Summary
ここでは、食用植物の 1 型糖尿病に対する経口ワクチン候補を生成するためのプロトコルを提案する.
Abstract
分子農業の興味の分子を生成するために植物の使用であります。このような観点で植物が両方使用するバイオリアクターとして生産と最終製品のそれに続く浄化のため、異種蛋白質の直接の口頭配達の食用植物の種を使用する場合。この作品は、食用植物を用いて解体工場ウイルスによる組換え DNA 技術、真空浸潤と配信のタイプ 1 の糖尿病 (T1D) に対する候補の経口ワクチンの開発を紹介します。我々 の結果は、赤いビーツが T1D ワクチンとして有望な候補であると T1D に関連付けられている人間の派生疱瘡一過性発現に適したホストであることを示します。胃消化に対する抵抗力、細菌の残留電荷の存在および潜在的な使用のためのプロセス生産の概要を与える彼らの二次代謝プロファイル、自己抗原の生産葉が特徴付けられた徹底的に植物による異種タンパク質の直接の口頭配達のため。我々 の分析を示した次のシミュレートされた胃の消化は、GAD の植物由来ワクチンの製造にカプセル化戦略が必要なことを示唆している凍結候補の経口ワクチンのほぼ完全劣化。
Introduction
1980 年代に植物分子生物学の革命以来バイオ医薬品の生産のための植物ベースのシステムは、微生物や哺乳動物細胞1に基づく従来のシステムに代わるものとして考えることが。植物は、スケーラビリティ、費用対効果と安全が最も関連性の高い2伝統的なプラットフォーム上のいくつかの利点を表示します。遺伝子組換え製品の形質転換体組織から精製や、経口的、どちらか口頭配達の直接変換の食用植物を使用ことができます経口投与し、また、することができます。経口ルートは同時に粘膜と全身の免疫を促進し、針や専門の医療関係者のための必要があります。さらに、口頭配達は通常組換え蛋白質3の総製造費用の 80% を占めている複雑なダウン ストリーム処理を排除します。すべてのこれらの利点は、生産、供給および労働の各投与量、世界の人口のほとんどが薬を手頃な価格のコスト削減で節約に翻訳できます。
安定した変換と過渡式の両方のいくつかの戦略は、植物における遺伝子組換え蛋白質の生産のために開発されました。その中で、高収率解体工場式のウイルス ベース システム (例えば、magnICON) は比較的短いタイム スケール4で組換えタンパク質の高収率をリードする優れた性能を提供します。ベンサミアーナ タバコ植物の植物ウイルス ベースの式を用いた一過性発現の多くの例が報告されているゴールド スタンダード本番ホストをされています。ただし、このモデルの植物はアルカロイドとその葉の蓄積は、他の毒性代謝産物により食用種とみなされない。
この作品は、赤ビート 2 つの食用植物システムの比較について述べる (ベータ版尋常 cvムーラン ルージュ) とほうれん草 (及ぼす oleracea cvインドゥストリア)、グルタミン酸の 65 kDa のアイソ フォームの 2 つの候補形式の表現のため脱炭酸酵素 (GAD65) 植物ウイルス ベースで実施の5 をベクトルします。GAD65 はタイプ 1 の糖尿病 (T1D) に関連付けられている主要な自己抗原と、それは現在または許容値6を誘導することによって T1D を遅延するを防ぐため人間臨床試験で調査中。植物における GAD65 の生産は、タバコと(名) ベンサミアーナ4,5,6,7としてモデル植物で広く研究されています。ここでは、直接口頭配達のために意味することができます組織の分子の生産のための食用植物の種の使用について述べる。ビューの技術的な観点から検討し、異なるパラメーターを評価することによって植物の agroinfiltration のシステムと GAD65 の生産のための食用植物プラットフォームを選択: 組換え蛋白質の表現のレベル、残留微生物工場にて組織の口頭配達、胃の消化に GAD65 の抵抗と野生型に変換された植物の同等のためのもの。
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Protocol
1. 赤いビーツとホウレンソウの栽培
- 赤カブを育てる (B の尋常性 cvムーラン ルージュ) とほうれん草 (s. キャベツ cvインドゥストリア) 23/21 ° C でそれぞれ照度, 相対湿度 65%, 12 時間の明暗サイクルの 150 Με を使用して成長部屋の植物。
- 種子発芽後市販肥料 (材料表) の 1 グラム/L の溶液で週二回植物を肥やしなさい。Agroinfiltration 5 週齢ほうれん草と 6 週齢赤ビーツの植物を使用します。
2. 過渡式解体工場ウイルス ベースの技術を
- 植物発現ベクターの構築
- -5' モジュール (pICH20111)、3' モジュール (pICH31070.GAD65mut、pICH31070.∆87G65mut、pICH7410.eGFP)、前述1,2、7、準備およびインテグラーゼ モジュール (pICH14011) - ベクトルを紹介します。アグロバクテリウムGV3101 ひずみで標準的な技術を使用してください。2 日間の 28 ° C の 50 μ g/mL リファンピシンおよび適切なベクトル特定の抗生物質 (pICH20111、pICH14011 および pICH7410.eGFP の 50 carbenicillin μ g/mL)、pICH31070 の 50 μ g/mL カナマイシンを含む LB 培地で育つ
