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Biochemistry

使用免疫过氧化物酶和免疫荧光方法鉴定成年斑马鱼中的奥列辛和内他大麻素受体

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

这里介绍的是免疫组织化学表征和定位的orexin肽,orexin受体,和内分泌大麻素受体在肠道和大脑中正常和饮食诱发肥胖(DIO)成年斑马鱼模型使用免疫渗透酶和双免疫荧光法。

Abstract

免疫组织化学(IHC)是一种高度敏感和特异性的技术,涉及在带有标记抗体的组织部分检测靶抗原。这是一个多步骤过程,其中每个步骤的优化对于获得最佳特定信号至关重要。通过IHC,可以检测出特定生物标志物的分布和定位,揭示进化保护的信息。此外,IHC还有助于了解生物标志物在病理条件下(如肥胖)的表达和分布变化。IHC,主要是免疫荧光技术,可用于成年斑马鱼检测植物遗传保护分子的组织和分布,但标准的IHC协议没有被破坏。Orexin和内分泌大麻素是两个高度保守的系统,涉及控制食物摄入量和肥胖病理学。这里报道的是用于获取有关orexin肽(OXA)、orexin受体(OX-2R)以及大麻素受体(CB1R)的定位和分布在肠道和大脑中正常和饮食诱发的肥胖(DIO)成年斑马鱼模型的信息的协议。还介绍了免疫过氧化物酶和双免疫荧光的方法,以及试剂的制备、固定、石蜡嵌入和斑马鱼组织的冷冻保护,以及内源性活动阻断步骤和背景的准备反染色。完整的参数集来自以前的IHC实验,通过这些实验,我们展示了免疫荧光如何帮助理解OX、OX-2R和CB1R在成年斑马鱼中的表达分布、定位和保存组织。生成的具有高度特异性信号强度的图像证实斑马鱼是适合于特定生物标志物分布、定位和进化保护的免疫组织化学研究的动物模型。生理和病理状况。这里介绍的协议推荐用于成人斑马鱼的IHC实验。

Introduction

免疫组织化学(IHC)是一种公认的经典技术,用于通过抗原-抗体相互作用1,2识别细胞或组织成分(抗原)。它可用于识别组织内目标生物分子的定位和分布。IHC使用免疫学和化学反应来检测组织第3部分的抗原。用于抗原-抗体相互作用可视化的主要标志物包括荧光染料(免疫荧光)和酶-基质颜色反应(免疫过氧化物酶),两者均与抗体4结合。使用微观观察可以确定标记组织的定位,这大约对应于组织中目标抗原的定位。

荧光或色原反应检测蛋白质的两种方法:直接检测方法,即直接标记特定原抗体的方法;间接检测方法,其中原抗体未结合,而二级抗体携带标签5,6,7。间接方法具有一些优点,主要是信号放大。此外,与其他分子和细胞技术不同,免疫荧光,可以可视化两个或两个以上蛋白质在细胞和组织7中不同表达的分布、定位和共表达。所使用的检测方法的选择取决于实验细节。

迄今为止,IHC被广泛用于基础研究,作为了解生物标志物的分布和定位以及从人类到无脊椎动物在生物组织中不同蛋白质的一般轮廓的有力和必要的工具。9,10,11.该技术有助于显示大量正常和改变的动物器官和不同组织类型的蛋白质表达图,显示生理和病理变化引起的表达可能向下或向上调节。IHC是一种高度敏感的技术,需要准确性和正确选择方法才能获得最佳结果12。首先,许多不同的因素,如固定,交叉反应,抗原检索,和抗体的敏感性可能导致假阳性和假阴性信号13。抗体的选择是IHC中最重要的步骤之一,取决于抗原特异性及其与被调查的蛋白质和物种的亲和力。

