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Neuroscience

Neuritogenesis और Synapse परिपक्वता की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए मानव Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के बाद भेदभाव replating

Published: August 28, 2019 doi: 10.3791/59305
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Division of Biological Sciences, University of California, San Diego, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल resuspending और मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स कि पहले कई हफ्तों के लिए इन विट्रो में तंत्रिका संतति से विभेदित थे culturing के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है. प्रक्रिया प्रकाश माइक्रोस्कोपी और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के साथ संगत एक प्रारूप में न्यूराइट्स, synapses, और देर से व्यक्त न्यूरॉन मार्करों के इमेजिंग आधारित परख की सुविधा.

Abstract

मानव pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न तंत्रिका जनक कोशिकाओं (NPCs) से दो आयामी संस्कृति में विभेदित न्यूरॉन्स रोग तंत्र का पता लगाने और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) बाहर ले जाने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं यौगिक पूछताछ करने के लिए पुस्तकालयों या जीन उत्परिवर्तन phenotypes की पहचान. हालांकि, मानव कोशिकाओं के साथ कार्यात्मक करने के लिए एनपीसी से संक्रमण, परिपक्व न्यूरॉन कई हफ्तों की आवश्यकता है. Synapses आम तौर पर मोनोलेयर संस्कृति में भेदभाव के 3 सप्ताह के बाद फार्म शुरू, और कई न्यूरॉन विशेष प्रोटीन, उदाहरण के लिए बाद में व्यक्त पैन-न्यूरॉनल मार्कर NeuN, या परत 5/6 मस्तिष्क cortical न्यूरॉन मार्कर CTIP2, व्यक्त करने के लिए शुरू लगभग 4-5 सप्ताह के बाद भेदभाव. यह लंबा भेदभाव समय इष्टतम संस्कृति छोटी मात्रा, बहु अच्छी तरह से एचसीएस प्लेटफार्मों के लिए इस्तेमाल किया शर्तों के साथ असंगत हो सकता है। कई चुनौतियों में से एक अच्छी तरह से adhered के लिए की जरूरत है, समान रूप से कम सेल क्लस्टरिंग के साथ वितरित कोशिकाओं, और संस्कृति प्रक्रियाओं है कि दीर्घकालिक व्यवहार्यता और कार्यात्मक synapse परिपक्वता को बढ़ावा. एक दृष्टिकोण एक बड़ी मात्रा प्रारूप में न्यूरॉन्स अंतर है, तो उन्हें HCS-संगत बहु कुओं में एक बाद के समय बिंदु पर replate. कुछ मुख्य चुनौतियों जब इस replating दृष्टिकोण चिंता reproducibility और सेल व्यवहार्यता का उपयोग कर, डेन्ड्रिटिक और axonal नेटवर्क के तनावपूर्ण व्यवधान के कारण. यहाँ हम enzymaticly ressssssssssssssible मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (HIPSC)-एक बड़े मात्रा प्रारूप में 4-8 सप्ताह के लिए उनके भेदभाव के बाद न्यूरॉन्स व्युत्पन्न, उन्हें 384-वेल microtiter को स्थानांतरित प्लेटें, और उत्कृष्ट सेल अस्तित्व के साथ एक और 1-3 सप्ताह के लिए उन्हें culturing. मानव न्यूरॉन्स के इस replating न केवल replating से दो सप्ताह के भीतर synapse विधानसभा और परिपक्वता के अध्ययन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी neurite पुनर्जनन और विकास शंकु विशेषताओं के अध्ययन में सक्षम बनाता है. हम एक 384-वेल मंच का उपयोग कर न्यूरिटोजेनेसिस और synaptogenesis के लिए स्केलेबल परख के उदाहरण प्रदान करते हैं.

Introduction

मानव pluripotent स्टेम सेल (HIPSC) व्युत्पन्न न्यूरॉन्स बुनियादी अनुसंधान के क्षेत्रों में तेजी से प्रासंगिक हैं, दवा विकास, और पुनर्योजी दवा. अपनी संस्कृति और रखरखाव को अनुकूलित करने के लिए कार्यप्रवाह और प्रक्रियाएं, और विशिष्ट न्यूरोनल उपप्रकारों में भेदभाव की दक्षता में सुधार, तेजी से विकसित हो रहे हैं1,2. दवा की खोज और लक्ष्य सत्यापन में उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए अनुकूल मॉडल सिस्टम के रूप में मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की उपयोगिता और लागत प्रभावशीलता में सुधार करने के लिए, यह परिपक्व उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय culturing कम करने के लिए उपयोगी है, कार्यात्मक न्यूरॉन्स, जबकि अधिकतम मजबूती बनाए रखने, reproducibility, और phenotype प्रासंगिकता. हालांकि 3 आयामी organoid संस्कृतियों neurodevelopment अनुसंधानमेंसफलताओं ड्राइविंग कर रहे हैं 3, 2 आयामी monolayer संस्कृतियों उनके न्यूनतम ऊतक मोटाई के कारण स्वचालित इमेजिंग आधारित अनुप्रयोगों के साथ विशेष रूप से संगत कर रहे हैं.

हालांकि, मानव न्यूरोलॉजिकल और neurodevelopmental रोग के मॉडल के लिए इमेजिंग आधारित स्क्रीनिंग तरीकों के अनुकूलन एक बड़ी चुनौती का सामना करना पड़ता है. लंबी समय सीमा जिस पर मानव तंत्रिका तंत्र विवो में परिपक्व जीन अभिव्यक्ति के प्राकृतिक कार्यक्रमों को समायोजित करने और न्यूरॉन परिपक्वता को प्राप्त करने के लिए संस्कृति में विस्तारित समय की आवश्यकता है.

लंबा न्यूरोनल भेदभाव कार्यक्रम का एक व्यावहारिक परिणाम यह है कि HIPSC व्युत्पन्न मोनोलेयर संस्कृतियों के रखरखाव के लिए कई हफ्तों के लिए निरंतर होना चाहिए पर्याप्त synapse परिपक्वता प्राप्त करने के लिए. इस समय के दौरान, तंत्रिका जनक है कि undifferentiated रहते हैं विभाजित करने के लिए जारी है. ये जल्दी से संस्कृति को बढ़ा सकते हैं और व्यवहार्य postmitotic न्यूरॉन्स को बनाए रखने के लिए आवश्यक पोषक तत्व सामग्री हड़पना. जोरदार विभाजित तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी) भी विकास सब्सट्रेट के लिए न्यूरॉन्स के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं. यह ऐसी संस्कृतियों गरीब आसंजन की समस्याओं के अधीन प्रस्तुत कर सकते हैं, इमेजिंग आधारित परख के लिए अनुपयुक्त हालत. इसके अलावा, कई जांचकर्ताओं पाते हैं कि छोटे संस्कृति की मात्रा, काफी लंबे समय तक विभेदित न्यूरॉन भेदभाव के देर से चरणों का निरीक्षण करने के लिए विभेदित न्यूरॉन्स के स्वस्थ आबादी को बनाए रखने में अधिक से अधिक कठिनाई. दूसरे शब्दों में, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) दृष्टिकोण का उपयोग synapse परिपक्वता के परख मानव व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकता है.

