Summary
Этот документ представляет хирургический метод для рассечения дрозофилы куколки сетчатки наряду с протоколами для обработки ткани для иммуногистохимии, Западный анализ и извлечение RNA.
Abstract
Куколки сетчатки дрозофилы обеспечивает отличную модель системы для изучения морфогенетических процессов во время разработки. В этой статье мы представляем надежный протокол для диссекции деликатный дрозофилы куколки сетчатки. Хирургический подход использует инструменты легко доступные microdissection для открытия куколок и точно извлекать глаз мозг комплексов. Эти можно фиксированной, подвергается иммуногистохимии и сетчатки затем монтируется на скольжениях микроскопа и образы, если цель заключается в том, чтобы обнаружить сотовой или внутриклеточных структур. В качестве альтернативы нефиксированных сетчатки может изолированы от мозговой ткани, лизированы в соответствующие буферы и используются для извлечения электрофореза или мРНК белка гель (оценить выражение протеина или гена, соответственно). Значительные практика и терпение может потребоваться освоить microdissection протокол описал, но как только освоил, протокол позволяет относительно быстро изоляции главным образом неповрежденных сетчатки.
Introduction
Дрозофилы Сетчатка состоит из примерно 750 фасеточном окружении пигментных клеток, расположенных в3,2,1,решетка соты4. Каждый Омматидий содержит восемь фоторецепторных нейронов, четыре линзы секретирующих колбочек и два первичных клеток пигмента. Каждый Омматидий окружают пигментных клеток решетки и сенсорные щетиной групп. Благодаря своей пост митотическая природы и стереотипных гексагональной куколки сетчатки дрозофилы обеспечивает отличную модель системы для изучения морфогенетических процессов, включая клетки адгезии5,6, 7,8,9,10 апоптоз11,12,13,,14и15.
Несколько опубликованных протоколов используют давление воздуха для извлечения глаз мозг комплексы из дрозофилы куколок16,17,18. Протокол, в описанный здесь вместо этого использует инструменты microdissection для тщательно и точно изолировать глаз мозг комплексы с целью получения неповрежденной ткани сетчатки. Это важно, если сетчатки должны быть использованы для морфологических, белка или экспрессии генов анализирует, так как повреждение сетчатки может привести к клеточного стресса или смерть, которые могут изменить клеточных фенотип или ген выражение. Кроме того после практики, 6-10 глаз мозг комплексы могут быть изолированы в 10-15 мин, содействие цели минимизации изменчивости в возраста и стадии развития расчлененных глаз ткани.
Фиксации, иммуноокрашивания и целом гора протокол описанные ниже подходит для подготовки дрозофилы глаза для флуоресцентной микроскопии. Сетчатки могут быть инкубирован с антителами против протеинов интереса. Например антитела к adherens соединения компонентов могут быть использованы для визуализации апикальной окружностей клеток, так что характеристики, включая тип клеток, форму и расположение может быть начисленных19. До фиксации глаза можно вместо расщепляется от головного мозга с целью извлечения белков для западного анализа, или РНК для использования в qRT ПЦР или РНК последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка тканей
- Настройка дрозофилы кресты (как описано ранее20) или культуры конкретных штаммов дрозофилы для получения куколок желаемого генотипа. Для обеспечения что большое количество куколок возникают совпадению, установить эти летать культур в двух экземплярах на средства массовой информации богатых питательными веществами продуктов питания или стандартное питание СМИ, щедро дополнена дрожжей пасты.
- Поддерживать дрозофилы культур при 25 ° C. Для использования системы UAS-GAL4 кресты GMR-GAL4 является идеальным драйвер, выраженная в личиночной глаз диск клетки задней морфогенетических борозды и на протяжении развития куколки21,,2223, 24. Крест UAS-lacZ X GMR-GAL4 служит идеальной управления крест, как он управляет экспрессии белка не эндогенного и инертных β-галактозидазы.
- Используйте кончик 6" бамбуковых шина, которая была мокрой с дистиллированной водой, аккуратно поднять белый предварительно куколки (рис. 1B) со стороны здоровой культуры флаконов (рис. 1A) и поместить в 1,5 мл microcentrifuge трубку (рис. 1 c).