- コロニー各ベクトルについて次の特異的プライマーを用いた PCR による植民地を画面: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' と 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' モジュール pICH31070.GAD65mut と pICH31070.∆87G65mut、55 ° C の熱処理温度と伸長時 110 s、5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' と 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3 3' モジュール pICH7410.eGFP、53 ° C の熱処理温度と 30 の伸長時間の s、5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' と 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3'53 ° C の熱処理温度と 20 s と 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3 の伸長時間 5' モジュール ' と 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' 57 ° C の熱処理温度と 45 の伸長時間インテグラーゼ モジュールの s。
- 総量が次の特定の反応サイクルを使用して 20 μ L の PCR 反応を行う: 5 分初期変性 95 ° c、30 の 35 サイクル 95 ° c、30 秒焼鈍温度と 72 ° C で延長のステップで s (アニール温度と伸びの時間、各プライマーのカップルのために特定の日時)、72 ° C で 7 分の最終的な延長のステップ
- 注射器 agroinfiltration
- 50 ml の LB 培地含む 50 μ g/mL のリファンピシンの次の適切なベクトル特定抗菌薬 3 A. 根頭がんしゅ病菌形質転換体を接種する: A. 根頭がんしゅ病菌pICH20111 と変換のための 50 μ g/mL carbenicillinpICH14011 または pICH7410.eGFP、またはA. 根頭がんしゅ病菌pICH31070 と変換のための 50 μ g/mL カナマイシン。一晩 28 ° c. で揺することによって成長します。
- 20 分 4,500 × gで遠心分離によって一晩細菌文化をペレットし、10 mM 4-morpholineethanesulfonic 酸 (MES; pH 5.5) を含む浸潤バッファーの 100 mL (または初期の細菌文化の 2 つの容積) でそれらを再懸濁しますと 10 mMMgSO4OD を考慮せず600 。懸濁液 3 時間 (RT) 室温で孵化させなさい。
- 3 つのモジュールでは、GAD65mut、5' モジュールと ∆87GAD65mut または eGFP の 3' モジュール、およびインテグラーゼ モジュールの 1 つを含む細菌懸濁液の平等なボリュームをミックスします。赤ビーツとほうれん草の葉の注射器浸潤用懸濁液ミックスを使用します。
- 針なしシリンジ 5 mL の懸濁液を配置します。ほうれん草とビーツの植物の葉の裏側から注射器の先端を押し、一方葉の反対側に優しい counterpressure を適用します。
- 各工場の頂点から始まって最初の 3 つの完全展開葉に潜入します。葉茎の紙タグと agroinfiltrated の葉のラベルを付けます。標準的な条件下で成長室で植物を返します。
注: 保健及び安全性の理由のためには目の保護と手袋を着用浸透過程中にして。 - 14 日後に感染症 (dpi) とそれらを液体窒素で凍結する 4 から収集 agroinfiltrated の葉します。-80 ° C でストア植物組織
- 真空 agroinfiltration
- 一晩 28 ° c. で揺することによって抗生物質の 50 μ g/mL リファンピシンおよび適切なベクトルに固有を含む LB 培地 50 mL に別途 3 A. 根頭がんしゅ病菌形質を成長します。
- ペレットで 4,500 x gで 20 分間の遠心分離で一晩細菌文化は 0.35 の OD600浸潤バッファーの 1 L でペレットを再懸濁し、RT で 3 h の懸濁液を孵化させなさい。
- 各サスペンションに 0.01 %v/v の洗剤 (ポリソルベート 20) を追加します。3 つのモジュールでは、GAD65mut、5' モジュールと ∆87GAD65mut または eGFP の 3' モジュール、およびインテグラーゼ モジュールの 1 つを含む細菌懸濁液の平等なボリュームをミックスします。
- 1 つのプラントを挿入 (6 週古い赤カブ植える、セクション 1 を参照してください) ホルダーに。ホルダーを反転し、浸透浴浸潤の懸濁液で葉が水没する (2 L) を含むビーカーの上に配置します。
注: は、すべての葉は、細菌懸濁液につけて完全にことを確認します。必要な場合は、余分な浸透の懸濁液を追加してレベルを上げます。 - 沈水植物の浸透浴を浸潤室に転送して閉じます。真空ポンプをオンにし、浸潤チャンバーの真空の吸気バルブを開きます。
- 浸潤チャンバー内の圧力が 90 mbar に縮小されると一度維持 3 分リリース真空 45 真空 s。浸潤室は大気圧に返されると、商工会議所を開き、細菌浴から浸透した工場を削除します。
- 標準的な条件下で成長室で植物を返します。
- 組換え蛋白質によって最大式 dpi で agroinfiltrated の葉を収集し、それらを液体窒素で凍結します。-80 ° C でストア植物組織
3. 組換え蛋白質発現解析
- 全可溶性タンパク (TSP) 抽出
- 注射器を挽くまたは真空浸透赤ビーツとほうれん草葉、乳鉢と乳棒を使用して液体窒素中微細粉末に 2.2.6、2.3.8、ステップで収集しました。15 mL プラスチック チューブに粉を転送および-80 ° C で素材を保存します。
- リーフ パウダー 300 mg に抽出バッファー (50 mM リン酸ナトリウム pH 8.0、メタ重亜硫酸ナトリウム 20 mM) の 900 μ L を追加します。
注: 選択したバッファー量 (μ L) を植物組織重量 (mg) 比は 1:3 です。 - 1 分間ボルテックスによって混合物を均質化し、4 ° C で 40 分間 30,000 × gで遠心分離
- クリーン チューブに上清を収集し、-80 ° C で保存
- 工場 eGFP の可視化と定量化
- 96 ウェル プレートに葉では、3 つの技術的なレプリケートを表現する eGFP から得られた各 TSP 抽出物の 100 μ L をロードします。