इन समस्याओं में से कुछ को दरकिनार करने के लिए, पहले से विभेदित HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स ressssing और replating की एक प्रक्रिया का इस्तेमाल किया गया है. सबसे पहले, यह पूरी तरह से प्रतिबद्ध न्यूरॉन्स की आबादी में neurite वृद्धि के अध्ययन की अनुमति देता है (या, अधिक सही, neurite पुनर्जनन)। दूसरे, एक बड़ी मात्रा प्रारूप से पहले विभेदित न्यूरॉन्स के replating (जैसे 10 सेमी प्लेटें या बड़ा), छोटे मात्रा प्रारूपों के लिए नीचे (जैसे HCS-संगत 96- या 384-अच्छी तरह microtiter प्लेटें) में कुल culturing समय में एक महत्वपूर्ण कमी सक्षम बनाता है छोटी मात्रा की स्थिति. यह इन विट्रो में बाद के सप्ताहों में synapse विधानसभा और परिपक्वता के अध्ययन की सुविधा.

हालांकि, परिपक्व न्यूरॉन्स है कि पहले से ही लंबे neurites और एक जटिल कनेक्टिविटी नेटवर्क की स्थापना की है replating कई चुनौतियों, जिनमें से एक कभी कभी उच्च और सेल मौत के चर दर है प्रस्तुत करता है. यहाँ, हम एक replating प्रक्रिया है कि उत्कृष्ट सेल अस्तित्व और reproducibility में परिणाम का वर्णन. आम तौर पर, न्यूरॉन्स कम ऊष्मायन अवधि के लिए proteolytic एंजाइमों को उजागर कर रहे हैं (आमतौर पर $ 3-10 मिनट) क्रम में trituration से पहले सब्सट्रेट से कोशिकाओं को अलग करने के लिए. इस संक्षिप्त प्रोटीओलिसिस समय का उपयोग कई प्रकार की विभाजित कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने और पारित करने के लिए किया जाता है, जिसमें गैर-न्यूरोनल कोशिकाएं और अपृथक्कृत संतति4,5,6शामिल हैं। हालांकि, लंबे समय से असर विभेदित न्यूरॉन्स के लिए, परस्पर neurites, यह न केवल सब्सट्रेट से कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी नुकसान को कम करते हुए व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करने के क्रम में डेन्ड्रिटिक और axonal नेटवर्क को बाधित करने के लिए। दरअसल, न्यूरॉन्स की एक मोटी meshwork आमतौर पर एक पत्रक के रूप में सब्सट्रेट से अलग करने के लिए जाता है, बजाय व्यक्तिगत कोशिकाओं के रूप में. यदि देखभाल neurites की मोटी नेटवर्क ढीला करने के लिए नहीं लिया जाता है, न्यूरॉन्स न केवल trituration के दौरान अपूरणीय क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, लेकिन उनमें से कई clumps को दूर करने के लिए इस्तेमाल फिल्टर के माध्यम से पारित करने में विफल, गरीब सेल उपज में जिसके परिणामस्वरूप. नीचे हम इन कठिनाइयों का मुकाबला करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रोटीज ऊष्मायन प्रक्रिया के लिए एक सरल संशोधन का वर्णन.

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल में, न्यूरॉन्स को हल्के प्रोटीज़ के साथ 40-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, जैसे प्रोटीओलिटिक एंजाइम (जैसे, एक्क्यूटेज)। एंजाइम जोड़ने के बाद पहले 5-10 मिनट के दौरान, न्यूरॉन नेटवर्क एक चादर के रूप में सब्सट्रेट से दूर लिफ्टों. protease के साथ इनक्यूबेशन कोमल trituration और छानने के साथ आगे बढ़ने से पहले एक अतिरिक्त 30-40 मिनट के लिए आय. यह अतिरिक्त ऊष्मायन समय यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि सामग्री का पाचन अंतरकोशिकीय नेटवर्क को आराम देता है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि बाद में अनुषण व्यक्तिगत कोशिकाओं का निलंबन पैदा करता है। इस प्रक्रिया को सेल मौत को कम करते हुए replating पर सेल वितरण की एकरूपता अधिकतम करता है। हम सफलतापूर्वक विभिन्न भेदभाव प्रोटोकॉल7,8 और hiPSCs के विभिन्न लाइनों से उत्पन्न hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए इस replating विधि लागू किया है. प्रक्रिया स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के सबसे या सभी लाइनों के साथ उपयोग के लिए नाममात्र उपयुक्त है. हमने देखा है कि एक विस्तारित protease ऊष्मायन समय छोटे प्रारूप प्लेटों से संस्कृतियों replating के लिए बिल्कुल आवश्यक नहीं है (उदाहरण के लिए, 35 मिमी व्यास); हालांकि, जैसा कि हम यहाँ दिखाने के लिए, यह एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है जब बड़े व्यास प्लेटों से replating (जैसे, 10 सेमी व्यास या बड़ा), शायद क्योंकि ऐसी प्लेटों में neurites बहुत लंबी प्रक्रियाओं का विस्तार कर सकते हैं और एक घने परस्पर सरणी फार्म.

यहाँ हम इस विधि का प्रदर्शन और संक्षेप में जल्दी neuritogenesis के लिए और synapse परिपक्वता के लिए, जो पूर्व और dendrites और axons के साथ postsynaptic प्रोटीन के क्लस्टरिंग शामिल है के लिए परख में अपने आवेदन वर्णन, उनके बाद के बाद synaptic साइटों पर colocalization. उदाहरण सेल व्यवहार्यता और reproducibility के संरक्षण में इस प्रोटोकॉल प्रदान करता है लाभ पर प्रकाश डाला. सबसे पहले, यह जांचकर्ताओं मानव न्यूरिटोजेनेसिस में प्रारंभिक कदम का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। प्रयोगात्मक सेटिंग कृंतक cortical या हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स, जहां कोशिकाओं देर से भ्रूण या जल्दी प्रसव के बाद मस्तिष्क से निकाले जाते हैं, कोमल protease उपचार के बाद trituration द्वारा अलग कर रहे हैं की आमतौर पर इस्तेमाल प्राथमिक संस्कृतियों के समान है, और करने की अनुमति दी न्यूराइट आरंभ करें या न्यूराइट को पुनर्जीवित करें जोप्रक्रिया 9,10में तोड़ दिए गए थे . इस तरह के कृंतक प्राथमिक न्यूरॉन्स के समान, HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के रूप में या replating के बाद घंटे के भीतर अपने neurites पुनर्जीवित करने के लिए शुरू, विकास शंकु और neurite आकृति विज्ञान के एक वातावरण में उच्च spatioorral इमेजिंग के लिए इष्टतम कम के साथ इमेजिंग की अनुमति अलग-अलग कोशिकाओं के आसपास. हमने देखा है कि न्युराइट वृद्धि चर देरी और विभिन्न वृद्धि दरों की तुलना में अधिक सिंक्रनाइज़ है देखा जब न्यूरॉन्स पहली बार एक संतति की आबादी से अंतर करने के लिए शुरू करते हैं. इसके अलावा, replating न्यूरॉन उपप्रकार मार्करों है कि आम तौर पर तंत्रिका विकास में बाद में दिखाई देते हैं व्यक्त न्यूरॉन्स के assays सक्षम बनाता है, इस तरह के cortical परत 5/6 प्रतिलेखन कारक CTIP2 के रूप में (चिकन ovalbumin अपस्ट्रीम प्रमोटर प्रतिलेखन कारक-इंटरैक्टिंग प्रोटीन 2), या पैन-न्यूरोनल मार्कर NeuN11| replating दृष्टिकोण की एक विशेष रूप से उपयोगी विशेषता यह है कि synaptogenesis एचसीएस के साथ संगत एक समय सीमा के भीतर आय.

