Summary
Her presenterer vi en protokoll for å produsere en oral vaksine kandidat mot Type 1 diabetes i en spiselig plante.
Abstract
Anlegget molekylær oppdrett er bruk av planter å produsere molekyler av interesse. I dette perspektivet, kan planter brukes både som bioreaktorer for produksjon og påfølgende rensing av det endelige produktet og den muntlige direktelevering heterologous proteiner ved spiselige plantearter. I dette arbeidet presenterer vi utviklingen av en kandidat oral vaksine mot Type 1 Diabetes (T1D) i spiselig plante-systemer som bruker dekonstruerte plante virus-basert rekombinant DNA-teknologi, leveres med vakuum infiltrasjon. Våre resultater viser at en red bete er en passende vert for forbigående uttrykket av en menneskelig avledede autoantigen knyttet til T1D, anses å være en lovende kandidat som en T1D vaksine. Bladene produserer autoantigen var grundig preget for deres motstand mot mage fordøyelsen, tilstedeværelse av gjenværende bakteriell og sekundære metabolske profilen, gir en oversikt over prosessen produksjon for å benytte planter for muntlig direktelevering en heterologous protein. Vår analyse viste nesten fullstendig nedvurdering frysetørket kandidat oral vaksine etter en simulert mage fordøyelsen, tyder på at det kreves en innkapsling strategi i produksjon av plante-avledet GAD vaksinen.
Introduction
Siden anlegget molekylærbiologi revolusjonen i 1980, kan plante-baserte systemer for produksjon av biopharmaceuticals betraktes som et alternativ til tradisjonelle systemer basert på mikrobiell og pattedyr celler1. Planter vise flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle plattformer, skalerbarhet, kostnadseffektivitet og sikkerhet blir de mest relevante2. Rekombinant produktet kan renset fra transformert anlegget vev og deretter administreres, enten parenterally eller muntlig, og dessuten transformert spiselig plante kan brukes direkte for muntlig levering. Muntlig ruten fremmer samtidig slimhinnene og systemisk immunitet, og det eliminerer behovet for nåler og spesialiserte medisinske personell. Videre eliminerer muntlig levering den komplekse nedstrøms behandlingen, som vanligvis står for 80% av totale produksjonskostnadene for en rekombinante proteiner3. Alle disse fordelene kan oversettes til besparelser i produksjon, utstyr og arbeidskraft redusere kostnadene for hver dose, gjør stoffet rimelig for de fleste av den globale befolkningen.
Flere strategier, både for stabil transformasjon og forbigående uttrykk, ble utviklet for produksjon av rekombinante proteinene i planter. Blant dem gir en høy avkastning dekonstruerte plante virus-basert uttrykk systemet (f.eks magnICON) overlegen ytelse fører høy avkastning av rekombinante proteinene over relativt korte tidsskalaer4. Mange eksempler på forbigående uttrykk ved hjelp av plante virus-basert uttrykk systemet i Nicotiana benthamiana planter rapporteres, være gullstandarden produksjon verten. Men regnes denne modellen anlegget ikke som en spiselig Art i alkaloider og andre giftige metabolitter som er akkumuleres i bladene.
I dette arbeidet, beskriver vi sammenligningen mellom to spiselig plante systemer, red bete (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (Spinacea oleracea cv Industria), for uttrykket av to kandidat former for 65 kDa isoformen av Glutaminsyre dekarboksylasehemmer (GAD65), utført av anlegget virus-basert vektorer5. GAD65 er en stor autoantigen knyttet til Type 1 Diabetes (T1D) og det er under etterforskning i menneskets kliniske forsøk å forebygge eller utsette T1D ved å fremkalle toleranse6. Produksjonen av GAD65 i planter har vært grundig studert i modellen plantearter Nicotiana tabacum og N. benthamiana4,5,6,7. Her beskriver vi bruk av spiselige planter for produksjon av molekylet i vev som kan være ment for en muntlig direktelevering. Fra et teknisk synspunkt, vi studerte og valgt systemet for anlegget agroinfiltration og spiselig plante plattformen for GAD65 produksjon ved å evaluere ulike parametere: rekombinante proteiner uttrykket nivåer, gjenværende mikrobiell tillegget i anlegget vev ment for muntlig levering, motstanden av GAD65 til mage fordøyelsen, og bioequivalence av transformert planter med vill-type.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Red bete og spinat dyrking
- Vokse red bete (B. vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (S. oleracea cv Industria) planter i en vekst kammer, med 150 µE lysintensiteten, 65% relativ fuktighet, 12t lys/mørke syklus ved 23/21 ° C, henholdsvis.
- Etter frø spiring, gjødsle plantene to ganger i uken med en 1 g/L løsning på en kommersielt tilgjengelig gjødsel (Tabell for materiale). Agroinfiltration bruke fem-uke-gamle spinat og seks-uke-gamle red bete planter.
2. forbigående uttrykk gjennom dekonstruerte plante virus-basert teknologi
- Byggingen av anlegget uttrykk vektorer
- Introdusere vektorer - 5' modulen (pICH20111), 3 moduler (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut og pICH7410.eGFP), utarbeidet som beskrevet tidligere1,2,7og integrase modulen (pICH14011)- i Agrobacterium tumefaciens GV3101 belastningen ved bruk av standardmetoder. Vokse på LB medium som inneholder 50 μg/mL og og riktig vektor-spesifikk antibiotika (50 μg/mL carbenicillin for pICH20111, pICH14011 og pICH7410.eGFP), 50 μg/mL kanamycin for pICH31070 for 2 dager på 28 ° C.
