Summary
Этот протокол описывает детальную процедуру для resuspending и culturing людские нейроны stem клетки выведенные которые ранее были продифференцированы от нервных прародителей in vitro на множественные недели. Процедура облегчает анализы нейритов, синапсов и поздневых нейронных маркеров на основе изображений в формате, совместимом со световой микроскопией и скринингом с высоким содержанием.
Abstract
Нейроны, отличаемые в двухмерной культуре от человеческих плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронными клетками-прародителями (NPC), представляют собой мощную модельную систему для изучения механизмов заболевания и проведения скрининга высокого содержания (HCS) для допроса соединения библиотек или определить фенотипы генных мутаций. Однако, с человеческими клетками переход от NPC к функциональному, возмужалым нейрону требует нескольких неделей. Синапсы обычно начинают формироваться после 3 недель дифференциации в монослойной культуре, и несколько нейронных белков, например, более поздний экспресс-нейрональный маркер NeuN, или слой 5/6 церереального коркового нейронного маркера CTIP2, начинают выражать около 4-5 недель после дифференциации. Это длительное время дифференциации может быть несовместимо с оптимальными условиями культуры, используемыми для небольших, многофункциональных платформ HCS. К числу многих проблем относятся потребность в хорошо совмещенной, равномерно распределенной ячейке с минимальной кластеризацией клеток и культурных процедурах, способствующих долгосрочной жизнеспособности и функциональному созреванию синапсов. Один из подходов заключается в дифференцировании нейронов в формате большого объема, а затем перенабчить их на более позднем этапе в HCS-совместимых мультискважин. Некоторые основные проблемы при использовании этого реплатингового подхода касаются воспроизводимости и жизнеспособности клеток из-за стрессовых нарушений дендритной и аксональной сети. Здесь мы демонстрируем детальную и надежную процедуру ферментативной перезагрузки антропогенных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) полученных нейронов после их дифференциации в течение 4-8 недель в крупнообъемном формате, передавая их 384-колодствующим микротитеру пластины, и культивирование их в течение еще 1-3 недель с отличным выживанием клеток. Это replating человеческих нейронов не только позволяет изучение синапса сборки и созревания в течение двух недель с момента повторного, но и позволяет исследования регенерации нейрита и роста конуса характеристики. Мы приведомляем примеры масштабируемых анализов на неуритогенез и синаптогенез с помощью платформы 384 колодца.
Introduction
Нейроны, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC), становятся все более актуальными в области фундаментальных исследований, разработки лекарственных средств и регенеративной медицины. Рабочие процессы и процедуры для оптимизации их культуры и обслуживания, а также повышения эффективности дифференциации в конкретные нейрональные подтипы, быстро развиваются1,2. Для повышения полезности и рентабельности нейронов, полученных из стволовых клеток человека, в качестве модельных систем, поддающихся анализу высокого содержания при обнаружении лекарственных средств и проверке целей, полезно уменьшить время культивирования, необходимое для создания зрелых, функциональных нейронов, сохраняя при этом максимальную прочность, воспроизводимость и релевантность фенотипа. Хотя трехмерные органоидные культуры являются движущей прорывв в исследовании нейроразвития3, 2-мерные монослойные культуры особенно совместимы с автоматизированными приложениями на основе изображений из-за их минимальной толщины тканей.
Однако адаптация методов скрининга на основе изображений к моделям неврологических и нейроразвития человека сталкивается с серьезной проблемой. Затяжные временные рамки, в течение которых нервная система человека созревает in vivo, требуют длительного времени в культуре для размещения естественных программ экспрессии генов и достижения нейронального созревания.
Одним из практических последствий длительной программы дифференциации нейронов является то, что поддержание hiPSC полученных монослойных культур должны быть устойчивыми в течение многих недель для достижения адекватной зрелости синапса. В течение этого времени, нейронные прародители, которые остаются недифференцированными продолжают делиться. Они могут быстро перерасти культуры и узурпировать содержание питательных веществ, необходимых для поддержания жизнеспособных постмитотических нейронов. Активно едить нервные клетки-прародители (NPC) также могут конкурировать с нейронами для роста субстрата. Это может сделать такие культуры подвержены проблемам плохой адгезии, состояние, неподходящее для анализов на основе изображений. Кроме того, многие исследователи считают, что чем меньше объем культуры, тем больше трудностей в поддержании здоровой популяции дифференцированных нейронов достаточно долго, чтобы наблюдать поздние стадии дифференциации нейронов. Другими словами, анализы созревания синапса с использованием подходов скрининга высокого содержания (HCS) могут быть очень сложными для нейронов, полученных человеком.
