Summary
Ce protocole décrit une procédure détaillée pour resuspendre et cultiver les neurones dérivés de cellules souches humaines qui étaient précédemment différenciés des progéniteurs neuronaux in vitro pendant plusieurs semaines. La procédure facilite les essais basés sur l'imagerie des neurites, des synapses et des marqueurs neuronaux à expression tardive dans un format compatible avec la microscopie légère et le dépistage à haute teneur.
Abstract
Les neurones différenciés en deux dimensions de cellules progénitrices neurales (PNJ) dérivées de cellules souches humaines représentent un système modèle puissant pour explorer les mécanismes de la maladie et effectuer un dépistage à haute teneur (HCS) pour interroger le composé bibliothèques ou identifier les phénotypes de mutation génétique. Cependant, avec les cellules humaines, la transition du PNJ au neurone fonctionnel et mature nécessite plusieurs semaines. Les synapses commencent généralement à se former après 3 semaines de différenciation dans la culture monocouche, et plusieurs protéines spécifiques aux neurones, par exemple le marqueur pan-neuronal exprimant plus tard NeuN, ou la couche 5/6 cérébrale marqueur de neurone cortical CTIP2, commencent à exprimer environ 4-5 semaines après la différiliation. Ce temps de différenciation prolongé peut être incompatible avec les conditions de culture optimales utilisées pour les plates-formes HCS à petit volume et multi-puits. Parmi les nombreux défis, il y a la nécessité de cellules bien respectées et distribuées uniformément avec un amas cellulaire minimal, et des procédures de culture qui favorisent la viabilité à long terme et la maturation des synapses fonctionnelles. Une approche consiste à différencier les neurones dans un format grand volume, puis les replaquer à un moment ultérieur dans hCS compatible multi-puits. Certains défis majeurs lors de l'utilisation de cette approche de replaquage concernent la reproductibilité et la viabilité cellulaire, en raison de la perturbation stressante du réseau dendritique et axonal. Ici nous démontrons une procédure détaillée et fiable pour enzymatiquement resuspendre les neurones de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) après leur différenciation pendant 4-8 semaines dans un format de grand volume, les transférant au microtiter de 384 puits plaques, et les cultiver pendant 1-3 semaines supplémentaires avec une excellente survie cellulaire. Ce replaquage des neurones humains permet non seulement l'étude de l'assemblage et de la maturation de synapse dans les deux semaines suivant le replaquage, mais permet également des études des caractéristiques de la régénération de neurite et du cône de croissance. Nous fournissons des exemples d'essais évolutifs pour la néuritogénèse et la synaptogénèse à l'aide d'une plate-forme de 384 puits.
Introduction
Les neurones dérivés des cellules souches pluripotentes humaines (hiPSC) sont de plus en plus pertinents dans les domaines de la recherche fondamentale, du développement de médicaments et de la médecine régénérative. Les workflows et les procédures pour optimiser leur culture et leur entretien, et améliorer l'efficacité de la différenciation en sous-types neuronaux spécifiques, évoluent rapidement1,2. Afin d'améliorer l'utilité et la rentabilité des neurones dérivés des cellules souches humaines en tant que systèmes modèles propices à des analyses à haute teneur en matière de découverte de médicaments et de validation de cibles, il est utile de réduire le temps de culture requis pour générer des neurones, tout en conservant la robustesse maximale, la reproductibilité, et la pertinence de phénotype. Bien que les cultures organoïdes tridimensionnelles soient à l'origine de percées dans la recherche sur le neurodéveloppement3, les cultures monocouches bidimensionnelles sont particulièrement compatibles avec les applications automatisées basées sur l'imagerie en raison de leur épaisseur minimale des tissus.
Cependant, l'adaptation des méthodes de dépistage basées sur l'imagerie aux modèles de maladies neurologiques et neurodéveloppementales humaines fait face à un défi majeur. Le délai prolongé sur lequel le système nerveux humain mûrit in vivo nécessite un temps prolongé dans la culture pour accueillir les programmes naturels d'expression génique et atteindre la maturation neuronale.
Une conséquence pratique du long programme de différenciation neuronale est que le maintien des cultures de monocouches dérivées de hiPSC doit être soutenu pendant de nombreuses semaines pour atteindre la maturité synapse adéquate. Pendant ce temps, les progéniteurs neuronaux qui restent indifférenciés continuent de se diviser. Ceux-ci peuvent rapidement dépasser la culture et usurper la teneur en nutriments nécessaires pour maintenir des neurones postmitotiques viables. La division vigoureuse des cellules progénitrices neurales (PNJ) peut également rivaliser avec les neurones pour le substrat de croissance. Cela peut rendre ces cultures sujettes à des problèmes de mauvaise adhérence, une condition impropre aux essais basés sur l'imagerie. En outre, beaucoup d'investigateurs constatent que plus le volume de culture est petit, plus la difficulté à maintenir des populations saines de neurones différenciés assez longtemps pour observer les derniers stades de la différenciation neuronale est grande. En d'autres termes, les essais de maturation des synapses à l'aide d'approches de dépistage à haute teneur (HCS) peuvent être très difficiles pour les neurones d'origine humaine.