- Место труб в поле Подсказка пластиковая Пипетка наряду с небольшой кусок ткани, смоченный в дистиллированной воде для поддержания палата при достаточной влажности для защиты куколки от сушки (рис. 1 d). Инкубируйте куколок при 25 ° C до вскрытия.
- Используйте сухой 6" бамбуковых шина для осторожно выдвиньте куколок из пробки microcentrifuge и на черный рассекает блюдо. Класть свежий кусок двухсторонний скотч на рассечения блюдо от куколок.
- Используя пару щипцов, тщательно место куколок спинной стороне вверх (то есть, оболочек вверх, рис. 1B) на ленту (рис. 2A). Убедитесь, что куколки хорошо придерживаться ленты.
Примечание: Влаги на корпусе куколки препятствуют безопасной адгезии на ленту, в этом случае, позволяют куколок высохнуть перед размещением на двухсторонний скотч.
2. рассечение глаз мозг комплексов
- Используйте щипцы для удаления крышечки каждой куколки (рис. 2 c).
- Используйте ножницы microdissection ломтик или разрезать куколки случай каждой куколки. Лоскут открыть куколки случай раскрыть головы, грудной клетки и передней брюшной сегмент, обеспечение края куколки дело двухсторонний скотч (рис. 2 c).
Примечание: Нет необходимости полностью раскрыть куколок. - Проколоть брюшке каждой куколки с острыми пинцет, чтобы понять животного и удалите его из чехла куколки (рис. 2 c).
- Поместите куколок на черный рассечение блюдо, от ленты и покрывают около 400 мкл раствора ледяной фосфат буфер-(PBS, рН 7,4).
- Возьмите каждой куколки живота с щипцами и microdissection ножницы, сделать чистой поперечного разруба через всей грудной клетки, резка куколки в два раза (Рисунок 2D).
- Удаление задней остаток каждой туши от PBS и надел рассечения блюдо в одну сторону (не отменить, смотрите шаг 3.2.1).
- Откройте с помощью двух пар тонкой щипцов, грудной клетки и головы каждой куколки раскрыть глаз мозг комплекс (рисунок 2E). Чтобы сделать это, возьмите края разреза грудной клетки эпителия и постепенно слезоточивый открыть грудной клетки и затем голову капсула, подвергая глаз мозг сложными и окружающие жировой ткани.
- Без цепляния ткани, используйте щипцы для руководства комплекс глаз мозг от пережитков головной капсулы или совок комплекс глаз мозг от войной открытый головной капсулы.
Примечание: Глаз мозг комплекс гантели образный, беловатого и более прозрачной, чем окружающие кремового цвета жира (рис. 2B, E). - Пинцетом тщательно удалите большинство жиров, связанные с глаз мозг комплексы без касатьться тканей глаза.
3. обработка ткани для иммунофлуоресценции
- Рассекать по крайней мере 6-10 куколки как описано (шаги 2.1-2.9).
Примечание: Три-четыре независимых реплицирует каждого рассечение, как правило, дают достаточно данных для проверки гипотезы. -
Мытье и фиксация
- Отрежьте кончик P20 или наконечник пипетки P100 с чистым лезвием увеличить наконечник открытие ~ 1 мм в радиусе и смазывать, дозирование смеси PBS и жира вверх и вниз. Этот жир можно получить остатки туши, снятыми в пункте 2.6.
- Перенесите глаз мозг комплексов в ~ 400 мкл PBS в 9-Ну стекла блюдо, на льду. Используйте кончик смазкой и P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха для передачи.
Примечание: Глаз мозг комплексов будет придерживаться несмазанной советы во время закупорить и повреждены или потеряны. - Удалите оставшиеся жира, связанные с тканей глаза, закупорить PBS вверх и вниз, чтобы слегка взболтать комплексов глаз мозг. В этом и все последующие стирки шаги, не Пипетка непосредственно комплексы глаз мозг вверх и вниз как это может повредить хрупкий глаз ткани.
- Передача глаз мозг комплексов в минимальном объеме (< 20 мкл) от PBS в по крайней мере 250 мкл фиксатором. Смешайте закупорить решение вверх и вниз. Инкубируйте 35 мин., на льду.
