Summary
Dette dokumentet presenterer en kirurgisk metode for dissekere Drosophila pupal Netthinne sammen med protokoller for behandling av vev for immunohistochemistry, western analyse og RNA-utvinning.
Abstract
Drosophila pupal netthinnen gir en utmerket modellsystem for studiet av Morfogenetiske prosesser under utvikling. I dette papiret presenterer vi en protokoll som er pålitelig for Disseksjon av delikate Drosophila pupal netthinnen. Våre kirurgisk tilnærming benytter lett-tilgjengelig microdissection verktøy å åpen pupae og nøyaktig ekstra øye-hjerne komplekser. Disse kan fast, utsatt for immunohistochemistry og Netthinne så montert på objektglass og fotografert hvis målet er å oppdage mobilnettet eller subcellular strukturer. Alternativt kan unfixed Netthinne isolert fra hjernevev, lysed i riktige buffere og benyttes for protein gel geleelektroforese eller mRNA utvinning (å vurdere protein eller genet uttrykk, henholdsvis). Betydelig praksis og tålmodighet kan være nødvendig å mestre microdissection protokollen beskrevet, men når mestret, protokollen gjør at relativt rask isolering av hovedsakelig uskadet netthinne.
Introduction
Drosophila netthinnen består av ca 750 ommatidia omgitt av pigment cellene ordnet i honeycomb gitter1,2,3,4. Hver ommatidium inneholder åtte photoreceptor nerveceller, fire linse-sekresjon koniske celler og to primære pigment cellene. Hver ommatidium er pigment-produserende gitter celler og sensoriske bust grupper. På grunn av sin post mitotisk natur og stereotype Sekskantet arrangement gir Drosophila pupal netthinnen en utmerket modellsystem for studier av Morfogenetiske prosesser inkludert celle vedheft5,6, 7,8,9,10 og apoptose11,12,13,14,15.
Flere publiserte protokoller benytte lufttrykket å trekke øyet-hjerne komplekser Drosophila pupae16,17,18. Protokollen beskrevet i stedet benytter her microdissection verktøy å forsiktig og isolere nøyaktig øye-hjerne komplekser med mål om å få uskadet retinal vev. Dette er avgjørende hvis Netthinne skal utnyttes for morfologiske, protein eller genuttrykk analyserer siden skade Netthinne kan resultere i mobilnettet stress eller død, som kan endre mobilnettet fenotype eller genet uttrykket. I tillegg etter trening, kan 6 til 10 øye-hjerne komplekser bli isolert i 10 til 15 min, tilrettelegge mål å minimere variasjon i alder og utviklingen scene av dissekert øye vev.
Den fiksering, immunostai- og hele-mount protokollen beskrevet nedenfor er egnet for utarbeidelse av Drosophila øyne for fluorescerende mikroskopi. Netthinne kan være inkubert med antistoffer målretting proteiner av interesse. Antistoffer mot adherens junction komponenter kan for eksempel brukes til å visualisere de apikale omkretsene av cellene slik at egenskaper, inkludert celle type, form og arrangement blir vurdert19. Før fiksering, kan øynene i stedet bli kløyvde fra hjernen for å trekke ut protein for vestlige analyse eller RNA for bruk i qRT PCR eller RNA-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vev forberedelse
- Definer Drosophila krysser (som beskrevet tidligere20) eller kultur spesifikke Drosophila stammer for å få pupae av ønsket genotype. Å sikre at et stort antall pupae dukke sammentreffet, etablere disse fly kulturer i duplikat på næringsrik mat media eller standard mat medier sjenerøst supplert med gjær-lim.
- Opprettholde Drosophila kulturer på 25 ° C. Kors utnytte UAS-GAL4 systemet, er GMR-GAL4 en ideell driver uttrykt i larver øye plate celler bakre Morfogenetiske fure og gjennom pupal utvikling21,22,23, 24. i kryss UAS-lacZ X GMR-GAL4 fungerer som en ideell kontroll krysse som driver uttrykk for ikke-endogene og inert β-galactosidase protein.
- Bruk spissen av en 6" bambus skinne som er våt med destillert vann og forsiktig løfte hvit pre pupae (figur 1B) fra siden av sunn kultur ampuller (figur 1A), og plasser i en 1,5 mL microcentrifuge tube (figur 1 c).