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Protocol

1. पुनर्प्लेटिंग से पहले भेदभाव अवधि

  1. 10 सेमी व्यंजन पर न्यूरॉन्स अलग, पसंद का एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर7,8 न्यूरॉन्स उनकी प्रक्रियाओं के साथ एक मोटी नेटवर्क का गठन किया है और न केवल जल्दी न्यूरॉन मार्करों जैसे MAP2 या TuJ1 व्यक्त, लेकिन यह भी देर मार्करों जैसे NeuN.
  2. न्यूरोनल विभेदन प्रक्रिया के दौरान हर 4 दिनों में पसंद के आधे माध्यम बदलें।
    नोट:     अधिक व्यापक या अक्सर मध्यम परिवर्तन आवश्यक ट्राफिक कारकों को पतला, और परिपक्वता नापसंद कर सकता है।
    1. iPSC व्युत्पन्न WT126 न्यूरॉन्स के लिए, निम्नलिखित पोस्ट-डिफरेशन culturing मीडिया का उपयोग करें: 5 एमएल 100x N2 पूरक, 10 एनजी/एमएल बीडीएनएफ, 10 एनजी/एमएल GDNF, 1 g/mL laminin, 200M ascorbic एसिड, 1 $M dibutyryl-cAMP और 500 mL SM1 के लिए 10 एमएल SM1 पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (डीएमईएम/ धीरे-धीरे, आधा मीडिया परिवर्तन का उपयोग कर, तंत्रिका बेसल माध्यम के साथ बदलें (सामग्री की तालिका) और एक ही पूरक.
    2. iPSC व्युत्पन्न CVB WT न्यूरॉन्स के लिए, निम्नलिखित पोस्ट-डिफरेंटेशन culturing माध्यम का उपयोग करें: 500 एमएल तंत्रिका बेसल एक मध्यम (सामग्री की तालिका) और 500 एमएल DMEM/F12 माध्यम के साथ 2 g/mL laminin, 10 एमएल ग्लूटामाइन पूरक ( सामग्री कीतालिका), 0.75 mg/एमएल सोडियम बाइकार्बोनेट, 5 एमएल न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) गैर जरूरी अमीनो एसिड, 0.2 एमएम एस्कॉर्बिक एसिड, 10 एनजी/एमएल बीडीएनएफ, 20 एमएल 50x B27, और 10 एमएल 100x N2 पूरक।

2. कोटिंग मल्टीवेल्स

  1. replating से पहले दिन, पाली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ) के साथ कोट। एक स्टॉक समाधान (10 मिलीग्राम/एमएल) बनाने के लिए बाँझ पानी में पीएलओ को भंग करें। इस स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। प्लास्टिक कोटिंग करते समय कांच तथा 1:1,000 अनुपात (10 ग्राम/एमएल) को कोटिंग करते समय 50 ग्राम/एमएल की सांद्रता प्राप्त करने के लिए पानी में 1:100 को पतला करना।
  2. लक्ष्य प्लेटों के लिए सीधे कोटिंग लागू करें. प्लेट आकार के लिए उपयुक्त कोटिंग की मात्रा का उपयोग करें (यानी, एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के लिए अच्छी तरह से प्रति PLO समाधान के 500 $L लागू होते हैं).
  3. प्लेटों कमरे के तापमान पर रात के अंधेरे में बैठने के लिए अनुमति दें।
  4. replating और एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट को स्थानांतरित करने के दिन लेपित प्लेटों को पुनः प्राप्त करें।
  5. PLO समाधान aspirate और बाँझ पानी के साथ दो बार कुल्ला.
  6. 1:400 कमजोर पड़ने पर फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में डिल्यूट लेमिनन (1.15 मिलीग्राम/एमएल)।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर thaw laminin और जल्दी से पीबीएस में जोड़ने के लिए laminin और असमान कोटिंग के एकत्रीकरण से बचने के.
  7. Aspirate बाँझ पानी और पहले PLO के साथ लेपित कुओं के लिए laminin कोटिंग के 500 $L लागू होते हैं।
  8. कम से कम 4-6 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट्स रखें। कांच की सतहों के लिए 16 एच तक लंबे समय तक इनक्यूबेशन का उपयोग करें। संगत ऊष्मायन समय का उपयोग करें.