- Skjermen koloniene av kolonien PCR bruker følgende spesifikke primerne for hver vektor: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3 "og 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3" for både 3 moduler pICH31070.GAD65mut og pICH31070.∆87G65mut, med en annealing temperatur på 55 ° C og en forlengelse tid på 110 s, 5-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3 "og 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3" for den tredje 3 modul pICH7410.eGFP, med en annealing temperatur 53 ° c og en forlengelse tid 30 s, 5-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3 "og 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3" for 5' modulen, med en annealing temperatur 53 ° c og en forlengelse tid 20 s og 5-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3 "og 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3" for integrase-modulen med en annealing temperatur 57 ° c og en forlengelse tid 45 s.
- Utføre PCR reaksjonen i et totalvolum på 20 μL bruker følgende spesifikk reaksjon syklusen: 5 min første rødsprit ved 95 ° C, 35 sykluser av 30 s på 95 ° C, 30 s annealing temperaturen og forlengelse trinnet ved 72 ° C (annealing temperatur og forlengelse en Re spesifikke for hver primer par) og en siste forlengelse trinn 7 min på 72 ° C.
- Sprøyte agroinfiltration
- Vaksinere de tre A. tumefaciens transformants i 50 mL av LB middels inneholder 50 μg/mL og og følgende aktuelle vektor-spesifikk antibiotika: 50 μg/mL carbenicillin for A. tumefaciens forvandlet pICH20111, pICH14011 eller pICH7410.eGFP, eller 50 μg/mL kanamycin for A. tumefaciens forvandlet pICH31070. Ved risting natten på 28 ° C.
- Pellets overnatting bakteriekulturer med sentrifugering 4500 x g for 20 min og resuspend dem i 100 mL (eller to bind av den første bakteriell kulturen) infiltrasjon bufferen inneholder 10 mM 4-morpholineethanesulfonic acid (MES, pH 5.5) og 10 mM MgSO4, uten å vurdere OD600. Inkuber suspensjoner ved romtemperatur (RT) for 3 h.
- Bland like volum av bakteriell suspensjoner som inneholder ett av de tre modulene, GAD65mut, ∆87GAD65mut eller eGFP 3 modulen, med 5' modul og integrase modulen. Bruk suspensjon blandingen for sprøyten infiltrasjon av red bete og spinat blader.
- Sett 5 mL av suspensjon i sprøyter uten nålen. Trykk spissen på sprøyten mot undersiden av bladet for både spinat og red bete planter, og i mellomtiden bruke en mild counterpressure på den andre siden av bladet.
- Infiltrere tre første fullstendig utvidet bladene fra toppen for hver plante. Etiketten agroinfiltrated bladene med en papir-kode på blad stammen. Returnere plantene i en vekst kammer under standard betingelser.
Merk: Helse- og sikkerhetsgrunner, Bruk vernebriller og hansker under infiltrasjon prosessen. - Samle agroinfiltrated blader fra 4 til 14 dager legge infeksjon (PPT) og fryse dem i flytende nitrogen. Store anlegget vev på-80 ° C.
- Vakuum agroinfiltration
- Vokse separat de tre A. tumefaciens transformants i 50 mL av LB medium som inneholder 50 μg/mL og og riktig vektor-spesifikk antibiotika av risting natten på 28 ° C.
- Pellet overnatting bakteriekulturer med sentrifugering 4500 x g i 20 min. Resuspend pellet 1 l infiltrasjon bufferen til et OD600 på 0,35 og ruge suspensjoner på RT 3 h.
- Legge til 0,01% v/v av vaskemiddel (polysorbat 20) til hver suspensjon. Bland like volum av bakteriell suspensjoner som inneholder ett av de tre modulene, GAD65mut, ∆87GAD65mut eller eGFP 3 modulen, med 5' modul og integrase modulen.
- Sett inn ett anlegg (seks-uke-gamle red bete plante, se avsnitt 1) i holderen. Invertere holderen og plasser på et beger som inneholder infiltrasjon badekaret (2 L) å senke blader i infiltrasjon suspensjon.
Merk: Kontroller at alle bladene er helt dyppet i bakteriell suspensjon. Heve nivået med tillegg av ekstra infiltrasjon suspensjon hvis nødvendig. - Overføre infiltrasjon badekaret med neddykket anlegget til infiltrasjon chamber og lukke den. Aktivere vakuumpumpe og åpne vakuum inntak ventilen på infiltrasjon kammeret.
- Når trykket i infiltrasjon kammeret har redusert til 90 mbar, holde vakuum for 3 min. utgivelsen vakuum for 45 s. Når infiltrasjon kammeret har returnert til lufttrykk, åpne kammeret og fjern infiltrere anlegget fra bakteriell bad.
- Returnere plantene i en vekst kammer under standard betingelser.
- Samle agroinfiltrated blader på maksimal uttrykk PPT, avhengig av rekombinant protein, og fryse dem i flytende nitrogen. Store anlegget vev på-80 ° C.
3. rekombinant protein uttrykk analyse
- Totalt løselig protein (TSP) utvinning
- Slipe sprøyten eller vakuum infiltrert red bete og spinat blader, samlet i trinn 2.2.6 og 2.3.8, til pulver i flytende nitrogen bruker morter. Overføre pulver til 15 mL plast rør og lagre materialet-80 ° C.