最近,我们优化了IHC技术,以检测成年斑马鱼组织中的奥西辛/脱脂素和内分泌大麻素系统的成员。我们主要专注于固定,组织嵌入使用两种不同的方法,切片和安装(这会影响分辨率和细节在微观分析),和阻塞(防止误报和减少背景)14。其他重要特征是单个IHC协议的抗体特异性和选择性和可重复性。提供抗体特异性的关键是使用阴性对照(包括没有已知不表达目标蛋白的初级抗体或组织)以及阳性对照(包括已知表达目标蛋白的组织)15.IHC抗体的选择基于其物种特异性(它们与感兴趣的抗原发生反应的可能性)和使用4、5、6的抗原抗体结合检测系统 ,7.在免疫过氧化物酶的情况下,反应的颜色是由沉淀的色原的选择决定的,通常是二氨基苯胺(棕色)16。另一方面,i mmunofluoresence 利用与荧光团结合的抗体来可视化冷冻组织部分的蛋白质表达,并可轻松分析与染色体检测系统相及的多种蛋白质5,7.

在免疫过氧化物酶技术中,二次抗体与生物蛋白结合,生物锡是一种链接分子,能够招募致色报告分子[avid-生物蛋白复合物(ABC)],导致染色信号的放大。使用ABC报告器方法,过氧化物酶与3,3'-二氨基苯甲酸酯(DAB)发生反应,产生强烈的棕色染色,酶与二级抗体结合,然后用普通光学显微镜进行分析。ABC染色,由于阿维丁对生物锡的高亲和力,产生快速和最佳的反应,很少有二级抗体附着在原抗体反应的部位。这种色谱检测方法允许对信号进行密度分析,提供基于棕色信号水平与蛋白质表达水平18相关性的半定量数据。

使用免疫荧光技术,由于不同荧光铬能够以独特的波长发出光,可以同时检测多种蛋白质,但仔细选择荧光铬以尽量减少光谱重叠非常重要。5.此外,在不同宿主物种中使用原抗体可最大限度地减少交叉反应方面的困难。在这种情况下,每个物种特异性的二级抗体只识别一种类型的原发抗体。荧光记者是小有机分子,包括商业衍生物,如Alexa氟染料。

许多动物模型用于了解特定的生理和病理条件。迄今为止,已经确定许多代谢途径在进化过程中被保存。因此,在斑马鱼等模型生物体上的IHC研究,可以深入了解病理和非病理状况的起源和维持17。本报告旨在说明可在成年斑马鱼组织上执行的IHC协议,用于获取OXA、OX-2R和CB1R在外围和中央层面的分布和定位的详细图像。报告还报告了在成年斑马鱼的周围和中心组织中应用两种主要IHC间接方法的协议。描述是间接方法,它允许在二级抗体与荧光染料(免疫荧光法)或酶报告器(免疫过氧化物酶方法)结合的情况下进行信号扩增。色化检测和荧光检测方法各有优缺点。该协议中报告是在成年斑马鱼中使用IHC,主要是免疫荧光,一种动物模型,广泛用于研究在不同生理和病理条件下进化保存的系统。