Чтобы обойти некоторые из этих проблем, была использована процедура повторного приостановки и повторного использования ранее дифференцированных нейронов, полученных от hiPSC. Во-первых, это позволяет изучать невритный рост (или, точнее, регенерацию неврита) в популяции полностью приверженных нейронов. Во-вторых, повторное переделывание ранее дифференцированных нейронов из большого формата громкости (например, 10 см пластин или больше), вплоть до небольших форматов громкости (например, HCS-совместимых 96- или 384-пузырчатого микротитерных пластин) позволяет значительно сократить общее время культивирования в небольшое состояние объема. Это облегчает изучение синапса сборки и созревания в течение последующих недель в пробирке.
Тем не менее, повторное переплетение зрелых нейронов, которые уже создали длинные невриты и сложную сеть подключения представляет собой несколько проблем, одна из которых иногда высокая и переменная скорость клеточной смерти. Здесь мы описываем процедуру повторного отреплирования, которая приводит к отличной выживаемости клеток и воспроизводимости. Как правило, нейроны подвергаются воздействию протеолитических ферментов в течение коротких инкубационных периодов (обычно 3-10 мин) для того, чтобы отделить клетки от субстрата до тритурации. Это краткое время протеолиза обычно используется для повторного приостановки и прохождения многих типов деления клеток, в том числе ненейрональных клеток и недифференцированных прародителей4,5,6. Однако для дифференцированных нейронов, несущих длинные, взаимосвязанные невриты, важно не только отделить клетки от субстрата, но и нарушить дендритную и аксональную сеть, чтобы изолировать отдельные клетки при минимизации повреждений. Действительно, толстая сетка нейронов обычно имеет тенденцию отделяться от субстрата как единый лист, а не как отдельные клетки. Если не принимать меры по ослаблению толстой сети нейритов, нейроны не только становятся необратимо поврежденными во время тритурации, но многие из них не проходят через фильтр, используемый для удаления комков, что приводит к плохой урожайности клеток. Ниже мы описываем простую модификацию широко используемой процедуры инкубации протеазы для борьбы с этими трудностями.
В описанном ниже протоколе нейроны инкубируются в течение 40-45 мин с легкой протеазой, например, протеолитическим ферментом (например, Accutase). В течение первых 5-10 минут после добавления фермента, нейронная сеть взлетает из субстрата в виде листа. Инкубация с протеаза продолжается еще 30-40 минут, прежде чем приступить к мягкой трикуляции и фильтрации. Это дополнительное время инкубации помогает гарантировать, что переваривание материала расслабляет межклеточной сети, тем самым гарантируя, что последующее тритурирование производит приостановление отдельных клеток. Эта процедура максимизирует единообразие распределения клеток при повторном окупаемости при минимизации клеточной смерти. Мы успешно применили этот метод повторного отправления к hiPSC полученных нейронных культур, порожденных различными протоколами дифференциации7,8 и из различных линий hiPSCs. Процедура номинально подходит для использования с большинством или всеми линиями стволовых клеток, полученных нейронов. Мы заметили, что продолжительное время инкубации протеазы не является абсолютно необходимым для перекалибровки культур из плит малого формата (например, диаметр 35 мм); однако, как мы показываем здесь, оно обеспечивает значительно преимущество от replating от плит большого диаметра (например, диаметр 10 сантиметров или большле), вероятно потому что neurites в таких плитах могут удлинить очень длинние процессы и сформировать плотно взаимосвязанный блок.
Здесь мы демонстрируем этот метод и кратко иллюстрируем его применение в анализах для раннего неуритогенеза и для созревания синапсов, который включает в себя кластеризацию до- и постсинаптических белков вдоль дендритов и аксонов, а затем их более поздние колокализация на синаптических сайтах. Примеры подчеркивают преимущества, которые дает этот протокол в сохранении жизнеспособности и воспроизводимости клеток. Во-первых, это позволяет следователям изучить ранние шаги в неуритогенез человека. Экспериментальная обстановка похожа на широко используемые первичные культуры корковых или гиппокампальных нейронов, где клетки извлекаются из позднего плода или раннего послеродового мозга, разобщены тритурой после мягкого лечения протеазы, и разрешено инициировать невриты или регенерировать невриты, которые были разорваны в процедуре9,10. Подобно таким первичным нейронам грызунов, нейроны, полученные из hiPSC, начинают формировать или регенерировать свои невриты в течение нескольких часов после повторного тестирования, что позволяет создавать конусы роста и морфологию нейритов в среде, оптимальной для высокой пространствентемпоральной визуализации с меньшим количеством окружающих недифференцированных клеток. Мы заметили, что неврит ный рост более синхронизирован по сравнению с переменной задержки и различные темпы роста видели, когда нейроны впервые начинают дифференцировать сяочку от популяции прародителей. Кроме того, переплатывание позволяет анализы нейронов, выражающих нейронные маркеры подтипа, которые обычно появляются позже в нервном развитии, такие как корковый слой 5/6 транскрипционный фактор CTIP2 (Куриный овальбумин вверх по течению промотор транскрипции взаимодействующий с фактором белок 2), или паннейрональный маркер NeuN11. Особенно полезной особенностью подхода replating является то, что синаптогенез протекает в сроки, совместимые с HCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Период дифференциации до переплатывания
- Дифференцируйте нейроны на 10 см блюд, используя протокол выбора7,8, пока нейроны сформировали толстую сеть с их процессами и выразить не только ранние нейронные маркеры, такие как MAP2 или TuJ1, но и поздние маркеры, такие как NeuN.