Примечание: Кончик же смазкой, подготовленную на этапе 3.1.1 может использоваться для этой передачи. - С же кончиком пипетки передача глаз мозг комплексов в хорошо содержащие ~ 400 мкл PBS. Смешать, закупорить решение вверх и вниз и инкубировать на 5-10 минут на льду, мыть. Повторите шаг стирки по крайней мере дважды.
Примечание: Глаз мозг комплексов может поддерживаться на несколько часов во время окончательной стирки PBS, на льду, или на 4 ° C, прежде чем перейти к шагу 3.3.1.
-
Пятнать антитела
- Чтобы заблокировать ткани до воздействия решений антитела, передать ~ 400 мкл PBT комплексы глаз мозг. Используйте кончик смазкой и P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха для передачи. Инкубируйте 10-60 мин, на льду.
- Приготовляют раствор основного антитела путем разбавления соответствующие антитела в PBT. Так как глаз мозг комплексы инкубируют в 10 мкл аликвоты раствор антител, объем подготовленных будет реплицировать из 10.
- Аликвота 10 мкл раствор антител в Чистый колодец 72-ну микрорезервуар лотка (см. обсуждение).
- Отрежьте кончик кончика пипетки P10 с чистым лезвием увеличить наконечник открытие ~0.5 мм в радиусе и смазывать, дозирования PBT вверх и вниз.
- Передачи в объеме не более 5 глаз мозг комплексов, < 3 мкл PBS, в каждый 10 мкл хорошо раствор антител с использованием микропипеткой перемещения воздуха P10 и кончик смазкой.
- Однородный раствор антител, закупорить решение вверх и вниз. Не Пипетка комплексы глаз мозг вверх и вниз, как это может повредить ткани.
- Чтобы свести к минимуму испарения раствор антител, место небольшой кусок ткани, смоченный в дистиллированной воде в микрорезервуар лоток и уплотнение лоток (например, с крышкой предусмотрено). Инкубируйте на ночь при 4 ° C.
- Перевод глаз мозг комплексы из лотка микрорезервуар на ~ 400 мкл ПБТ в 9-навернулись стеклянную посуду мыть. Используйте микропипеткой перемещения воздуха P10 и ПБТ смазать наконечник (готовить, как описано в шаге 3.3.4). Смешайте закупорить решение вверх и вниз. Инкубируйте 5-10 мин на льду.
- Повторите шаг стирки по крайней мере дважды. Используйте P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазать наконечник для передачи глаз мозг комплексы между Вымойте решения.
- Приготовляют раствор вторичного антитела путем разбавления соответствующие Флюорофор тегами вторичные антитела в PBT при необходимости. 100 мкл раствора вторичного антитела является достаточным в пакете куколок 6-10. Алиготе вторичное антитело решения в блюдо рассечение 9-навернулись стекла.
- Перенесите глаз мозг комплексов в раствор вторичных антител. Используйте P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазать наконечник для передачи.
- Инкубировать глаз мозг комплексов в растворе вторичное антитело для 1-2 ч при комнатной температуре, или 3-5 ч при 4 ° C. Чтобы предотвратить обесцвечивание флуорофоров светом, охватывают подготовку с фольгой.
Примечание: Оптимальная продолжительность инкубации в растворе вторичные антитела могут отличаться в зависимости первичного и вторичного антитела, которые используются. - Перенесите глаз мозг комплексов в ~ 400 мкл PBT в стекло 9-Ну блюдо, чтобы мыть. Смешайте закупорить решение вверх и вниз. Инкубируйте 5-10 мин на льду. Этот шаг Стиральная должен повторяться по крайней мере дважды.
-
Вторичные фиксации
- Для вторичного фиксации передать по крайней мере 200 мкл фиксатором глаз мозг комплексов и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре или 35 мин при 4 ° C.
Примечание: Среднее фиксации застывает тканей глаза, которая помогает монтажа (шаг 3.5). - Используйте P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазать наконечник для передачи глаз мозг комплексов в ~ 400 мкл PBT в стекло 9-Ну блюдо, на льду, чтобы помыть 5 мин.
- Повторите шаг стирки по крайней мере один раз.
