Summary
Dieses Papier stellt eine Operationsmethode für sezieren Drosophila pupal Netzhaut zusammen mit Protokolle für die Verarbeitung von Gewebe für Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Extraktion.
Abstract
Die Drosophila pupal Netzhaut bietet ein hervorragendes Modellsystem für das Studium der morphogenetischen Prozesse während der Entwicklung. In diesem Beitrag präsentieren wir Ihnen ein zuverlässiges Protokoll für die Zerlegung der zarten Drosophila pupal Netzhaut. Unsere chirurgische Ansatz nutzt verfügbar Mikrodissektion Werkzeuge um Puppen zu öffnen und extrahieren Sie genau Auge-Gehirn-komplexe. Diese feste, Immunohistochemistry und Netzhaut ausgesetzt dann montiert auf Objektträger und abgebildet, wenn das Ziel, zelluläre und subzelluläre Strukturen zu erkennen. Alternativ können Sie fixierten Netzhaut von Gehirngewebe isoliert, in entsprechende Puffer lysiert und für Gel-Elektrophorese oder mRNA Proteingewinnung (, Protein oder gen-Expression, bzw. bewerten) genutzt. Bedeutende Übung und Geduld können erforderlich sein, das beschriebenen Mikrodissektion Protokoll beherrschen, aber einmal gemeistert, das Protokoll ermöglicht relativ schnelle Isolation vor allem unbeschädigt Netzhaut.
Introduction
Die Drosophila Netzhaut besteht aus ca. 750 Ommatidien umgeben von Pigmentzellen in einer Bienenwabe Gitter1,2,3,4angeordnet. Jedes Ommatidium enthält acht Photorezeptor Neuronen, vier Objektiv-sezernierenden Zapfen und zwei primäre Pigmentzellen. Rund um jedes Ommatidium sind pigmentbildenden Gitter Zellen und sensorischen Borsten Gruppen. Aufgrund seiner Post-mitotische Natur und Stereotype hexagonalen Anordnung bietet die Drosophila pupal Netzhaut eine hervorragendes Modell-System für das Studium der morphogenetischen Prozesse einschließlich Zelle Adhäsion5,6, 7,8,9,10 und Apoptose11,12,13,14,15.
Mehrere veröffentlichte Protokolle nutzen Luftdruck, Auge-Gehirn-komplexe von Drosophila Puppen16,17,18zu extrahieren. Das Protokoll beschrieben hier stattdessen nutzt Mikrodissektion Werkzeuge, um sorgfältig und genau Auge-Gehirn-komplexe mit dem Ziel der Erlangung unbeschädigt Netzhautgewebe zu isolieren. Dies ist entscheidend, wenn die Netzhaut für genutzt werden morphologische, Protein und Genexpression analysiert, da Schäden an der Netzhaut führen kann, in zellulären Stresses oder Tod, der die zellulären Phänotyp oder gen-Ausdruck ändern könnte. Darüber hinaus können nach dem Training, 6 bis 10-Auge-Gehirn-komplexe in 10 bis 15 min, erleichtern das Ziel der Minimierung Variabilität in den Alter und Entwicklungsstadium der seziert Augengewebe isoliert werden.
Die Fixierung, Immunostaining und vollständig-hängen Protokoll beschrieben ist geeignet für die Zubereitung von Drosophila Augen für Fluoreszenz-Mikroskopie. Netzhaut können mit Antikörpern interessierender Proteine gezielt inkubiert werden. Zum Beispiel können Antikörper gegen Adherens Junction Komponenten genutzt werden, um die apikale Umfänge von Zellen zu visualisieren, so dass Eigenschaften einschließlich Zelle Art, Form und Anordnung bewerteten19sein können. Vor der Fixierung können Augen stattdessen aus dem Gehirn zum Zweck der Gewinnung von Protein für die westlichen Analyse oder RNA für den Einsatz in qRT-PCR oder RNA-Sequenzierung abgespalten werden.
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Protocol
(1) Gewebe-Vorbereitung
- Einrichten von Drosophila kreuzt (wie zuvor beschrieben20) oder Kultur spezifische Drosophila Stämme um Puppen des gewünschten Genotyps zu erhalten. Um sicherzustellen, dass eine große Anzahl von Puppen zusammentreffend entstehen, schaffen diese Fliege Kulturen in zweifacher Ausfertigung auf nährstoffreiche Lebensmittel oder standard-Food Medien großzügig mit Hefe-Paste ergänzt.
- Pflegen von Drosophila Kulturen bei 25 ° C. Für Kreuze unter Verwendung der UAS-GAL4-System ist GMR-GAL4 eine ideale Treiber ausgedrückt in Larven Auge Bandscheibenzellen posterior der morphogenetischen Furche und während pupal Entwicklung21,22,23, 24. das Kreuz UAS-LacZ X GMR-GAL4 dient als ideale Kontrolle zu überqueren, wie es die Expression des Proteins nicht endogene und inerte β-Galaktosidase fährt.