-
Изменение половины среды выбора каждые 4 дня в процессе дифференциации нейронов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более обширные или частые средние изменения разбавляют существенные трофические факторы, и могут не благоволить к созреванию.- Для нейронов WT126, полученных iPSC, использовать следующие пост-дифференциации культивирования средств массовой информации: 5 мл 100x N2 дополнения, 10 нг/мЛ BDNF, 10 нг/мл GDNF, 1 мкг /мл ламин, 200 мкм аскорбиновой кислоты, 1 мкм дибутирил-CAMP и 10 мл SM1 для 500 мл Dulbeco питательная смесь F-12 (DMEM/F12). Постепенно, используя полумедийные изменения, заменяйте нейронную базальную среду(Таблицаматериалов) и те же добавки.
- Для iPSC полученных CVB WT нейронов, используйте следующие пост-дифференциации культивирования среды: 500 мл нервного базального A medium(Таблица материалов) и 500 мл DMEM/F12 среды с 2 мкг /мл ламинина, 10 мл глутамина добавок (Таблица материалов, 0,75 мг/мл бикарбоната натрия, 5 мл минимальной незаменимой среды (МЭМ) несущественные аминокислоты, 0,2 мм аскорбиновой кислоты, 10 нг/мл BDNF, 20 мл 50x B27 и 10 мл 100x N2 добавка.
2. Покрытие Multiwells
- За день до переплатывания, пальто с поли-L-орнитином (PLO). Растворите ООП в стерильной воде, чтобы сделать бульонный раствор (10 мг/мл). Храните этот запас при -20 градусах по Цельсию. Разбавить ООП 1:100 в воде, чтобы дать концентрацию 50 мкг/мл при покрытии стекла и 1:1,000 соотношение (10 мкг/мл) при покрытии пластика.
- Нанесите покрытие непосредственно на целевые пластины. Используйте объем покрытия, соответствующий размеру пластины (т.е. для 24-хорошо пластины, нанесите 500 л раствора ООП на скважину).
- Разрешить пластины сидеть в темноте на ночь при комнатной температуре.
- Извлеките пластины с покрытием в день повторного покрытия и перенесите в стерильный шкаф для биобезопасности.
- Придумать раствор ООП и дважды промыть стерильной водой.
- Разбавить ламинин (1,15 мг/мл) в фосфатно-буферном сольном (PBS) в 1:400 разбавления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оттойте ламинин при 4 градусах Цельсия и быстро добавьте в PBS, чтобы избежать агрегации ламинина и неравномерного покрытия. - Аспирируйте стерильную воду и наносите 500 л ламинина на скважины, ранее покрытые ООП.
- Поместите пластины в инкубатор 37 градусов по Цельсию минимум на 4-6 ч. Используйте более длинные инкубации, до 16 ч, для стеклянных поверхностей. Используйте последовательное время инкубации.
3. Переплата дифференцированных нейронов
- Промыть пластину дифференцированных нейронов с PBS раз мягко. Разогнать PBS мягко вниз по стене пластины, а не непосредственно на клетки, чтобы избежать их нарушения.
- Аккуратно аспирировать PBS, стараясь избежать прикосновения к клеткам непосредственно, но аспирировать от края блюда в то время как опрокидывания его к исследователю.
- Нанесите при минимум 1 мл протеолитического фермента(таблицаматериалов) на тарелку 10 см и верните клетки в инкубатор. Добавьте немного большие объемы, если в комнате культуры тканей высокая скорость испарения из-за низкой влажности.
- Инкубировать клетки протеолитическим ферментом в течение 40-45 мин, чтобы отделить их от пластины и отделить их от других нейронов в нейронной сети.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки на этом этапе имеет решающее значение. Утоления протеазы слишком рано может привести к увеличению смерти клеток после повторного. Производитель протеолитических ферментов рекомендует использовать температуры значительно ниже 37 градусов по Цельсию при более длительных инкубационных периодах для прохождения клеточных линий (например, на ночь при температуре 4 градусов По Цельсию). Тем не менее, обработки нейронов при 4 градусах Цельсия следует избегать, так как они часто показывают плохое выживание после холодного воздействия. Производитель также утверждает, что инкубация 60 мин с ферментом при 37 градусах Цельсия приводит к его ферментатической инактивации. Однако, по опыту авторов, 40-45 мин инкубации hiPSC полученных нейронных культур при 37 градусах Цельсия достаточно для эффективной диссоциации и отличного выживания нейронов при повторном оцепенении. - Проверьте нейроны на фазово-контрастном микроскопе во время инкубационного времени и позвольте лечению протеазы продолжаться до тех пор, пока нейронная сеть полностью не отсоединяется от пластины и не начнет распадаться на мелкие листы при кратком встряхивании пластины под Микроскоп.