- Использование P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазкой подсказка для передачи глаз мозг комплексов в ~ 400 мкл PBS в 9-Ну стекла блюдо, на льду, для полоскания для 1-2 мин держать ткани в движение дозирования PBS, но не ткани , вверх и вниз, чтобы предотвратить глаз мозг комплексы от урегулирования и придерживаясь стеклянную посуду во время PBS-промыть.
- Для вторичного фиксации передать по крайней мере 200 мкл фиксатором глаз мозг комплексов и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре или 35 мин при 4 ° C.
-
Монтаж
- Перенесите глаз мозг комплексов в ~ 200 мкл монтажа СМИ. Используйте P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазать наконечник для передачи комплексов глаз мозг. Разрешить ткани, чтобы сбалансировать в монтаж СМИ для 1-2 ч.
- Место 5-8 мкл капли свежего монтажа СМИ на чистой микроскопа.
- Отрежьте кончик P10 с чистым лезвием увеличить наконечник открытие ~0.5 мм в радиусе и использовать это и микропипеткой перемещения воздуха P10 для передачи глаз мозг комплексов в 5-8 мкл монтажа СМИ в падение монтажа СМИ на слайде.
- Используйте две иглы вольфрама для разделения глаз от зрительного лопастями. Контакт глаз мозг комплекс на слайд с прочная вольфрамовой иглой и нарежьте каждый глаз от его связанного доли оптика с тонкой вольфрамовой иглой (Рисунок 2F).
- Используйте тонкой вольфрамовой иглой для маневра каждого глаза на поверхности микроскопа с базальной поверхности каждого глаза, прилегающих к слайду. Слегка ниже чистой крышкой скольжения над ткани и закрепите с лак.
Примечание: Организация глаза на слайде, так что они находятся рядом друг с другом или в строке облегчит последующее микроскопии. - Изображение с помощью флуоресцентных или конфокальной микроскопии сетчатки.
Примечание: Слайды следует хранить при 4 ° C, если не немедленно отражаться.
4. подготовка ткани глаза для западный Blotting:
- Вскрыть 10-16 куколки (шаги 2.1-2.9) со следующими изменениями:) собирать и анализировать куколки в двух пакетах, 10-15 мин врозь и b) вскрыть в PBS, дополняют ингибиторы протеазы и фосфатазы (PBS + pi).
- Передача с помощью P20 комплексы глаз мозг или P100 воздуха микропипеткой перемещения и смазать наконечник (подготовлен как шаг 3.2.1) в ~ 400 мкл PBS + pi в 9-Ну стекла блюдо, на льду, чтобы ополоснуть кратко.
Примечание: Этот смазать наконечник может использоваться для последующих шагов, 4.3 и 4.4. - Повторите шаг полоскать дважды.
- Перенесите все комплексы глаз мозг в ~ 400 мкл лед холодной PBS + pi, сливают на чистый черный рассечения блюдо.
- Удаление каждый глаз из зрительного лопастями, с помощью иглы прочная вольфрама (устойчивый комплекс глаз мозг) и тонкой лезвие бритвы или microdissection ножницы для аккуратно вырезать каждый глаз от лоб зрительный.
Примечание: Глаза «липкий» на этой стадии и могут легко придерживаться рассечения блюдо. Это выгодно, как она может помочь облегчить удаление глаз от зрительного лопастями (см. обсуждение). - «Sweep» все глаза в кучу» в PBS + pi на рассечения блюдо, используя один blade прекрасные пары щипцов.
- Отрежьте кончик P10 с чистым лезвием расширить Совет открытие ~0.5 мм в радиусе и Смажьте наконечник интерьер буфера Lysis (WTLB ткани дозирования Западной) вверх и вниз.
- Передача в 5 мкл PBS + pi глаз мозг комплексов в 500 мкл microcentrifuge трубку. Используйте этот смазать наконечник и микропипеткой перемещения воздуха P10 для завершения передачи.
- Место пробки microcentrifuge на льду. Добавьте 1 тома (5 мкл) WTLB в образец и 10 мкл буфера выборки концентрированных белков 2 x (или 2,5 мкл буфера выборки концентрированных белков 5 x). Перемешать путем выстукивать.