3. अलग-अलग न्यूरोन को फिर से चढ़ाना

  1. पीबीएस के साथ विभेदित न्यूरॉन्स की प्लेट को धीरे से एक बार कुल्ला करें। पीबीएस धीरे थाली की दीवार के नीचे फैलाओ, और सीधे कोशिकाओं पर नहीं, उन्हें बाधित करने से बचने के लिए.
  2. धीरे से पीबीएस, सावधान किया जा रहा है कोशिकाओं को सीधे छू से बचने के लिए, लेकिन पकवान के किनारे से aspirate जबकि यह शोधकर्ता की ओर tipping.
  3. प्रोटीओलिटिक एंजाइम (सामग्री की तालिका) प्रति 10 सेमी प्लेट के कम से कम 1 एमएल पर लागू करें और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें। ऊतक संस्कृति कक्ष कम आर्द्रता के कारण एक उच्च वाष्पीकरण दर दर्शाती है, तो थोड़ा उच्च मात्रा जोड़ें।
  4. 40-45 मिनट के लिए प्रोटीओलिटिक एंजाइम के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं ताकि उन्हें थाली से अलग करने के लिए और उन्हें न्यूरॉन नेटवर्क के भीतर अन्य न्यूरॉन्स से अलग करने के लिए.
    नोट: इस कदम पर समय महत्वपूर्ण है. बहुत जल्दी protease को बुझाने replating के बाद सेल मौत में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. प्रोटीओलिटिक एंजाइम निर्माता सिफारिश करता है कि तापमान 37 डिग्री सेल्सियस से बहुत कम है, सेल लाइनों (जैसे, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए लंबी ऊष्मायन अवधि के साथ उपयोग किया जाएगा। हालांकि, 4 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरॉन्स से निपटने से बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे अक्सर ठंड जोखिम के बाद खराब अस्तित्व दिखाते हैं। निर्माता यह भी कहा गया है कि 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम के साथ 60 मिनट ऊष्मायन इसके एंजाइमी निष्क्रियता की ओर जाता है। हालांकि, लेखकों के अनुभव में, 37 डिग्री सेल्सियस पर HIPSC व्युत्पन्न न्यूरोनल संस्कृतियों की 40-45 मिनट ऊष्मायन replating पर कुशल वियोजन और उत्कृष्ट न्यूरॉन अस्तित्व के लिए पर्याप्त है।
  5. ऊष्मायन समय के दौरान एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप पर न्यूरॉन्स की जाँच करें और प्रोटीज़ उपचार जारी रखने के लिए जब तक तंत्रिका नेटवर्क पूरी तरह से थाली से detaches और संक्षेप में नीचे प्लेट मिलाते पर छोटे चादरों में अलग तोड़ने के लिए शुरू होता है की अनुमति माइक्रोस्कोप.
  6. पाचन को रोकने के लिए 10 सेमी प्लेट में प्रोटीज़ के प्रति 1 एमएल के ताजा DMEM मीडिया के 5 एमएल का उपयोग करके प्रोटीज़ गतिविधि को कंजकरें। धीरे से प्लेट के खिलाफ कोशिकाओं triturate 5-8 बार नेटवर्क को बाधित करने के लिए, serological pipettes का उपयोग कर. triturating जब बहुत अधिक दबाव लागू करने के लिए नहीं सावधान रहना, के रूप में विभेदित न्यूरॉन्स नाजुक हैं. एक P1000 टिप का उपयोग न करें, के रूप में अंत भी तेज और संकीर्ण है, और इस तरह सरासर या न्यूरॉन्स को नुकसान पहुंचा सकता है.
  7. 100 मीटर व्यास के जाल के साथ एक सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं के साथ समाधान को एक ताजा 50 एमएल शंकु ट्यूब ड्रॉप में लागू करें।
  8. कोशिकाओं के माध्यम से फ़िल्टर किया गया है के बाद, ताजा DMEM मीडिया के एक अतिरिक्त 5 एमएल के साथ कुल्ला छलनी.
  9. 5 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर बेंचटॉप अपकेंद्रित्र में स्पिन कोशिकाओं।
  10. जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए शंकु ट्यूब लौटें और ज्यादातर मीडिया को प्रेरित करें, कोशिकाओं को नमी बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करने के लिए लगभग 250 डिग्री सेल्सियस छोड़ दें।
  11. ताजा DMEM मीडिया के 2 एमएल में धीरे से कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। ट्यूब के पक्ष के खिलाफ गोली पाइपेट मत करो. इसके बजाय, धीरे शंकु 2-3 बार उलटा और उन्हें उखाड़ना करने के लिए एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल पाइप के अंत के माध्यम से कोशिकाओं को पारित।
  12. एक हीमोसाइटोमीटर के किनारे पर resuspended न्यूरॉन्स के 10 डिग्री सेल्सियस लागू करें.
  13. इस पुनर्निलंबन चरण के दौरान सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए कोशिकाओं की छोटी बूंद के लिए ट्रिपन ब्लू के 8-10 डिग्री सेल्सियल जोड़ें। हेमोसाइटोमीटर या अन्य स्वचालित सेल काउंटरों पर इस मिश्रण का 10 डिग्री सेल्सियस लागू करें। चरण उज्ज्वल हैं कि उन कोशिकाओं के रूप में व्यवहार्य का आकलन और trypan नीले रंग बाहर.
  14. व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल की मात्रा निर्धारित करें, और वांछित सेल घनत्व के अनुसार शंकु नली की सामग्री को पतला करने के लिए तैयार करें।
  15. प्लेट $ 10,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक 384-अच्छी प्लेट के लिए; प्लेट $ 150,000-200,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए.
  16. उचित कमजोर पड़ने को प्राप्त करने और विशिष्ट सेल लाइन की आवश्यकताओं के आधार पर B27 और/या BDNF जैसे अतिरिक्त उपयुक्त पूरक जोड़ने के लिए resuspended कोशिकाओं की शंकु ट्यूब के लिए ताजा DMEM जोड़ें.
  17. 2-3 बार मिश्रण करने के लिए शंकु ट्यूब को धीरे से झुकाएं।
  18. 24-वेल प्लेट से एस्पायर लेमिन कोटिंग, या 384-वेल मल्टीवेल प्लेट से 16-चैनल पाइप का उपयोग करके और पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला।
  19. Aspirate PBS 24 अच्छी तरह से प्लेट, या 384 अच्छी प्लेटों के लिए 16 चैनल पिपेट के लिए एक P1000 का उपयोग कर.
  20. clumping से बचने के लिए एक आंकड़ा आठ गति में प्रत्येक अच्छी तरह से सेल समाधान लागू करें. प्लेटिंग एकरूपता भी स्वचालित तरल हैंडलिंग उपकरणों का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है।
    नोट: 2-4 दिनों के बाद शुरू होने वाले मीडिया में लेमिनिन के अलावा कोशिकाओं के समरूप वितरण को बनाए रखने में भी मदद मिलती है।
  21. प्रत्येक कुएं के लिए चरण 3.19 और 3.20 दोहराएँ.
  22. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2पर इनक्यूबेटर सेट पर लौटाएं।
  23. 2 दिनों के बाद, अनुभाग 1.2 में वर्णित पोस्ट-डिफरेंटेशन culturing मीडिया का उपयोग करके हर 4 दिनों में आधा माध्यम बदलना शुरू करें। वांछित परिपक्वता समय के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर 3.7% formaldehyde का उपयोग कर संस्कृतियों को ठीक करें और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार दाग कोशिकाओं।

4. सेल Viability परख पोस्ट-रिप्लेटिंग

  1. जल्दी सेल मौत रिपोर्टर जोड़ें (VivaFix: 0.5 $L 50 $L शेयर समाधान प्रति 500 $L संस्कृति मीडिया प्रति अच्छी तरह से) संक्षेप में शेयर समाधान भंवर के बाद जोड़ें.
  2. छवि लाइव और मृत कोशिकाओं कांच के नीचे multiwells पर सुसंस्कृत, 20 मिनट के बाद, किसी भी धोने कदम के बिना, के बाद से डाई fluoresces केवल एक बार कोशिकाओं के अंदर, या ठीक है और 4 के साथ सह दाग,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और / एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर.

5. इम्यूनोस्टेनिंग

  1. पीबीएस में 3.7% फार्मेल्डिहाइड के साथ संस्कृतियों को ठीक करें प्लस 120 एमएम 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सुक्रोज।
  2. कुल्ला और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.2% Triton एक्स-100 के साथ permeabilize, और फिर 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के साथ 30 मिनट के लिए ब्लॉक.
  3. खरगोश विरोधी के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए rinsing और इनक्यूबेट के बिना बीएसए Aspirate 1:1,000, माउस विरोधी जेड 3 ट्यूबुलिन (TuJ1) एंटीबॉडी 1:2,000, चिकन विरोधी NeuN एंटीबॉडी (1:100) और चूहे विरोधी CTIP2 एंटीबॉडी (1:500), या विरोधी-CTIP2 एंटीबॉडी (1:500) के साथ, या विरोधी-CTIP2 एंटीबॉडी (1:500), या विरोधी PSD के साथ 1:200), खरगोश विरोधी synapsin 1 (1:200) और चिकन विरोधी MAP2 synaptic धुंधला के लिए एंटीबॉडी.
  4. पीबीएस के साथ कुल्ला, और एलेक्सा फ्लोर-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी प्लस DAPI के साथ 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. अंत में, इमेजिंग से पहले पीबीएस के साथ दो बार धो लें।

6. कैल्शियम इमेजिंग

  1. AAV8-syn-JGCAMP7f-WPRE (द साल्क इंस्टीट्यूट फॉर बायोलॉजिकल स्टडीज, GT3 कोर फैसिलिटी) के साथ 10 दिनों के बाद replating और छवि के साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए 3-4 सप्ताह के बाद replating पर सहज कैल्शियम यात्रियों का आकलन करने के लिए.

7. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

नोट: अधिग्रहण प्रणाली पर विवरण के लिए कृपया Calabrese एट अल12को देखें.

  1. मैनुअल या स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए एक इमेजिंग मॉड्यूल का उपयोग करें, और एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर मॉड्यूल, जैसे CellProfiler13,morphometric माप के लिए.
  2. एक ही क्षेत्र के भीतर न्यूरॉन्स (DAPI + MAP2 या TuJ1 सकारात्मक कोशिकाओं) की संख्या से विभाजित दृश्य के क्षेत्र प्रति कुल लंबाई को मापने के द्वारा TuJ1 सकारात्मक neurites और MAP2 सकारात्मक dendrites की औसत लंबाई की गणना.

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Representative Results

कई हफ्तों के लिए विभेदित किया गया है कि hiPSCs व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के replating कई फायदे प्रदान करता है. हालांकि, अलग करने और विभेदित न्यूरॉन्स कि लंबे समय है replating, परस्पर dendrites और axons (चित्र 1ए) अपरिवर्तनीय रूप से क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स के एक उच्च अंश में परिणाम कर सकते हैं.