- Legge til 900 µL utvinning bufferen (50 mM natrium fosfat pH 8.0, 20 mM natriummetabisulfitt) 300 mg blad pulver.
Merk: Det valgte forholdet mellom anlegget vev vekt (mg) til buffer volum (µL) er 1:3. - Homogenize blandingen av vortexing for 1 min, så sentrifuge 30.000 x g for 40 minutter til 4 ° C.
- Samle nedbryting i et rent rør og lagre det på-80 ° C.
- Anlegget eGFP visualisering og kvantifisering
- Legg 100 µL av hver TSP pakke hentes fra eGFP uttrykke blader, i tre tekniske gjentak, på en 96-brønns plate.
- La 96-brønns platen i en fluorescens leser og starte målingen. Bruk 485/535 nm filtersettet kreves for eGFP fluorescens gjenkjenning.
- For absolutte kvantifiseringen, i den samme platen forberede en kalibreringskurven lasting forskjellige mengder (62,5, 125, 500, 750 og 1.000 ng) av en renset eGFP.
- Bicinchoninic syre (BCA) analysen for TS kvantifisering
- Bland 50 deler av reagens A (Tabell for materiale) med 1 del av reagens B (Tabell for materiale). Forbered tilstrekkelig mengde frisk BCA fungerende løsning for prøvene å være assayed og kalibrering standarder.
Merk: Volumet av BCA fungerende løsning kreves for hvert utvalg er 1,9 mL. Standard prosedyre med 9 standarder (inkludert en tom), er 17.1 mL av BCA fungerende løsning nødvendig. - Pipetter 0,1 mL av hver standarden (inkludert en tom), og TS ekstrakter inn i et merket rør.
Merk: Som kalibrering standarder, forberede et friskt sett med bovin serum albumin (BSA) standarder i området 10-1000 μg/mL, fortrinnsvis bruker samme fortynningsmiddel som prøver, som vann. Tomt består av 0,1 mL av den fortynningsmiddel benyttes til kalibrering standard og prøve forberedelse. - Legg 1,9 mL av BCA fungerende løsning og bland godt. Dekker rør og ruge på 37 ° C i 30 min.
- Cool rør til RT. måle absorbans ved 562 nm i alle prøvene i 10 min.
Merk: Selv om RT, farge utviklingen fortsetter. Ingen betydelige feil vil bli introdusert hvis absorbansen målinger av alle rør er gjort i 10 min. - Trekk 562 nm absorbansen verdien av tomt fra målingene av standarder og TS ekstrakter.
- Tomten tom-korrigert 562 nm lesing for hver standard på sin konsentrasjon. Bestemme protein konsentrasjonen av hver TSP ekstrakt.
- Bland 50 deler av reagens A (Tabell for materiale) med 1 del av reagens B (Tabell for materiale). Forbered tilstrekkelig mengde frisk BCA fungerende løsning for prøvene å være assayed og kalibrering standarder.
- Utføre Coomassie gel flekker som beskrevet tidligere i Gecchele et al.8.
- Western blot analyse
- Utføre western blot analysen som tidligere beskrevet i Gecchele et al.8.
- Etter electrophoretic separasjon av proteiner, overføre dem på en nitrocellulose membran ved hjelp av. Forberede den blokkerende løsningen ved å blande 4% melk i fosfat-bufret saltvann (PBS) pH 7.4. Blokkere membranen med 10 mL blokkerer løsningen på RT 1t.
- Forberede kanin primære antistoffer ved 1:10,000 for anti-GAD65/67 og anti-LHCB2 og 1:20,000 for anti-eGFP i 5 mL blokkerer løsning med 0,1% vaskemiddel. Inkuber membranen med forberedt primære antistoff løsninger overnatting på 4 ° C eller 4 h på RT med konstant uro.
- Forkaste primære antistoffer og vask membranen 3 ganger i 5 min hver blokkerer løsning som inneholder 0,1% vaskemiddel.
- Forberede pepperrotperoksidase (HRP)-konjugat anti-kanin antistoff på 1:10,000 i blokkering løsning med 0,1% vaskemiddel. Inkuber membranen 1.5 h på RT med konstant uro.
- Forkaste sekundære antistoffer og vask membranen 5 ganger i 5 min hver med PBS-T (PBS med 0,1% vaskemiddel).
- Inkuber membranen en kommersielt tilgjengelig luminol løsning etter produsentens instruksjoner. Gjenkjenne bruker chemiluminescence imaging system.
4. plante materiale behandling
- Harvest vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-uttrykke red bete blader på uttrykk toppen (11 PPT) og fryse dem i flytende nitrogen.
- Lyophilize frosne bladene 72 h-50 ° C og 0.04 mbar. Lagre dem på-80 ° C.
- Slipe bladene til pulver og lagre den på RT i lukket beholder med silica gel å ekskludere fuktighet.
5. mage fordøyelsen simulering og celle integritet analyse
- Mage fordøyelsen simulering
- Veie 100 mg av slipt frysetørket red bete blader og resuspend det i 6 mL av PBS (pH 7.4).
- Justere eksempel pH 2 med 6 M HCl.
- Legge til 4 mg/mL pepsin fra svin mage mucosa i 10 mM HCl å skaffe en siste pepsin konsentrasjon av 1 mg/mL forholdet 1:20 totale løselig proteiner. Riste prøven på 37 ° C i 120 minutter.
- Justere prøvene til pH 8 med 1 M NaOH å deaktivere pepsin.