Pour contourner certains de ces problèmes, une procédure de re-suspension et de replaquage des neurones dérivés de hiPSC précédemment différenciés a été utilisée. Tout d'abord, il permet l'étude de la croissance neurite (ou, plus exactement, la régénération neurite) dans une population de neurones pleinement engagés. Deuxièmement, le replaquage de neurones précédemment différenciés d'un format de grand volume (comme des plaques de 10 cm ou plus), jusqu'à de petits formats de volume (comme les plaques de microtiter 96 ou 384 puits compatibles Avec le HCS) permet une réduction significative du temps total de culture dans l'état du petit volume. Ceci facilite l'étude de l'assemblage et de la maturation de synapse au cours des semaines suivantes in vitro.
Cependant, le replaquage des neurones matures qui ont déjà établi de longues neurites et un réseau de connectivité complexe présente plusieurs défis, dont l'un est le taux parfois élevé et variable de la mort cellulaire. Ici, nous décrivons une procédure de replating qui a comme conséquence la survie et la reproductibilité excellentes de cellules. Généralement, les neurones sont exposés à des enzymes protéolytiques pendant de courtes périodes d'incubation (généralement de 3 à 10 minutes) afin de détacher les cellules du substrat avant la trituration. Ce bref temps de protéolyse est habituellement utilisé pour resuspendre et transmettre de nombreux types de cellules de division, y compris les cellules non neuronales et les progéniteurs indifférenciés4,5,6. Cependant, pour les neurones différenciés portant de longues néurites interconnectées, il est essentiel non seulement de détacher les cellules du substrat, mais aussi de perturber le réseau dendritique et axonal afin d'isoler les cellules individuelles tout en minimisant les dommages. En effet, un maillage épais de neurones tend généralement à se détacher du substrat comme une seule feuille, plutôt que comme des cellules individuelles. Si l'on ne fait pas attention à desserrer l'épais réseau de neurites, les neurones deviennent non seulement irrémédiablement endommagés pendant la trituration, mais beaucoup d'entre eux ne parviennent pas à passer à travers le filtre utilisé pour enlever les amas, ce qui entraîne un faible rendement cellulaire. Ci-dessous nous décrivons une modification simple à une procédure d'incubation de protéase largement utilisée pour contrer ces difficultés.
Dans le protocole décrit ci-dessous, les neurones sont incubés pendant 40-45 min avec une protéase douce, comme l'enzyme protéolytique (par exemple, Accutase). Pendant les 5-10 premières min après l'ajout de l'enzyme, le réseau neuronal se soulève du substrat comme une feuille. L'incubation avec la protéase se poursuit pendant 30-40 minutes supplémentaires avant de procéder à une trituration douce et au filtrage. Ce temps d'incubation supplémentaire permet de s'assurer que la digestion du matériau détend le réseau intercellulaire, assurant ainsi que la trituration ultérieure produit une suspension des cellules individuelles. Cette procédure maximise l'uniformité de la distribution cellulaire lors du replaquage tout en minimisant la mort cellulaire. Nous avons appliqué avec succès cette méthode de replaquage aux cultures neuronales hiPSC-dérivées générées par divers protocoles de différenciation7,8 et de diverses lignes de hiPSCs. La procédure est nominalement appropriée pour une utilisation avec la plupart ou toutes les lignes de neurones dérivés de cellules souches. Nous avons observé qu'un temps d'incubation prolongé du protéase n'est pas absolument essentiel pour replaquer les cultures à partir de plaques de petit format (p. ex., 35 mm de diamètre); cependant, comme nous le montrons ici, il offre un avantage significatif lors du replatage des plaques de grand diamètre (par exemple, 10 cm de diamètre ou plus), probablement parce que les neurites dans ces plaques peuvent prolonger les processus très longs et former un tableau densément interconnecté.
Ici, nous démontrons cette méthode et illustrent brièvement son application dans les essais pour la néuritogénèse précoce et pour la maturation de synapse, qui implique le regroupement des protéines pré- et postsynaptic le long des dendrites et des axones, suivis par leurs plus tard colocalisation sur les sites synaptiques. Les exemples mettent en évidence les avantages que ce protocole offre dans la préservation de la viabilité et de la reproductibilité cellulaires. Tout d'abord, il permet aux chercheurs d'étudier les premières étapes de la néuritogénèse humaine. Le cadre expérimental est similaire aux cultures primaires couramment utilisées des neurones corticaux ou hippocampiques de rongeurs, où les cellules sont extraites du cerveau foetal tardif ou postnatal précoce, dissociées par trituration après le traitement doux de protéase, et ont permis de initier des neurites ou régénérer les névrites qui ont été sectionnées dans la procédure9,10. Semblable à ces neurones primaires de rongeur, les neurones hiPSC-dérivés commencent à former ou régénérer leurs neurites dans les heures suivant le replaquage, permettant l'imagerie des cônes de croissance et de la morphologie neurite dans un environnement optimal pour l'imagerie spatiotemporal élevée avec moins de cellules indifférenciées. Nous avons observé que la croissance neurite est plus synchronisée par rapport aux retards variables et aux différents taux de croissance observés lorsque les neurones commencent à se différencier d'une population progénitrice. En outre, le replaquage permet d'évaluer les neurones exprimant des marqueurs de sous-type neuronaux qui apparaissent généralement plus tard dans le développement neuronal, tels que la couche corticale 5/6 facteur de transcription CTIP2 (Chicken ovalbumin upstream promoter transcription protéine d'interaction de facteur 2), ou le marqueur pan-neuronal NeuN11. Une caractéristique particulièrement utile de l'approche de replaquage est que la synaptogénèse se déroule dans un délai compatible avec HCS.