- 96 ウェルのプレートを入れて蛍光リーダーと測定を開始します。485/535 nm のフィルターが eGFP 蛍光検出に必要なセットを使用します。
- 絶対的な定量化のため同じプレートに準備校正曲線荷重別数量 (62.5、125、500、750、1,000 ng) 精製 eGFP の。
- ビシンコニン酸 (BCA) 試金小さじ定量化のため
- 試薬 B (材料表) の 1 部分に 50 部試薬 A (材料表) をミックスします。試金するためのサンプルと校正標準器の新鮮な BCA 実用的なソリューションの十分な量を準備します。
注: BCA 作業ソリューションの各サンプルの必要量は 1.9 mL です。9 基準 (空白を含む) の標準的な手順、17.1 mL BCA 実用的なソリューションが必要です。 - 各標準 (空白を含む) とラベル付きチューブに小さじエキス 0.1 mL のピペットします。
注: 校正標準器としては、ウシ血清アルブミンの新鮮なセットを準備できれば水などのサンプルとして同じ希釈を使用して 10 1,000 μ g/mL の範囲で (BSA) 標準。空白は、校正標準と試料調製用希釈液の 0.1 mL で構成されています。 - BCA 実用的なソリューションの 1.9 mL を加え、徹底的に混ぜます。チューブをカバーし、30 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- RT。 562 で吸光度を測定する管を冷却 10 分以内のすべてのサンプルの nm。
注: も常温色開発が続行されます。10 分以内ですべてのチューブの吸光度測定が行われた場合、重大なエラーは発生しません。 - 基準と小さじ抽出物の測定値から空白の 562 nm の吸光度の値を減算します。
- プロット空白修正 562 nm 濃度ごとの標準のための読書。各 TSP 抽出液のタンパク質濃度を決定します。
- 試薬 B (材料表) の 1 部分に 50 部試薬 A (材料表) をミックスします。試金するためのサンプルと校正標準器の新鮮な BCA 実用的なソリューションの十分な量を準備します。
- Gecchele ら8で説明したとおり染色 Coomassie ゲルを実行します。
- 西部のしみの分析
- Gecchele ら8に示したように西部のしみの分析を実行します。
- 蛋白質の電気泳動の分離後標準的な手法を用いた硝酸セルロースの膜の上にそれらを転送します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4 で 4% の牛乳を混ぜてブロック ソリューションを準備します。1 h の RT でブロッキング溶液 10 mL と膜をブロックします。
- ウサギ第一抗体抗 GAD65/67 および反 LHCB2、1: 10,000、0.1% 洗剤でブロッキング溶液 5 mL にアンチ eGFP の 1:20,000 を準備します。一晩で 4 ° C または一定の攪拌で常温 4 時間準備された一次抗体ソリューションと膜を孵化させなさい。
- 一次抗体を破棄し、ブロッキング溶液 0.1% 洗剤で 3 回各 5 分の膜を洗浄します。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の準備-0.1% 洗剤ソリューションをブロックの 1: 10,000 共役抗家兎抗体。一定の攪拌と RT で 1.5 h の膜を孵化させなさい。
- 二次抗体を破棄し、5 回 PBS-T (0.1% 洗剤を添加した PBS) で各 5 分の膜を洗浄します。
- 製造元の指示に従って市販ルミノール溶液を膜を孵化させなさい。化学発光イメージング システムを用いた信号を検出します。
4. 工場加工
- 真空 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 表現赤カブの収穫式ピーク (11 dpi) に出発し、液体窒素で凍結します。
- -50 ° C で 0.04 mbar 72 h の冷凍の葉を凍結乾燥します。-80 ° C で保存します。
- 葉は細かい粉に挽くし、水分を除外するシリカゲルと密封された容器で常温保存します。
5. 胃消化シミュレーションとセル ・ インテグリティ解析
- 胃消化シミュレーション
- 砕いたフリーズドライ赤ビートの葉の 100 mg の重量を量るし、6 mL の PBS (pH 7.4) でそれを再懸濁します。
- 6 M 塩酸で 2 サンプルの pH を調整します。
- 10 ミリメートル最後ペプシン濃度 1 mg/mL または 1:20 に可溶性蛋白質の比率を取得する HCl のブタの胃粘膜から 4 mg/mL ペプシンを追加します。120 分の 37 ° C でサンプルを振る。
- ペプシンを不活化する 1 M NaOH で pH 8 にサンプルを調整します。
- 遠心分離機の 20,000 × g 4 ° C で 20 分間の各サンプルの 750 μ 因数別に上清を収集し、読み込みバッファーの 1 つの上清ボリュームでペレットを再懸濁します (1.5 M トリス塩酸で pH 6.8, 3 %sds、15% グリセロールおよび 4 %2-メルカプトエタノール)。
注: 保健及び安全性の理由から、手袋を着用し、試料のヒューム フードの下で動作します。 - 西部のしみの分析8によって清と再懸濁のペレットの両方を分析します。
- セル ・ インテグリティ解析
- 砕いたフリーズドライ赤ビートの葉の 100 mg の 2 つのサンプルを準備し、6 mL の PBS (pH 7.4) の両方を再懸濁します。
- だけで 1 つの 120 分の 37 ° C で両方のサンプルを 6 M 塩酸シェイク 2 サンプルの pH を調整します。
- 遠心分離機の 20,000 × g 4 ° C で 20 分間の各サンプルの 750 μ 因数別に上清を収集し、読み込みバッファーの 1 つの上清ボリュームでペレットを再懸濁します。
- 西部のしみの分析によって清と再懸濁のペレットの両方を分析します。
6. バイオバーデン法
- フリーズドライの赤ビートの葉の 100 mg の重量を量る。8 mL の滅菌 PBS (pH 7.4) と 1 分の渦の中はパウダーを再懸濁します。