- Вихревой microcentrifuge трубки кратко и спин вниз образца с помощью рабочего стола Мини центрифуга.
- Магазин образец при-20 ° C до анализа. Анализ с помощью стандартных протоколов.
5. подготовка ткани глаза РНК добыча:
- Носить перчатки, чистый benchtop, Микроскоп, рассечение инструменты и черный рассекает блюдо впервые с 70% этанола, а затем РНКазы обеззараживания реагента. Дайте высохнуть.
- Вскрыть 30-40 куколки как описано (шаги 2.1-2.9), со следующими изменениями:) собираются и вскрыть 6-8 куколки в пакетах, 15-20 минут друг от друга; b) вскрыть в свободной от нуклеиназы PBS и c) изолировать каждый пакет глаза отдельно, но накапливать все ткани сетчатки в же пробки microcentrifuge (шаг 5.5).
Примечание: Два люди препарировать параллельно ускорит эффективной изоляции хороший глаз ткани. - Для каждого пакета изолируйте глаз мозг комплексы (шаги 2.1-2.9) и передачи в ~ 400 мкл свободной от нуклеиназы PBS в 9-Ну стеклянную посуду для полоскания кратко, на льду, с использованием P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и смазать наконечник (готовится, как описано в шаге 3.1.2).
Примечание: Этот смазать наконечник может использоваться для последующих шагов, 5.4, 5.5 и 5,8. - Повторите шаг полоскать дважды.
- Перевод глаз мозг комплексов на свежие 400 мкл капля ледяной свободной от нуклеиназы PBS на чистый черный рассекает блюдо.
- Удаление каждый глаз из зрительного лопастями, с помощью иглы прочная вольфрама (устойчивый комплекс глаз-мозг) и тонкой лезвие бритвы или microdissection ножницы для аккуратно вырезать каждый глаз от лоб зрительный.
Примечание: Глаза «липкий» на этой стадии и могут легко придерживаться рассечения блюдо. Это выгодно, как она может помочь облегчить удаление глаз от зрительного лопастями (см. обсуждение). - «Sweep» все глаза в кучу» в свободной от нуклеиназы PBS на рассечения блюдо, используя один blade прекрасные пары щипцов.
- Перевести глаза в стерильную пробирку microcentrifuge РНКазы бесплатно и флэш замораживание в жидком азоте.
- Повторите диссекции (шаги 5.3-5.8) каждой партии куколок. Передачи каждого пакета глаз в же microcentrifuge трубку, которая была сохранена в жидком азоте (шаг 5.5) накапливать все глаза в одной из труб.
- Хранение образцов-80 ° C до извлечение RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Куколки глаз является легко доступной ткани, которая служит прекрасной моделью для изучения процессов развития, диск морфогенеза. Здесь, мы расчленены сетчатки и используются иммунофлюоресценции для обнаружения апикальной adherens соединения (рис. 3A, C) или caspase Dcp-1 (рис. 3D), который активируется во время апоптоз (рис. 3)25. Эти подходы позволяют четко соблюдать клетки во время ключевых морфогенетических процессов, включая вербовку и морфогенез начальной клеток (от 18 h НФА), интеркаляции решетчатой клетки вокруг каждого Омматидий (18-24 h НФА), создание Третичный нишу (21-24 h НФА), изменения в размер ячейки и формы (от 18 h 40 h НФА) и апоптоз (от 18 до ~ 33 h НФА). Сроки проведения этих морфогенетических событий зависит от температуры и будет незначительно варьироваться в ответ на незначительные различия в инкубатор температуры в различных лабораторных параметров. Однако, около 40 h НФА, окончательной договоренности клеток обычно достигается (рисунок 3B, C) и это идеальный возраст для оценки последствий генетической мутации или изменения экспрессии генов. Например следующее выражение внематочная Diap1, основных ингибитора апоптоза caspase активации (рис. 3 c)26, наш подход позволяет дать количественную оценку последующее увеличение числа клеток решетки по сравнению с элементом управления GMR > lacZ сетчатки. Apoptosis также легко можно оценить более непосредственно, используя антитела анти Dcp-1 или другие подходы для выявления умирающие клетки (Рисунок 3D).