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Protocol
1. Période de différenciation avant le replaquage
- Différencier les neurones sur les plats de 10 cm, en utilisant un protocole de choix7,8 jusqu'à ce que les neurones ont formé un réseau épais avec leurs processus et d'exprimer non seulement les premiers marqueurs neuronaux tels que MAP2 ou TuJ1, mais aussi des marqueurs tardifs tels que NeuN.
-
Changez la moitié du milieu de choix tous les 4 jours pendant le processus de différenciation neuronale.
REMARQUE : Des changements moyens plus étendus ou plus fréquents diluent les facteurs trophiques essentiels, et pourraient défavoriser la maturation.- Pour les neurones WT126 dérivés d'iPSC, utiliser les supports de culture post-différenciation suivants : 5 mL 100x N2 supplément, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 lamininine g/mL, 200 'M acide ascorbique, 1 'M dibutyryl-cAMP et 10 mL SM1 pour 500 mL Dulbecco's Eagle's mélange d'éléments nutritifs F-12 (DMEM/F12). Peu à peu, en utilisant des changements semi-médias, remplacer par le milieu basal neural (Tableau des matériaux) et les mêmes suppléments.
- Pour les neurones VB WT dérivés de l'iPSC, utilisez le milieu de culture post-différenciation suivant : 500 ml de milieu basal neural (Table of Materials) et 500 mL DMEM/F12 avec 2 'g/mL laminin, 10 mL de supplément de glutamine ( Tableau desmatériaux), 0,75 mg/mL de bicarbonate de sodium, 5 mL d'acides aminés non essentiels,5 mL, 0,2 mM d'acide ascorbique, 10 ng/mL de BDNF, 20 mL 50x B27 et 10 mL de supplément N2 100x.
2. Enduit multipuits
- La veille du replatage, enrober de poly-L-ornithine (PLO). Dissoudre l'OLP dans de l'eau stérile pour faire une solution de stock (10 mg/mL). Entreposez ce stock à -20 oC. Diluer l'OLP 1:100 dans l'eau pour produire une concentration de 50 g/mL lors de l'enrobage du verre et du ratio 1:1 000 (10 g/mL) lors de l'enrobage du plastique.
- Appliquer le revêtement directement sur les plaques cibles. Utiliser le volume de revêtement approprié à la taille de la plaque (c.-à-d. pour une plaque de 24 puits appliquer 500 L de solution PLO par puits).
- Laisser les assiettes reposer dans l'obscurité toute la nuit à température ambiante.
- Récupérer les plaques enduites le jour du replaqué et les transférer dans une armoire de biosécurité stérile.
- Aspirez la solution PLO et rincez deux fois à l'eau stérile.
- Diluer lalaminin (1.15 mg/mL) dans la saline phosphate-tamponnée (PBS) à 1:400 dilution.
REMARQUE: Décongeler la laminine à 4 oC et ajouter rapidement au PBS pour éviter l'agrégation de lalaminine et de revêtement inégal. - Aspirez l'eau stérile et appliquez 500 l de revêtement de laminin sur des puits préalablement recouverts d'OLP.
- Placer les assiettes dans un incubateur de 37 oC pendant au moins 4 à 6 h. Utiliser des incubations plus longues, jusqu'à 16 h, pour les surfaces vitrées. Utilisez des temps d'incubation constants.
3. Replating Neurones différenciés
- Rincer la plaque des neurones différenciés avec PBS une fois doucement. Dispersez le PBS doucement le long de la paroi de la plaque, et non pas directement sur les cellules, pour éviter de les perturber.
- Aspirez doucement PBS, en prenant soin d'éviter de toucher les cellules directement, mais d'aspirer du bord du plat tout en le faisant basculer vers le chercheur.
- Appliquer au minimum 1 ml de l'enzyme protéolytique (tableaudes matériaux) par plaque de 10 cm et retourner les cellules à l'incubateur. Ajoutez des volumes légèrement plus élevés si la salle de culture tissulaire présente un taux d'évaporation élevé en raison d'une faible humidité.
- Incuber les cellules avec l'enzyme protéolytique pendant 40-45 min afin de les détacher de la plaque et de les détacher des autres neurones dans le réseau neuronal.
REMARQUE: Le moment à cette étape est crucial. L'étanchéité de la protéase trop tôt peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire après le replaquage. Le fabricant d'enzymes protéolytiques recommande que des températures bien inférieures à 37 oC soient utilisées avec des périodes d'incubation plus longues pour le passage des lignées cellulaires (p. ex., pendant la nuit à 4 oC). Cependant, la manipulation des neurones à 4 oC devrait être évitée, car ils montrent souvent une faible survie après une exposition au froid. Le fabricant affirme également qu'une incubation de 60 min avec l'enzyme à 37 oC conduit à son inactivation enzymatique. Cependant, dans l'expérience des auteurs, une incubation de 40-45 min de cultures neuronales dérivées de hiPSC à 37 oC est suffisante pour une dissociation efficace et une excellente survie neuronale lors du replatage. - Vérifier les neurones sur un microscope à contraste de phase pendant le temps d'incubation et permettre au traitement de la protéase de continuer jusqu'à ce que le réseau neuronal se détache complètement de la plaque et commence à se briser en petites feuilles en secouant brièvement la plaque sous le microscope.