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Protocol

1. 免疫过氧化物酶方案

注:斑马鱼是由Omid Safari教授(伊朗马什哈德马什哈德费尔多西大学自然资源和环境系渔业系)获得。

  1. 组织解剖
    1. 通过浸入冰水中牺牲斑马鱼(5部分冰/1部分水,4°C);离开他们,直到停止所有运动,以确保死亡的缺氧。
    2. 使用以下解剖方法快速切除肠道和大脑:
      1. 将鱼擦干,放在纸巾上,然后放在解剖垫上,阻塞眼窝的腹腔部分和尾巴的肉质部分。
      2. 对于肠道:切皮肤,小心地从鱼的一侧去除皮肤和底层肌肉,直到内部器官可见。从体腔中取出肠子,将其伸出。
      3. 对于大脑:用剃刀取下头部。用钳子从头骨的腹侧取出软组织。打开头骨,从大脑的腹侧取出骨头。从大脑的背侧去除皮肤和头骨。取出大脑。
  2. 组织固定
    1. 在室温(RT)下,将新鲜4%的副质脱甲(PFA)浸入磷酸盐缓冲液(PB,pH 7.4,4°C)3小时,修复解剖组织。
      1. 在 450 mL 蒸馏水 (dH2O) 中溶解 1.755 g 的 NaH2PO4H2O 和 4.575 g 的 Na2HPO4,并调整到 pH 的 pH 7.4,且必要量为 NaOH 1N,从而制备 0.1 M PB。
      2. 通过在热板上搅拌,在 0.1 M PB (pH 7.4) 的 100 mL 中制备 4% PFA 溶解 4 g 的 PFA。当温度达到60°C时,加入2-4滴NaOH 1N,以获得清晰的溶液。在 RT 处将 PFA 保留 4%,并控制 pH。将 pH 调整到 7.4。
        注:组织固定超过4~6小时可能导致过度固定,从而掩盖抗原,限制抗体-表位结合。固定时间取决于组织大小。
  3. 组织嵌入
    1. 将纸巾冲洗5次,每次5分钟,浸入0.1M PB(pH 7.4)。
    2. 通过随后浸入酒精 70%(6 分钟)、80%(6 分钟)、95%(5 分钟)、95%(5 分钟)、100%(1 分钟)和 100%(1 分钟)来脱水组织。
    3. 将组织浸入100%酒精:二甲苯(1:1)10分钟,然后2倍在二甲苯中,每次5分钟。
    4. 直接浸入石蜡,将石蜡(56°C)两次渗透,每次1小时。
    5. 在室温 (RT) 下将组织嵌入石蜡块中,并储存在 RT 直到切片。
  4. 组织切割
    1. 用微缩器将组织切成8微米厚的冠状或下垂部分,并交替将部分收集到水面上的粘合玻璃玻片上,并在38°C下加热。
    2. 在 37°C 下干燥幻灯片,在 37°C 下过夜。
  5. 组织部分的脱蜡和再水化
    1. 将部分浸入二甲苯5分钟,然后浸入二甲苯3分钟。
    2. 通过后续的幻灯片浸入酒精 100% II (1 分钟)、100% I(1 分钟)、95%(1 分钟)、75%(1 分钟)、50% (1 分钟)来补充部分,然后将幻灯片置于 dH2O(5 分钟)中。
      注:在开始反应之前,完全脱蜡部分。如果部分仍然有石蜡的痕迹,在二甲苯中再浸泡5分钟或更长时间。
  6. 抗原检索
    1. 将滑片浸入溶液中,在微波炉中加热 5 分钟,用玻璃酸盐缓冲液(0.01 M,pH 6.0)处理各部分。
    2. 让部分冷却。
    3. 在微波中以最大功率重复5分钟的循环,以完成抗原检索。
      1. 在 100 mL 的 dH2O 中溶解 2.10 g 柠檬酸,在 200 mL 的 dH2O 中将柠檬酸钠 (0.01 M) 与柠檬酸 (0.01 M) 混合,以 1:4 的比例按体积将柠檬酸溶解,从而制备柠檬酸缓冲液(0.01 M),并将 pH 调整到6 使用 HCl 0.1N。
  7. 阻断内源性过氧化物酶
    1. 用耐溶剂笔划分幻灯片上的组织区域。
    2. 用三缓冲盐水溶液(TBS)(0.1 M,pH 7.3)冲洗部分3次,每次5分钟。
      1. 在 950 mL 的 dH2O 中溶解 12.1 g 的 trizma 基和 9 g NaCl,并在 HCl 0.1N 下调节到 pH 7.3,从而制备 0.1 M TBS。
    3. 在RT处,在0.75%H2O2溶液中滑动浸泡,以5分钟的速度阻止内源性过氧化物酶活性。
      1. 准备 0.75% H2O2溶液溶解 5 mL 30% H2O2在 195 mL 的 dH2O。
        注:ndogenos酶可与IHC试剂发生反应,并产生假阳性结果。此外,高度血管化组织表达许多内源性过氧化物酶,这可能导致强烈的非特异性染色和背景水平。处理0.75%H2O2淬火内源性过氧化物酶,并显著减少非特异性背景。
  8. 阻止非特异性宾迪ng 站点和组织渗透
    1. 用TBS/0.4%Triton (TBS-T)阻断缓冲液(含有原发性抗血清(NRS)孵育组织部分,在RT处孵育30分钟,以阻止非特异性结合位点。
      1. 在 100 mL TBS 中溶解 0.4 mL 的 Triton X-100,制备 0.4% Triton。
      2. 通过在 TBS 中溶解包含 0.4% Triton X-100(正常血清 1 mL = 8.2 mL 的 TBS = 0.48 Triton X-100)中的 1% 正常血清,制备阻塞缓冲液 TBS-T 溶液。