- Sentrifuge 750 µL dele hver prøve 20.000 x g for 20 min på 4 ° C. Samle separat nedbryting og resuspend pellet i ett supernatant volum av laste buffer (1,5 M Tris HCl, pH 6.8, 3% SDS, 15% glyserol og 4% 2-mercaptoethanol).
Merk: Helse- og sikkerhetsgrunner, bruk hansker og arbeide under avtrekksvifte for eksempel forberedelse. - Analysere både nedbryting og urinprøven ved western blot analyse8.
- Celle integritet analyse
- Forberede to eksempler på 100 mg av slipt frysetørket red bete blader og resuspend både i 6 mL av PBS (pH 7.4).
- Justere pH i bare en prøve 2 med 6 M HCl. rist begge eksempler på 37 ° C i 120 minutter.
- Sentrifuge 750 µL dele hver prøve 20.000 x g for 20 min på 4 ° C. Samle separat nedbryting og resuspend pellet i ett supernatant volum av laste buffer.
- Analysere både nedbryting og urinprøven ved western blot analyse.
6. Bioburden analysen
- Veie 100 mg av fryse-tørket rød bete blader. Resuspend pulver i 8 mL steril PBS (pH 7.4) og vortex for 1 min.
- Forberede LB medium uten antibiotika eller som inneholder (i) 50 µg/mL og, (ii) 50 µg/mL hver og og carbenicillin, (iii) 50 µg/mL hver og og kanamycin eller (iv) 50 µg/mL hver og, carbenicillin og kanamycin.
- Plate 1 mL av hver frysetørket blad homogenate i en av 5 selektiv LB media.
- Inkuber alle platene for 3 dager på 28 ° C.
- Telle Agrobacterium koloniene dyrket på hver plate.
- Beregn og definere gjenværende bakterielle belastningen som antall kolonien danner enheter (CFU) per mL frysetørket blad homogenate (CFU/mL).
7. metabolitten utvinning
- Primære metabolitten utvinning
- Veie 30 mg-80 ° c lagret, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-uttrykke red bete blad pulver i en 2 mL plastrør.
- Legge til 750 µL av kaldt 70/30 (v/v) metanol/kloroform og vortex for 30 s. Incubate på 20 ° C for 2T.
Merk: Alle betalingsevne og tilsetningsstoffer må være LC-MS klasse. - Legge til 600 µL av kaldt vann og sentrifuge 17,900 x g på 4 ° C for 10 min. samle og overføre den øvre hydroalcoholic fasen i en ny 2 mL tube. Kast den nedre chloroformic fasen og interphase.
- Sett prøvene i et vakuum munnstykke for 3 h å fordampe løsemidlene.
- Oppløse pellet fra trinn 7.1.4 i 300 µL 50/50 (v/v) acetonitrile/vann og sonicate prøvene i 3 minutter.
- Løsningene passere 0,2 μm membran filtre og sette dem inn i en gjennomsiktig fast 300 µL sett inn BILLEDRØR.
- Sekundær metabolitt utvinning
- Veie 300 mg-80 ° c lagret, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-uttrykke red bete blad pulver i en 15 mL plastrør.
- Legge 3 mL av metanol, vortex for 30 s, og sonicate ved 40 kHz i 15 min.
Merk: Alle betalingsevne og tilsetningsstoffer må være LC-MS klasse. - Sentrifuge prøvene 4500 x g ved 4 ° C i 10 min og overføre supernatants i nye 15 mL rør.
- Fortynne 100 µL av ekstra 1:3 (v/v) med vann og løsningen passere et 0,2 μm membran filter.
- Sette løsningen i en gjennomsiktig fast 300 µL sett inn røret.
- Polar lipid utvinning
- Veie 200 mg-80 ° C lagret, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-uttrykke red bete blad pulver i en 15 mL plastrør.
- Legg 200 µL av vann og deretter 2 mL av metanol, og deretter holde på is 1t.
Merk: Alle betalingsevne og tilsetningsstoffer må være LC-MS klasse. - Vortex for 30 s og sonicate ved 40 kHz i 15 min.
- Sentrifuge prøver 4500 x g ved 4 ° C i 25 min. samle og overføre kloroform fasen i 2 mL rør. Kast den øvre hydroalcoholic fasen og interphase.
- Sett prøvene i et vakuum munnstykke for 3 h å fordampe løsemiddelet.
- Oppløse pellet hentet i trinn 7.3.5 med 600 µL av metanol.
- Fortynne 100 µL av ekstra 1:5 (v/v) med metanol og løsningen passere filtere 0,2-μm membran.
- Sette løsningen i en gjennomsiktig fast 300 µL sett inn røret.
8. flytende kromatografi massespektrometri analyse og behandling
- Definere LC-MS systemet som anbefalt av leverandøren.
Merk: LC-delen består av en autosampler kombinert med HPLC utstyrt med en C18 vakt kolonne (75 x 2.1 mm, partikkel størrelse 5 µm) foran en C18 kolonne (150 x 2.1 mm, partikkel størrelse 3 µm) for analyse av sekundær metabolitter og polar lipider , mens HILIC vakt kolonnen (7.5 x 2.1 mm, 3 µm) foran en HILIC kolonne (150 x 2.1 mm, partikkel størrelse 2.7 µm). MS er en ion felle masse spectrometer leveres med en electrospray ionization (ESI) eller en atmosfærisk trykk kjemiske ionisation (APIC) kilder. - Forberede aktuelle løsemidlene HPLC graderingene. For primære metabolitten analyse, kan du bruke 20 mM ammonium formiat som løsemiddel A; 95% acetonitrile, 5% vann pluss 10 mM ammonium formiat som løsemiddel B. Sekundær metabolitt analyse, bruke vann pluss 0,05% maursyre (A) og acetonitrile pluss 0,05% maursyre (B). Polar lipid analyse, bruke vann pluss 0,05% maursyre (A) og 100% acetonitrile (B).