- Plassere rør i en plastikk pipe tips boks med en liten bit av vev dynket i destillert vann å opprettholde kammeret ved tilstrekkelig fuktighet til å beskytte pupae fra uttørking (figur 1 d). Inkuber pupae ved 25 ° C til disseksjon.
- Bruk en tørr 6" bambus skinne Skyv pupae fra microcentrifuge røret og inn på en svart dissekere parabolen. Lå et nytt stykke dobbeltsidig tape på dissecting retten fra pupae.
- Med en tang, forsiktig plassere pupae dorsal side opp (dvs. operculums vendt opp, figur 1B) på båndet (figur 2A). Kontroller at pupae følge godt til båndet.
Merk: Fuktighet på pupal saken vil hemme sikker vedheft på båndet, i så fall, la pupae til air-dry før du plasserer på dobbeltsidig tape.
2. Disseksjon av øye-hjerne komplekser
- Bruke pinsett fjerne bløtdyr av hver puppe (figur 2C).
- Bruk microdissection saks skjær eller klippes pupal ved hver puppe. Klaff åpne pupal sak å avdekke hodet, syn, og fremre abdominal segmentet, sikre kantene av pupal saken dobbeltsidig tape (figur 2C).
Merk: Det er ikke nødvendig å fullstendig avsløre pupae. - Pierce magen av hver puppe med skarpe tang, å forstå dyr, og fjerne den fra pupal tilfelle (figur 2C).
- Plasser pupae på svart disseksjon fatet, fra tape, og dekk med ca 400 µL av iskalde fosfat-bufret-løsning (PBS, pH 7.4).
- Forstå hvert puppe av magen med tang og med microdissection saks, gjør en ren cross-sectional klippe gjennom hele thorax, kutte puppe i halv (figur 2D).
- Fjern bakre levningen av hver carcass fra PBS og sett til side på dissecting parabolen (ikke forkaste, se trinn 3.2.1).
- Bruker to par fine tang, åpne syn og leder for hver puppe å avsløre øye-hjerne komplekset (figur 2E). Gjør forstå kutt-kantene av thorax epitel og gradvis rive åpne thorax og deretter hodet capsule, utsette øye-hjerne komplekse og omkringliggende fettvev.
- Uten grasping vevet, bruk tang til å guide øye-hjerne komplekset fra restene av hodet kapsel eller scoop øye-hjerne komplekset fra revet åpne hodet kapselen.
Merk: Øye-hjerne komplekset er Manual-formet, natur og mer gjennomsiktig enn omkringliggende kremfargede fett (figur 2B, E). - Med pinsett, fjerne nøye de fleste fett assosiert med øye-hjerne komplekser uten å berøre øye vev.
3. behandling av vev for Immunofluorescence
- Dissekere minst 6-10 pupae som beskrevet (trinn 2.1-2.9).
Merk: Tre til fire uavhengige gjenskapninger av hver disseksjon tendens til å gi tilstrekkelig data til å teste en hypotese. -
Vask og fiksering
- Klipp spissen av en P20 eller P100 pipette tips med ren razor blad å øke tips-åpningen til ~ 1 mm i radius og smør av pipettering en blanding av PBS og fett opp og ned. Dette fettet kan fås fra carcass rester fjernet i trinn 2.6.
- Overføre øye-hjerne komplekser til ~ 400 µL av PBS i en 9-og glass rett, på is. Bruke smurt spissen og P20 eller P100 luft forskyvning brønnene for å overføre.
Merk: Øye-hjerne komplekser overholder unlubricated tips under pipettering og blir skadet eller mistet. - Fjern gjenværende fettet tilknyttet øye vev av pipettering PBS opp og ned for forsiktig swirl øye-hjerne komplekser. I dette og alle påfølgende vask trinn, ikke direkte Pipetter øye-hjerne komplekser opp og ned som dette vil skade den skjøre øyevevet.
- Overføre øye-hjerne komplekser i en minimal volum (< 20 µL) for PBS i minst 250 µL av bindemiddel. Bland ved pipettering løsningen opp og ned. Inkuber for 35 min, på is.