- Verwendung der Spitze eine 6" Bambus-Schiene, die mit destilliertem Wasser zu heben weiß Pre-Puppen (Abbildung 1 b) von der Seite des gesunden Kultur Fläschchen (Abbildung 1A) und legen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch (Abbildung 1) nass wurde.
- Legen Sie die Rohre in einer Kunststoff-Pipette-Tipp-Box zusammen mit ein kleines Stück Gewebe, getränkt in destilliertem Wasser weiterhin die Kammer bei ausreichender Luftfeuchtigkeit um die Puppen vor Austrocknung (Abbildung 1) zu schützen. Inkubieren Sie die Puppen bei 25 ° C bis zu sezieren.
- Verwenden Sie eine trockene 6" Bambus-Schiene, um sanft die Puppen aus den Microcentrifuge Schlauch und auf einem schwarzen sezieren Gericht heraus zu drücken. Legen Sie ein frisches Stück doppelseitigem Klebeband auf der sezierenden Schale weg von den Puppen.
- Legen Sie die Puppen dorsalen Seite nach oben (d. h. Operculums nach oben, Abbildung 1 b) mit einer Zange, vorsichtig auf das Band (Abbildung 2A). Sicherzustellen Sie, dass die Puppen auch das Band einhalten.
Hinweis: Feuchtigkeit auf der pupal Fall wird sichere Haftung in diesem Fall auf das Band zu hemmen, die Puppen vor dem Inverkehrbringen auf das doppelseitige Klebeband an der Luft trocknen lassen.
2. Präparation des Auge-Gehirn-komplexe
- Verwenden Sie Zange um die Kiemendeckel jede Puppe (Abbildung 2) zu entfernen.
- Verwenden Sie Mikrodissektion Schere zu schneiden oder aufschneiden den pupal Fall jede Puppe. Klappe öffnen den pupal Fall, der Kopf, Thorax und vorderen Abdominalsegment, sichern die Kanten der pupal Fall, doppelseitiges Klebeband (Abbildung 2) zu offenbaren.
Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Puppen ganz zu offenbaren. - Stechen Sie den Bauch jede Puppe mit scharfen Zange, das Tier zu erfassen und entfernen Sie sie aus ihrer pupal Fall (Abbildung 2).
- Legen Sie die Puppen auf die schwarzen Dissektion Gericht, Weg von der Band und mit etwa 400 µL eiskalte Phosphat-gepuffert-Lösung (PBS, pH 7.4).
- Jede Puppe durch den Bauch zu erfassen, mit Zange und Schere Mikrodissektion, machen Sie einen sauber quer-Schnitt durch die gesamte Thorax, die Puppe in Hälfte schneiden (Abb. 2D).
- Entfernen der hinteren Überrest jede Karkasse aus der PBS und auf dem sezierenden Teller beiseite stellen (nicht verwerfen, siehe Punkt 3.2.1).
- Öffnen Sie mit zwei Paaren von feinen Pinzette Thorax und Kopf jeder Puppe, die Auge-Gehirn-Komplex (Abb. 2E) zu offenbaren. Um dies zu tun, greifen Sie die Schnitt-Kanten des Thorax Epithel und reißen Sie allmählich zu, um den Brustkorb zu öffnen und dann den Kopf Kapsel, Freilegung der Auge-Gehirn komplexe und umliegende Fettgewebe.
- Ohne das Gewebe zu erfassen, verwenden Sie Zange zu führen den Auge-Gehirn-Komplex entfernt die Überreste der Kopfkapsel oder Schaufel den Auge-Gehirn-Komplex aus der Kopfkapsel zerrissen offen.
Hinweis: Der Auge-Gehirn-Komplex ist Hantel-förmige, Wollweiß und lichtdurchlässiger als die umliegenden cremefarbenen Fett (Abb. 2 b, E). - Entfernen Sie mit der Pinzette vorsichtig die meisten Fett die Auge-Gehirn-komplexe ohne Berührung der Augengewebe zugeordnet.
3. Bearbeitung von Gewebe für die Immunfluoreszenz
- Sezieren Sie mindestens 6-10 Puppen als beschrieben (Schritte 2.1-2,9).
Hinweis: Drei bis vier unabhängige Wiederholungen von einzelnen Dissektion tendenziell liefern genügend Daten, um eine Hypothese zu testen. -
Wasch- und Fixierung
- Schneiden Sie Tipp von einem P20 oder P100 Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge, erhöhen die Tipp-Eröffnung bis ~ 1 mm im Radius und schmieren von Pipettieren eine Mischung von PBS und Fett oben und unten. Dieses Fett kann die Kadaver Reste entfernt im Schritt 2.6 entnommen werden.
- Übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL PBS in einer 9-Brunnen Glasschale auf Eis. Mithilfe der geschmierten Spitze und ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette übertragen.
Hinweis: Auge-Gehirn-komplexe werden beim Pipettieren ungeschmierten Tipps befolgen und beschädigt oder verloren. - Entfernen Sie das restliche Fett verbunden mit dem Augengewebe durch Pipettieren der PBS rauf und runter, um sanft schwenken, die Auge-Gehirn-komplexe. In diesem und allen weiteren Waschschritten nicht direkt pipette Auge-Gehirn-komplexe rauf und runter da die empfindliche Augengewebe dadurch beschädigt wird.