Merk: Betalingsevne og tilsetningsstoffer må være LC-MS klasse. - Bruk graderingene rapportert i tabell 1 for metabolitten elueringsrør. Sett flow rate på 0,2 mL/min. injisere 10 µL av hver prøve både sekundære metabolitter og polar lipider, mens injisere 5 µL for primære metabolitter.
- Forberede et eksempel på kvalitetskontroll (QC) ved å blande like deler av forskjellige prøver å ha en representant blanding av hver eksperimentelle tilstand. Analysere QC prøven under eksperimentet å overvåke instrument effektivitet. Spesielt sett en QC eksempel analyse etter hver 10 utvalget-bakst.
- Tilfeldig prøvene å unngå instrument-drevet effekter.
- Etter 9 analyser, sette inn en kolonne metode og en tom analyse umiddelbart etter.
Merk: Utfør en langsom forløpning mellom to løsemidlene med en isocratic elueringsrør på høy andel sterkeste løsemiddel. Tomt består av injeksjon av en ren metanol: vann (50/50, v/v) å forbedre oppbevaring tid reproduserbarhet i følgende analyse. - Konfigurere instrumentet å skaffe masse spectra i alternative positive og negative ioniseringen modus med parameterne som er oppført i tabell 2.
Merk: Andre parametere, avhenger av den spesifikke plattformen. - Utfør neste databehandlingen som forklart i Dal Santo et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbeidet presenteres arbeidsflyten for utviklingen av en oral vaksine spiselig plante vev. Fokus for dette arbeidet er uttrykk for et mål protein i en spiselig vert plantearter og karakterisering av potensielle oral vaksine.
Det første trinnet involvert evalueringen av hensiktsmessigheten av plante virus-basert uttrykk teknologien å produsere rekombinante proteinene i spiselig plante systemer. For denne internettsiden bruker vi først til eGFP som en modell protein og vi uttrykte det i to spiselig grønn plante systemer: red bete og spinat. Planter var manuelt agroinfiltrated med suspensjon av A. tumefaciens bærer eGFP rekombinant uttrykk vektorer. Fluorescerende protein uttrykk var visualisert ved western blot analyse (figur 1A, B, D, E) og kvantifisert under UV-lys. Resultatene viste at red bete systemet er preget av en høyere eGFP uttrykk, nå 544.9 ± 10.9 µg/g av friske blad vekt (FLW) på 9 dpi (figur 1 c), enn spinat, hvilke maksimal eGFP nivåer (113.4 ± 0,3 µg/g FLW) ble målt med 11 dpi ( Finne 1F). For disse grunner red bete ble valgt som uttrykk vert for alle etterfølgende eksperimenter.
Ifølge Chen et al.10, ble eGFP forbigående uttrykket testet av et vakuum-metoden for infiltrasjon, som er mer egnet for storskala vaksineproduksjon. Forskjellige fortynninger av overnatting A. tumefaciens kultur, alt fra 10-1 til 10-3, og ulike konsentrasjoner av vaskemiddel (0.005 0.05%) har testet ved å sammenligne eGFP akkumulering nivået på maksimal uttrykk ppt (9 PPT). Resultatene fant at høyere bakteriell titers produsert større eGFP gir (10-1 ~ 0,35). Men ble ingen signifikante forskjeller funnet ved hjelp av ulike vaskemiddel konsentrasjoner (data ikke vist).
Da var planter vakuum infiltrert med en A. tumefaciens suspensjon på 0,35 OD600 og 0,01% av vaskemiddel. Når uttrykket plattformen og levering systemet ble etablert, uttrykk for to former for GAD65, GAD65mut og en N-terminalt avkortet skjemaet (∆87GAD65mut), ble sammenlignet på dagen for maksimal uttrykk, 5 og 11 dpi, henholdsvis som tidligere opprettet11. Etter TSP utvinning fra agroinfiltrated blader, alle prøver ble analysert ved western blot og rekombinant protein var relativt kvantifisert ved en densitometry analyse (figur 2). Resultater merket 20-fold høyere ytelsen til skjemaet ∆87GAD65mut over på GAD65mut. Avkortet skjemaet ble derfor valgt som foretrukket oral vaksine kandidat, samler så høyt som 201.4 ± 29,3 µg/g FLW i red bete blader med 11 PPT.
Til slutt, parametere for utviklingen av en mulig oral vaksine ble evaluert. Rekombinant protein integriteten etter Frysetørring vakuum infiltrert red bete blader uttrykke ∆87GAD65mut ble vurdert i sammenligning med ubehandlet (bare frossen) vev, ved western blot analyse. Som vist i figur 3A, målet protein vist for å være stabil etter lyophilization prosessen.