- 抗生物質有無 (i) 50 μ G/ml リファンピシン、または (ii) 50 μ G/ml リファンピシンおよび carbenicillin の各、(iii) 50 μ g/mL 各リファンピシン、カナマイシン、(iv) 50 μ g/mL 各カナマイシン、carbenicillin、リファンピシンを含む LB 培地を準備します。
- プレート各 5 LB 培のいずれかで凍結乾燥した葉に磨砕液の 1 mL。
- 28 ° C で 3 日間のすべての版を孵化させなさい
- 各プレート上に成長したアグロバクテリウムコロニーをカウントします。
- 計算し、凍結乾燥した葉のホモジネート (CFU/mL) の mL あたりコロニー形成単位 (CFU) 数として残留細菌電荷を定義します。
7. 代謝物抽出
- 主な代謝物抽出
- 格納されている-80 ° C の 30 mg の重量を量る、真空 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 表現 2 mL プラスチック チューブに赤ビートの葉の粉末。
- 2 時間-20 ° C で 30 s. 加温の冷たい 70/30 (v/v) メタノール/クロロホルムと渦の 750 μ L を追加します。
注: すべての溶剤と添加剤は、LC MS グレードをする必要があります。 - 新しい 2 mL のチューブに冷たい水と 10 分間収集 17,900 x gで 4 ° C で遠心と転送の 600 μ L 上するフェーズを追加します。下のクロロ相、相間を破棄します。
- 溶媒を蒸発させるため 3 h 用真空濃縮器にサンプルを入れてください。
- 50/50 (v/v) アセトニ トリル/水のステップ 7.1.4 で 300 μ L から得られたペレットを溶解し、3 分間サンプルを超音波照射します。
- ソリューションを 0.2 μ m のメンブラン フィルターを通過し、透明固定 300 μ L 挿入ガラス チューブに入れてください。
- 二次代謝産物の抽出
- -80 ° C 保存の 300 mg の重量を量る、真空 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 表現 15 mL プラスチック チューブに赤ビートの葉の粉末。
- 3 mL のメタノール、30 の渦を追加 s、15 分間 40 khz 超音波と。
注: すべての溶剤と添加剤は、LC MS グレードをする必要があります。 - 4,500 × g 10 分のための 4 ° c でサンプルを遠心し、培養上清を新しい 15 mL チューブに移します。
- 希釈 100 μ L の水と 1:3 (v/v) を抽出し、解決策を 0.2 μ m のメンブラン フィルターを通過します。
- 透明な固定 300 μ L 挿入ガラス管に、ソリューションを配置します。
- 極性脂質の抽出
- -80 ° C 保存の 200 mg の重量を量る、真空 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 表現 15 mL プラスチック チューブに赤ビートの葉の粉末。
- 水を 200 μ l 添加し、メタノール 2 mL を追加し、1 h の氷をします。
注: すべての溶剤と添加剤は、LC MS グレードをする必要があります。 - 渦 30 s と 15 分の 40 khz 超音波。
- 2 mL チューブにクロロホルム段階を 25 分収集のための 4 ° C で 4,500 x gでサンプルと転送に遠心します。上するフェーズと相間を破棄します。
- 溶剤を蒸発させる 3 h 用真空濃縮器にサンプルを入れてください。
- メタノールの 600 μ L で 7.3.5 ステップから得られたペレットを溶解します。
- 100 μ L 希釈 1:5 (v/v) とメタノールを抽出し、ソリューションを 0.2 μ m のメンブラン フィルターを通過します。
- 透明な固定 300 μ L 挿入ガラス管に、ソリューションを配置します。
8. 液体クロマトグラフィー質量分析およびデータ処理
- 製造元によって推奨されている LC MS システムを設定します。
注: LC セクションから成ります装備 C18 カラム (75 × 2.1 mm、粒子サイズ 5 μ m) C18 カラム (150 x 2.1 mm、粒子サイズ 3 μ m) の前に二次代謝産物と極性脂質の分析用 HPLC と相まって、オートサンプラー、一方、HILIC カラム (150 x 2.1 mm、粒子サイズ 2.7 μ m) の前に HILIC ガード列 (7.5 x 2.1 mm、3 μ m) を持つ。MS は、エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) または大気圧化学イオン化 (APCI) ソースで提供されるイオン トラップ質量分析計です。 - 高速液体クロマトグラフィー グラデーションの適切な溶剤を準備します。主代謝物分析用溶剤 A としてギ酸アンモニウム 20 mM を使用します。95% アセトニ トリル、水 5% プラス溶剤 B としてギ酸アンモニウム 10 mM二次代謝産物の解析、水プラス 0.05% ギ酸 (A) とアセトニ トリル 0.05% ギ酸 (B) を使用します。極性脂質の分析、水プラス 0.05% (A) と 100% ギ酸アセトニ トリル (B) を使用します。
注意: 溶剤と添加剤が LC MS グレードでなければなりません。 - 代謝物溶出の表 1で報告されたグラデーションを使用します。一方流量 0.2 mL/分二次代謝産物と極性脂質の各サンプルの注入の 10 μ L のセットは、主要代謝物の 5 μ L を挿入します。
- 品質管理 (QC) のサンプルを準備するには、各実験条件の代表的な混合物を持っているさまざまなサンプルの等しい部分を混合します。計測器の効率を監視するための実験中に QC サンプルを分析します。具体的には、それぞれの 10 のサンプル バッチ後 QC サンプル分析を挿入します。