        注:根据次生抗体的宿主选择动物血清的种类(例如,使用山羊抗兔子二级抗体时,使用正常的山羊血清)。
  9. 与原抗体的组织孵育
    1. 在RT的潮湿箱中孵育部分过夜,在TBS-T中稀释原抗体。用以下初级抗体染色各部分:
      1. 山羊抗体对OX-2R稀释1:200,识别蛋白质的C端。
      2. 山羊抗体对OX-A稀释1:200[或exin-A(C-19)],识别蛋白质的C端。
        注:确保原抗体与感兴趣的生物分子发生反应。定义主要抗体使用基因对齐作用的生物分子的表位。例如,OX-A 表位已映射在人类 OX-A (O43612) 的 aa 50–100 之间,而 OX-2R 表位已映射在人类 C 端的最后 50 aa 附近。
  10. 二次抗体的组织孵育
    1. 用 0.1 M TBS (pH 7.3) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    2. 在RT用生物仿当二级抗体和兔子抗山羊免疫球蛋白(H+L)与生物蛋白结合孵育1.5小时,然后在TBS-T中稀释1:100。
      注:测试并找出初级和次级抗体的不同稀释,以找到允许减少背景的最佳稀释。
  11. 过氧化物酶反应
    1. 用 0.1 M TBS (pH 7.3) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    2. 用阿维丁生物复合物(ABC)孵育各部分1小时。
      1. 准备 ABC 解决方案,在 TBS 的 5 mL 中添加两滴组件 A,然后加入两滴组件 B。
    3. 用 0.1 M TBS (pH 7.3) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    4. 用色原基质3,3'-二氨基苯甲酰胺-4(DAB)处理各部分。
      1. 制备 DAB 溶液,将 DAB 色原浓缩物加入一滴(约 30 μL)至 1 mL 的 DAB 稀释剂,并在使用前充分混合。
        注:在使用前至少30分钟准备ABC溶液,并将复合物保持在4°C,直到使用后允许稳定的avidin/生物素结合。准备新鲜的 DAB 工作溶液,应用于组织部分,并开发,直到颜色合适。当色原反应将表位位转换为棕色,并且信号强度适合成像时,继续下一步。DAB 开发的时间可能从几秒钟到 10 分钟不等。对于 OX-A 和 OX-2R 1,2 分钟就足够了。小心处理 DAB,因为它具有致癌性。
  12. 组织脱水和安装
    1. 用 0.1 M TBS (pH 7.3) 冲洗所有部分 3x,每次 5 分钟,以停止 DAB 反应。
    2. 通过后续的幻灯片浸入酒精 50%(2 分钟)、75%(2 分钟)、95%(2 分钟)、100% I(2 分钟)、100% II(2 分钟)来脱水部分。
    3. 将2倍的二甲苯浸入其中,每次10分钟,以浸入2倍来澄清切片。
    4. 使用 DPX(二丁基邻苯二甲酸酯二甲苯)安装部分,用于组织学,在幻灯片中添加两滴安装介质,然后缓慢地用盖玻片浇头。
      注:由于组织在脱水期间浸入酒精浓度增加会导致组织酒精渗透和用酒精替代水,确定精确的脱水时间,不要过度脱水组织。脱水后在二甲苯中进行浸入,以澄清组织并去除任何多余的或残留的酒精。
  13. 控制
    1. 重复第1.1~1.12节,省略原抗体和/或用TBS替代原抗体或二级抗体IgG(阴性对照)。
    2. 重复部分1.1~1.12预吸收每个原抗体与过量的相对肽(100毫克肽/1 mL稀释抗血清)。
    3. 使用不同的组织作为正对照(例如,小鼠组织)重复第 1.1-1.12 节。
      注:在开始之前,请新鲜准备所有缓冲区。在每个步骤时,用移液器或滤纸在各部分周围小心地清除多余的液体,始终保持部分湿润。
  14. 图像采集和分析
    1. 使用配备数码相机的显微镜,在恒定的光照下以相同的放大倍率获取数字图像。
    2. 使用成像软件对染色强度进行半定量分析(参见材料表)。
      1. 以 .lif 或 .tiff 文件格式打开捕获的图像,以评估 OX-A 或 OX2-R 正性指数。
      2. 选择"测量"下的按钮,然后单击"手动计数"。通过单击鼠标在正单元格上放置标记,直接从屏幕上计算染色单元格配置文件的数量。
      3. 选择感兴趣的区域 (ROI) 区域 (3 x 103 μm2) 来量化免疫信号密度(光密度、OD)。
      4. 确定分析图像内强度最高(高正)和最小强度(负)的像素,以指定零为背景值(即,没有染色细胞的组织部分)。
      5. 通过处理对数吸收度刻度来评估 OD。在数字图像分析中,DAB 像素强度范围从最暗(0 值)到最亮(255 值)阴影。
      6. 通过绘制以下直方图来确定 OD:日志10(255/I),其中"I"是程序给出的像素强度值,并通过减去背景来确定。
        注:永久稳定的免疫过氧化物酶反应可随时在明场显微镜下分析。在备用截面上执行标记单元格的计数,以避免从相邻截面重复计算同一单元格。