- Das Auge-Gehirn-komplexe in einem minimalen Volumen zu übertragen (< 20 µL) von PBS in mindestens 250 µL Fixativ. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie für 35 min auf Eis.
Hinweis: Die gleichen geschmierte Spitze im Schritt 3.1.1 vorbereitet für diesen Transfer einsetzbar. - Übertragen Sie mit der gleichen Pipettenspitze die Auge-Gehirn-komplexe in einem gut mit ~ 400 µL PBS. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren und inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis, um zu waschen. Wiederholen Sie waschen mindestens zweimal.
Hinweis: Auge-Gehirn-komplexe können für mehrere Stunden in das endgültige PBS waschen, auf Eis oder bei 4 ° C, bevor Sie mit Schritt 3.3.1 gepflegt werden.
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Antikörper Färbung
- Um das Gewebe vor der Belichtung auf Antikörper Lösungen zu blockieren, übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe auf ~ 400 µL PBT. Verwenden Sie die geschmierten Spitze und ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette für die Übertragung. Inkubieren Sie für 10 bis 60 min auf Eis.
- Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung durch Verdünnung entsprechenden Antikörper in PBT. Da Auge-Gehirn-komplexe in 10 µL-Aliquots der Antikörperlösung ausgebrütet werden, wird das Volume erstellt eine Replikation der 10 sein.
- Aliquoten 10 µL Antikörper-Lösung in eine saubere Schale eines 72-Brunnen Microwell-Tabletts (siehe Diskussion).
- Schneiden Sie die Spitze eine P10 Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge zu erhöhen die Tipp-Eröffnung bis ~0.5 mm im Radius und schmieren von Pipettieren PBT rauf und runter.
- Transfer von nicht mehr als 5 Auge-Gehirn-komplexe in einem Volumen von < 3 µL PBS, in jeweils 10 µL gut Antikörperlösung mit einem P10 Luft Hubraum Mikropipette und geschmierten Tipp.
- Die Antikörperlösung durch pipettieren die Lösung oben und unten zu homogenisieren. Das Auge-Gehirn-komplexe oben und unten nicht pipette, da sonst das Gewebe beschädigt wird.
- Zur Minimierung von Verdampfung der Antikörper-Lösung legen Sie ein kleines Stück Gewebe, getränkt in destilliertem Wasser in der Microwell-Fach und verschließen Sie das Fach (z. B. mit dem Deckel zur Verfügung gestellt). Über Nacht bei 4 ° c inkubieren
- Übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe aus dem Microwell-Fach in ~ 400 µL PBT in 9 quoll Glasschale zu waschen. Verwenden Sie eine P10 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp (bereiten Sie wie in Schritt 3.3.4 beschrieben). Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis.
- Wiederholen Sie waschen mindestens zweimal. Verwenden Sie ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp um die Auge-Gehirn-komplexe zwischen Waschlösungen übertragen.
- Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung durch Verdünnung entsprechenden Fluorophor-markierten Sekundärantikörper in PBT nach Bedarf zu. 100 µL der Sekundärantikörper Lösung reicht pro Charge von 6-10 Puppen. Aliquoten Sekundärantikörper Lösung in einer 9 quoll Dissektion Glasschale.
- Übertragen Sie das Auge-Gehirn-komplexe in Sekundärantikörper Lösung. Verwenden Sie ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp für den Transfer.
- Inkubieren Sie das Auge-Gehirn-komplexe in Sekundärantikörper Lösung für 1-2 h bei Raumtemperatur oder 3-5 h bei 4 ° c Um zu verhindern, durch das Licht des Fluorophore Bleichen, decken Sie die Vorbereitung mit Folie.
Hinweis: Optimale Dauer der Inkubation in Sekundärantikörper Lösung unterscheiden sich nach der primären und sekundären Antikörper verwendet. - Übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL PBT in eine Glasschale 9-gut zu waschen. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis. Diese Waschschritt sollte mindestens zweimal wiederholt werden.
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Sekundäre Fixierung
- Für eine sekundäre Fixierung die Auge-Gehirn-komplexe auf mindestens 200 µL Fixativ übertragen und 20 min bei Raumtemperatur oder 35 min bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Sekundäre Fixierung versteift das Augengewebe, die aids-Montage (Schritt 3.5). - Verwenden Sie ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp zum Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL PBT in eine Glasschale auf Eis, 9-gut für 5 min waschen übertragen.
- Wiederholen Sie waschen mindestens einmal.
- Verwendung einer P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp zur Übertragung der Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL PBS in einer Glasschale auf Eis, 9-gut für 1-2 min. Spülen halten das Gewebe in Bewegung durch Pipettieren PBS, aber nicht das Gewebe , oben und unten, Auge-Gehirn-komplexe von Abrechnung und die Einhaltung der Glasschale während PBS-spülen zu verhindern.