प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में, हम सब्सट्रेट से न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए एक proteolytic एंजाइम के साथ ऊष्मायन का इस्तेमाल किया. आमतौर पर, न्यूराइट्स की मोटी जाली के कारण (चित्र 1ए), कोशिकाएं एक ही सिंकिटिशियल-जैसे परत के रूप में सभी को एक साथ अलग करती हैं, जो अक्सर कुएं में तैरने लगती है (चित्र 1ग)। यह काफी जल्दी होता है, और शायद यही वजह है कि ज्यादातर प्रयोगशालाओं के लिए अपनी पसंद के proteolytic एंजाइम के साथ ऊष्मायन के केवल 5 मिनट के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा करते हैं, और तुरंत trituration द्वारा कोशिकाओं की चादर को तोड़ने के लिए (यह ऊपर और नीचे पाइपिंग). हालांकि, इस यांत्रिक हेरफेर न्यूरॉन्स के लिए उच्च तनाव में परिणाम प्रकट होता है. हमारा मानना है कि तनाव की डिग्री न्यूरॉन नेटवर्क द्वारा कवर क्षेत्र के लिए आनुपातिक हो सकता है, क्योंकि हम पाते हैं कि अपर्याप्त protease ऊष्मायन से स्पष्ट क्षति के लिए अधिक से अधिक है 10 सेमी या बड़ा प्लेटों के लिए की तुलना में 35 मिमी या छोटे प्लेटें. इस प्रकार, प्रतिबोधात्मक रूप से, हमने पाया कि एंजाइमी ऊष्मायन को 40-45 मिनट तक बढ़ाना सेल वियोजन के समय कोशिका मृत्यु को कम कर देता है (चित्र 1ब्) और जीवित, स्वस्थ कोशिकाओं के अधिक कुशल पुनर्प्राप्ति की अनुमति देता है जो घंटों से अधिक प्रक्रियाओं का उत्सर्जन करते हैं दिन के बाद replating के लिए (चित्र 1बी). शायद, एक हल्के proteolytic एंजाइम के साथ विस्तारित ऊष्मायन समय प्रोटीन के आंशिक पाचन कि दृढ़ता से कोशिकाओं और उनकी प्रक्रियाओं का पालन एक दूसरे के लिए और extracellular मैट्रिक्स के लिए अनुमति देता है. यह resuspension प्रक्रिया कुशलता से अत्यधिक जोरदार trituration के लिए आवश्यकता के बिना अलग-अलग कोशिकाओं को अलग करने के लिए काम करने के लिए अनुमति देता है।

विस्तारित एंजाइम ऊष्मायन प्रक्रिया की प्रभावशीलता को परिमाणित करने के लिए, हमने ट्रिपैन ब्लू(चित्र 1ब्) का उपयोग करके त्रिगुण के तुरंत बाद निलंबित कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया , और बाद में 1, 3 और 7 दिनों के बाद एक प्रारंभिक सेल का उपयोग करके पुनः प्लेटिंग मृत्यु मार्कर (चित्र 2)। ट्रिटिओटेशन के तुरंत बाद, ट्राइपैन ब्लू धुंधला ने संकेत दिया कि प्रोटीओलिटिक एंजाइम के साथ 45 मिनट के ऊष्मायन की तुलना में 5 मिनट के ऊष्मायन के बाद काफी अधिक कोशिका मृत्यु हुई थी (चित्र 1ब्)। दो iPSC लाइनों हम इस अवलोकन वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग तंत्रिका जनक चरण से न्यूरॉन्स में विभेदित थे, और replating प्रक्रिया के लिए मोटे तौर पर अलग संवेदनशीलता से पता चला. WT126 लाइन से संस्कृति NPCs में विभेदित "rosette चयन विधि"7 का उपयोग कर CVB WT24 लाइन से भेदभाव संस्कृतियों की तुलना में नुकसान के प्रति अधिक संवेदनशील थे एक तेजी से भेदभाव विधि8का उपयोग कर. फिर भी, दोनों लाइनों के लिए तत्काल सेल मौत की डिग्री लगभग विस्तारित एंजाइम ऊष्मायन प्रक्रिया का उपयोग करके आधा था.

replating के बाद, संस्कृतियों विस्तारित एंजाइम ऊष्मायन प्रक्रिया का उपयोग कर बाद के दिनों में सेल व्यवहार्यता के एक अनुमानित दोहरीकरण का प्रदर्शन किया, के रूप में DAPI सकारात्मक कोशिकाओं के घनत्व द्वारा निर्धारित (चित्र2बी,बाईं ओर ग्राफ). इसके अतिरिक्त, विस्तारित एंजाइम ऊष्मायन के परिणामस्वरूप डाई-निष्कर्ष व्यवहार्यता किट (चित्र2बी, दाईं ओर ग्राफ) का उपयोग करके पता लगाया गया मृत या मरती कोशिकाओं का घनत्व कम हो गया। मृत कोशिकाओं का अंश 24 एच के बाद व्यवहार्यता परख का उपयोग कर पता चला है कि trituration के तुरंत बाद trypan नीले रंग का उपयोग कर देखा से अधिक था. यह शायद इन पहले 24 एच पर मृत और मर कोशिकाओं के संचय को दर्शाता है, हालांकि यह भी संभव है कि व्यवहार्यता परख अधिक संवेदनशील trypan नीले परख से सेल मौत का पता लगाता है. मृत कोशिकाओं का पता लगातार 1-7 दिनों के बाद (चित्र2बी) का पता लगाया जाता रहा। दोनों प्रयोगात्मक समूहों (5 मिनट और 45 मिनट) के लिए प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व समान था और हेमोसाइटोमीटर के बाद के सेल गिनती के आधार पर- trituration सेल निलंबन. महत्वपूर्ण बात, सभी समय अंक के बाद replating, जीने की संख्या, स्वस्थ कोशिकाओं लगभग 5 मिनट ऊष्मायन की तुलना में 45 मिनट एंजाइम ऊष्मायन के बाद दोगुनी हो गई थी. इन प्रेक्षणों की गुणात्मक रूप से पुष्टि की गई थी, प्रत्येक चरण पर कोशिका आकारिकी की निगरानी करने के लिए चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके: पुनः प्लेटिंग के दौरान, और पुनः प्लेटिंग के बाद (चित्र 1 और चित्र2)।

HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स replating के लाभ में से एक के बाद वे कई हफ्तों के लिए अलग किया गया है कि कोशिकाओं के अधिकांश संतान चरण से बाहर निकल गया है और replating के समय में एक न्यूरॉन phenotype के लिए प्रतिबद्ध हो जाएगा. तंत्रिका संतति से न्यूरोनल भेदभाव के संक्रमण चरण कई दिनों में जगह लेता है, कोशिकाओं की अधिक से अधिक संख्या के साथ धीरे-धीरे प्रारंभिक चरण न्यूरॉन मार्करों व्यक्त, जैसे बीटा-III ट्यूबुलिन (एंटीबॉडी TuJ1 द्वारा पता लगाया) या MAP2. जीन अभिव्यक्ति कई हफ्तों से अधिक विकसित, अंततः देर से चरण पैन-न्यूरॉनल मार्करों की अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप, जैसे NeuN, या ऐसे CTIP2 के रूप में cortical न्यूरॉन्स के लिए सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों. इसलिए, पहले से विभेदित hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के replating एक इस तरह के न्यूराइट दीक्षा के रूप में जल्दी और क्षणिक न्यूरॉन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, न्यूरॉन्स की पहचान उपप्रकारों में. चित्र 3 संस्कृतियों है कि एक बड़ा संस्कृति पकवान में पूर्व भेदभाव के 4 सप्ताह के बाद replated थे में जल्दी न्यूरॉन मार्करों की तत्काल उपस्थिति दिखाता है. ध्यान दें कि न्यून- और CTIP2-अभिव्यक्त न्यूरॉन्स की पहचान कुछ दिनों के भीतर पुनः प्लेटिंग के बाद की जाती है (चित्र3)। लक्षण और न्यूरोनल भेदभाव के समय HIPSC लाइनों के बीच भिन्न हो सकते हैं. WT 126 लाइन और CVB WT24 लाइनों हम यहाँ का वर्णन के लिए, 85 - 12% (एन $ 2) और 52 ] 11% (एन $ 5) कोशिकाओं की, क्रमशः, विस्तारित प्रो इनक्यूबेशन प्रक्रिया का उपयोग कर replating के बाद 4 दिनों में $III-tubulin मार्कर TuJ1 के लिए इम्यूनोरेक्टेशन व्यक्त की। दोनों लाइनों के लिए, कोशिकाओं के 30-40%, और न्यूरॉन्स के 80-90% भी परत व्यक्त 5/6 neocortical मार्कर CTIP2. बेहतर व्यवहार्यता के अलावा, विस्तारित प्रोटीज़ प्रोटोकॉल ने भी मामूली रूप से न्युराइट आउटग्रोथ (प्रति न्यूरॉन औसत न्यूराइट लंबाई) को बढ़ाया, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। दोनों कुल न्यूराइट लंबाई (एंटीबॉडी Tuz1 का उपयोग कर मात्रा, जो दोनों axons और dendrites दाग; चित्र 4 बी,बाएँ ग्राफ) और डेन्ड्राइट वृद्धि (MAP2 का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई है, जो केवल डेन्ड्राइट पर दाग लगता है; चित्र 4 बी,केंद्र ग्राफ) विस्तारित प्रोटीज ऊष्मायन प्रक्रिया का उपयोग करते समय इष्ट थे। ध्यान दें कि चित्र 2 में DAPI-सकारात्मक (DAPI (+)) कक्ष गणनाओं का ग्राफ उसी छवि नमूनों पर आधारित होता है, जैसा कि चित्र 4में सेल काउंटग्राफ में किया गया था, लेकिन चित्र 2 में उन्हें फिजी सॉफ्टवेयर द्वारा सहायता प्राप्त एक गैर-स्वचालित विधि का उपयोग करके परिमाणित किया गया था, जबकि चित्रा 4 में वे स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर मंच CellProfiler का उपयोग कर परिमाणित किया गया. इन दो छवि विश्लेषण दृष्टिकोण इसी तरह के परिणाम मिले.

Replating न केवल neurite outgrowth का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, लेकिन यह भी synapses या न्यूरॉन्स के अन्य बाद में प्रदर्शित जैविक सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए. वास्तव में, सिर्फ एक सप्ताह के बाद replating के बाद हम कई presynaptic और postynaptic प्रोटीन के लिए मार्करों का निरीक्षण एक punctate पैटर्न में न्यूरोनल dendrites सजाने (चित्र 5ए). 4 सप्ताह के बाद हम उनके सहस्थानीकरण का भी पता लगाना शुरू करते हैं, जो कार्यात्मक synapses के गठन का सूचक है (चित्र 5क)। इसके अलावा, सहज depolarization और synaptically संचालित धाराओं से विद्युत गतिविधि कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग कर पता लगाने योग्य है (चित्र 5बी) या multielectrode सरणियों (MEAs).