- Утолить протеазу с помощью 5 мл свежих DMEM-носителей на 1 мл протеазы в 10 см пластины, чтобы остановить пищеварение. Аккуратно тритурировать клетки против пластины 5-8 раз, чтобы нарушить сеть, используя серологические пипетки. Будьте осторожны, чтобы не применять слишком большое давление при тритурации, как дифференцированные нейроны являются хрупкими. Не используйте наконечник P1000, так как конец слишком острый и узкий, и, таким образом, может просто или повредить нейроны.
- Применить раствор с клетками через клеточный ситечко с сеткой диаметром 100 мкм в свежем 50 мл конической трубки капля за каплей.
- Промыть ситечко с дополнительным5 мл свежих средств DMEM, после того, как клетки фильтруются до конца.
- Спиновые клетки в центрифуге скамейки при 1000 х г в течение 5 мин.
- Вернуть коническую трубку в шкаф биобезопасности и аспирировать большинство носителей, оставляя около 250 л, чтобы обеспечить клетки удерживают влагу.
- Аккуратно приостанавливайте клетки в 2 мл свежих dMEM-носителей. Не пипетка гранулы против стороны трубки. Вместо этого, аккуратно инвертировать конические 2-3 раза и пройти клетки через конец 5 мл серологического пайпе, чтобы выбить их.
- Нанесите 10 л перепровиваемых нейронов на край гемоситометра.
- Добавьте 8-10 л трипан-голубого в каплю клеток для оценки жизнеспособности клеток во время этого шага повторного действия. Нанесите 10 кЛ этой смеси на гемоситометр или другие автоматические счетчики клеток. Оцените как жизнеспособные те клетки, которые являются фазой яркие и исключить трипан синий краситель.
- Определить количество жизнеспособных клеток / мл, и подготовить, чтобы разбавить содержимое конической трубки в соответствии с желаемой плотностью клеток.
- Плита 10 000 клеток на скважину для 384-хорошо йлевой пластины; пластина 150 000-200 000 клеток на скважину для 24-хорошей пластины.
- Добавьте свежий DMEM в коническую трубку перепровилотых клеток для достижения соответствующего разбавления и добавьте дополнительные соответствующие добавки, такие как B27 и/или BDNF, в зависимости от требований конкретной клеточной линии.
- Аккуратно наклоните коническую трубку, чтобы перемешать 2-3 раза.
- Аспирла ламинина покрытие из 24-хорошо пластины, или из 384-хорошо многовелл пластины с помощью 16-канальный пипетка и промыть один раз с PBS.
- Аспир PBS с помощью P1000 для 24-колодец пластины, или 16-канальный пипетка для 384-колодец пластин.
- Применить клеточное решение для каждого хорошо в цифре восемь движения, чтобы избежать слипания. Равномерность покрытия также может быть оптимизирована с помощью автоматизированных устройств обработки жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ламинина в средствах массовой информации, начиная 2-4 дней после повторного повторного также помогает поддерживать однородное распределение клеток. - Повторите шаги 3.19 и 3.20 для каждой скважины.
- Вернуть пластину в инкубатор, установленный при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
- После 2 дней, начать менять половину среды каждые 4 дня с помощью пост-дифференциации культивирования средств массовой информации, описанные в разделе 1.2. После желаемого времени созревания, исправить культур, используя 3,7% формальдегида при 37 градусов по Цельсию и пятна клеток в соответствии с экспериментальными требованиями.
4. Сотовый Жизнеспособность Анализы после повторного
- Добавьте репортера ранней смерти клеток (VivaFix: 0,5 л из 50-Л стежка на 500 л культурных носителей на скважину) после краткого вихря акционерного раствора.
- Изображение живых и мертвых клеток культивируется на стеклянно-дно multiwells, после 20 мин, без каких-либо стирки шаг, так как краситель флуоресцтолько только один раз внутри клеток, или исправить и совместно пятно с 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и / или другие антитела до изображения изображения с помощью конфокального микроскопа.
5. Иммуностогирование
- Исправьте культуры с 3,7% формальдегида в PBS плюс 120 мм сахарозы в течение 20 мин при 37 градусах Цельсия.
- Промыть и пронизовать 0,2% Triton X-100 в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем блокировать в течение 30 мин с 2% бычьей сыворотки альбумина (BSA).
- Аспирировать BSA без промывки и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре с кроликом анти-MAP2 антитела 1:1000, мышь анти-3 тубулин (TuJ1) антитела 1:2,000, курица анти-NeuN антитела (1:100) и крысы анти-CTIP2 антитела (1:500), или с мышью анти-PS9 ( 1:200), кролик анти-синапсин 1 (1:200) и курица анти-MAP2 антитела для синаптической окрашивания.