Глаз lysate может быть допрошен с использованием западных анализа для определения присутствия и/или относительное выражение протеинов интереса. Здесь мы показываем обнаружения де Кадгерины, основной компонент adherens развязок, в дикого типа S кантона сетчатки расчленены на 21 и 40 h НФА глаза (Рисунок 4A). Количественная оценка этого образца Вестерн-блот (справа, рис. 4A) показал, что относительное выражение де-Кадгерины, существенно не отличаются в этих двух-моменты времени, когда группа интенсивности нормализованы согласно выражение GAPDH (ядро метаболические фермента). Такой анализ будет обычно осуществляться в трех экземплярах, а не только один раз, как показано здесь.
Важно, чтобы изолировать высокой чистоты mRNA от дрозофилы куколки сетчатки, если его цель заключается в анализе экспрессии генов, с использованием передовых виртуализации приложений (например, Next-Gen, РНК seq). Мы обнаружили, что разбор более чем 60 глаза на генотип или экспериментальных условие является оптимальным, если один в цель изолировать > 1 мг высокого качества РНК (рис. 4В). Здесь мы покажем пример спектров поглощения образцов РНК, изолированы от 57 глаз Кантоне S дикого типа, расчлененные на 40 h APF (Рисунок 4B, верхней панели). Пик поглощения на 260 Нм соответствует длине волны поглощения РНК. Мы также присутствует таблица, отражающая РНК урожайности и A260/A280 и A260/A230 чистоты соотношения шести образцов РНК, собрались в 21 h или 40 h НФА. Эти данные отражают тонкие различия в РНК доходность при извлечении РНК.
Рисунок 1 : Выбор и культура куколок для рассечения. (A) бродил третий личиночных возраста (L3) личинки и куколки найти по бокам здорового дрозофилы культур. (B) предварительной куколки могут быть определены по их полупрозрачного белого цвета как пигмент предстоит быть сгенерирована куколки защитный. Передней и задней и спинной вентральный оси куколки показаны синим цветом. Влажной бамбуковых шина используется для выбить и выбрать предварительно куколок из флакона стен. (C) куколок помещены внутри трубы microcentrifuge 1,5 мл, которые помечены соответствующим образом (генотип, Дата сбора и время сбора) и (D) культивировали внутри увлажненные камеры собираются из коробки пустой пипетку подсказка. Влажность поддерживается размещая кусок влажной ткани внутри коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Разбор куколки глаз. (A) куколок соблюдаются двухсторонний скотч на черный рассекает блюдо. Передняя, задняя и спинной координаты указаны синим цветом. (B), чтобы изолировать глаз мозг комплексы (одна один показано здесь), (C) куколки сначала удаляется из куколки дела. Показаны важные шаги в рамках этого процесса. Красные линии показывают где рвать и открыть куколки случай после удаления крышечки. Куколки затем удаляются из разорванной куколки случай с щипцами. (D) подвергаются куколки сначала разрезать вдоль грудной клетки с microdissection ножницы (позиция с пунктирная красная линия) и головы эпителия затем тщательно раскрылся (красные стрелки), как показано на (E), чтобы выявить комплекс непрозрачный глаз мозг. (F) после инкубации с соответствующим антител, сетчатки отрезаны от глаз мозг комплексов. Показаны важные шаги в рамках этого процесса. Глаз мозг стабилизируется с прочная вольфрамовой иглой (слева) и retinas удалены с тонкой вольфрамовой иглой (справа). Для белков и РНК анализов нефиксированных сетчатки может аккуратно вырезанные из зрительного лопастями, с помощью тонкой лезвие или ножницы microdissection, вместо тонкой вольфрамовой иглой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Иммунофлюоресценции куколки глаза. (A) антител к де Кадгерины лейбл апикальной adherens соединения клеток куколки глаза. Все изображения в панели A были собраны в регионе Центральной сетчатки с помощью конфокальной микроскопии, минимально изменения с помощью программного обеспечения обработки изображений и представлены на той же шкале (шкала бар = 5 мкм). Обратите внимание, роста и перестройки клеток от 18 h НФА к 27 h НФА. (B) мультфильм апикальной представления единого полностью узорной Омматидий на 40 h APF (слева) и Омматидий в поперечном сечении. Типы клеток цветом, перечисленных в ключе. Фоторецепторы похоронены