Figure 1
चित्र 1 : सेल वियोजन के लिए प्रोटीओलिटिक एंजाइम के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन के बाद न्यूरोनल व्यवहार्यता का बेहतर संरक्षण। (क) एनपीसी व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की चरण विपरीत छवि 3 सप्ताह के लिए विभेदित। बाईं छवि में बॉक्स्ड क्षेत्र दाईं ओर बढ़ा है. इस स्तर पर न्यूरॉन्स लंबी प्रक्रियाओं है, जो एक मोटी meshwork फार्म. स्केल बार्स ] 80 डिग्री मी (बाएं); 35 डिग्री मी (दाएं)। (बी) 1 और 5 दिनों के बाद replating पर HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के चयनित छवियों. स्केल बार - 100डिग्री मी. (सी ) बाएँ: कोशिकाएं प्रोटीज़ उपचार शुरू करने के कुछ ही मिनटों के भीतर एक शीट के रूप में अलग हो जाती हैं। स्केल बार ] 200 डिग्री मी. दाएँ: trituration कोशिकाओं के बाद replating से पहले हीमोसाइटोमीटर पर गिना जाता है. रेखांकन दो अलग अलग लाइनों CVB WT24 (* * पी और lt; 0.0003, unpaired टी-परीक्षण) और WT 126 (* * पी और lt; 0.0001, unpaired परीक्षण) के लिए proteolytic एंजाइम के साथ 5 मिनट या 45 मिनट इनक्यूबेशन के बाद गैर-व्यवहार्य, trypan-नीले सकारात्मक कोशिकाओं के परिमाणीकरण दिखा। मान माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं - 4 व्यक्तिगत प्रतिकृतियों के S.E.M. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : कई दिनों के बाद replating के बाद तंत्रिका व्यवहार्यता. (ए) WT126 एनपीसी व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की छवियाँ 1 और 3 दिनों के बाद 5 मिनट और 45 मिनट protease इनक्यूबेशन का उपयोग कर replating. मर कोशिकाओं संवेदनशील जल्दी सेल मौत रिपोर्टर के साथ लेबल रहे हैं. संगत ब्राइटफील्ड छवियों को बाईं ओर दिखाया गया है। कुछ सेलुलर मलबे (नीले तीर) आम तौर पर replating के बाद पता चला है, विशेष रूप से 5 मिनट समूह में. स्केल बार ] 150 $m. (बी) CVB WT24 एनपीसी व्युत्पन्न संस्कृतियों की छवियाँ 1, 3 और 7 दिनों के बाद 5 मिनट और 45 मिनट protease ऊष्मायन का उपयोग कर replating. डाइंग कोशिकाओं संवेदनशील जल्दी सेल मौत रिपोर्टर (लाल) के साथ लेबल रहे हैं. जीवित और मर कोशिकाओं के सभी नाभिक DAPI (सियान) के साथ लेबल कर रहे हैं. मर्ज किए गए सफेद संकेत DAPI और VivaFix-positive (+) कक्षों का प्रतिनिधित्व करता है। कुछ कोशिकाओं VivaFix धुंधला प्रदर्शन लेकिन DAPI धुंधला कमी (सही पर संयुक्त छवि में लाल कोशिकाओं); इन कोशिकाओं की संभावना है कि कई घंटे के लिए मर चुके थे. स्केल बार: 25 डिग्री मी. दाएँ ग्राफ प्रोटीओलिटिक एंजाइम के साथ अलग-अलग ऊष्मायन समय के बाद मृत कोशिकाओं (VivaFix/DAPI) के अंश की मात्रा से पता चलता है (5 मिनट बनाम 45 मिनट: * p;lt; 0.05 1 d और * * p और lt; 0.001, 3 d; दो-वे ANOVA, multifer Bononi पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद). बाएँ ग्राफ समग्र सेल घनत्व में परिवर्तन से पता चलता है ($ DAPI(+) 5 मिनट बनाम 45 मिनट के लिए कोशिकाओं: * * पी और lt; 0.0001 सभी समय अंक के लिए; दो तरह ANOVA, multicomparison Bonferroni के बाद हॉक परीक्षण के बाद). सभी मूल्यों मतलब के रूप में दिखाया गया है - 3 प्रतिकृति के S.E.M, 1500 कोशिकाओं की एक न्यूनतम शर्त के अनुसार रन बनाए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : replating के तुरंत बाद देर से चरण न्यूरॉन मार्करोंका पता लगाने योग्य अभिव्यक्ति। CVB WT24 hiPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं की संस्कृति replating के बाद 4 दिन छवि, 45 मिनट protease इनक्यूबेशन का उपयोग कर, एक 10 सेमी पकवान है कि 4 सप्ताह के लिए एनपीसी चरण से अलग किया गया था से. दिखाए गए उदाहरण पैन-न्यूरोनल मार्कर TuJ1, MAP2, या NeuN के लिए दाग थे; या गहरी परत cortical पिरामिड न्यूरॉन मार्कर CTIP2. व्यापक neurites की उपस्थिति, और TuJ1 और MAP2 के मजबूत अभिव्यक्ति नोट करें. विशेष रूप से ध्यान दें कि न्यूरॉन्स का एक बड़ा अंश भी देर से मंच मार्करों NeuN और CTIP2 व्यक्त करता है. स्केल बार ] 16 $m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : replating के दौरान छोटे और लंबे समय तक एंजाइम ऊष्मायन के बाद समय के साथ न्यूराइट और डेन्ड्रेट विकास। (ए) Replated CVB WT24 HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स जल्दी से neurites का विस्तार, के रूप में एंटीबॉडी Tuz1 का उपयोग कर पता चला. ध्यान दें कि विस्तारित प्रोटीज़ ऊष्मायन समय न्यूरिटोजेनेसिस को बढ़ावा देता है। स्केल बार - 25 डिग्री मी. (बी) न्यूराइट और डेन्ड्रेट लंबाई का परिमाणीकरण, 1, 3 और 7 दिनों के बाद या तो 5 मिनट या 45 मिनट protease का उपयोग कर के बाद replating. कुल न्यूराइट लंबाई TuJ1 से मात्रा निर्धारित किया गया था ([III-tubulin) धुंधला; dendrite-विशिष्ट धुंधला MAP2 धुंधला snf समग्र सेल घनत्व (सही ग्राफ) के लिए सही से मात्रा निर्धारित किया गया था. सभी मानों को 3 प्रतिकृतियों के S.E.M के रूप में दर्शाया गया है। Neurite लंबाई 5 मिनट बनाम 45 मिनट: * पी और lt; 0.05 पर 1 दिन और 7 दिन, * पी और lt; 0.01 पर 3 दिन; dendrite लंबाई 5 मिनट बनाम 45 मिनट: * पी और lt; 0.01 पर 1 दिन और 3 दिन, 7 दिन में महत्वपूर्ण (एन एस) नहीं; $ DAPI(+) 5 मिनट बनाम 45 मिनट: * * पी और lt; सभी समय अंक के लिए 0.0001; दोन्ही प्रकारच्या आणि बहुसंख्य बँकांनी पोस्ट हॉक टेस्ट केले आहे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : Synaptogenesis और सहज कैल्शियम replating के बाद विभेदित hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में यात्रियों. (A) वाम: विस्तारित प्रोटीज़ इनक्यूबेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 4 सप्ताह के बाद, presynaptic मार्कर synapsin 1 MAP2 सकारात्मक dendrites साथ punctate समूहों में डिटेक्टेबल है। स्केल बार्स $ 5 $m. दाएँ: चयनित डेन्ड्रिटिक क्षेत्र presynaptic और postsynaptic समूहों (पीला तीर), संभावित सक्रिय synapses का एक संकेत के बीच colocalization दिखा. स्केल बार ] 1.5 m. (बी) बाएँ: HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स AAV8-syn-JGCaMP7f-WPRE से संक्रमित नेटवर्क गतिविधि द्वारा संचालित सहज कैल्शियम यात्रियों की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया. Brightfield छवि समय चूक श्रृंखला में एक ही समय बिंदु पर GCaMP7 फ्लोरोसेंट के छद्म रंग प्रतिपादन के बगल में दिखाया गया है. स्केल बार - 25 डिग्री मी. रंगीन संख्याएं उन 4 चयनित कोशिकाओं को इंगित करती हैं जिनमें GCaMP7 फ्लोरोसेंट को समय के साथ मापा गया था, जैसा कि दाईं ओर अंश में दिखाया गया है। प्रत्येक रंगीन ट्रेस एक सेल से मेल खाती है. तारांकन लाइव रिकॉर्डिंग के दौरान समय को इंगित करता है जिससे बाईं ओर की छवि मेल खाती है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए संस्कृति hiPSCs के लिए replating प्रक्रियाओं का कार्य प्रवाह और / एक बड़ा प्रारूप में 4 या अधिक सप्ताह के लिए बड़े न्यूरॉन्स की एक विभेदित संस्कृति से शुरू (उदाहरण के लिए, एक 10 सेमी संस्कृति पकवान), न्यूरॉन्स 40-45 मिनट के लिए एक protease के साथ incubated रहे हैं, धीरे से अलग करने के लिए triturated और resuspend. कोशिकाओं तो एचसीएस के साथ संगत बहु कुओं में वितरित कर रहे हैं, इमेजिंग विकास शंकु (पीला तीर) या अन्य संरचनाओं के साथ संगत substrates पर replated, या multielectrode सरणी रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त बहु-वेल्स पर. स्केल बार्स - 27 डिग्री मी, 5 डिग्री मी, 2.5 डिग्री मी, 130 डिग्री (बाएं से दाएं)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम resuspension और मानव न्यूरॉन संस्कृतियों है कि व्यवहार्यता का अनुकूलन के replating के लिए एक सीधे आगे प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है, भेदभाव सफलता, और subcellular इमेजिंग एक तरह से है कि उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के साथ संगत है में, और अन्य दवा की खोज के लिए प्रासंगिक परख. चित्र 6 समग्र कार्यप्रवाह और ऐसे अनुप्रयोगों के उदाहरण दिखाता है.

हालांकि यहाँ हम hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स कि एक cortical न्यूरॉन भाग्य की ओर निर्देशित कर रहे हैं पर ध्यान केंद्रित, हम उम्मीद है कि इस विधि मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के लिए समान रूप से लागू होना चाहिए, और स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के लिए अन्य की ओर निर्देशित तंत्रिका फीनोटाइप्स14,15,16,17,18. इसके अलावा, हम इस विस्तारित protease प्रक्रिया अन्य स्थितियों है कि एक स्थापित neurite meshwork होने कोशिकाओं के resuspension की आवश्यकता के लिए फायदेमंद हो सकता है कि, उदाहरण के लिए FACS छँटाई या प्राथमिक न्यूरॉन्स के एकल सेल विश्लेषण के लिए19 , 20|

HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स replating एक व्यवहार्य मॉडल प्रणाली है जिसमें कई प्रमुख जैविक घटनाओं के सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, इस प्रक्रिया मानव neurite वृद्धि और विकास शंकु विशेषताओं के विस्तृत अध्ययन की सुविधा, और व्यापक ज्ञान के आधार के लिए निष्कर्षों की तुलना अन्य प्रजातियों के अध्ययन के दशकों से बनाया जा सकता है, दोनों कशेरुकी और अकशेरुकी. हम पाते हैं कि पुनः प्लेटिंग प्रक्रिया ने बड़े विकास शंकु उत्पन्न करने के लिए स्थितियों का अनुकूलन करना आसान बना दिया है जो उपकोशिकीय संरचना और प्रकार्य के ऑप्टिकल मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से उपयुक्त हैं (चित्र6)। तुलना करके, विकास शंकु अधिक आम तौर पर hiPSCs से न्यूरॉन्स के प्रारंभिक भेदभाव के दौरान मनाया छोटे और कॉम्पैक्ट हो जाते हैं, और ऐसी संस्कृतियों में गैर-न्यूरॉनकोशिका कोशिकाओं के घने सरणी यह मुश्किल दोनों सब्सट्रेट शर्तों को समायोजित करने के लिए बनाता है विकास शंकु प्रसार को बढ़ावा देने और जटिल ऊतक वातावरण के भीतर व्यक्तिगत विकास शंकु छवि के लिए. इस प्रकार, एक ताजा पकवान पर न्यूरॉन्स replating एक "क्लीनर स्लेट" जिस पर अच्छा इमेजिंग शर्तों के तहत विकास शंकु को देखने के लिए प्रदान करता है.