- Промыть pbS и инкубировать с Alexa Fluor-конъюгированных вторичных антител плюс DAPI в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия.
- Наконец, мыть дважды с PBS до изображения.
6. Изображение кальция
- Заразить культивированные клетки AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (Институт биологических исследований Salk, GT3 Core Facility) в течение 10 дней после переплатывания и изображения для оценки спонтанных переходных кальция в 3-4 недели после переплатывания.
7. Приобретение и анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о системе приобретения, пожалуйста, обратитесь к Calabrese et al.12.
- Используйте модуль визуализации для ручного или автоматизированного получения изображений, а также модуль программного обеспечения для анализа изображений, такой как CellProfiler13,для морфометрических измерений.
- Рассчитайте среднюю длину положительных невритов TuJ1 и положительных дендритов MAP2, измеряя общую длину на поле зрения, разделенную на количество нейронов (DAPI и MAP2 или TuJ1 срабатываний) в одном поле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Replating hiPSCs-производных нейронов, которые были дифференцированы в течение нескольких недель предлагает несколько преимуществ. Однако, отсоединение и повторное дифференцированное нейроны, которые имеют длинные, взаимосвязанные дендриты и аксоны(Рисунок 1А) может привести к высокой доле необратимо поврежденных нейронов.
Как описано в разделе протокола, мы использовали инкубацию с протеолитическим ферментом, чтобы отделить нейроны от субстрата. Как правило, из-за их толстой сетки нейритов(рисунок 1А), клетки, как правило, отделить все сразу, как единый синцитиальный слой, который часто начинает плавать в колодце (Рисунок1C). Это происходит довольно быстро, и, возможно, поэтому большинство лабораторий, как правило, собирают клетки после всего лишь 5 минут инкубации с их протеолитическим ферментом выбора, и сразу же разбить лист клеток трикуляции (пиптирование его вверх и вниз). Тем не менее, это механическое манипулирование, как представляется, приводит к высокому стрессу для нейронов. Мы считаем, что степень стресса может быть пропорциональной области, охватываемой нейронной сети, потому что мы находим, что видимый ущерб от недостаточного инкубации протеазы больше на 10 см или больше пластин, чем для 35 мм или меньше пластин. Таким образом, нелогично, мы обнаружили, что продление ферментативной инкубации до 40-45 мин снижает клеточную смертность во время диссоциации клеток(рисунок 1С) и позволяет более эффективное восстановление живых, здоровых клеток, которые излучают процессы в течение нескольких часов в дни после повторного отплатывания(рисунок 1B). Предположительно, расширенное время инкубации с мягким протеолитическим ферментом позволяет частично переварить белки, которые прочно прилипают клетки и их процессы друг к другу и к внеклеточной матрице. Это позволяет процессу повторного действия эффективно работать, чтобы отделить отдельные ячейки без необходимости чрезмерно энергичной тритурации.
Для количественной оценки эффективности расширенной процедуры инкубации ферментов, мы оценили жизнеспособность взвешенных клеток сразу после трихаринации с помощью трипан синий (Рисунок 1C), а затем на 1, 3 и 7 дней после повторного использования ранней клетки маркер смерти(рисунок 2). Сразу же после тритурации, trypan синий окрашивание указал, что было значительно больше клеточной смерти после 5 мин инкубации по сравнению с 45 мин инкубации с протеолитическим ферментом (Рисунок 1C). Две линии iPSC, которые мы использовали для иллюстрации этого наблюдения, были дифференцированы в нейроны от стадии нейро-прародителя с использованием различных протоколов, и показали широко различную чувствительность к процедуре повторного отбрасывания. Культуры из линии WT126, дифференцированные в NPC с использованием "метода выбора розетки"7 были более чувствительны к повреждениям, чем культуры, отличающиеся от линии CVB WT24 с использованием метода быстрой дифференциации8. Тем не менее, для обеих линий степень немедленной гибели клеток была примерно вдвое снижена с помощью расширенной процедуры инкубации ферментов.
После повторного опрокидывания, культуры продемонстрировали приблизительное удвоение жизнеспособности клеток в последующие дни с использованием расширенной процедуры инкубации ферментов, определяемой плотностью DAPI-положительных клеток(рисунок 2B, график слева). Кроме того, расширенная инкубация ферментов привела к снижению плотности мертвых или умирающих клеток, обнаруженных с помощью набора жизнеспособности для исключения красителей(рисунок 2В,график справа). Доля мертвых клеток, обнаруженных с помощью проверки жизнеспособности после 24 ч после переплатывания, была выше, чем увидена с помощью трипана синего сразу после тритурации. Это, вероятно, отражает накопление мертвых и умирающих клеток в течение этих первых 24 ч, хотя это также возможно, что жизнеспособность асссы более чувствительно обнаруживает гибель клеток, чем trypan синий ассс. Мертвые клетки продолжали обнаруживаться в течение 1-7 дней после повторного погружения(рисунок 2B). Первоначальная плотность покрытия для обеих экспериментальных групп (5 мин и 45 мин) была идентичной и основывалась на гемоцитометре живых клеток после тритурации клеточной подвески. Важно отметить, что во все моменты после повторного погружения, количество живых, здоровых клеток было примерно в два раза после 45 мин инкубации фермента по сравнению с 5 мин инкубации. Эти наблюдения были подтверждены качественно с помощью фазовой контрастной микроскопии для мониторинга морфологии клеток на каждом шагу: перед повторной платой, во время повторного отвода и после повторного покрытия(рисунок 1 и рисунок 2).