Merk: Samme smurt spissen i trinn 3.1.1 kan brukes ved denne overføringen. - Med samme pipette spissen, overføre øye-hjerne komplekser inn et tillegg som inneholder ~ 400 µL av PBS. Blande av pipettering løsningen opp og ned og ruge i 5-10 min på is, å vaske. Gjenta trinnet vask minst to ganger.
Merk: Øye-hjerne komplekser kan vedlikeholdes i flere timer i siste PBS vask, på is, eller på 4 ° C, før du går videre til trinn 3.3.1.
-
Antistoff flekker
- Hvis du vil blokkere vevet før eksponering for antistoff løsninger, overføre øye-hjerne komplekser til ~ 400 µL av PBT. Bruk smurt spissen og P20 eller P100 luft forskyvning brønnene for overføringen. Inkuber i 10 til 60 minutter, på is.
- Klargjør primære antistoff løsningen ved å fortynne riktig antistoffer i PBT. Siden øye-hjerne komplekser er ruges i 10 µL dele antistoff løsning, blir volumet utarbeidet en replikere av 10.
- Aliquot 10 µL av antistoff løsning til en ren godt av en 72-vel microwell brett (se diskusjon).
- Kutte spissen av en P10 pipette tips med ren razor blad å øke tips-åpningen ~0.5 mm i radius og smør av pipettering PBT opp og ned.
- Overføre mer enn 5 øye-hjerne komplekser, i et volum på < 3 µL av PBS, i hver 10 µL godt av antistoff løsning å bruke P10 luft forskyvning brønnene og smurt spissen.
- Homogenize antistoffer løsningen av pipettering løsningen opp og ned. Ikke Pipetter øye-hjerne komplekser opp og ned som dette vil skade vevet.
- For å minimere fordampning av antistoff løsningen, plassere en liten bit av vev dynket i destillert vann i microwell skuffen og forsegle skuffen (f.eks med lokk gitt). Ruge over natten på 4 ° C.
- Overføre øye-hjerne komplekser fra microwell brett til ~ 400 µL av PBT i en 9-vellet glass rett, å vaske. Bruk P10 luft forskyvning brønnene og PBT-smurt tips (forberede som beskrevet i trinn 3.3.4). Bland ved pipettering løsningen opp og ned. Inkuber i 5-10 min på is.
- Gjenta trinnet vask minst to ganger. Bruk P20 eller P100 luft forskyvning brønnene og PBT-smurt tips overføre øye-hjerne komplekser mellom vask løsninger.
- Forberede den sekundære antistoff løsningen ved å fortynne riktig fluorophore-merket sekundære antistoffer i PBT som kreves. 100 µL av sekundær antistoff løsning er tilstrekkelig per gruppe med 6-10 pupae. Aliquot sekundære antistoff løsningen i en 9-vellet glass disseksjon parabol.
- Overføre øye-hjerne komplekser sekundære antistoff løsning. Bruk P20 eller P100 luft forskyvning brønnene og PBT-smurt tips for overføringen.
- Inkuber øye-hjerne komplekser i sekundære antistoff løsning for 1-2 h ved romtemperatur eller 3-5 h på 4 ° C. For å hindre bleking av fluorophores av lys, dekk utarbeidelse med folie.
Merk: Optimal varigheten av inkubasjon i sekundære antistoff løsning kan variere avhengig primære og sekundære antistoffer brukes. - Overføre øye-hjerne komplekser til ~ 400 µL av PBT i en 9-og glass rett, å vaske. Bland ved pipettering løsningen opp og ned. Inkuber i 5-10 min på is. Dette vask trinnet skal gjentas minst to ganger.
-
Sekundær fiksering
- For en sekundær fiksering, overføre øye-hjerne komplekser til minst 200 µL av bindemiddel og ruge for 20 min ved romtemperatur eller 35 min på 4 ° C.
Merk: Sekundær fiksering stiv øye vev, som hjelpemidler montering (trinn 3,5). - Bruk P20 eller P100 luft forskyvning brønnene og PBT-smurt tips overføre øye-hjerne komplekser til ~ 400 µL av PBT i en 9-og glass rett, på is, å vaske etter 5 min.
- Gjenta trinnet vask minst én gang.
