛ 3 & mu ؛ م) الحراس عمود |
| بيروكسيداز الفجل (HRP) - مترافق الأجسام المضادة للأرانب | Sigma | A6154 | لا تجمد / تذوب مرات |
| عديدة HPLC Autosampler | Beckman Coulter | ؛ - | نظام الذهب 508 أخذ العينات التلقائية |
| HPLC نظام | بيكمان كولتر | ؛ - | نظام الذهب 128 وحدة المذيبات HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | |
| كبريتات الكاناميسين | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 جم / لتر مع كلوريد الصوديوم ، Na 2< / sub>HPO4< / sub> و KH2< / sub>PO4< / sub> لجعل PBS |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Sigma | P9791 | 2.4 جم / لتر مع كلوريد الصوديوم ، Na 2 < / sub >HPO4< / sub> و KCl لصنع PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol | حل Ge Healthcare | RPN2232 | تحضير الحل باستخدام مجموعة ECL Prime Western Blotting System التجارية |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; تم تجهيز مطياف الكتلة بمصدر ESI وكان المحلل عبارة عن مصيدة أيونية |
| الميثانول | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| حجب الحليب | Ristora | - | 3٪ في PBS |
| Na 2< / sub>HPO4< / sub> | Sigma | S7907 | استخدم مع NaH 2< / sub>PO4< / sub > لصنع عازلة فوسفات الصوديوم |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 جم / لتر مع KCl و Na2HPO4 و KH2PO4 لصنع PBS ؛ 10 جم / لتر لصنع وسط LB (درجة الحموضة 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم) مع مستخلص الخميرة ، التربتون وأجار البكتريولوجية الصف |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | استخدم مع Na2HPO4 لإنشاء عازلة فوسفات الصوديوم. 14.4 جم / لتر لصنع PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| غشاء النيتروسليلاز | Ge Healthcare | 10600002 | |
| البيبسين من الغشاء المخاطي للمعدة الخنازير | Sigma | P7000 | |
| ركيزة بيروكسيداز ECL | GE Healthcare | RPN2235 | المواد الحساسة للضوء |
| مضخة مكبس فراغ | VWR 111400000098 | ||
| الكاشف A | Sigma | B9643 | استخدم 50 جزءا من هذا الكاشف مع جزء واحد من الكاشف B لإعداد حل عمل BCA |
| الكاشف B | Sigma | B9643 | استخدم جزءا واحدا من هذا الكاشف مع 50 جزءا من الكاشف A لإعداد حل عمل BCA |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic & 25 مجم / مل مخزون في DMSO |
| SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم) | Sigma | L3771 | قابل للاشتعال ، سام ، تآكل - 10٪ مخزون ؛ 3٪ لجعل التحميل عازلة مع Tris-HCl و Glycerol و 2 & ndash ؛ mercaptoethanol |
| الصوديوم metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| نظام Sonicator | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; تردد 40 كيلو هرتز |
| حقنة | Terumo | - | |
| شفافة ثابتة 300 - وميكرو ؛ L إدراج أنابيب زجاجية | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام 1N HCl لعمل عازلة Tris-HCl ، استخدم 1،5M Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) لجعل عازلة التحميل مع SDS و Glycerol و 2 & ndash ؛ ميركابتو إيثانول |
| تريبتون | فورميد | TRP03 | 10 جم / لتر لصنع وسط LB (درجة الحموضة 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم) مع مستخلص الخميرة ، كلوريد الصوديوم ومكثف الفراغ من الدرجة البكتريولوجية |
| أجار Heto | 3878 F1-3 | نظام Speed-vac | |
| الماء LC-MS الصف | Sigma | 39253 | |
| مستخلص الخميرة | Sigma | Y1333 | 5 جم / لتر لعمل وسط LB (درجة الحموضة 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم) مع درجة التربتون والكلوريد الصوديوم وأجار البكتريولوجية |
المراجع
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