под поверхностью псевдомногослойный neuroepithlium и окружении конуса и пигментные клетки. Три группы щетиной окружают каждого Омматидий. (C) малых регионов управления сетчатки в котором lacZ была выражена (слева) или Diap1 (справа) подавлять апоптоз клеток пигмента вторичных и третичных. Маркировка adherens развязок с анти де Кадгерины позволяет анализ количества клеток, расположения и формы. Изображения были пойманы с помощью стандартных флуоресцентной микроскопии. (D всю сетчатку, инкубировали с антителами к активации Dcp-1, caspase, активирована во время apoptosis, которое чернослив многочисленные клетки от глаз. Образ был захвачен с помощью конфокальной микроскопии. Белая линия пунктирная излагаются глаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Белок и гена анализ выражения куколки глаза. (A) Западная помарка (слева) 28 глаз, расчлененный в 21 h НФА или 40 h НФА, исследовали с антителами к де cad и, как контроль погрузки, GAPDH. Анализы белка полосы света (справа) показывает, что сопоставимые концентрации де cad в этих группах сетчатки, по отношению к GAPDH. (B) одного поглощения спектр пример РНК, извлеченные из кантона S сетчатки, расчлененные на 40 h APF (вверху). Примечание пик поглощения на 260 Нм. Таблица, документирование соотношения суммы и чистоты РНК, извлеченные из кантона S куколки сетчатки, изолированных в 21 и 40 h APF (внизу). Эти данные возникают из трех наборов независимых образца. Куколки для каждой выборки были подняты и инкубировали в тех же условиях и расчлененный в тот же день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод дрозофилы куколки глаз рассечение описанных здесь позволяет для изоляции 6-10 глаз мозг комплексов в течение 10-15 мин. Однако терпение и практика имеют важное значение для того, чтобы освоить технику рассечения и улучшить качество и скорость вскрытия. Этот короткий рассечение время гарантирует, что каждый глаз примерно же стадии развития, снижение изменчивости в выражении фенотип или гена сетчатки в наборе данных. Хотя альтернативные протоколы могут требовать менее практике освоить, наш протокол предназначен для методично изолировать деликатные ткани сетчатки при сведении к минимуму риска разрывов или сдвига, потому что повреждение глаз может вызвать стресс пути активации или даже гибель клеток. Мы рекомендуем новичкам освоить первые рассечение куколок, культивируемых до 40 ч НФА прежде чем пытаться вскрыть младшим глазами. Мы рекомендуем, Настройка replicate кресты для всех экспериментов (шаг 1.1), которые обеспечат, что есть всегда достаточно куколок, доступны для коллекции (шаг 1.3). Сетчатки может быть расчлененный на различных timepoints во время куколки разработки, в зависимости от различных морфогенетических события, представляющие интерес для исследователя. Эти меры могут включать набор и морфогенез Главные ячейки (от 18 h НФА), интеркаляции решетки клеток (18-24 h НФА), создание высшего нишу (21-24 h НФА), изменения в размер ячейки и формы (от 18 h 40 h НФА) и апоптоза (от 18 до ~ 33 h НФА) (Рис. 3A).
Если во время первоначального открытия куколки дела (шаг 2,2, рис. 2 c), повреждении грудной клетки куколки, исследователь должен по-прежнему сможет продолжить работу с рассечение. Однако если руководитель первоначально проколотый, извлечения неповрежденных глаз мозг комплексов может быть трудным. При удалении куколка из чехла куколки (шаг 2.3, рис. 2 c, правая панель), брюшной куколки случай иногда может выбить из двухсторонней ленты и остаются завернутый о куколки живота. Это маловероятно в препятствие, хотя куколки могут плавать, когда окружении PBS до живота и придает куколки дело выделено в отдельное от куколки (шаг 2.6). Для сохранения целостности ткани сетчатки, важно, что она фиксированной или заморожены как можно быстрее после первоначального прокола куколок. Кроме того, с помощью ледяной решения и поддержания тканей на льду (или на 4 ° C), везде, где возможно на протяжении протокол будет сохранять тканей и клеточных целостность, приводит к лучше иммунофлюоресценции, белок анализ или РНК анализ. Для последних приложений важно удалить все мозга и жировой ткани от глаз как эти ткани будет загрязнять анализы (шаг 2.9 и 4.3 или 5.4).