- Für eine sekundäre Fixierung die Auge-Gehirn-komplexe auf mindestens 200 µL Fixativ übertragen und 20 min bei Raumtemperatur oder 35 min bei 4 ° c inkubieren
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Montage
- Übertragen Sie das Auge-Gehirn-komplexe in ~ 200 µL Montage Medien. Verwenden Sie ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp um die Auge-Gehirn-komplexe übertragen. Lassen Sie das Gewebe zu equilibrate bei der Montage von Medien für 1-2 h.
- Geben Sie einen 5-8 µL Tropfen frisch Montage Medien auf einen sauberen Objektträger.
- Schneiden Sie eine P10-Spitze mit einer sauberen Rasierklinge zu erhöhen die Tipp-Eröffnung bis ~0.5 mm im Radius und nutzen dies und eine P10 Luft Hubraum Mikropipette, um die Auge-Gehirn-komplexe in 5-8 µL der Medien in den Tropfen der Medien auf der Folie Montage Montage zu übertragen.
- Verwenden Sie zwei Wolfram-Nadeln, um die Augen von Sehlappen zu trennen. PIN einen Auge-Gehirn-Komplex zur Folie mit einer robusten Wolfram-Nadel und in Scheiben schneiden jedes Auge Weg von seiner zugehörigen Optik-Lappen mit einer feinen Wolfram-Nadel (Abb. 2F).
- Benutzen Sie die feinen Wolfram-Nadel, um jedes Auge auf die Oberfläche der Objektträger mit der basalen Fläche jedes Auges angrenzend an der Folie zu manövrieren. Sanft über das Gewebe sauber Deckglas senken und sichern mit Nagellack.
Hinweis: Die Augen auf der Folie anordnen, so dass sie nebeneinander oder in einer Linie sind erleichtert spätere Mikroskopie. - Bild der Netzhaut mit Leuchtstofflampen oder konfokalen Mikroskopie.
Hinweis: Dias sollte bei 4 ° C gelagert Falls nicht sofort ein Image erstellt.
4. Vorbereitung der Augengewebe für Western Blotting:
- Sezieren von 10-16 Puppen (Schritte 2.1-2,9) mit folgenden Änderungen: (a) sammeln und sezieren die Puppen in zwei Durchgängen, 10-15 min auseinander und (b) sezieren in PBS mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren (PBS + Pi) ergänzt.
- Das Auge-Gehirn-komplexe mit einer P20 übertragen oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und geschmiert Tipp (zubereitet wie in Schritt 3.2.1) in ~ 400 µL PBS + Pi in eine Glasschale von 9-gut, auf Eis, kurz abspülen.
Hinweis: Dieser geschmierten Tipp für Folgeschritte 4.3 und 4.4 einsetzbar. - Wiederholen Sie die Spülung Schritt zweimal.
- Übertragen Sie alle Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL Eis kaltem PBS + Pi auf ein sauberes schwarz sezierenden Gericht dekantiert.
- Entfernen Sie jedes Auge aus der Sehlappen mit einer stabilen Wolfram-Nadel (um das Auge-Gehirn-Komplexes zu stabilisieren) und einer feinen Rasierklinge oder Mikrodissektion Schere sauber schneiden jedes Auge aus der Optik-Lappen.
Hinweis: Augen sind in diesem Stadium "klebrig" und können leicht in die sezierenden Schale anhaften. Dies ist vorteilhaft, da es helfen kann, die Entfernung von den Augen aus dem Sehlappen zu erleichtern (siehe Diskussion). - "Fegen Sie" alle Augen auf einen "Haufen" in der PBS + Pi auf dem sezierenden Gericht mit einer Klinge von einem feinen paar Zangen.
- Schneiden Sie eine P10-Spitze mit einer sauberen Rasierklinge zu erweitern die Tipp-Eröffnung bis ~0.5 mm im Radius und den Tipp-Innenraum durch Pipettieren Western Gewebe Lysis Puffer (WTLB) rauf und runter zu schmieren.
- Übertragen Sie das Auge-Gehirn-komplexe in 5 µL PBS + Pi zu einem 500 µL Microcentrifuge Schlauch. Verwenden Sie diesen geschmierten Tipp und eine P10 Luft Hubraum Mikropipette zum Abschließen der Übertragung.
- Legen Sie den Microcentrifuge Schlauch auf Eis. Volumen Sie 1 (5 µL) WTLB auf die Probe und 10 µL 2 X konzentriertes Protein Probenpuffer (oder 2,5 µL 5 X konzentriertes Protein Probenpuffer). Mischen Sie durch Antippen.
- Wirbel der Microcentrifuge Schlauch kurz und spin-down Probe mit einer Desktop-Mini-Zentrifuge.
- Speichern Sie das Sample bei-20 ° C bis zur Analyse. Verwendung von standard-Protokolle analysieren.
5. Vorbereitung des Augengewebe für RNA-Extraktion:
- Tragen von Handschuhen, saubere Benchtop, Mikroskop, Dissektion Werkzeuge und schwarz sezieren Gericht zuerst mit 70 % Ethanol und dann RNase Dekontamination Reagenz. Trocknen lassen.