- Désinguer l'activité de protéase en utilisant 5 ml de média DMEM frais par 1 ml de protéase dans la plaque de 10 cm pour arrêter la digestion. Triturate doucement les cellules contre la plaque 5-8 fois pour perturber le réseau, à l'aide de pipettes sérologiques. Veillez à ne pas appliquer trop de pression lors du triturating, car les neurones différenciés sont fragiles. N'utilisez pas une pointe P1000, car la fin est trop nette et étroite, et peut donc pure ou endommager les neurones.
- Appliquer la solution avec des cellules à travers une passoire cellulaire avec un maillage de 100 m de diamètre dans un tube conique frais de 50 ml goutte par goutte.
- Rincer la passoire avec 5 ml supplémentaires de supports DMEM frais, après que les cellules ont filtré à travers.
- Faire tourner les cellules dans la centrifugeuse de banc à 1 000 x g pendant 5 min.
- Retournez le tube conique dans l'armoire de biosécurité et aspirez la plupart des supports, en laissant environ 250 L pour s'assurer que les cellules retiennent l'humidité.
- Resuspendre délicatement les cellules dans 2 ml de média DMEM frais. Ne pas pipette la boulette contre le côté du tube. Au lieu de cela, inverser doucement conique 2-3 fois et passer les cellules à travers la fin d'un tuyaut sérologique de 5 ml pour les déloger.
- Appliquer 10 l de neurones en suspension sur le bord d'un hémocytomètre.
- Ajouter 8-10 l de trypan bleu à gouttelettede de cellules pour évaluer la viabilité cellulaire au cours de cette étape de suspension. Appliquer 10 ll de ce mélange sur l'hémocytomètre ou d'autres compteurs cellulaires automatiques. Évaluer comme viable les cellules qui sont phase lumineux et exclure le colorant bleu trypan.
- Déterminer la quantité de cellules viables/mL, et se préparer à diluer le contenu du tube conique en fonction de la densité cellulaire désirée.
- Plaque de 10 000 cellules par puits pour une plaque de 384 puits; plaque de 150 000 à 200 000 cellules par puits pour une plaque de 24 puits.
- Ajouter du DMEM frais au tube conique des cellules suspendues pour obtenir une dilution appropriée et ajouter des suppléments appropriés supplémentaires tels que B27 et/ou BDNF, selon les exigences de la lignée cellulaire spécifique.
- Inclinez doucement le tube conique pour mélanger 2-3 fois.
- Aspirez le revêtement de lamininin de la plaque de 24 puits, ou de la plaque multipuits de 384 puits à l'aide d'une tuyauterie de 16 canaux et rincez une fois avec PBS.
- Aspirez PBS à l'aide d'un P1000 pour la plaque de 24 puits, ou de la pipette à 16 canaux pour les plaques de 384 puits.
- Appliquer la solution cellulaire à chaque puits dans un mouvement de figure huit pour éviter l'agglutination. L'uniformité du placage peut également être optimisée à l'aide de dispositifs automatisés de manipulation liquide.
REMARQUE: L'ajout de lamininine aux médias à partir de 2-4 jours après le replaquage contribue également à maintenir une distribution homogène des cellules. - Répétez les étapes 3.19 et 3.20 pour chaque puits.
- Remettre la plaque dans l'incubateur fixé à37 oC et 5 % de CO 2.
- Après 2 jours, commencez à changer la moitié du médium tous les 4 jours à l'aide des supports de culture post-différenciation décrits à la section 1.2. Après le temps de maturation souhaité, fixer les cultures en utilisant 3,7% de formaldéhyde à 37 oC et les cellules de tache selon les exigences expérimentales.
4. Tests de viabilité cellulaire post-replaquage
- Ajoutez le reporter de mort cellulaire précoce (VivaFix : 0,5 L de la solution de stock de 50 L par 500 'L de culture par puits) après avoir brièvement vortexé la solution de stock.
- Imagedes vivantes et mortes cultivées sur des multipuits à fond de verre, après 20 min, sans aucune étape de lavage, puisque le colorant ne fluore qu'une seule fois à l'intérieur des cellules, ou fixer et co-tacher avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et/ou d'autres anticorps avant l'imagerie à l'aide d'un microscope confocal.
5. Immunostaining
- Fixer les cultures avec 3,7 % de formaldéhyde en PBS plus 120 mM de saccharose pendant 20 min à 37 oC.
- Rincer et perméabilizer avec 0,2 % de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante, puis bloquer pendant 30 min avec 2 % d'albumine de sérum bovin (BSA).
- Aspirez le BSA sans rincer et incuber pendant 1 h à température ambiante avec un anticorps anti-MAP2 lapin 1:1 000, un anticorps anti-3 de souris (TuJ1) 1:2 000, un anticorps anti-NeuN de poulet (1:100) et un anticorps anti-CTIP2 (1:500) ou avec une souris anti-PSD95 ( 1:200), lapin anti-synapsin 1 (1:200) et poulet anti-MAP2 anticorps pour la coloration synaptique.