REplating विशेष रूप से फायदेमंद है जब सेल संस्कृति HCS के लिए उपयुक्त प्लेटफार्मों का उपयोग कर, क्योंकि यह बहुत कुल समय जिसमें संस्कृतियों छोटे संस्करणों में बड़े हो रहे हैं कम कर देता है. 96, 384 या 1536-वेल बहु-वेल्स (लगभग 100, 50 और 5 माइक्रोलीटर काम करने की मात्रा, क्रमशः) के व्यक्तिगत कुओं के छोटे काम की मात्रा आमतौर पर अक्सर की आवश्यकता होती है (यानी, दैनिक) मीडिया परिवर्तन वाष्पीकरण और पोषक तत्वों की कमी प्रतिक्रिया करने के लिए। लगातार मीडिया में परिवर्तन महंगा कर रहे हैं, न केवल अभिकर्मकों और श्रम के मामले में, लेकिन वे वातानुकूलित मीडिया को कम करके संस्कृतियों की व्यवहार्यता समझौता कर सकते हैं और संभावना है कि कोशिकाओं यांत्रिक अशांति के कारण सब्सट्रेट से अलग बढ़ रही है. एच आई पी एस सी के पुनः प्लेटिंग से मल्टीइलेक्ट्रोड सरणियों21,22या गतिशील न्यूरोनल फेनोटाइप23के परखों में संस्कृतियों के लाइव इमेजिंग का उपयोग करके शारीरिक क्रियाकलापों की रिकॉर्डिंग को भी सुविधाजनक बनाया जा सकता है .

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह कार्य मानसिक बीमारी का अध्ययन करने के लिए राष्ट्रीय सहकारी पुनर्-प्रोग्रामित सेल अनुसंधान समूह (एनसीआरसीआरजी) का एक घटक है और इसे एनआईएच अनुदान यू 19एमएचएच1 2015-0644 द्वारा समर्थित किया गया था। प्रारंभिक कार्य भी NIH अनुदान NS070297 द्वारा समर्थित किया गया था. हम Drs. कैरोल Marchetto और फ्रेड पण, Salk संस्थान, तंत्रिका जनक कोशिकाओं के WT 126 लाइन प्रदान करने के लिए धन्यवाद, और Drs. यूजीन येओ और लॉरेंस Goldstein, यूसी सैन डिएगो तंत्रिका जनक कोशिकाओं की CVB WT24 लाइन प्रदान करने के लिए. हम डॉ ऐनी बैंग, Sanford Burnham Prebys चिकित्सा डिस्कवरी संस्थान की प्रयोगशाला में डेबोरा पूर्व धन्यवाद, उपयोगी विचार विमर्श के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Post Replating Media
L-Ascorbic Acid Sigma A4403 Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media
Dibutyryl-cAMP Sigma D0627 Add 1 µM
Human BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml final concentration
B27 (50x) Thermofisher Scientific 17504044 Add 20 mL to 1 L N2B27 media
DMEM/F12 with Glutamax Thermofisher Scientific 31331093 Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids
Human GDNF Peprotech 450-10 10 ng/mL final concentration
Glutamax Thermofisher Scientific 35050038 Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement
Mouse Laminin Sigma P3655-10mg Add 100 µL to 50 mL N2B27
MEM Nonessential Amino Acids Thermofisher Scientific 11140035 Add 5 mL to 1 L N2B27 media
N2 (100x) Supplement Life Technologies 17502048 Add 5 mL to 500 mL media
Neurobasal A Media Thermofisher Scientific 10888022 Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media
Neurobasal Media Thermofisher Scientific 21103049 for WT126 cells; neural basal media
SM1 Supplement StemCell Technologies 5711 Add 1:50 to media
Sodium bicarbonate Thermofisher Scientific 25080-094 Add 10 mL to 1 L N2B27 media
Plate Preparation
10 cm Tissue Culture Dishes Fisher Scientific 08772-E Plastic TC-treated dishes
6-well Tissue Culture Dishes Thomas Scientific 1194Y80 NEST plates
Mouse Laminin Life Technologies 23017-015 Add 1:400 on plastic
Poly-Ornithine Sigma P3655-10mg Add 1:1,000 on plastic
UltraPure Distilled Water Life Technologies 10977-015 To dilute Poly-L-Ornithine
Replating Reagents
100 mM Cell Strainer Corning 431752 Sterile, individually wrapped
384-well plate, uncoated PerkinElmer 6007550 Coat with PLO and Laminin
DPBS Life Technologies 14190144 Dulbecco's phosphate-buffered saline
Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates PerkinElmer 6057500 Rinse before coating with laminin
StemPro Accutase Life Technologies A1110501 Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme
Fixation Materials
37% Formaldehyde Fisher Scientific F79-1 Dissolved in PBS
Sucrose Fisher Scientific S5-12 0.8 g per 10 mL of fixative
Immunostaining Materials
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse Invitrogen A-11001 secondary antibody
Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken Invitrogen A-11041 secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken Invitrogen A-21449 secondary antibody
Alexa Fluor 561 Goat anti-rat Invitrogen A-11077 secondary antibody
DAPI Biotium 40043 visualizes DNA
Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) Neuromics MO15013 early stage neuronal marker
Rat antibody against CTIP2 Abcam ab18465 layer 5/6 cortical neurons
Chicken antibody against MAP2 LifeSpan Biosciences LS-B290 early stage neuronal marker
Chicken antibody against NeuN Millipore ABN91 late stage neuronal marker
Rabbit antibody against MAP2 Shelley Halpain N/A early stage neuronal marker
Mouse antibody against PSD-95 Sigma P-246 post-synaptic marker
Rabbit antibody against Synapsin 1 Millipore AB1543 pre-synaptic marker
Bovine serum albumin (BSA) GE Healthcare Life Sciences SH30574.02 10% in PBS for blocking
Titon X-100 Sigma 9002931 Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization
Viability Markers
Vivafix 649/660 Biorad 135-1118 cell death marker
Calcium Imaging
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility N/A calcium reporter in a viral delivery system
hiPSC-derived NPCs
WT 126 (Y2610) Gage lab N/A Marchetto et al., 2010
CVB WT24 Yeo and Goldstein labs N/A unpublished

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References

  1. Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
  2. Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
  3. Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
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  5. Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
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Neuritogenesis और Synapse परिपक्वता की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए मानव Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के बाद भेदभाव replating
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Calabrese, B., Powers, R. M., Slepian, A. J., Halpain, S. Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation. J. Vis. Exp. (150), e59305, doi:10.3791/59305 (2019).

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