- Sezieren von 30-40 Puppen als beschrieben (Schritte 2.1-2,9) mit folgenden Änderungen: ein) zu sammeln und zu zergliedern, 6 bis 8 Puppen in den Reihen, 15-20 min auseinander; (b) sezieren Nuklease-freie PBS und c) jeder Charge der Augen einzeln zu isolieren, sondern sammeln alle Netzhautgewebe in den gleichen Microcentrifuge Schlauch (Schritt 5.5).
Hinweis: Nachdem zwei Personen gleichzeitig sezieren wird effiziente Isolierung der gute Augengewebe beschleunigen. - Für jede Charge isolieren der Auge-Gehirn-komplexe (Schritte 2.1-2,9) und Transfer in ~ 400 µL Nuklease-freie PBS in einer Glasschale 9-Brunnen zu kurz, auf Eis, Spülen mit einem P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und geschmierten Tipp (zubereitet wie in Schritt 3.1.2 beschrieben).
Hinweis: Dieser geschmierten Tipp für nachfolgende Schritte 5.4 und 5.5 5.8 einsetzbar. - Wiederholen Sie die Spülung Schritt zweimal.
- Übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe zu einem frischen 400 µL Tropfen des eiskalten Nuklease-freie PBS auf eine saubere schwarz sezieren Gericht.
- Entfernen Sie jedes Auge aus der Sehlappen mit einer stabilen Wolfram-Nadel (um das Auge-Gehirn-Komplex zu stabilisieren) und einer feinen Rasierklinge oder Mikrodissektion Schere sauber schneiden jedes Auge aus der Optik-Lappen.
Hinweis: Augen sind in diesem Stadium "klebrig" und können leicht in die sezierenden Schale anhaften. Dies ist vorteilhaft, da es helfen kann, die Entfernung von den Augen aus dem Sehlappen zu erleichtern (siehe Diskussion). - "Fegen Sie" alle Augen auf einen "Haufen" in der Nuklease-freie PBS auf dem sezierenden Gericht mit einer Klinge von einem feinen paar Zangen.
- Übertragen Sie die Augen zu einem sterilen RNase-freie Microcentrifuge Schlauch und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff.
- Dissektion (Schritte 5,3-5,8) von jeder Charge eines Puppen zu wiederholen. Übertragen Sie jede Charge der Augen in der gleichen Microcentrifuge Schlauch, der in flüssigem Stickstoff (Schritt 5.5), alle Augen in einem Gefäß sammeln gewartet wurde.
- Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis RNA-Extraktion.
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Representative Results
Das pupal Auge ist eine leicht zugängliche Gewebe, das das Laufwerk Morphogenese als ein hervorragendes Modell dient, Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Hier haben wir die Netzhaut seziert und Immunfluoreszenz zur Erkennung der apikalen Adherens Junctions (Abb. 3A, C) oder die Dcp-1 Caspase (Abbildung 3D), die während der Apoptose (Abbildung 3)25aktiviert wird verwendet. Diese Ansätze lassen sich Zellen während wichtige morphogenetischen Prozesse einschließlich der Rekrutierung und Morphogenese von Primärzellen (ab 18 h APF) deutlich zu beobachten, die Interkalation des Gitters Zellen um jedes Ommatidium (18-24 h APF), die Einrichtung der tertiäre Nische (21-24 h APF), Änderungen der Zellengröße und Form (von 18 h bis 40 h APF) und Apoptose (vom 18. bis ~ 33 h APF). Das Timing dieser morphogenetischen Ereignisse ist temperaturabhängig und wird daher bescheiden als Reaktion auf geringfügige Unterschiede in den Inkubator Temperaturen in verschiedenen Labors Einstellungen variieren. Von rund 40 h APF, die endgültige Anordnung der Zellen wird jedoch in der Regel erreicht (Abb. 3 b, C) und dies ist ein ideales Alter bei der Beurteilung die Folgen der genetischen Mutation oder Genexpression geändert. Beispielsweise kann folgende ektopische Expression von Diap1, ein Kern-Inhibitor der Apoptose Caspase Aktivierung (Abbildung 3)26, unser Ansatz zu quantifizieren, die daraus resultierende Erhöhung der Zahl der Gitter-Zellen im Vergleich zu einem Steuerelement GMR > LacZ Netzhaut. Man kann auch leicht Apoptose beurteilen, mehr direkt durch die Verwendung der Anti-Dcp-1 Antikörper oder andere Ansätze, sterbende Zellen (Abbildung 3D) zu erkennen.
Mit der westlichen Analyse um zu bestimmen, die Präsenz und/oder relativen Ausdruck der interessierenden Proteine kann Auge lysate abgefragt werden. Hier zeigen wir die Erkennung von DE-Cadherin, seziert die Kernkomponente von Adherens Junctions in Wildtyp Kanton S Netzhaut um 21 und 40 h APF Augen (Abbildung 4A). Quantifizierung von diesem Probe-Western-Blot (rechts, Abbildung 4A) ergab, dass die relative Expression von DE-Cadherin, Unterschied sich nicht wesentlich zu diesen zwei Zeitpunkten, wenn Band Intensität ist normalisiert, nach Ausdruck von GAPDH (einen Kern metabolische Enzym). Solche Analysen würden in der Regel in dreifacher Ausfertigung, anstatt nur einmal durchgeführt werden, wie hier gezeigt.