2. 免疫荧光方案

  1. 组织解剖
    1. 如第 1.1 节所述,牺牲和解剖动物。
  2. 组织固定
    1. 在 4°C 下浸入 4% PFA 中 3 小时,修复肠道和大脑。
      1. 如第 1.2.1 节所述,准备 PB 和 4% PFA。
        注:固定时间取决于组织大小。组织固定超过4~6小时可能导致过度固定,从而掩盖抗原并限制抗体表位结合。
  3. 组织嵌入
    1. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗组织 3 次,每次 5 分钟。
    2. 对于冷冻保护,将组织转移到PB(0.1 M,pH 7.4)中的20%蔗糖,并在4°C过夜。然后,将组织转移到0.1 M PB(pH 7.4)中的30%蔗糖,并在4°C下再维持一个晚上。
    3. 将组织嵌入最佳切割温度 (OCT) 化合物块中。为此,准备一小块液氮,取铝箔,切成两半,形成一个锅。含有充满OCT化合物的纸巾必须浸入液氮中,直到OCT化合物冷却。冷冻组织可储存在-80°C,直到切片。
  4. 组织切割
    1. 将冷冻组织块转移到-20°C的低温中,切成10μm的冠状或下垂部分。
    2. 将组织以备用序列部分收集到适合免疫组织化学的胶合玻璃玻片上,并将其储存在-20°C,直到使用。
      注:将幻灯片存储在 -20 °C 和 4°C 之间,放在深色幻灯片盒或幻灯片簿中。
  5. 阻止非特异性结合位点和组织渗透
    1. 使用耐溶剂笔划除幻灯片上的组织区域。
    2. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    3. 用1%正常驴血清在渗透缓冲液PB-Triton X-100 0.3%(PB-T)中孵育30分钟,在RT中渗透细胞膜并阻断非特异性结合位点。
      1. 制备 Triton X-100 0.3% 溶解 0.3 mL 的 Triton X-100 在 100 mL 0.1 M PB (pH 7.4) 中溶解 0.3 mL。
      2. 制备阻断液溶解1%正常驴血清在PB含有0.3%TritonX-100。
        注:用于渗透和阻断缓冲液的血清的动物种类取决于二次抗体的宿主。
  6. 培养与原抗体混合
    1. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
      1. 在RT的湿箱中孵育部分过夜,在PB-T中稀释原抗体。可以使用以下初级抗体的混合:山羊抗体对 OX-2R 稀释 1:100/兔子抗体对 CB1R 稀释 1:100,或山羊抗体对 OX-A 稀释 1:100/兔子抗体对 CB1R 稀释 1:100。
  7. 培养与二次抗体的混合
    1. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    2. 在RT孵育2小时,1)混合驴抗兔子Alexa Fluor 488结合二级抗体和驴抗山羊Alexa Fluor 594-结合二级抗体稀释1:100在PB-T;或2)混合驴抗山羊Alexa Fluor 488-结合二级抗体和驴抗兔子AlexaFluor 594-结合二级抗体稀释1:100在PB-T。
      注:使用在同一动物宿主中开发的二级抗体。正常血清必须属于同一种的二次抗体(例如,使用在驴和驴正常血清中开发的二级抗体)。用含有洗涤剂的阻断缓冲液稀释原抗体和二级抗体,以增加细胞渗透和减少背景。
  8. 组织安装