- Bruk en P20 eller P100 luft forskyvning brønnene og PBT-smurt tips overføre øye-hjerne komplekser til ~ 400 µL av PBS i en 9-og glass rett, på is, skylle i 1-2 min. holde vevet i bevegelse av pipettering PBS, men ikke vevet , opp og ned for å unngå øye-hjerne komplekser fra bosetting og følge glass rett under PBS-skylling.
- For en sekundær fiksering, overføre øye-hjerne komplekser til minst 200 µL av bindemiddel og ruge for 20 min ved romtemperatur eller 35 min på 4 ° C.
-
Montering
- Overføre øye-hjerne komplekser til ~ 200 µL av montering media. Bruk P20 eller P100 luft forskyvning brønnene og PBT-smurt tips overføre øye-hjerne komplekser. Kan vev å equilibrate i montering medier for 1-2 h.
- Plass en 5-8 µL dråpe friskt montering medier på en ren microscope skyve.
- Skjær et P10 tips med et rent barberblad øke tips-åpningen ~0.5 mm i radius og bruke dette og P10 luft forskyvning brønnene overføre øye-hjerne komplekser i 5-8 µL av montering media i dråpe montering media på lysbildet.
- Bruk to tungsten nåler skille øynene fra optikk lobes. Feste et øye-hjerne kompleks på lysbildet med en solid tungsten nål og skjær hvert øye fra sin tilknyttede optikk lobe med en fin tungsten nål (figur 2F).
- Bruke fine tungsten nålen for å manøvrere hvert øye på overflaten av mikroskopet lysbildet med basal overflaten av hvert øye tilstøtende til lysbildet. Forsiktig lavere en ren cover-slip over vevet og fest med neglelakk.
Merk: Ordne øynene på lysbildet slik at de er nær hverandre eller i en linje vil lette påfølgende mikroskopi. - Bilde netthinnen bruker fluorescent eller AC confocal mikroskopi.
Merk: Lysbilder bør være lagret på 4 ° C om ikke avbildet umiddelbart.
4. forberedelse av øyevevet for vestlige Blotting:
- Dissekere 10-16 pupae (trinn 2.1-2.9) med følgende modifikasjoner: a) samle og analysere pupae i to partier, 10-15 min fra hverandre og b) dissekere i PBS med protease og fosfatase hemmere (PBS + pi).
- Overfør øye-hjerne komplekser bruker en P20 eller P100 air forskyvning brønnene og smurt tips (forberedt som trinn 3.2.1) i ~ 400 µL av PBS + pi i en 9-og glass rett, på is, til skyll kort.
Merk: Denne smurt tips kan brukes for etterfølgende trinnene 4.3 og 4.4. - Gjenta skyll trinn to ganger.
- Overføre alle øye-hjerne komplekser til ~ 400 µL av is kaldt PBS + pi decanted på en ren svart dissecting rett.
- Fjerne hvert øye fra optikk lobes bruker en solid tungsten nål (for å stødig øye-hjerne komplekset) og en fin barberblad eller microdissection saks til ren klippe hvert øye fra optikk lobe.
Merk: Øyne er "klissete" på dette stadiet og kan overholde lett dissecting parabolen. Dette er en fordel som det kan hjelpe lette fjerning av øynene fra optikk lobes (se diskusjon). - "Feie" alle øyne en "haug" i PBS + pi på dissecting fatet, med ett blad av en fin par pinsett.
- Skjær et P10 tips med ren razor blad å utvide tips-åpningen ~0.5 mm i radius og smøre tips-interiør av pipettering Western vev Lysis Buffer (WTLB) opp og ned.
- Overføre øye-hjerne komplekser i 5 µL av PBS + pi til en 500 µL microcentrifuge tube. Bruk denne smurt tips og P10 luft forskyvning brønnene for å fullføre overføringen.
- Sett microcentrifuge røret på is. Legge til 1-volum (5 µL) WTLB til prøven, og 10 µL av 2 x konsentrert protein eksempel buffer (eller 2,5 µL av 5 x konsentrert protein eksempel buffer). Bland ved å trykke.
- Vortex microcentrifuge rør kort og spinne ned utvalget med en desktop mini sentrifuge.