- 計測器駆動の影響を避けるためにサンプルをランダムに。
- 9 解析後クリーニング方法およびブランク分析カラムに挿入直後後。
注: は、最強の溶媒の割合が高いをイソクラティック溶出と 2 つの溶媒間遅いグラデーションを実行します。純粋なメタノールの注入から成っている空白: 水 (50/50、v/v) 以下における保持時間の再現性を改善します。 - 表 2に記載されているパラメーターを使用して代替の正と負イオン化モードで質量スペクトルを取得する楽器を設定します。
注: その他のパラメーターは、特定のプラットフォームに依存します。 - Dal サントら9で説明したように、次のデータ処理を実行します。
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Representative Results
この作品は、食用植物組織の経口ワクチンの開発のためのワークフローが表示されます。この作品の焦点は、食用宿主植物のターゲット蛋白質の発現と潜在的な経口ワクチンの評価です。
最初のステップでは、食用植物システムで組換えタンパク質を生産する植物ウイルス ベース式技術の適合性の評価を関与しています。この目標に向けて、私たちは最初モデル蛋白質として、eGFP を使用し、我々 は 2 つの緑豊かな植物のシステムにそれを表明した: 赤いビーツとほうれん草。植物は手動で eGFP 遺伝子組換え発現ベクターを運ぶA. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液の agroinfiltrated.蛍光蛋白質の表現は西部のしみの分析 (図 1 a B、D、E) によって可視化され、紫外線の下で定量化します。結果 11 dpi (で測定した最大 eGFP レベル (113.4 ± 0.3 μ g/g FLW)、ほうれん草よりも赤ビート システムは 544.9 ± 10.9 μ g/g の新鮮な葉重量 (FLW) 9 dpi (図 1) に達するより高い eGFP 発現によって特徴付けられることを示した図 1 階)。これらの理由から赤カブは、式のホストすべての後の実験のために選ばれました。
陳ら10によると浸潤, より大規模なワクチン生産に適しているため真空法による eGFP 一過性発現を調べた。一晩 10-1 10-3と洗剤の濃度に至るA. 根頭がんしゅ病菌文化の異なる希釈率 (0.005 0.05%)最大式 dpi (9 dpi) で eGFP 蓄積レベルを比較することによってテストされています。結果はより高い細菌抗体価が大きい eGFP 利回りを生産 (10-1 〜 0.35)。ただし、大きな違いが見つかりませんでした洗剤濃度 (データは示されていない)。
その後、植物 0.35 外径600と洗剤の 0.01% のA. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液を注入した真空であった.GAD65、GAD65mut と、N 末端の 2 つの形式の式がフォーム (∆87GAD65mut) を切り捨て式プラットフォームと配信システムが確立されると、最大の式の日に比べれば 5 と 11 の dpi, 以前として11を設立しました。Agroinfiltrated から TSP の抽出が退職した後ウエスタンブロット分析したすべてのサンプルと組換え蛋白質のデンシトメトリーの分析 (図 2) によって比較的定量化を行った。結果は、GAD65mut を ∆87GAD65mut フォームの 20 の高いパフォーマンスを強調表示されます。省略形したがって 201.4 ± 29.3 μ g/g として FLW レッドビート葉 11 dpi で高蓄積最寄りの経口ワクチン候補に選ばれました。
最後に、潜在的な経口ワクチンの開発のためのパラメーターが評価されます。組換え蛋白質の整合性 ∆87GAD65mut を表現する赤いビーツの葉を浸透させた真空の凍結乾燥後は未処理 (冷凍のみ) と比較で評価された西部のしみの分析による組織。図 3 aのように、ターゲット蛋白質を凍結乾燥処理後安定する示した。
胃消化のシミュレーション凍結乾燥した材料を最終濃度 1 mg/mL または 1:20 TSP への割合で豚の胃の酵素ペプシンを追加によって行なわれました。消化器系の治療の両方の条件は西部のしみの分析によって示されるように組換えタンパク質分解の結果 (図 3、D、E、データ報告のみペプシンの最終濃度 1 mg/mL)。ペプシン消化 (車線ペプシン、p 1-3)、治療を凍結乾燥後植物細胞はターゲット蛋白質の分解につながる、それらの整合性を失ったことを示唆した後のペレット試料中の特定の信号の不在。
セルの整合性の評価を示したこと乾燥した植物組織された中性 pH (ペーハー 7.4)、∆87GAD65mut とバッファーで再停止されるとき部分的に可溶化、粉砕と乾燥葉中に少なくともいくつかの細胞が壊れたことを示唆します。酸性条件下で乾燥した植物組織の巻き上げは、代わりに、不溶性画分にのみ ∆87GAD65mut の検出につながった。これはおそらく、切れ目のないセル11のタンパク質含有量に加え、低 pH による ∆87GAD65mut 析出による。これらのアッセイは、その凍結乾燥は、ワクチン候補の準備のため治療が選択される可能性がありますを示します。
さらに、残留微生物 agroinfiltrated 赤ビートの葉にて評価しました。
その治療法の候補者ワクチンの準備のために悪用排除細菌負荷11バイオバーデン測定が表示されます。
∆87GAD65mut ・ コントロールの赤カブ植物の代謝的同等性は第一次および二次代謝産物の ∆87GAD65mut、9 つの agroinfiltrated コントロールを表現する 9 赤カブ工場から LC MS によって生成される極性脂質指紋によって評価されたと9 野生型を制御します。PCA の統計では、他のすべてのサンプルから分離野生型プラント クラスターを明らかにしました。∆87GAD65mut と浸潤と負の制御植物の代わりに強調表示されます有意差がないです。さらに、極性脂質プロファイルの面で植物の 3 つのグループの間で有意差は識別された11ありませんでした。