Куколки глаз мозг комплекс может придерживаться несмазанной наконечники, стекла и рассечение инструменты когда незафиксированные или во время PBS моет/полоскания, ведущих к повреждению тканей. Чтобы предотвратить это, мы рекомендуем тщательной смазке наконечники и не мытье посуды 9-Ну стекла с этанолом (мыльница следует также избегать). Вместо этого просто очистите стеклянные блюда с дистиллированной H2O и смазывать, при необходимости, с PBT полоскания перед использованием. Рассечение щипцы, ножницы и иглы должны также главным образом очищаться с дистиллированной H2O, за исключением при подготовке этих для вскрытия извлечение RNA (шаг 5.1). Однако легкие адгезии между сетчатки и стеклянных скольжениях микроскопа может помочь в развернув глаза и позиционирование их на слайдах, отделяя глаза от зрительного лопастями во время монтажа (шаг 3.5.4 и 3.5.5). Аналогичным образом легкие адгезии глаз черный, рассекает блюда может использоваться для выравнивания и слегка растянуть ткань, которая облегчает Чистый разрыв доли глаз оптических соединений при изоляции сетчатки для белка и РНК анализирует (шаг 4.5 и 5.6). Мы обнаружили, что microdissection ножницы или тонкой лезвия являются отличными инструментами для быстро и чисто прилепится нефиксированных глаза от зрительного лопастями.
Во время основное антитело пятная, вместо инкубации глаз мозг комплексов в 72-микро скважины лотки (шаг 3.3.5), 9-Ну стеклянную посуду можно вместо этого использовать. Чтобы предотвратить испарение раствор антител на ночь, убедитесь, что крышка стекла блюдо скважин с крышки выскальзования или слайд. Однако этот подход потребует 40-50 мкл раствора первичного антитела для пакета 6-10 комплексов глаз мозг инкубировали в одной скважине 9-Ну стеклянную посуду, а не 20 мкл раствора первичного антитела, распределены между 2 скважины 72-микро скважины лотка.
Вторичные фиксации глаз мозг комплексов (шаг 3.4) до монтажа глаза на скольжениях микроскопа (шаг 3.5) незначительно жесткость ткани, так что это легче прилепится глаз от зрительного лопастями и глаза реже сложить или придерживаться рассечение иглы. После 1-2 ч инкубации в среде монтажа (шаг 3.5.1) глаз мозг комплексы становятся немного непрозрачной и поэтому легче увидеть во время монтажа. Кроме того после 1-2 ч в среде монтажа, большинство вторичные антитела будут надлежащим образом защищены от обесцвечивания фото во флуоресцентных изображений. Инкубации сетчатки на ночь в СМИ монтажа до монтажа не рекомендуется, поскольку это делает сетчатки мягкой, отрицая влияние жесткости средней фиксации.
Для западных анализов lysate по крайней мере 20 глаз необходимо надежно обнаруживать белки с использованием антител, которые энергично признать дрозофилы белков (например, рис. 4A). Однако большее количество глаз может потребоваться, если есть низкий выражение целевой протеина интереса. Если лизис ткани для последующего Западный blotting неполной (шаг 4.7), объем WTLB добавлен в образец может незначительно увеличился и объем буфера концентрированного образца соответственно скорректированы (шаг 4.9). Для извлечения РНК, быстрое рассечение значительное количество глаз может потребоваться если цель заключается в том, чтобы изолировать большое количество высококачественных РНК (шаг 5.2, смотрите Рисунок 4B). Этот потенциальный недостаток можно преодолеть, если два ученых, которые освоили дрозофилы куколки глаз рассечение взаимодействовать одновременно анализировать эти большое количество летать сетчатки. Однако, общее количество необходимых РНК будет зависеть от требований учреждение или объекта, выполняя анализ РНК, тип РНК анализа или последовательности и РНК добыча комплект, который используется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Zack барабан и наши рецензенты за полезные замечания по рукописи. Эта работа была поддержана R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