- Lagre prøven på 20 ° C før analysen. Analysere ved hjelp av standardprotokoller.
5. utarbeidelse av øyevevet for RNA utvinning:
- Bruk hansker, ren Borstemmaskin, mikroskop, disseksjon verktøy og svart dissekere parabolen først med 70% etanol, og deretter RNase dekontaminering reagens. La tørke.
- Analysere 30-40 pupae som beskrevet (trinn 2.1-2.9) med følgende modifikasjoner: en) samle og analysere 6 til 8 pupae i kladder, 15-20 min fra hverandre; b) dissekere i nuclease-fri PBS og c) isolere hver bunke øyne separat men samle alle netthinnen vev i samme microcentrifuge rør (trinn 5.5).
Merk: Å ha to dissekere samtidig vil akselerere effektiv isolasjon av godt øye vev. - For hver bunke, isolere øye-hjerne kompleksene (trinn 2.1-2.9) og overføring til ~ 400 µL av nuclease-fri PBS i et 9-og glass rett skylle kort, på is, bruker P20 eller P100 luft forskyvning brønnene og smurt tips (forberedt som beskrevet i trinn 3.1.2).
Merk: Denne smurt tips kan brukes for etterfølgende trinnene 5.4, 5.5 og 5,8. - Gjenta skyll trinn to ganger.
- Overføre øye-hjerne komplekser i en fersk 400 µL dråpe iskalde nuclease-fri PBS på en ren svart dissekere parabolen.
- Fjerne hvert øye fra optikk lobes bruker en solid tungsten nål (for å stødig øye hjernen komplekse) og en fin barberblad eller microdissection saks til ren klippe hvert øye fra optikk lobe.
Merk: Øyne er "klissete" på dette stadiet og kan overholde lett dissecting parabolen. Dette er en fordel som det kan hjelpe lette fjerning av øynene fra optikk lobes (se diskusjon). - "Feie" alle øyne en "haug" i nuclease-free-PBS på dissecting fatet, med ett blad av en fin par pinsett.
- Overføre øynene til et sterilt RNase uten microcentrifuge rør og flash-fryse i flytende nitrogen.
- Gjenta disseksjon (trinn 5.3-5.8) av hvert sett med pupae. Overføre hvert sett med øynene til samme microcentrifuge rør som har vært opprettholdt i flytende nitrogen (trinn 5.5) å samle alle øyne i en tube.
- Lagre prøvene ved-80 ° C til RNA utvinning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pupal øyet er en drøy vev som fungerer som en utmerket modell å undersøke utviklingsprosesser som stasjonen morphogenesis. Her har vi dissekert Netthinne og brukte immunofluorescence til å oppdage de apikale adherens veikryssene (figur 3A, C) eller Dcp-1 caspase (figur 3D) som aktiveres under apoptose (Figur 3)25. Disse metodene tillater en tydelig observere celler under viktige Morfogenetiske prosesser inkludert rekruttering og morphogenesis av primær celler (fra 18 h APF), innskudd på gitter cellene rundt hver ommatidium (18-24 h APF), etableringen av den tertiær nisje (21-24 h APF), endringer i Cellestørrelse og form (fra 18 h til 40 h APF) og apoptose (fra 18 til ~ 33 h APF). Tidspunktet for disse Morfogenetiske hendelsene er temperaturen-avhengige og vil derfor variere beskjedent svar på mindre forskjeller i inkubator temperaturer i forskjellige laboratorium innstillinger. Imidlertid av rundt 40 h APF, er den endelige plasseringen av cellene vanligvis oppnås (figur 3B, C) og dette er en perfekt alder å vurdere konsekvensene av genetisk mutasjon eller endret genuttrykk. For eksempel gjør følgende ektopisk uttrykk for Diap1, en kjerne hemmer apoptose caspase Aktivisering (Figur 3 c)26, vår tilnærming det mulig å kvantifisere den påfølgende økningen i antall gitter celler sammenlignet med en kontroll GMR > lacZ netthinnen. Man kan også vurdere apoptose mer direkte ved å benytte anti-Dcp-1 antistoffer eller andre tilnærminger å oppdage døende celler (figur 3D).