Es ist für hochreine mRNA von Drosophila pupal Netzhaut zu isolieren, wenn das Ziel ist es, Genexpression mit fortgeschrittenen Sequencing-Anwendungen (z. B. Next-Gen, RNA-Seq) zu analysieren. Wir haben festgestellt, dass mehr als 60 Augen pro Genotyp oder Versuchsbedingung sezieren optimal ist, wenn man das Ziel ist es, isolieren > 1 mg hochwertigen RNA (Abbildung 4 b). Hier zeigen wir ein Beispiel für eine Absorption Spektren einer RNA-Probe von 57 Wildtyp Kanton S Augen seziert bei 40 h APF (Abbildung 4 b, Oberboden) isoliert. Die Peak-Absorption bei 260 nm entspricht die Absorption Wellenlänge der RNA. Außerdem präsentieren wir eine Tabelle, die die RNA-Ausbeute und A260/A280 und A260/A230 Reinheit Verhältnisse von sechs RNA-Proben, versammelten sich 21 h oder 40 h APF widerspiegelt. Diese Daten spiegeln, feine Unterschiede in der RNS Ausbeute beim RNA extrahieren.
Abbildung 1 : Auswahl und die Kultur der Puppen für Dissektion. (A) dritte larvalen Instar (L3) Wandern Larven und Puppen zu finden entlang der Seiten des gesunden Drosophila -Kulturen. (B) Pre-Puppen können durch ihre lichtdurchlässige weiße Farbe identifiziert werden, als Pigment noch in der Schutzhülle pupal generiert werden. Anterior-posterioren und dorsal-Ventral Achse der Puppe sind in blau dargestellt. Eine feuchten Bambus Schiene wird verwendet, um zu verdrängen, und wählen Sie Pre-Puppen aus den Fläschchen Wänden. (C) Puppen befinden sich in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, die entsprechend gekennzeichnet sind (Genotyp, Sammlung, Datumund Uhrzeitder Sammlung) und (D) kultiviert innen eine feuchte Kammer aus einer leeren Pipettenspitze-Box montiert. Feuchtigkeit wird beibehalten, indem man ein Stück feuchtes Gewebe im Inneren der Box. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Sezieren das pupal Auge. (A) Puppen doppelseitiges Klebeband auf einem schwarzen sezieren Gericht eingehalten werden. Anterior, posteriore und dorsale Koordinaten werden in blau angezeigt. (B), Auge-Gehirn-komplexe (eine Single, die man hier gezeigt wird), (C) die Puppe zu isolieren wird zunächst von seinem pupal Fall entfernt. Wichtige Schritte in diesem Prozess werden angezeigt. Rote Linien zeigen wo Sie reißen und öffnen den pupal Fall, nachdem die Kiemendeckel entfernt wird. Die Puppen werden dann aus der zerrissenen pupal Fall mit einer Pinzette entfernt. (D) eine exponierte Puppe Anschnitt entlang dem Thorax mit Mikrodissektion Schere (Position angegeben durch gestrichelte rote Linie) und der Kopf Epithel dann vorsichtig aufgerissen (rote Pfeile), wie in (E), den undurchsichtige Auge-Gehirn-Komplex zu offenbaren. (F) nach Inkubation mit entsprechenden Antikörper sind Netzhaut von Auge-Gehirn-komplexe in Scheiben geschnitten. Wichtige Schritte in diesem Prozess werden angezeigt. Das Auge-Gehirn stabilisiert mit einer robusten Wolfram-Nadel (links) und der Netzhaut entfernt mit einer feinen Wolfram-Nadel (rechts). Für Proteine und RNA Analysen können unfixierten Netzhaut aus Sehlappen mit einer feinen Rasierklinge oder Mikrodissektion Schere, anstatt eine feine Wolfram-Nadel sauber geschnitten werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Immunfluoreszenz des pupal Auges. (A) Antikörper gegen DE-Cadherin Label apikalen Adherens Kreuzungen von Zellen des pupal Auges. Alle Bilder in Schalttafel A wurden in der zentralen Region der Netzhaut mit der konfokalen Mikroskopie, minimal modifiziert mit einer Bildbearbeitungssoftware gesammelt und sind im gleichen Maßstab dargestellt (Maßstabsleiste = 5 µm). Beachten Sie Wachstum und Neuordnung der Zellen von 18 h APF 27 h APF. (B) Cartoon der apikalen Ansicht von einem einzigen vollständig gemustert Ommatidium bei 40 h APF (links) und ein Ommatidium im Querschnitt. Zelltypen sind farblich gekennzeichnet, wie im Schlüssel aufgeführt. Die Photorezeptoren sind begraben unter der Oberfläche des pseudostratified Neuroepithlium und umgeben von Kegel und Pigmentzellen. Drei Gruppen der Borsten umgeben jedes Ommatidium. (C) kleine Bereiche der Netzhaut Kontrolle in welche LacZ niederschlug (links) oder Diap1 (rechts), Apoptose von sekundären und tertiären Pigmentzellen hemmen. Kennzeichnung von Adherens Kreuzungen mit Anti-DE-Cadherin ermöglicht die Analyse der Zelle Anzahl, Anordnung und Form. Die Bilder wurden aufgenommen mit standard-Fluoreszenz-Mikroskopie. (D) eine gesamte Netzhaut mit Antikörpern inkubiert aktiviert Dcp-1, ein Caspase während der Apoptose, die zahlreichen Zellen aus dem Auge Pflaumen aktiviert. Bild wurde mit der konfokalen Mikroskopie erfasst. Weiße gepunktete Linie zeigt das Auge. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Eiweiß und gen Expressionsanalysen des pupal Auges. (A) Western-Blot (links) von 28 Augen seziert um 21 h APF oder 40 h APF, sondiert mit Antikörpern zu de-Cad und als Steuerelement laden, GAPDH. Analyse von Protein-Band Intensitäten (rechts) zeigt, dass vergleichbare Konzentrationen in diesen Gruppen der Netzhaut, im Vergleich zu GAPDH de-Cad. (B) einzelne Absorptionsspektrum einer RNA-Probe extrahiert aus Kanton S Netzhaut seziert bei 40 h APF (oben). Hinweis Extinktion Peak bei 260 nm. Tabelle dokumentiert die Menge und Reinheit Verhältnisse der RNA aus Kanton S pupal Netzhaut isoliert um 21 und 40 h APF (unten) extrahiert. Diese Daten ergeben sich aus drei unabhängigen Sample-Sets. Puppen für jede Probe wurden aufgezogen und unter den gleichen Bedingungen inkubiert und am selben Tag seziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Methode der Drosophila pupal Auge Dissektion hier beschriebenen ermöglicht für die Isolierung von 6 bis 10-Auge-Gehirn-komplexe innerhalb von 10 bis 15 Minuten. Geduld und Übung sind jedoch notwendig, um die Dissektion Technik beherrschen und Verbesserung der Qualität und Geschwindigkeit der Sektionen. Diesmal kurz Dissektion sorgt dafür, dass jedes Auge ungefähr gleichen Entwicklungsstadium, Reduzierung der Variabilität in der Phänotyp oder gen Ausdruck der Netzhaut in einem Dataset. Während alternative Protokolle weniger Praxis zu meistern erfordern, ist unser Protokoll zur methodisch isolieren zarte Netzhautgewebe und gleichzeitig das Risiko von reißen oder Scheren, weil Schäden am Auge Stress Weg Aktivierung verursachen könnte oder sogar Zelltod. Wir beraten Anfänger bis zum ersten Meister das Sezieren von Puppen bis 40 h APF kultiviert, bevor Sie versuchen, die jüngeren Augen sezieren. Es wird empfohlen, Einrichten der Replikation für alle Experimente (Schritt 1.1) kreuzt, die sicherstellt, dass es immer genügende Puppen zur Abholung (Schritt 1.3). Netzhaut können bei einer Vielzahl von Zeitpunkten während der pupal Entwicklung, je nach der unterschiedlichen morphogenetischen Veranstaltungen von Interesse für die Forscher seziert. Dazu gehören die Rekrutierung und Morphogenese von Primärzellen (ab 18 h APF), Interkalation Gitter Zellen (18-24 h APF), Gründung der tertiären Nische (21-24 h APF), Veränderungen in der Zellengröße und Form (von 18 h bis 40 h APF) und Apoptose (vom 18. bis ~ 33 h APF) (Abb. 3A).
Wenn beim ersten Öffnen des pupal Fall (Schritt 2.2, Abbildung 2), der Thorax eine Puppe punktiert wird, sollte der Forscher die Dissektion fortsetzen. Jedoch wenn der Kopf zunächst punktiert wird, kann extrahieren unbeschädigt Auge-Gehirn-komplexe schwierig sein. Beim Entfernen einer Puppe aus seinem pupal Fall (Schritt 2.3, Abbildung 2, rechts), kann der Abdominal-pupal Fall manchmal aus doppelseitigem Klebeband zu verdrängen und bleiben über die Puppe Bauch gewickelt. Dies ist unwahrscheinlich, dass eine Behinderung, obwohl die Puppe schweben kann, wenn von PBS bis zum Bauch umgeben und befestigt pupal Fall sind getrennt von der Puppe (Schritt 2.6). Um die Integrität des retinalen Gewebes zu erhalten, ist es unerlässlich, dass es behoben oder so schnell wie möglich nach der ersten Punktion der Puppen gefroren. Darüber hinaus mit eiskalten Lösungen und Aufrechterhaltung des Gewebes auf Eis (oder bei 4 ° C), wo immer möglich im gesamten Protokoll erhalten die Gewebe und zellulären Integrität, führt zu besseren Immunfluoreszenz, Protein-Analyse oder RNA-Analyse. Für die letzteren Anwendungen es ist wichtig, alle Gehirn entfernen und Fettgewebe von Augen als diese Gewebe verunreinigen Analysen (Schritt 2,9 und 4.3 oder 5,4).