Одним из преимуществ повторного hiPSC полученных нейронов после того, как они были дифференциирования в течение нескольких недель является то, что большинство клеток будет вышли из стадии прародителя и стать привержены нейрональных фенотипа во время переплатывания. Переходная фаза нейрональной дифференциации от нейронных прародителей происходит в течение нескольких дней, при этом большее количество клеток постепенно выражает ранние нейронные маркеры, такие как бета-III тубулин (обнаруженный антителом TuJ1) или MAP2. Выражение гена развивается в течение нескольких недель, в конечном итоге приводит к экспрессии поздних стадиях паннейрональных маркеров, таких как NeuN, или клеточного типа конкретных маркеров для корковых нейронов, таких как CTIP2. Таким образом, повторное переплетирование ранее дифференцированных нейронов, полученных из hiPSC, позволяет изучать ранние и переходные нейронные события, такие как инициирование неврита, в выявленных подтипах нейронов. Рисунок 3 иллюстрирует непосредственное присутствие ранних нейрональных маркеров в культурах, которые были перенапрягаться после 4 недель предварительной дифференциации в более крупном блюде культуры. Обратите внимание, что NeuN- и CTIP2-выражения нейронов легко определить в течение нескольких дней после повторного(Рисунок 3). Характеристики и сроки дифференциации нейронов могут варьироваться между линиями hiPSC. Для линии WT 126 и линий CVB WT24, которые мы описываем здесь, 85 и 12% (n No 2) и 52 и 52 11% (n no 5) клеток, соответственно, выраженная иммунореактивность для маркера TuJ1 III-тубулина в 4 дня после опрокидывания с помощью расширенной процедуры инкубации протеазии. Для обеих линий, 30-40% клеток, и 80-90% нейронов также выражают слой 5/6 неокортикального маркера CTIP2. В дополнение к улучшению жизнеспособности, расширенный протокол протеазы также умеренно расширенный невритный рост (средняя длина неврита на нейрон), как показано на рисунке 4. Оба общей длины неврита (количественно с использованием антитела Tuj1, который пятна как аксоны и дендриты; Рисунок 4 B, левый график) и рост дендрита (количественно с помощью MAP2, который окрашивает только дендриты; Рисунок 4 B,центральный график) были благоприятствования при использовании расширенной процедуры инкубации протеазы. Обратите внимание, что график для DAPI-положительных (DAPI (я) количество ячеек на рисунке 2 основаны на тех же образцах изображений, что и график количества клеток на рисунке 4, но на рисунке 2 они были количественно оценены с помощью неавтоматизированного метода, которым помогало программное обеспечение Фиджи, в то время как на рисунке 4 они были количественно с помощью автоматизированной платформы анализа изображений CellProfiler. Эти два подхода к анализу изображений дали схожие результаты.
Переплет полезен не только для изучения невритовых наростов, но и для изучения синапсов или других более поздних биологических особенностей нейронов. Действительно, после всего лишь одной недели после восстановления мы наблюдаем маркеры для многих пресинаптических и постсинаптические белки, украшающие нейронные дендриты в пунктуальной картине(Рисунок 5А). Через 4 недели мы также начинаем обнаруживать их колокализацию, которая является показателем формирования функциональных синапсов(рисунок 5А). Кроме того, электрическая активность от спонтанной деполяризации и синаптически управляемых токов обнаруживается с помощью изображения кальция(рисунок 5B)или мультиэлектродных массивов (МЭА).