Øye lysate kan bli avhørt bruker vestlige analyse for å bestemme tilstedeværelse og/eller relativ uttrykk for proteiner av interesse. Her viser vi påvisning av DE-cadherin, kjernen komponenten av adherens knutepunktene, i vill type Canton S Netthinne dissekert på 21 og 40 h APF øyne (figur 4A). Kvantifisering av denne eksempel Western blot (høyre, figur 4A) avslørte at den relative uttrykket for DE-Cadherin, ikke avvike vesentlig på disse to tid-poeng, da bandet intensitet er normalisert etter uttrykk for GAPDH (en kjerne Metabolsk enzym). Slike analyser ville vanligvis utføres i tre eksemplarer i stedet for bare en gang, som vist her.
Det er viktig å isolere høy renhetsgrad mRNA fra Drosophila pupal Netthinne hvis ens mål er å analysere genuttrykk bruker avansert sekvensering programmer (f.eks, neste generasjons, RNA-seq). Vi har funnet at dissekere mer enn 60 øyne per genotype eller eksperimentelle tilstand er optimalt hvis ett mål er å isolere > 1 mg av høy kvalitet (figur 4B). Her viser vi et eksempel på en absorbansen spektra av en RNA prøve isolert fra 57 vill type Canton S øyne, dissekert på 40 h APF (figur 4B, topp panel). Topp absorbansen på 260 nm tilsvarer absorbansen Bølgelengden av RNA. Vi presenterer også en tabell reflekterer RNA avkastning og A260/A280 og A260/A230 renhet prosenter av seks RNA prøver, samlet på 21 h eller 40 h APF. Disse dataene gjenspeiler små forskjeller i RNA gi når utdrager RNA.
Figur 1 : Utvalg og kultur pupae for disseksjon. (A) vandrende tredje larver skikkelsen (L3) larver og pupae finne langs sidene av sunn Drosophila kulturer. (B) før pupae kan identifiseres av deres gjennomskinnelig hvit farge som pigment ennå genereres i beskyttende pupal saken. Anterior-posterior og dorsal ventrale aksen puppe vises i blått. En fuktig bambus skinne brukes til å fjerne pre pupae fra medisinglass veggene. (C) Pupae er plassert inne i 1,5 mL microcentrifuge rør som merkes riktig (genotype, dato for samling og anvist) og (D) kultivert inne en fuktet kammer samlet fra en tom pipette-tip-boksen. Fuktighet opprettholdes ved å plassere en del av fuktig inne i boksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Dissekere pupal øyet. (A) Pupae følges dobbeltsidig tape på en svart dissekere parabolen. Fremre, bakre og dorsal koordinatene vises i blått. (B) å isolere øye-hjerne komplekser (en enkelt en er vist her), (C) puppe fjernes først fra pupal tilfelle. Viktige skritt i denne prosessen vises. Røde linjer viser hvor å rive og åpne pupal sak etter bløtdyr fjernes. Pupae fjernes deretter fra revet pupal tilfelle med tang. (D) en utsatt puppe kuttes først langs thorax med microdissection saks (posisjon indikert med stiplet rød linje) og hodet epitel så nøye revet åpent (røde piler), som vist i (E) å avsløre ugjennomsiktig øye-hjerne komplekset. (F) etter inkubasjon med passende Antistoffene, netthinne er snittet fra øye-hjerne komplekser. Viktige skritt i denne prosessen vises. Øye-hjernen er stabilisert med en solid tungsten nål (venstre) og netthinnen fjernet med en fin tungsten nål (høyre). Protein og RNA analyser, unfixed Netthinne kan bli rent kuttet fra optikk lobes bruker en fin barberblad eller microdissection saks, i stedet for en fin tungsten nål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Immunofluorescence av pupal øyet. (A) antistoffer mot DE-cadherin etiketten apikale adherens knutepunkter i celler av pupal øyet. Alle bildene i panelet A var samlet i den sentrale regionen i en netthinnen med AC confocal mikroskopi, minimal endret med en bildebehandling, og presenteres på samme skala (skala bar = 5 µm). Merk vekst og omorganisering av celler fra 18t APF til 27 h APF. (B) tegneserie av apikale visningen av en enkelt fullt-mønstret ommatidium på 40 h APF (venstre) og en ommatidium tverrsnitt. Celletyper er fargekodet som er oppført i nøkkelen. Fotoreseptorer er begravet under overflaten av den pseudostratified