図 1: agroinfiltrated 赤ビーツとほうれん草の eGFP 発現レベルの比較の葉。西部のしみの分析 (A, D) と対応するコントロールを読み込む (RuBisCO 大サブユニット) Coomassie ブリリアント ブルー (B, E) の eGFP 発現からの蛋白質のエキスで染色 4 から 14 への葉のサンプルの時間コース分析中に収集日後に感染症 (dpi)。各葉蛋白質抽出物の eGFP コンテンツの蛍光測定 (C, F) による定量化を行った。Agroinfiltrated 赤ビートの葉サンプルからの結果は、右側の 1 つの agroinfiltrated ほうれん草のサンプルを表示する左側のパネルに表示されます。西部のしみの 3.5 μ g とクマシー染色の 30 μ g、タンパク質抽出の同量を読み込まれています。アンチ eGFP 抗体はウェスタンブロッティング解析プローブとして使用されています。側番号は、kDa の分子質量マーカーを示します。p. c.、肯定的な制御、10 商用組換え人間 GAD65; の ngA. 根頭がんしゅ病菌5' を運ぶだけで浸透して葉からノースカロライナ州ネガティブ コントロールを抽出- およびインテグラーゼ モジュール。誤差範囲は、3 つの独立した実験から標準偏差を表しています。この図は、ベルティーニら11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 赤ビートの葉で GAD65mut と Δ87GAD65mut の発現レベル。西部のしみの分析 (A) と対応する読み込み制御 (RuBisCo 大サブユニット) Coomassie ブリリアント ブルー (B) Δ87GAD65mut (左) と GAD65mut (右) を表現する 3 つの赤いビーツの葉からの蛋白質のエキスのと汚れます。抗 GAD 抗体は (車線は、GAD65mut のためのエキスの 20 μ L と Δ87GAD65mut のためのエキスの 1 μ L 読み込まれた) 西部のしみの分析プローブとして使用されています。ゲルを染色 Coomassie、タンパク質抽出液 (10 μ L/レーン) の同じボリュームが GAD65mut と Δ87GAD65mut の積載されていた。側番号は、kDa の分子質量マーカーを示します。p. c.、肯定的な制御、10 商用組換え人間 GAD65; の ngノースカロライナ州、ネガティブ コントロール、 A. 根頭がんしゅ病菌5' を運ぶだけで潜入の葉から得られた抽出物- およびインテグラーゼ モジュール。(C) 使用してデンシトメトリーの分析、2 つのタンパク質の形態の相対発現レベルの参照として西部のしみの肯定的な制御がプロットされます。誤差範囲は、3 つの独立した実験から標準偏差を表しています。この図は、ベルティーニら11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:経口ワクチン候補の評価。左側にある後治療 (a, B) を凍結乾燥タンパク質の安定性の解析。西部のしみの分析 (A) と対応するゲルは、Coomassie ブリリアント ブルー (B) Δ87GAD65mut を表現する葉から 3 つの独立したエキスを表すと汚れます。収穫された葉直接冷凍 (新鮮な) または 72 時間 (凍結乾燥) 0.04 mbar-50 ° C で凍結乾燥します。異なる組織: バッファー比は、脱水による水の損失を考慮するために小さじ抽出の間に採用されました。エキスの等量は、0.25 と 10 μ L、西部のしみのそれぞれ染色 Coomassie 読み込まれました。抗 GAD 抗体が使用されているプローブ側西部のしみの数字は kDa の分子質量マーカー。A. 根頭がんしゅ病菌 5' を運ぶだけで葉の infiltrated からノースカロライナ州ネガティブ コントロールを抽出- およびインテグラーゼ モジュール。生体外模擬の右側にある、Δ87GAD65mut の胃の消化 (C、D、E)。西部のしみの分析 (C, D) と対応するゲルは、Coomassie ブリリアント ブルー (E) シミュレートされた胃消化後 Δ87GAD65mut を表現する葉の 3 つの独立したエキスを表すと汚れます。ペプシンの mg/ml 1 つなしで酵素が使用されているコントロールのサンプル中の凍結組織の 100 mg に追加されました。24 μ L と培養上清 (s) および餌 (p) 最終的なの遠心分離のステップで得られるそれぞれのための 16 μ L は、SDS-PAGE 分析のために使用されています。抗 GAD (C) および反 LHCB2 (D) 抗体はウェスタンブロッティング解析プローブとして使用されました。側番号は、kDa の分子質量マーカーを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 主な代謝物 (100 分) | 時間 (分) | % A | % B | 時間 (分) | タイプ |
| 初期 | 0 | 100 | - | 初期条件 | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | イソクラティック | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | グラデーション | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | イソクラティック | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | グラデーション | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | イソクラティック | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | グラデーション | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | イソクラティック (再平衡) | |
| 二次代謝産物 (60 分) | 時間 (分) | % A | % B | 時間 (分) | タイプ |