    1. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    2. 用核染料DAPI(4',6-二酰胺-2-phenylindole)对部分进行反污染,在3 mL的PB中制备溶解1.5μL的DAPI(1mg/mL)。
    3. 带安装介质的盖玻片滑轨(参见材料表)。这种水性安装介质可稳定组织样品和污渍,用于长期使用。荧光样品可储存在黑暗中4°C。要延长氟利昂的使用寿命,请使用抗馈安装介质。
      注:选择良好的安装介质。安装剂最重要的参数之一是折射率(nD),折射率(nD)应为1.5左右,即玻璃的折射率。此处使用的安装介质特别可用于为酶和脂质测定制备的标本(即,不得用酒精上升系列脱水的试样)。
  9. 控制
    1. 重复 2.1-2.8 部分,省略原抗体或二级抗体,或在特定步骤中用 PB(负控制)替换初级或二级抗血清。
    2. 重复部分2.1~2.8,用过量的相对肽(100mg肽/1 mL稀释的抗血清)预吸收每个原抗体。
    3. 在小鼠大脑切片(正控制)上重复第 2.1~2.8 节。
      注:在开始之前,请重新准备所有缓冲区。在每个步骤时,用移液器或滤纸在各路段周围小心地清除多余的液体,始终保持部分的湿度。
  10. 图像采集
    1. 使用配备 x-y-z 电动舞台、数码相机以及采集和图像分析软件(如 NIS-Elements C)的共聚焦显微镜来观察和分析免疫染色部分。使用 5-20-40x 目标获取数字图像。
    2. 在每个可用通道中以低放大倍率(10 倍或 20 倍目标)拍摄每个部分的图像,以组成低放大倍率蒙太奇,提供整个区域的概览,以方便 OX-2R/CB1R 的本地化和文档化解剖共表达。在分析之前,将荧光图像标准化为最大的对比度和叠加。
    3. 收集整个感兴趣区域的连续 Z 堆栈图像。通过六个焦平面(Z 步)采集图像,焦阶为 1~1.8 μm,以覆盖 OX-2R/CB1R 共表达可视化为黄色双锥形的组织体积。使用 Z 电动显微镜分别为每个通道(红色、绿色、蓝色)执行此集合。
    4. 使用成像反卷积软件通过应用十次迭代来对图像进行去卷,并将串行 Z 平面图像折叠到单个最大投影图像中。
    5. 使用 Adobe Photoshop 6.01(加利福尼亚州圣何塞的 Adobe 系统)调整显微图以进行光和对比度。
      注: 在观察过程中执行去卷积步骤以进一步减小背景。将幻灯片曝光限制在光线下,以防止光漂白。
  11. 图像分析
    1. 通过覆盖每只动物的所有感兴趣区域,对交替的 10 μm 厚部分(n = 每组 5 只动物)执行 OX-2R/CB1R 共表达的定量分析。
    2. 通过半自动化的图像分析系统,将 OX-2R/CB1R 共表达量化为黄色正双核的数量。Imagins 软件可以提供更高级别的细节,其中包含有关不同荧光探针之间重叠区域的定量数据。
    3. 使用阈值工具在两个通道中测量信号强度,量化双光。打开 .liff、.tiff 或 .jpg 图像文件,然后选择"图像阈值"。选择"自动设置"或"手动方法"并调节阈值,直到选择所有染色的双色。分析图像中不包含任何免疫标记对象的区域中的像素强度分布,以获得背景阈值。为每个图像单独确定此背景。然后,程序通过将像素强度的基线设置为背景值来删除背景阈值。
    4. 选择"分析"和"测量"并选择要测量的参数(标点强度最小值、最大值和平均值;免疫标记的双核子的数量/密度)。
    5. 在每个部分,使用位于上方或下方的堆栈到最佳对焦平面,沿 4 个 Z 堆栈中的组织体积计算黄色双节。从分析中排除焦点区域。
      注: 在备用节上执行标记单元格的计数,以避免从相邻部分重复计数相同的单元格。