neuroepithlium og omgitt av kjeglen og pigment cellene. Tre bust grupper omgir hver ommatidium. (C) små områder av en kontroll netthinnen som lacZ ble uttrykt (venstre) eller Diap1 (høyre) for å hemme apoptose sekundære og tertiære pigment celler. Merking av adherens veikryss med anti-DE-cadherin gjør det mulig for analyse av celle nummer, arrangement og form. Bildene ble tatt ved hjelp av standard fluorescerende mikroskopi. (D) en hele netthinnen inkubert med antistoffer mot aktivert Dcp-1, en caspase aktivert under apoptose, som rensker mange celler fra øyet. Bildet ble tatt med AC confocal mikroskopi. Hvite stiplede linjen angir omrisset øyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Protein og gene expression analyser av pupal øyet. (A) Western blot (venstre) av 28 øyne dissekert 21t APF eller 40 h APF, analysert med antistoffer til de cad og, som en lasting, GAPDH. Analyser av protein bandet intensiteter (høyre) avslører sammenlignbare konsentrasjoner av de cad i gruppene netthinne, i forhold til GAPDH. (B) én absorbansen spekteret av en RNA prøve Hentet fra Canton S Netthinne dissekert på 40 h APF (øverst). Merk absorbansen peak på 260 nm. Tabell dokumentere beløp og renhet prosenter av RNA utvunnet fra Canton S pupal Netthinne isolert på 21 og 40 h APF (nederst). Disse dataene oppstår fra tre uavhengige Prøvesett. Pupae for hvert eksempel ble reist og ruges i samme vilkår og dissekert på samme dag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila pupal øye disseksjon beskrevet her tillater for isolering av 6-10 øye-hjerne komplekser innen 10 til 15 min. Men er tålmodighet og praksis avgjørende for å mestre teknikken disseksjon og forbedre kvaliteten og hastigheten på disseksjoner. Denne korte disseksjon tiden sikrer at hvert øye er omtrent den samme utviklingsstadiet, reduserer variasjon i fenotype eller genet uttrykk for Netthinne i et datasett. Mens alternativ protokoller kan kreve mindre øvelse å mestre, er våre protokollen utformet metodisk isolere delikat netthinnen vev samtidig minimere rive eller skjæring, fordi skade øyet kan indusere stress veien aktivisering eller celledød. Vi anbefaler at nybegynnere første original Disseksjon av pupae kultivert til 40 h APF før du prøver å dissekere yngre øyne. Vi anbefaler å sette opp kopiere krysser for alle eksperimenter (trinn 1.1) som vil sikre at det er alltid nok pupae tilgjengelig for samling (trinn 1.3). Netthinne kan være dissekert på en rekke timepoints i pupal utvikling, avhengig av forskjellige Morfogenetiske hendelsene rundt å forskeren. Disse kan inkludere rekruttering og morphogenesis av primær celler (fra 18 h APF), innskudd gitter celler (18-24 h APF), etablering av tertiær nisje (21-24 h APF), endringer i cellestørrelsen og form (fra 18 h til 40 h APF) og apoptose (fra 18 til ~ 33 h APF) (Figur 3A).
Hvis under innledende åpningen av pupal saken (trinn 2.2, figur 2C), thorax av august er punktert, skal forskeren fortsatt kunne fortsette med dissection. Men hvis hodet er utgangspunktet punktert, kan trekke ut uskadet øye-hjerne komplekser være vanskelig. Når du fjerner en puppe fra pupal tilfelle (trinn 2.3, figur 2C, høyre panel), kan abdominal pupal tilfelle noen ganger dislodge fra dobbeltsidig tape og fortsatt innpakket om puppes mage. Dette er neppe en hindring, men puppe kan flyte når omgitt av PBS til magen og knyttet pupal saken er kuttet fra puppe (trinn 2.6). For å opprettholde dataintegriteten netthinnen vev, er det viktig at det er fast eller frosset så raskt som mulig etter den første punktering av pupae. I tillegg bruker iskald løsninger og vedlikeholde vev på is (eller 4 ° C) hvor mulig gjennom protokollen vil bevare vev og mobilnettet integritet, fører til bedre immunofluorescence, protein-analyse eller RNA-analyse. For sistnevnte programmer, er det viktig å fjerne alle hjernen og fettvev fra øynene som disse vev forurenser analyser (trinn 2.9 og 4.3 eller 5.4).