Рисунок 1 : Превосходное сохранение жизнеспособности нейронов после более длительной инкубации с протеолитической ферментом для клеточной диссоциации. (A) Фазовое контрастное изображение нейронов, полученных из NPC, дифференцировано в течение 3 недель. Область коробок в левом изображении увеличена справа. На этом этапе нейроны имеют длительные процессы, которые образуют толстую сетку. Шкала баров 80 мкм (слева); 35 мкм (справа). (B) Выбранные изображения hiPSC-производных нейронов на 1 и 5 дней после повторного отправления. Шкала бар 100 мкм. (C) Слева: клетки отсоединяться в течение нескольких минут после инициирования лечения протеазы. Шкала бар 200 мкм. Справа: после трихаляции клетки рассчитываются на гемоситометр перед переплатыванием. Графики показывают количественную оценку нежизнеспособных, трипан-голубых положительных клеток после 5 мин или 45 мин инкубации с протеолитической фермента для двух различных линий CVB WT24 (я п.т; 0,0003, неспаренный t-test) и WT 126 (я. Значения представляют среднее значение S.E.M 4 отдельных репликатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Нейронная жизнеспособность после нескольких дней после повторного переплатывания. (A) Изображения WT126 NPC полученных нейронов на 1 и 3 дней после повторного использования 5 мин и 45 мин инкубации протеазы. Умирающие клетки помечены чувствительным репортером ранней смерти клетки. Слева показаны соответствующие яркие изображения. Некоторые клеточные обломки (голубая стрелка), как правило, обнаруживаются после повторного, особенно в 5 мин группы. Шкала баров 150 мкм. (B) Изображения CVB WT24 NPC полученных культур на 1, 3 и 7 дней после повторного повторного использования 5 мин и 45 мин протеазы инкубации. Умирающие клетки помечены чувствительным репортером ранней смерти клетки (красный). Все ядра живых и умирающих клеток помечены DAPI (cyan). Слитый белый сигнал представляет DAPI и VivaFix-положительные (яп.) ячейки. Несколько клеток отображают окрашивание VivaFix, но не имеют DAPI окрашивания (красные клетки в комбинированном изображении справа); это, вероятно, клетки, которые были мертвы в течение многих часов. Шкала баров: 25 мкм. Правый график показывает количественную оценку фракции мертвых клеток (VivaFix/DAPI) после разного инкубационного времени с протеолитической ферментом (5 мин против 45 мин: p slt; 0,05 1 d и no slt; 0.001, 3 d; двухсторонней ANOVA, а затем мультисравнение Bonferroni после хок-теста). Левый график показывает изменения в общей плотности клеток ("DAPI( я) ячейки в течение 5 мин против 45 мин: р-л; 0,0001 для всех временных точек; двусторонний ANOVA, а затем многосравнение Bonferroni после хо-теста). Все значения отображаются как средние s.E.M из 3 репликаций, с минимум 1500 ячейками, набранными на состояние. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Обнаруживаемое выражение поздних стадий нейрональных маркеров сразу после повторного отвода. Культуры CVB WT24 hiPSC-полученных клеток, полученных через 4 дня после переплатывания, используя 45 мин инкубации протеазы, из 10 см блюдо, которое было дифференцировано от стадии NPC в течение 4 недель. Были показаны примеры для паннейрональных маркеров TuJ1, MAP2 или NeuN; или глубокослойный кортикальный пирамидальный нейронный маркер CTIP2. Обратите внимание на наличие обширных невритов, а также надежное выражение TuJ1 и MAP2. Обратите внимание, особенно, что значительная часть нейронов также выражает поздней стадии маркеров NeuN и CTIP2. Шкала бар No 16 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Нейрит и дендрит роста с течением времени после более короткой и более длинной инкубации фермента во время повторного покрытия. (A) Replated CVB WT24 hiPSC полученных нейронов быстро продлить нейриты, как обнаружено с помощью антитела Tuj1. Обратите внимание, что расширенное время инкубации протеазы способствует неуритогенез. Шкала бар No 25 мкм. (B) Количественная длина неврита и дендрита, в течение 1, 3 и 7 дней после повторного использования либо 5 мин или 45 мин протеазы. Общая длина неврита была количественно определена из окрашивания TuJ1 (III-tubulin); дендрит-специфическое окрашивание было количественно от MAP2 окрашивания snf исправлено для общей плотности клеток (правый график). Все значения отображаются как средние s.E.M из 3 репликатов. Длина нейрита 5 мин против 45 мин: ч. л.; 0,05 в 1 день и 7 дней, п.л.; 0,01 в 3 дня; длина дендрита 5 мин против 45 мин: q p qlt; 0.01 в 1 день и 3 дня, не значительные (нс) в 7 день; - DAPI () 5 мин против 45 мин: р-р lt; 0,0001 за все время точек; двусторонняя ANOVA, а затем многосравнение Bonferroni после специального теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Синаптогенез и спонтанные переходные кальция в дифференцированных нейронах, полученных от hiPSC, после повторного спокрытия. (A) Слева: в 4 недели после восстановления с использованием расширенного протокола инкубации протеазы, пресинаптический маркер синапсин 1 обнаруживается в пунктуальных кластерах вдоль положительных дендритов MAP2. Шкала баров 5 мкм. Справа: выбранный дендритный регион, показывающий колокализацию между пресинаптическими и постсинаптические кластерами (желтая стрелка), что указывает на потенциально активные синапсы. Шкала баров No 1,5 мкм. (B) Слева: hiPSC полученных нейронов, инфицированных AAV8-syn-jGCaMP7f-WPRE были использованы для