- Rincer au PBS et incuber avec des anticorps secondaires conjugués par Alexa Fluor plus DAPI pendant 45 min à 37 oC.
- Enfin, lavez-vous deux fois avec du PBS avant l'imagerie.
6. Imagerie calcique
- Infecter les cellules cultivées avec AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) à 10 jours après le replaquage et l'image pour évaluer les transitoires spontanées de calcium à 3-4 semaines après le replaquage.
7. Acquisition et analyse d'images
REMARQUE: Pour plus de détails sur le système d'acquisition, veuillez consulter Calabrese et coll.12.
- Utilisez un module d'imagerie pour l'acquisition d'images manuelles ou automatisées, et un module logiciel d'analyse d'images, tel que CellProfiler13, pour des mesures morphométriques.
- Calculer la longueur moyenne des neurites positives TuJ1 et des dendrites positives MAP2 en mesurant la longueur totale par champ de vision divisé par le nombre de neurones (cellules positives DAPI et MAP2 ou TuJ1) dans le même champ.
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Representative Results
Le replaquage des neurones dérivés des hiPSCs qui ont été différenciés pendant plusieurs semaines offre plusieurs avantages. Cependant, le détachage et le replaquage des neurones différenciés qui ont de longs dendrites et axones interconnectés (Figure 1A) peuvent entraîner une fraction élevée de neurones irrémédiablement endommagés.
Comme décrit dans la section de protocole, nous avons employé l'incubation avec une enzyme protéolytique pour détacher les neurones du substrat. Typiquement, en raison de leur maillage épais de neurites (Figure 1A), les cellules ont tendance à se détacher tout à la fois comme une seule couche syncytiale, qui commence souvent à flotter dans le puits (Figure 1C). Cela se produit assez rapidement, et c'est peut-être pourquoi la plupart des laboratoires ont tendance à recueillir les cellules après seulement 5 min d'incubation avec leur enzyme protéolytique de choix, et de briser immédiatement la feuille de cellules par trituration (pipetting il de haut en bas). Cependant, cette manipulation mécanique semble entraîner un stress élevé pour les neurones. Nous croyons que le degré de stress peut être proportionnel à la zone couverte par le réseau neuronal, parce que nous constatons que les dommages apparents de l'incubation inadéquate de protéase est plus grand pour les plaques de 10 cm ou plus grandes que pour les plaques de 35 mm ou plus petites. Ainsi, contre-intuitif, nous avons constaté que la prolongation de l'incubation enzymatique à 40-45 min réduit la mort cellulaire au moment de la dissociation cellulaire (figure 1C) et permet une récupération plus efficace des cellules vivantes et saines qui émettent des processus au fil des heures jours après replaquage (Figure 1B). Vraisemblablement, le temps d'incubation prolongé avec une enzyme protéolytique douce permet la digestion partielle des protéines qui adhèrent fortement les cellules et leurs processus les uns aux autres et à la matrice extracellulaire. Cela permet au processus de résuspension de fonctionner efficacement pour séparer les cellules individuelles sans avoir besoin d'une trituration trop vigoureuse.
Pour quantifier l'efficacité de la procédure prolongée d'incubation enzymatique, nous avons évalué la viabilité des cellules en suspension immédiatement après la trituration à l'aide du bleu trypan (figure1C),et plus tard à 1, 3 et 7 jours après le replaqué à l'aide d'une cellule précoce marqueur de décès (Figure 2). Immédiatement après la trituration, la coloration bleue trypan a indiqué qu'il y avait une mortalité cellulaire sensiblement plus importante après une incubation de 5 min par rapport à une incubation de 45 min avec l'enzyme protéolytique (Figure 1C). Les deux lignes d'iPSC que nous avons employées pour illustrer cette observation ont été différenciées en neurones du stade d'ancêtre neural utilisant différents protocoles, et ont montré la sensibilité largement différente à la procédure de replaquage. Les cultures de la ligne WT126 différenciées en PNJ utilisant la « méthode de sélection des rosettes »7 étaient plus sensibles aux dommages que les cultures différenciées de la ligne CVB WT24 à l'aide d'une méthode de différenciation rapide8. Néanmoins, pour les deux lignées, le degré de mort cellulaire immédiate a été réduit d'environ deux fois en utilisant la procédure d'incubation enzymatique prolongée.
Après le replaquage, les cultures ont montré un doublement approximatif de la viabilité cellulaire au cours des jours suivants en utilisant la procédure d'incubation enzymatique prolongée, telle que déterminée par la densité des cellules DAPI-positives (figure2B, graphique sur la gauche). De plus, l'incubation prolongée d'enzymes a entraîné une diminution de la densité des cellules mortes ou mourantes détectées à l'aide d'un kit de viabilité de l'exclusion des colorants (figure2B, graphique à droite). La fraction de cellules mortes détectées à l'aide de l'essai de viabilité après 24 h après le replaquage était plus élevée que celle observée en utilisant le bleu trypan immédiatement après la trituration. Cela reflète probablement l'accumulation de cellules mortes et mourantes au cours de ces 24 premiers h, bien qu'il soit également possible que l'analyse de viabilité détecte plus délicatement la mort cellulaire que l'essai bleu trypan. Les cellules mortes ont continué d'être détectées pendant 1 à 7 jours après le replaquage (figure2B). La densité initiale de placage pour les deux groupes expérimentaux (5 min et 45 min) était identique et basée sur des comptes de cellules vivantes d'hémocytomètre de la suspension de cellule de poteau-trituration. Fait important, à tout moment après le replaquage, le nombre de cellules vivantes et saines a été approximativement doublé après l'incubation enzymatique de 45 min par rapport à l'incubation de 5 min. Ces observations ont été confirmées qualitativement à l'aide de la microscopie de contraste de phase pour surveiller la morphologie cellulaire à chaque étape : avant le replaquage, pendant le replaquage et après replaquage (figure1 et figure 2).