Pupal øye-hjerne komplekset kan overholde unlubricated pipette-spisser, glass og disseksjon verktøy når unfixed eller under PBS vasker/skyller, fører til skade på vev. For å unngå dette anbefaler vi grundig smøring av pipette-spisser og ikke 9-og glass vaske med etanol (dish såpe bør også unngås). I stedet, bare ren glass retter med destillert H2O og smøre, om nødvendig med en PBT skylling før å bruke. Disseksjon tang, saks og nåler bør også hovedsakelig rengjøres med destillert H2O, unntatt når forbereder disse RNA-utvinning disseksjoner (trinn 5.1). Men kan lett vedheft mellom Netthinne og glass objektglass hjelpe unfurling øyne og plasser dem på lysbilder når skille øyne fra optikk lobes under montering (trinn 3.5.4 og 3.5.5). Tilsvarende lys vedheft av øynene til svart dissekere retter kan brukes å flate og veldig lett stretch vevet som muliggjør ren severing av øye-optisk lobe tilkoblinger når isolere Netthinne protein eller RNA analyserer (trinn 4.5 og 5.6). Vi har funnet at microdissection saks eller et fint barberblad er utmerket verktøy for å raskt og rent cleave unfixed øyne fra optikk lobes.
Primære antistoff flekker, i stedet for rugende øye-hjerne komplekser i 72-og mikro-og skuffer (trinn 3.3.5), kan en 9-og glass rett i stedet brukes. For å hindre fordampning av antistoff løsningen over natten, pass cap glass rett brønnene med cover slip eller lysbildet. Men vil denne tilnærmingen kreve 40-50 µL av primære antistoff løsning for en gruppe med 6-10 øye-hjerne komplekser ruges i en brønn av 9-og glass rett, i stedet for 20 µL av primære antistoff løsning fordelt mellom 2 wells fra en 72-og mikro-og brett.
Sekundær fiksering av øye-hjerne komplekser (trinn 3.4) før montering øyne på objektglass (trinn 3,5) vil marginalt stive vev slik at det er lettere å holde seg øynene fra optikk lobes og øynene er mindre sannsynlig å kaste eller overholder disseksjon nåler. Etter en 1-2 h inkubasjon i montering medium (trinn 3.5.1) blir øye-hjerne komplekser litt ugjennomsiktige og dermed lettere å se mens montering. I tillegg etter 1-2 h i montering medium beskyttes de fleste sekundære antistoffer passende fra Foto-bleking under fluorescerende bildebehandling. Rugende Netthinne overnatter i monterer medier før montering ikke er anbefalt som dette gjør Netthinne myke, benektende stivne effekten av sekundær fiksering.
For vestlige analyser, er den lysate minst 20 øyne pålagt å oppdage proteiner ved hjelp av antistoffer som robust gjenkjenner Drosophila proteiner (f.eks figur 4A). Men kan et større antall øyne være nødvendig hvis det er lav uttrykk for målet protein av interesse. Hvis lysis av vev for påfølgende vestlige blotting er ufullstendig (trinn 4.7), volumet av WTLB lagt til utvalget kan økes marginalt og volumet av konsentrert utvalg buffer justert tilsvarende (trinn 4,9). For RNA utvinning, rask Disseksjon av et betydelig antall øyne kan være nødvendig hvis målet er å isolere mye av høy kvalitet (trinn 5.2, se figur 4B). Denne potensielle ulempen kan overvinnes Hvis to forskere som har mestret Drosophila pupal-øye disseksjon samarbeider for å dissekere disse store antall fly Netthinne samtidig. Men den totale mengden RNA kreves avhengig kravene i institusjon eller anlegget utfører RNA analyse, RNA analyse eller sekvensering, og RNA utvinning kit som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Zack trommelen og våre korrekturlesere nyttig på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