мониторинга спонтанного кальция переходных обусловлен сетевой активности. Яркое изображение показано рядом с псевдоцветом визуализации флуоресценции GCaMP7 в один момент времени в серии тайм-лап. Шкала бар No 25 мкм. Цветные цифры указывают на 4 выбранных ячеек, в которых GCaMP7 флуоресценция была измерена с течением времени, как показано в следах справа. Каждый цветной след соответствует одной ячейке. Звездочка указывает на время во время живой записи, к которой соответствует изображение слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Рабочий процесс переплатывания процедур в культуру hiPSCs для скрининга высокого содержания и / или подробные исследования дифференциации и невритовый рост или MEA записей. Начиная с дифференцированной культуры нейронов, выращенных в течение 4 или более недель в более крупном формате (например, 10 см культуры блюдо), нейроны инкубируются с протеаза в течение 40-45 минут, тритурированные мягко разъединить и повторной работы. Клетки затем распределяются в мультискважинах, совместимых с HCS, перекрываются на субстраты, совместимые с конусами роста изображения (желтая стрелка) или другими структурами, или на мультискважины, пригодные для многоэлектронных записей массива. Шкала баров 27 мкм, 5 мкм, 2,5 мкм, 130 мкм (слева направо). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировали прямолинейную процедуру повторного и повторного обновления нейронных культур человека, которая оптимизирует жизнеспособность, успех дифференциации и субклеточную визуализацию таким образом, что она совместима с платформами скрининга с высоким содержанием, и другие анализы, имеющие отношение к обнаружению наркотиков. На рисунке 6 иллюстрируется общий рабочий процесс и примеры таких приложений.
Хотя здесь мы сосредоточились на hiPSC полученных нейронов, которые направлены на корковой судьбы нейронов, мы ожидаем, что этот метод должен быть в равной степени применимы к человеческим эмбриональных стволовых клеток, полученных нейронов, и стволовых клеток, полученных нейронов, направленных на другие нейронные фенотипы14,15,16,17,18. Кроме того, мы постулируем, что эта расширенная процедура протеазы может быть полезной для других ситуаций, которые требуют повторной приостановки клеток, имеющих установленные нейритной сетки, например, для сортировки FACS или одноклеточного анализа первичных нейронов19 , 20.
Replating hiPSC-производных нейронов обеспечивает жизнеспособную модель системы, в которой для изучения клеточных и молекулярных механизмов многих ключевых биологических событий. Например, эта процедура может способствовать детальным исследованиям роста нейрита человека и характеристик конуса роста, а также сопоставлению результатов с обширной базой знаний, построенной из десятилетий изучения других видов, как позвоночных, так и беспозвоночных. Мы находим, что процедура переплатывания сделала его легче оптимизировать условия для создания больших конусов роста, которые хорошо подходят для оптической оценки субклеточной структуры и функции(рисунок 6). Для сравнения, конусы роста, которые чаще наблюдаются во время первоначальной дифференциации нейронов от hiPSCs, как правило, малы и компактны, а плотный массив ненейрональных клеток в таких культурах затрудняет как корректировку условий субстрата, так и способствовать распространению конуса роста и изображению отдельных конусов роста в сложной среде тканей. Таким образом, повторное перекладывание нейронов на свежее блюдо обеспечивает "чистый шифер", на котором для просмотра конусов роста в хороших условиях изображения.
Replating особенно выгодно при использовании платформ клеточной культуры, подходящих для HCS, потому что это значительно сокращает общее время, в котором культуры выращиваются в небольших объемах. Небольшие рабочие объемы отдельных скважин 96, 384 или 1536 скважин (приблизительно 100, 50 и 5 микролитров рабочего объема соответственно) обычно требуют частых (т.е. ежедневных) изменений в средствах массовой информации для противодействия испарению и истощению питательных веществ. Частые изменения в средствах массовой информации являются дорогостоящими, не только с точки зрения реагентов и труда, но они могут поставить под угрозу жизнеспособность культур путем разбавления условных средств массовой информации и за счет увеличения шансов, что клетки отделиться от субстрата из-за механической турбулентности. Повторное использование HIPSCs может также облегчить запись физиологической активности с помощью мультиэлектродных массивов21,22, или живой визуализации культур в анализы динамических нейрональных фенотипов23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа является составной частью Национальной кооперативной перепрограммированной группы по исследованию ячеек (NCRCRG) для изучения психических заболеваний и была поддержана грантом NIH U19MH1 2015-0644. Первоначальная работа также была поддержана грантом NIH NS070297. Мы благодарим доктора Кэрол Маркетто и Фред Гейдж, Институт Салка, за предоставление линии WT 126 нейронных клеток-прародителей, и доктора Евгений Ео и Лоуренс Гольдштейн, Калифорнийский университет в Сан-Диего за предоставление CVB WT24 линии нейронных клеток-прародителей. Мы благодарим Дебора Pre в лаборатории д-р Энн Банг, Сэнфорд Бернхэм Пребис медицинских открытий института, для полезных дискуссий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