Un des avantages de replaquer les neurones dérivés de hiPSC après qu'ils ont été différenciation pendant plusieurs semaines, c'est que la plupart des cellules auront quitté le stade progéniteur et se sont engagés à un phénotype neuronal au moment du replaquage. La phase de transition de la différenciation neuronale des progéniteurs neuronaux se déroule sur plusieurs jours, avec un plus grand nombre de cellules exprimant progressivement des marqueurs neuronaux à un stade précoce, tels que la tubuline bêta-III (détectée par l'anticorps TuJ1) ou MAP2. L'expression génique évolue sur plusieurs semaines, aboutissant éventuellement à l'expression de marqueurs pan-neuronaux à un stade avancé, tels que le NeuN, ou de marqueurs spécifiques de type cellulaire pour les neurones corticaux tels que le CTIP2. Par conséquent, le replaquage des neurones précédemment différenciés hiPSC-dérivés permet d'étudier les événements neuronaux tôt et transitoires, tels que l'initiation de neurite, dans les sous-types identifiés des neurones. La figure 3 illustre la présence immédiate de marqueurs neuronaux précoces dans les cultures qui ont été replated après 4 semaines de pré-différenciation dans un plat de culture plus grande. Il est à noter que les neurones exprimant neuN et CTIP2 sont facilement identifiés dans les quelques jours suivant le replaquage (figure3). Les caractéristiques et le moment de la différenciation neuronale peuvent varier d'une lignée à l'autre. Pour la ligne WT 126 et les lignes CVB WT24 que nous décrivons ici, 85 à 12 % (n et 2) et 52 à 11 % (n - 5) des cellules, respectivement, ont exprimé l'immunoréactivité pour le marqueur TuJ1 de l'III-tubulin à 4 jours après le replatage à l'aide de la procédure d'incubation prolongée de la protéase. Pour les deux lignes, 30-40% des cellules, et 80-90% des neurones expriment également la couche 5/6 marqueur néocortical CTIP2. En plus d'améliorer la viabilité, le protocole de protéase prolongée a également modérément amélioré la croissance de neurite (longueur moyenne de neurite par neurone), comme indiqué dans la figure 4. Longueur totale de neurite (quantifiée à l'aide de l'anticorps Tuj1, qui tache à la fois les axones et les dendrites; Figure 4 B, graphique gauche) et la croissance des dendrites (quantifiées à l'aide de MAP2, qui ne tache que les dendrites; Figure 4 B, graphique central) ont été favorisés lors de l'utilisation de la procédure d'incubation de protéase prolongée. Notez que le graphique pour les comptes de cellules DAPI-positifs (DAPI) à la figure 2 est basé sur les mêmes échantillons d'image que le graphique de comptage cellulaire à la figure 4, mais dans la figure 2, ils ont été quantifiés à l'aide d'une méthode non automatisée assistée par le logiciel Fidji, tandis que dans la figure 4, ils ont été quantifiés à l'aide de la plate-forme logicielle automatisée d'analyse d'images CellProfiler. Ces deux approches d'analyse d'image ont donné des résultats similaires.
Le replaquage est utile non seulement pour étudier la croissance neurite, mais aussi pour étudier les synapses ou d'autres caractéristiques biologiques apparaissant plus tard des neurones. En effet, après seulement une semaine après le replaquage, nous observons des marqueurs pour de nombreuses protéines presynaptiques et postsynaptiques décorant les dendrites neuronales dans un modèle de ponctate (Figure 5A). Après 4 semaines, nous commençons également à détecter leur colocalisation, qui est un indicateur de la formation de synapses fonctionnelles (Figure 5A). De plus, l'activité électrique provenant de la dépolarisation spontanée et des courants synaptiquement entraînés est détectable à l'aide de l'imagerie calcique (figure5B) ou des réseaux multiélectrodes (MeA).