| 初期 | 98 | 2 | - | 初期条件 | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | グラデーション | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | グラデーション | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | グラデーション | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | グラデーション | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | イソクラティック | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | グラデーション | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | イソクラティック | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | グラデーション | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | イソクラティック (再平衡) | |
| 極性脂質 (90 分) | 時間 (分) | % A | % B | 時間 (分) | タイプ |
| 初期 | 50 | 50 | - | 初期条件 | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | グラデーション | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | イソクラティック | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | グラデーション | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | イソクラティック (再平衡) |
LC-MS 分析で代謝物溶出の表 1: 勾配条件。
| 質量分析計部品 | 関数 | パラメーター | ||||
| 主な代謝物 | 二次代謝産物 | 極性脂質 | ||||
| エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) ソース | ガスを噴霧 | 50 psi、350 ° C | 50 psi、350 ° C | - | ||
| 乾燥ガス | 10 L 分 1 | 10 L 分 1 | ||||
| 大気圧化学イオン化 (APCI) ソース | ガスを噴霧 | - | - | 50 psi、350 ° C | ||
| 乾燥ガス | 10 L 分-1 | |||||
| 気化器 | 450 ° C | |||||
| イオン トラップと検出器走査 | フルスキャン モード | 1 秒あたり 13,000 m/z | 1 秒あたり 13,000 m/z | 1 秒あたり 13,000 m/z | ||
| 50-1,500 m/z | 50-1,500 m/z | 50-1,500 m/z | ||||
| スキャン範囲 | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| 質量を対象します。 | ||||||
| 衝突ガス | ヘリウム | |||||
| 真空圧力 | 1.4 x 10-5 mbar | |||||
| キャピラリーのソース | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| エンド プレート オフセット | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| スキマー | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| キャップ出口 | 106 V | -121 V | 143.5 V | |||
| 10 月 1 日 DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| 10 月 2 日 DC | 1.7 V | -1.7 V | 2 V | |||
| レンズ 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| レンズ 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| 正イオン化モードの ICC | 20 | |||||
| 負イオン化モードの ICC | 7 | |||||
表 2: 代替の正と負イオン化モードで質量スペクトル取得のパラメーター。
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Discussion
本研究では、自己免疫の糖尿病のための候補者の経口ワクチンの設計のための予備的な分析を示した。この実験のターゲット蛋白質は人間 65 kDa の生産と機能が、容易に検出および測定可能な12グルタミン酸脱炭酸酵素の変異する形式だった別の食用の植物の組織での発現ベクトル5では非常に短い時間枠で組換えタンパク質生産の高いレベルを仲介媒介だった。赤カブの eGFP 発現に基づく食用ホストが行った最高の候補者植物の選択とほうれん草のマニュアル agroinfiltration によって葉します。この手順は、手動 agroinfiltration の時間のかかるプロシージャとほうれん草葉組織浸潤における硬さのため産業のスケール アップにとって重要な可能性があります。
組換え蛋白質の最高の組換え蛋白質蓄積レベルを与える収穫の特定の dpi の識別の重要なステップは、テストし、ケースバイ ケースに基づいて選択する必要があります.各工場における最大の式の日を識別することは異なる dpi (4 〜 12) の蛍光蛋白質の表現の分析。EGFP の濃度 (μ g/g FLW)、これらの最大表現日比較強調表示赤ビートは最高の組換え蛋白質収量面でプラットフォームを実行します。