Simulering av mage fordøyelsen ble gjennomført frysetørket materiale ved å legge til svin mage enzym pepsin en siste konsentrasjon av 1 mg/mL eller i forholdet 1:20 til TS. Begge fordøyelseskanal behandling betingelsene resulterte i rekombinant protein fornedrelse, som demonstrert av western blot analyse (Figur 3 c, D, E, data rapportert bare for pepsin siste konsentrasjonen av 1 mg/mL). Fravær av en bestemt signal i pellet utvalgene etter pepsin fordøyelse (baner pepsin, p 1-3), foreslo at etter Frysetørring behandling, anlegg celler mistet sin integritet, fører til målet protein fornedrelse.
Evalueringen av celle integritet viste at når tørkede planter vev var resuspended i buffer med nøytral pH (pH 7.4), ∆87GAD65mut var delvis solubilized, antyder at minst noen celler ble ødelagt under blad sliping og tørking. Rørets av tørkede planter vev i Sure forhold, i stedet ført til oppdagelsen av ∆87GAD65mut bare i uløselig fraksjonen. Dette skyldes sannsynligvis ∆87GAD65mut nedbør skyldes den lave pH, i tillegg til proteininnholdet i ubrutt celler11. Disse analyser viser at fryser tørking kunne velges som behandling for utarbeidelse av vaksine kandidaten.
Videre ble gjenværende mikrobiell tillegget i agroinfiltrated rød-bete bladene evaluert.
Bioburden analysen vist at behandlinger utnytte til kandidat vaksine utarbeidelse eliminert den bakterielle belastning11.
Den metabolske bioequivalence av ∆87GAD65mut og kontroll red bete planter ble vurdert av fingeravtrykk av primære og sekundære metabolitter og polar lipider generert av LC-MS fra ni red bete planter uttrykke ∆87GAD65mut, ni agroinfiltrated kontroller og ni vill-type kontroller. PCA flygninger avslørte en vill-type anlegg klynge atskilt fra alle andre prøvene. Ingen signifikante forskjeller ble i stedet markert mellom ∆87GAD65mut og infiltrere og negative control planter. Videre var ingen signifikant forskjell mellom de tre gruppene av planter i polar lipid profiler identifisert11.
Figur 1: sammenligning av eGFP uttrykk i agroinfiltrated rød bete og spinat blader. Western blot analyse (A, D) og tilsvarende lasting kontroller (RuBisCO store delenhet) med Coomassie briljant blå (B, E) av protein utdrag fra eGFP-uttrykke blad prøver samlet under tid-retters analysen fra 4 til 14 dager legge infeksjon (PPT). EGFP innholdet i hvert blad protein ekstrakt ble kvantifisert ved fluorescens måling (C, F). Resultatene fra agroinfiltrated rød-bete blader prøver vises i venstre panel, der agroinfiltrated spinat prøvene er vist i riktig. Like mye protein ekstrakter er lastet, 3,5 µg for western blot og 30 µg for den Coomassie flekker. Et anti-eGFP antistoff har blitt brukt som en sonde i western blot analysen. Siden tallene molekylære masse markører i kDa. PC, positiv kontroll, 10 ng av kommersielle rekombinant menneskelige GAD65; NC, negativ kontroll, ekstrakt fra bladene infiltrert utelukkende med A. tumefaciens bærer 5'- og integrase moduler. Feilfelt representerer standardavviket fra tre uavhengige eksperimenter. Dette tallet er endret fra Bertini et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: GAD65mut og Δ87GAD65mut uttrykk nivåer i red bete blader. Western blot analyse (A) og tilsvarende lasting kontroll (RuBisCo store delenhet) farget med Coomassie briljant blå (B) av protein utdrag fra tre red bete blader uttrykke Δ87GAD65mut (venstre) og GAD65mut (høyre). Et anti-GAD antistoff har blitt brukt som en sonde i western blot analyse (banene var lastet med 20 μL trekke i GAD65mut og 1 μL trekke i Δ87GAD65mut). Coomassie farget gel, var den samme mengden protein ekstrakter (10 μL/lane) lastet for GAD65mut og Δ87GAD65mut. Siden tallene molekylære masse markører i kDa. PC, positiv kontroll, 10 ng av kommersielle rekombinant menneskelige GAD65; NC, negativ kontroll, ekstrakt fra bladene infiltrert bare med A. tumefaciens bærer 5'- og integrase moduler. (C) bruke western blot positiv kontrollen som referanse for en densitometric analyse, relativ uttrykk nivåer av skjemaene to protein tegnes. Feilfelt representerer standardavviket fra tre uavhengige eksperimenter. Dette tallet er endret fra Bertini et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Oral vaksine kandidaten bedømmelse. På venstre side, analyser av protein stabilitet etter Frysetørring behandling (A, B). Western blot analyse (A) og tilsvarende gel farget med Coomassie briljant blå (B) representerer tre uavhengige utdrag fra bladene uttrykke Δ87GAD65mut. Høstet bladene var direkte frosset (frisk) eller lyofiliserte ved-50 ° C, 0.04 mbar 72 h (fryse tørket). Ulike vev: bufferen forholdstall var ansatt under TSP utvinning vurderer vanntap på grunn av dehydrering. Like volum av ekstrakter ble lastet, 0,25 og 10 µL, for western blot og Coomassie flekker henholdsvis. Et anti-GAD antistoff har blitt brukt for western blot sondering siden tallene molekylære masse markører i kDa. NC, negativ kontroll, utdrag fra bladene infiltrated utelukkende med A. tumefaciens bærer 5'- og integrase moduler. På høyre side, i vitro simulert mage fordøyelsen av Δ87GAD65mut (C, D, E). Western blot analyser (C, D) og tilsvarende gel farget med Coomassie briljant blå (E) som representerer tre uavhengige ekstrakter av bladene uttrykke Δ87GAD65mut etter simulert mage fordøyelsen. 1 mg/mL pepsin er lagt til 100 mg av lyofilisert vev, mens en kontroll prøven uten enzymet er brukt. 24 µL og 16 µL, for supernatants (s) og pellets (p) henholdsvis oppnådd i det siste sentrifugering trinnet, har blitt brukt for SDS side analyse. Anti-GAD (C) og anti-LHCB2 (D) antistoffer ble brukt som sonder i western blot analysen. Siden tallene molekylære masse markører i kDa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primære metabolitter (100 min) | Tid (min) | % A | % B | Varighet for | Type |
| Første | 0 | 100 | - | Opprinnelige tilstand | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Isocratic | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | Gradering | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | Isocratic | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | Gradering | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | Isocratic | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | Gradering | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | Isocratic (re-likevekt) | |
| Sekundær metabolitter (60 minutter) | Tid (min) | % A | % B | Varighet for | Type |
| Første | 98 | 2 | - | Opprinnelige tilstand | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | Gradering | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | Gradering | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | Gradering | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | Gradering | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | Isocratic | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | Gradering | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | Isocratic | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | Gradering | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | Isocratic (re-likevekt) | |
| Polar lipider (90 minutter) | Tid (min) | % A | % B | Varighet for | Type |
| Første | 50 | 50 | - | Opprinnelige tilstand | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Gradering | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | Isocratic | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | Gradering | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | Isocratic (re-likevekt) |
Tabell 1: Gradient betingelser for metabolitten elueringsrør LC-MS analyse.