Figure 1 : Préservation supérieure de la viabilité neuronale après une incubation plus longue avec l'enzyme protéolytique pour la dissociation cellulaire. (A) Image de contraste de phase des neurones PNJ différenciés pendant 3 semaines. La région en boîte dans l'image de gauche est agrandie à droite. À ce stade, les neurones ont de longs processus, qui forment un maillage épais. Barres d'échelle de 80 m (gauche); 35 m (à droite). (B) Images sélectionnées de neurones dérivés de hiPSC à 1 et 5 jours après le replaquage. Barre d'échelle de 100 m . (C) Gauche : les cellules se détachent en une seule feuille quelques minutes après avoir commencé le traitement à la protéase. Barre d'échelle de 200 m. Droite : après trituration, les cellules sont comptées sur l'hémocytomètre avant le replaquage. Les graphiques montrent la quantification des cellules positives non viables, trypan-bleu après 5 min ou 45 min d'incubation avec l'enzyme protéolytique pour deux lignes différentes CVB WT24 (p 'lt; 0,0003, t-test non apparié) et WT 126 (p 'lt; 0,0001, t-test non apparié). Les valeurs représentent la moyenne de 4 répétitions individuelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Viabilité neuronale après plusieurs jours de post-replaquage. (A) Images de neurones dérivés du PNJ WT126 à 1 et 3 jours après le replaqué à l'aide de 5 min et 45 min d'incubation de protéase. Les cellules mourantes sont étiquetées avec le journaliste sensible de la mort cellulaire précoce. Des images brightfield correspondantes sont affichées sur la gauche. Certains débris cellulaires (flèche bleue) sont généralement détectés après replaquage, en particulier dans le groupe de 5 min. Barres d'échelle de 150 m . (B) Images de cultures dérivées du PNJ CVB WT24 à 1, 3 et 7 jours après le replaqué à l'aide de 5 min et 45 min d'incubation de protéase. Les cellules mourantes sont étiquetées avec le journaliste sensible de la mort cellulaire précoce (rouge). Tous les noyaux de cellules vivantes et mourantes sont étiquetés avec DAPI (cyan). Le signal blanc fusionné représente les cellules DAPI et VivaFix-positives. Quelques cellules affichent la coloration VivaFix mais n'ont pas de coloration DAPI (cellules rouges dans l'image combinée à droite); ce sont probablement des cellules qui étaient mortes pendant de nombreuses heures. Barres d'échelle : 25 m. Le graphique de droite montre la quantification de la fraction des cellules mortes (VivaFix/DAPI) après un temps d'incubation différent avec l'enzyme protéolytique (5 min contre 45 min : p 'lt; 0.05 1 d et 'p 'lt; 0.001, 3 d; bidirectional ANOVA, suivi d'un test post hoc multicomparable de Bonferroni). Le graphique de gauche montre les changements dans la densité globale des cellules (DAPI) pendant 5 min vs 45 min : p 'lt; 0.0001 pour tous les points de temps; ANOVA bidirectionnel, suivi d'un test post hoc Bonferroni multicomparatif). Toutes les valeurs sont indiquées comme la moyenne de 3 répliques de S.E.M, avec un minimum de 1 500 cellules notées par condition. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Expression détectable des marqueurs neuronauxà un stade avancé immédiatement après le replaquage. Cultures de cellules dérivées de CVB WT24 hiPSC représentées 4 jours après le replaquage, à l'aide d'incubation de 45 min de protéase, à partir d'un plat de 10 cm qui avait été différencié du stade PNJ pendant 4 semaines. Des exemples montrés ont été souillés pour les marqueurs pan-neuronaux TuJ1, MAP2, ou NeuN ; ou le marqueur pyramidal de neurone pyramidal de couche profonde CTIP2. Notez la présence de nombreuses neurites, et l'expression robuste de TuJ1 et MAP2. Notez en particulier qu'une fraction substantielle des neurones exprime également des marqueurs de stade avancé NeuN et CTIP2. Barre d'échelle de 16 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Croissance de neurite et de dendrite au fil du temps après une incubation enzymatique plus courte et plus longue pendant le replaqué. (A) Les neurones dérivés de CVB WT24 hiPSC extensiblent rapidement les neurites, tels que détectés à l'aide d'anticorps Tuj1. Notez que le temps d'incubation prolongé de protéase favorise la neuritogenesis. Barre à l'échelle de 25 m. (B) Quantification de la longueur neurite et dendrite, plus de 1, 3 et 7 jours après le replaqué à l'aide de 5 min ou 45 min de protéase. La longueur totale de neurite a été quantifiée à partir de la coloration tuJ1 (III-tubuline); La coloration dendrite-spécifique a été quantifiée du snf de coloration de MAP2 corrigé pour la densité globale de cellules (graphique droit). Toutes les valeurs sont affichées sous la forme d'une moyenne de 3 répliques. Longueur de neurite 5 min vs 45 min : p 'lt; 0.05 à 1 jour et 7 jours, 'p 'lt; 0.01 à 3 jours ; longueur dendrite 5 min vs 45 min: 'p 'lt; 0.01 à 1 jour et 3 jours, non significatif (ns) à 7 jours; DAPI(MD) 5 min vs 45 min: 'p 'lt; 0.0001 pour tous les points de temps; aNOVA bidirectionnelle, suivi d'un test post hoc Bonferroni multicompara. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Synaptogenesis et transitoires spontanés de calcium dans les neurones hiPSC-dérivés différenciés après replaquage. (A) Gauche : à 4 semaines après le replatage à l'aide du protocole d'incubation de protéase prolongée, la synapse marqueur présynaptique 1 est détectable dans les amas de ponctate le long des dendrites positives MAP2. Barres d'échelle de 5 m. Droite : région dendritique sélectionnée montrant la colocalisation entre les amas presynaptiques et les amas postsynaptiques (flèche jaune), une indication de synapses potentiellement actives. Des barres d'échelle de 1,5 m . (B) Gauche : les neurones dérivés de l'hiPSC infectés par AAV8-syn-jGCaMP7f-WPRE ont été utilisés pour surveiller les transitoires spontanés de calcium entraînés par l'activité du réseau. L'image brightfield est montrée à côté du rendu pseudocolor de la fluorescence GCaMP7 à un seul moment dans la série time-lapse. Barre d'échelle de 25 m. Les nombres colorés indiquent les 4 cellules sélectionnées dans lesquelles la fluorescence de GCaMP7 a été mesurée au fil du temps, comme le montrent les traces de droite. Chaque trace colorée correspond à une cellule. L'astérisque indique l'heure de l'enregistrement en direct à laquelle correspond l'image de gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Flux de travail des procédures de replatage vers les hiPSC de culture pour le dépistage à haute teneur et/ou des études détaillées de différenciation et d'excroissance neurite ou d'enregistrements MEA. Partant d'une culture différenciée de neurones cultivés pendant 4 semaines ou plus dans un format plus grand (par exemple, un plat de culture de 10 cm), les neurones sont incubés avec une protéase pendant 40-45 min, triturés doucement pour dissocier et resuspendre. Les cellules sont ensuite réparties en multi-puits compatibles avec le HCS, replaquées sur des substrats compatibles avec des cônes de croissance d'imagerie (flèche jaune) ou d'autres structures, ou sur des multi-puits adaptés aux enregistrements multiélectrodes. Barres d'échelle de 27 m, 5 m, 2,5 m, 130 m (de gauche à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous avons démontré une procédure directe pour la resuspension et le replaquage des cultures neuronales humaines qui optimise la viabilité, le succès de différenciation, et l'imagerie subcellulaire d'une manière qui est compatible avec les plates-formes de criblage à haute teneur, et d'autres essais pertinents à la découverte de médicaments. La figure 6 illustre le flux de travail global et les exemples de ces applications.
Bien qu'ici nous nous sommes concentrés sur les neurones dérivés de hiPSC qui sont dirigés vers un destin de neurone cortical, nous nous attendons à ce que cette méthode devrait être également applicable aux neurones embryonnaires humains dérivés de cellules souches, et aux neurones dérivés de cellules souches dirigés vers d'autres phénotypes neuronaux14,15,16,17,18. En outre, nous postulons que cette procédure de protéase prolongée pourrait être bénéfique pour d'autres situations qui nécessitent la suspension des cellules ayant un maillage neurite établi, par exemple pour le tri FACS ou des analyses unicellulaires des neurones primaires19 , 20.
Replating hiPSC-dérivé neurones fournit un système modèle viable dans lequel étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de nombreux événements biologiques clés. Par exemple, cette procédure peut faciliter des études détaillées des caractéristiques de la croissance et du cône de croissance des neurites humaines, et la comparaison des résultats à la vaste base de connaissances construite à partir de décennies d'étude d'autres espèces, à la fois vertébrées et invertébrés. Nous constatons que la procédure de replatage a rendu plus facile d'optimiser les conditions pour générer de plus grands cônes de croissance qui sont bien adaptés pour l'évaluation optique de la structure et de la fonction sous-cellulaires (Figure 6). En comparaison, les cônes de croissance plus généralement observés lors de la différenciation initiale des neurones des hiPSCont ont tendance à être petits et compacts, et le réseau dense de cellules non neuronales dans ces cultures rend difficile à la fois d'ajuster les conditions du substrat à promouvoir la propagation du cône de croissance et d'imager les cônes de croissance individuels dans l'environnement tissulaire complexe. Ainsi, le replating neurones sur un plat frais fournit une « ardoise plus propre » sur laquelle voir les cônes de croissance dans de bonnes conditions d'imagerie.
Le replaquage est particulièrement avantageux lorsque l'on utilise des plateformes de culture cellulaire adaptées au SCH, car il réduit considérablement le temps total pendant lequel les cultures sont cultivées en petits volumes. Les petits volumes de travail des puits individuels de 96, 384 ou 1536 puits multipuits (environ 100, 50 et 5 microlitres de volume de travail, respectivement) nécessitent généralement des changements fréquents (c.-à-d. quotidiens) des médias pour contrer l'évaporation et l'épuisement des nutriments. Les changements fréquents des médias sont coûteux, non seulement en termes de réactifs et de main-d'œuvre, mais ils peuvent compromettre la viabilité des cultures en diluant les médias conditionnés et en augmentant les chances que les cellules se détachent du substrat en raison de turbulences mécaniques. Le replaquage des hiPSC peut également faciliter l'enregistrement de l'activité physiologique à l'aide de réseaux multiélectrodes21,22, ou l'imagerie en direct des cultures dans les essais de phénotypes neuronaux dynamiques23.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail est une composante des National Cooperative Reprogrammed Cell Research Groups (NCRCRG) pour étudier la maladie mentale et a été soutenu par la subvention des NIH U19MH1 2015-0644. Les travaux initiaux ont également été soutenus par la subvention des NIH NS070297. Nous remercions les Drs Carol Marchetto et Fred Gage, de l'Institut Salk, d'avoir fourni la ligne WT 126 de cellules progénitrices neurales, et les Drs Eugene Yeo et Lawrence Goldstein, UC San Diego, d'avoir fourni la gamme DE cellules progénitrices neurales CVB WT24. Nous remercions Deborah Pre dans le laboratoire de la Dre Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, pour des discussions utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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