このため、赤カブは真空システムは、ワクチン産業の大規模な生産13より望ましいと思われる植物ウイルスのベクトルの配信のためさらにテストされました。
タバコ種5標準真空浸潤プロトコルを最適化したことを考える、考慮植物種のプロシージャ調整のパラメーターの範囲の設定は重要なポイントです。その後、赤ビート真空 agroinfiltration プロトコルを最適化しました。我々 の証拠を示したアグロバクテリウム希釈が葉の浸透率を高めるために洗剤濃度中のバイオマーカ発現量を改善するために重要であります。その結果、プラント システム、この仕事の目的に合う技術。
(名) ベンサミアーナ7、別の細胞内局在を表示する彼らの表現の特徴と以前 GAD65、GAD65mut と ∆87GAD65mut、2 つの異なる形式がビーツで真空浸潤で表現されます。3 つの生物学的複製は、すべてのサンプルの調製しました。各生物の複製には、GAD65 形式のどちらに対して 14 dpi に 2 からサンプリングした別の植物から 3 つの浸透した葉のプールが構成されています。発現レベルは、植物組織の最高の蓄積蛋白質を選択する比較しました。
デンシトメトリーの分析による相対的な定量化は、∆87GAD65mut がそのままその相手よりも 20 高い発現レベルを持っていることを示した。これがゾル性細胞質局在化のため GAD65mut、細胞膜は、このフォームをアンカーの残基によるものがある7をもたらす低いながら反映するタンパク質の安定性が低い。赤カブの葉のティッシュの ∆87GAD65mut 平均蓄積レベルだった 201.4 ± 29.3 μ g/g、FLW T1D 経口ワクチンの開発を開始するのに十分であります。
最後に、プラットフォーム、技術およびタンパク質に最も適した形の選択は後は、感染葉の収穫後の処理を設定することによって進んだ。葉の組織は、水の 95% から構成されている、脱水治療、微生物汚染を防ぐために役立ちます。実験の結果, 凍結乾燥処理が葉の組換えタンパク質レベルの影響を与えずにサンプルに適用すること。凍結乾燥によって 10 倍水の除去は、agroinfiltration プロシージャに使用される組換えA. 根頭がんしゅ病菌を含む細菌汚染 (バイオバーデン) を排除します。
さらに、タンパク質バイオ カプセル化の分析は、シミュレートされた胃消化の後、∆87GAD65mut は完全に消化されることを示した。胃の環境の酸性と酵素の組成に組換えタンパク質を公開する、植物細胞壁を凍結乾燥処理に損傷が示唆されました。
吸収のサイトに消化管転移をタンパク質やペプチド分子の整合性の維持は、経口薬配信14の問題を表します。したがって、脱水治療後正しくの整合性を失うことがなく胃の環境を克服するために潜在的なワクチンを策定します。GAD の植物由来ワクチンの製造に保護し口頭配達ルート15に沿って安定にすることができますその効率を向上させるシステムとして比較的安定したシェルでカプセル化を適用でした。
高分子高カプセル化効率を示したインスリンと急激なインスリン合成ハイドロゲルの錯形成反応に関するいくつかの最近の研究などの口頭配達に関連する問題を克服するために様々 な技術が検討されています。pH 依存的16,17の腸内をリリースします。
浸潤と非浸潤のコントロールと比較して ∆87GAD65mut を発現する植物の両方の第一次および二次代謝物の同等は、PCA の統計を用いて検討しました。野生型の非浸透植物独立したクラスターを形成するのに対し、∆87GAD65mut と浸透したコントロールを表す浸透した植物の違いは重要でした。これらの結果は、浸透した植物細菌代謝産物または既に文学13に示すように、浸透のための植物によって生成される代謝産物のおかげで液体クロマトグラフィー質量分析による無処理に区別されることをお勧めします。全体的にこの分析は、∆87GAD65mut の蓄積が全体の代謝に対してほとんど影響を持っていることを示した。
全体で示唆された植物ウイルス ベース式技術を利用して得られた ∆87GAD65mut を表現する凍結乾燥レッドビート葉組織によって表される、潜在的な経口ワクチンは実験的 T1D 経口免疫療法に適しています。試験。植物ウイルス発現ベクター テクノロジーは、過渡の式] フィールドに急速にかつ高いレベルで外国蛋白質を生成する能力のために非常に魅力的になっています。この技術は RNA 依存 RNA ポリメラーゼと運動蛋白質5のみを運ぶ解体ベクトルに基づいており、したがってそれは植物に感染力を失う結果として、人間への潜在的な感染を除外すべき。
ここで報告した実験的なプロトコルは、多くの異なる食用種、レタスなどアカザ capitatum 、ツルナに拡張すること。これらの種は、ビーツ、ほうれん草などの葉から調理食品として使用できる誰が以前良い式プラント システム5と検出、製造食用ワクチンや、ここで提案されているテクノロジーを使用可能性があります。最低限の処理の機能性食品や飼料の生産。
組換えタンパク質/植物種の組み合わせは、最高の組換え蛋白質蓄積レベルを与える収穫の dpi 必要がありますまだ発現組換え蛋白質によってケースバイ ケースとホスト、経験的に決定植物種18。
経口ワクチンの生産のためのこの技術の応用を保持に従来のワクチンは、近い将来には、戦闘腫瘍溶解性ウイルス、リンパ腫、固形腫瘍、自家ワクチンに加えての代替になる大きな可能性とターゲット癌19,20モノクローナル抗体。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は「自己免疫性糖尿病食用ワクチン (eDIVA) 生産ため植物の使用」の共同プロジェクトによって支えられた (プロジェクト ID: 891854) 呼び出し 2014 のフレームワークで、ヴェローナ大学によって資金を供給。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
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