| Masse spectrometer komponenter | Funksjonen | Parametere | ||||
| Primære metabolitter | Sekundær metabolitter | Polar lipider | ||||
| Electrospray Ionization (ESI) kilde | Nebulizing gass | 50 psi, 350 ° C | 50 psi, 350 ° C | - | ||
| Tørking gass | 10 L min-1 | 10 L min-1 | ||||
| Lufttrykk kjemiske Ionization (APIC) kilde | Nebulizing gass | - | - | 50 psi, 350 ° C | ||
| Tørking gass | 10 L min-1 | |||||
| Vaporizer | 450 ° C | |||||
| Ion felle og detektor skanning | Full skanningsmodus | 13 000 m/z per sekund | 13 000 m/z per sekund | 13 000 m/z per sekund | ||
| 50-1500 m/z | 50-1500 m/z | 50-1500 m/z | ||||
| Skanneområde | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| Målrette masse | ||||||
| Kollisjon gass | Helium | |||||
| Tomrommet trykket | 1.4 x 10-5 mbar | |||||
| Kapillær kilde | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| Enden plate forskyvning | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| Skimmer | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| Cap exit | 106 V | -121 V | 143.5 V | |||
| 1 oktober DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| 2 oktober DC | 1.7 V | -1.7 V | 2 V | |||
| Linsen 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| Linsen 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| ICC for positiv ionisering modus | 20 | |||||
| ICC for negative ioniseringen modus | 7 | |||||
Tabell 2: Parametere for masse spectra oppkjøpet i alternative positive og negative ioniseringen moduser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien viste vi foreløpig analyse for design av en kandidat oral vaksine for autoimmune diabetes. Målet protein for dette eksperimentet var en mutated form av den menneskelige 65 kDa glutamat dekarboksylasehemmer, hvilke produksjon og funksjonalitet er lett synlig og målbare12. Uttrykket i forskjellige spiselig plante vev ble formidlet av vektorer5, som megle høy rekombinante proteiner produksjon i et svært kort tidsperspektiv. Valg av beste kandidat anlegget spiselige vert ble utført basert på det eGFP uttrykket i red bete og spinat blader av manuell agroinfiltration. Dette trinnet kan være avgjørende for industriell skala-up på grunn av tidkrevende prosedyren for manuell agroinfiltration og hardheten i spinat blad vev infiltrasjon.
Identifikasjon av bestemte PPT for høsting som gir høyeste rekombinante proteiner akkumulering nivå for en rekombinant protein er et kritisk punkt og må være testet og valgt på et sak-til-sak grunnlag. Analyse av fluorescerende protein uttrykk med forskjellige dpi (fra 4 til 12), lov til å identifisere dagen for maksimal uttrykk i hver plante systemet. Sammenligningen mellom eGFP konsentrasjon (µg/g FLW), i disse dager for maksimal uttrykk, fremhevet at red bete er best utføre plattform i rekombinante proteiner gir.
Derfor var red bete ytterligere testet for levering av plante virus-basert vektorer av et system, som regnes som mer egnet for vaksine industri Storskalaproduksjon13.
Gitt at standard vakuum infiltrasjon protokollen er optimalisert for tobakk arter5, er av en rekke parametere for prosedyren justeringen plantearter vurdert et kritisk punkt. Deretter ble red bete vakuum agroinfiltration protokollen optimalisert. Våre bevis viste at Agrobacterium fortynning er avgjørende for å forbedre protein uttrykk nivåene, mens vaskemiddel konsentrasjonen å forbedre blad permeabilitet. Resultatene viste at anlegget systemet og teknologien med dette arbeidet formålet.