Die pupal Auge-Gehirn-Komplex kann ungeschmierten Pipettenspitzen, Glas und Dissektion Werkzeuge beim unfixierten oder PBS Wäschen/Spülungen, führt zu Gewebeschäden einhalten. Um dies zu verhindern, empfehlen wir sorgfältige Schmierung von Pipettenspitzen und nicht waschen 9-Brunnen Glasschalen mit Ethanol (Spülmittel sollte auch vermieden werden). Stattdessen einfach reinigen Sie Glasschalen mit destilliertem H2O und schmieren Sie, wenn erforderlich, mit einer PBT-Spülung vor dem Gebrauch. Dissektion Zangen, Scheren und Nadeln sollte auch hauptsächlich mit destilliertem H2O, außer gereinigt werden wenn Sie diese für RNA-Extraktion Dissektionen (Schritt 5.1) vorbereiten. Allerdings helfen leichte Adhäsion zwischen Netzhaut und Glas-Objektträger unfurling Augen und positionieren sie auf Folien, wenn Augen von Sehlappen trennt, während der Montage (Schritt 3.5.4 und 3.5.5). Ebenso leichte Adhäsion der Augen schwarz sezieren Gerichte lässt sich flach und sehr leicht dehnen das Gewebe erleichtert sauber durchtrennen von Auge-Optik Lappen Verbindungen bei der Netzhaut für Proteine oder RNA isoliert analysiert (Schritt 4.5 und 5.6). Wir haben festgestellt, dass Mikrodissektion Schere oder eine feine Klinge hervorragendes Werkzeug, um schnell und sauber Unfixierte Augen aus Sehlappen zerspalten.
Während der primären Antikörper Färbung, kann anstatt Inkubation Auge-Gehirn-komplexe in 72-Brunnen Mikro-Brunnen Schalen (Schritt 3.3.5), eine 9-Brunnen Glasschale stattdessen verwendet werden. Um Verdunstung der Antikörper-Lösung über Nacht zu vermeiden, achten Sie darauf, Glas Schüssel Brunnen mit einem Deckglas oder Folie verschließen. Dieser Ansatz erfordert jedoch 40-50 µL Primärantikörper Lösung für einen Stapel von 6-10-Auge-Gehirn-komplexe in einem Brunnen der 9-Brunnen Glasschale inkubiert, anstatt 20 µL Primärantikörper Lösung verteilt auf 2 Brunnen eines 72-Brunnen Mikro-Brunnen-Tabletts.
Sekundäre Fixierung des Auge-Gehirn-komplexe (Schritt 3.4) vor dem Einbau Augen auf Objektträger (Schritt 3.5) wird am Rande des Gewebes versteifen, damit es einfacher ist, die Augen von Sehlappen zerspalten und die Augen weniger wahrscheinlich sind zu Falten oder Dissektion Nadeln halten. Nach einer ca. 1-2 h Inkubation in Eindeckmedium (Schritt 3.5.1) werden die Auge-Gehirn-komplexe etwas undurchsichtig und daher einfacher zu sehen, während der Montage. Darüber hinaus werden nach 1-2 h im Eindeckmedium, entsprechend die meisten Sekundärantikörper von Foto-bleichen während der fluoreszierenden Bildgebung geschützt werden. Inkubation Netzhaut über Nacht in Montage Medien vor Montage wird nicht empfohlen, da dadurch Netzhaut weich wird, negiert die versteifende Wirkung der sekundären Fixierung.
Für westliche Analysen lysate von mindestens 20 Augen muss zuverlässig detektieren Proteine mit Antikörpern, die robust Drosophila Proteine (z. B. Abbildung 4A) erkennen. Jedoch möglicherweise eine größere Anzahl von Augen erforderlich, wenn es geringe Expression des Zielproteins von Interesse gibt. Lyse des Gewebes für spätere westliche Beflecken unvollständig (4.7) ist, kann das Volumen der WTLB hinzugefügt, um die Probe geringfügig erhöht werden und das Volumen der konzentrierten Probenpuffer entsprechend angepasst (Schritt 4,9). Für RNA-Extraktion, kann schnelle Zerlegung einer erheblichen Anzahl von Augen verlangt werden, wenn das Ziel ist, eine große Menge an qualitativ hochwertigen RNA zu isolieren (Schritt 5.2, siehe Abbildung 4 b). Diese potenzielle Nachteil kann überwunden werden, wenn zwei Wissenschaftler, die Drosophila pupal Auge Dissektion beherrschen zusammenarbeiten, um diese große Anzahl von fliegen Netzhaut gleichzeitig zu sezieren. Jedoch der Gesamtbetrag der RNA benötigt hängt von den Anforderungen der Institution oder Einrichtung, die Durchführung von RNA-Analyse, die Art der RNA Analyse oder Sequenzierung, und die RNA-Extraktion-Kit, das verwendet wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Zack Trommel und unsere Rezensenten für hilfreiche Kommentare auf das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch R15GM114729 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