To ulike former for GAD65, GAD65mut og ∆87GAD65mut, som var tidligere preget sine uttrykk i N. benthamiana7viser forskjellige sub mobilnettet lokalisering, ble uttrykt i red bete av vakuum infiltrasjon. Tre biologiske gjentak var forberedt for hvert utvalg. Hver biologiske replikere består av et utvalg av tre infiltrere blader fra ulike planter, samplet fra 2 til 14 dpi for begge GAD65 skjemaene. Graden uttrykket ble sammenlignet med velge høyeste samler protein i anlegget vev.
Den relative kvantifiseringen av densitometry analyse viste at ∆87GAD65mut har et 20-fold høyere uttrykk enn motparten intakt. Dette kan være på grunn av beliggenheten cytosolic mens GAD65mut, på grunn av sin rester som anker dette skjemaet til å cellemembranen, har en lavere avkastning7, reflekterer en lavere protein stabilitet. ∆87GAD65mut var gjennomsnittlig akkumulering i red bete blad vev 201.4 ± 29,3 µg/g FLW, som er tilstrekkelig til å starte med T1D oral vaksineutvikling.
Til slutt, etter at skjemaet for mest passende plattform, teknologi og protein fortsatte vi ved å sette opp en post-Harvest behandling av infiserte bladene. Siden blad vev består av 95% av vannet, er dehydrering behandling nyttig å hindre microorganism forurensning. Resultatene viste at en fryse-tørking behandling kan brukes på utvalget, uten å påvirke rekombinante proteiner nivåene i bladene. 10 ganger vann fjerning av lyophilization eliminerer bakteriell forurensning (bioburden), inkludert den rekombinante A. tumefaciens brukes fremgangsmåten for agroinfiltration.
Videre viste analyse av protein bio innkapsling at ∆87GAD65mut er helt fordøyd etter en simulert mage fordøyelsen. Dette tyder på at fryse-tørking behandling skader anlegget cellevegg, utsette rekombinant protein til syreholdig og enzymatiske sammensetningen av mage miljøet.
Vedlikehold av protein eller peptid molekyl integriteten over fordøyelsessystemet overgangen til området av absorpsjon representerer et problem for muntlig stoff levering14. Derfor etter dehydrering behandling, bør potensielle vaksinen være riktig formulert for å overvinne mage miljø uten å miste sin integritet. I produksjon av plante-avledet GAD vaksinen, kan innkapsling i en relativt stabil skall brukes som et system å forbedre sin effektivitet tillater det å være beskyttet og stabil langs muntlig levering route15.
Ulike teknologier utforsket for å overvinne problemene knyttet til muntlig levering av macromolecules for eksempel enkelte studier på complexation av syntetiske hydrogel med insulin som viste en høy innkapsling effektivitet og rask insulin slipp i tarmen i en pH-avhengig måte16,17.
Både den primære og sekundære metabolitten bioequivalence planter uttrykke ∆87GAD65mut i forhold til infiltrere og ikke-infiltrated ble undersøkt bruke PCA statistikk. Forskjellene mellom infiltrere plantene uttrykke ∆87GAD65mut og infiltrere kontrollene var ikke betydelig, mens ikke-infiltrated vill-type plantene dannet skille. Disse resultatene tyder på at infiltrere plantene skilles fra ubehandlet planter av LC-MS analysen takket være bakteriell metabolitter eller metabolitter produsert av planter på grunn av infiltrasjon, som allerede vist i litteratur13. Samlet viste denne analysen at opphopning av ∆87GAD65mut har liten innvirkning på det samlede stoffskiftet.
Sammen tyder disse resultatene på at potensielle oral vaksine, representert ved frysetørket red bete blad vev uttrykke ∆87GAD65mut oppnådd utnytte plante virus-basert uttrykk teknologi, er egnet for eksperimentell T1D muntlig immunterapi forsøk. Plante virus uttrykk vektor teknologien er blitt veldig ettertraktet i feltet forbigående uttrykk på grunn av sin evne til å produsere utenlandske proteiner både raskt og på høye nivåer. Denne teknologien er basert på en dekonstruerte vektor som bærer bare RNA polymerase RNA avhengige og bevegelse protein5 og derfor mister sin infectivity i planter; som en konsekvens, bør den potensielle overføringen til mennesker utelukkes.
Eksperimentell protokollen rapporterte her kan utvides til mange forskjellige spiselige arter, slik som salat, Chenopodium capitatum og Tetragonia expansa. Siden bladene av disse arter, inkludert red bete og spinat, som ble oppdaget tidligere godt uttrykk anlegget systemer5, kan brukes som ukokt mat, teknologien foreslått her kan brukes for produksjon spiselige vaksiner eller produksjon av minimalt prosesserte funksjonell mat eller feed.
Kombinasjonen av rekombinant protein/plantearter, PPT for høsting som gir høyeste rekombinante proteiner akkumulering nivå må fortsatt skal fastsettes empirisk på en sak til sak avhengig av rekombinant protein uttrykt og verten plante arter18.
Anvendelsen av denne teknologien for produksjon av oral vaksine holder stort potensial til å bli et alternativ til konvensjonelle vaksiner i nær fremtid, i tillegg til kamp kan virus, autologous vaksiner for lymfomer og solide tumorer, og monoklonale antistoffer mot målet kreft19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av samarbeidsprosjektet "Bruk av anlegg for produksjon av en autoimmun diabetes spiselige vaksine (eDIVA)" (prosjekt-ID: 891854) finansiert av universitetet i Verona i rammen av samtalen 2014.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
References
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
- Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
- Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
- Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
- Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
- Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
- Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
- Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
- Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
- Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
- Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
- Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
- Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
- Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
- Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
- Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).