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Representative Results

免疫过氧化物酶染色的代表性数据如图1和图2所示。 成人斑马鱼肠道OX-A和OX-2R分布的免疫组织化学分析表明,OX-A和OX-2R的定位位点不同,在DIO斑马鱼肠道细胞中表达增加。在内肠和前肠的细胞中观察到OX-A的强烈棕色染色(图1A,A1)。OX-A的免疫表达在不同的肠道组成中发出明确的信号,从前向内肠下降(图1B,B1)。负控制用作背景参考,确认OX-A信号的特异性(图1E)。长时间接触色原DAB会导致背景强度增加(图1D)。在DIO肠道的OX-2R免疫表达和对照饮食斑马鱼(图2)也观察到类似的结果。DIO成年斑马鱼中OX-A信号的增加伴随着OX-2R在其它肠道的过度表达(图2B,B1)。

利用免疫荧光,通过免疫过氧化物酶分析获得的数据得到确认,这是成年DIO斑马鱼肠道中OX-A和OX-2R表达在对照方面增加的基础(图3)。此外,使用双免疫荧光,可以获取有关内分泌大麻素受体CB1R的表达及其与OX-A或OX-2R在控制饮食和DIO成年斑马鱼的肠道和大脑中共同定位的信息。免疫荧光的优点是,与免疫过氧化物酶技术相比,它产生更详细的信号,而提供的组织形态信息较少。使用免疫荧光法,我们之前已经确定了OX-2R和CB1R在肠道和大脑10之间的解剖相互作用。

免疫荧光图像的准确分析表明,与对照饮食斑马鱼相比,DIO成年斑马鱼肠道的OX-2R/CB1R共定位增加(图3B,C)。 在不同的大脑区域也观察到了类似的情况,如背端脑、下丘脑(侧、腹和背带)、视道、圆环侧和下垂的漫射核(图4)。负数(图5A,B)和正(小鼠脑)(图5C)控制用作背景参考,并确认CB1R和OX-2R信号的特异性。

此外,通过用OX-A/CB1R进行双重免疫染色,在下丘脑的坐其中神经元中观察到,共定位的增加伴随着OX-A荧光信号的增加(图6)。这些结果表明,双免疫荧光如何帮助识别生理上保守的蛋白质表达,靶蛋白的共同定位,以及它们在不同病理条件下的分布和/或表达变化。

Figure 1
图1:DIO肠道中的奥乐辛免疫定位与控制饮食成年斑马鱼。(A) 控制饮食斑马鱼的中肠细胞中的OX-A免疫反应.(A1)DIO斑马鱼中肠细胞中的OX-A免疫反应。(B) 控制饮食斑马鱼前肠细胞中的OX-A免疫反应。(B1)DIO斑马鱼前肠细胞中的OX-A免疫反应。(A1, B1)DIO斑马鱼中肠和前肠不同组织中OX-A阳性细胞的增加。(C) DIO斑马鱼前肠细胞中的OX-A免疫反应。(D) 长期接触DAB后,OX-A的免疫过氧化物酶反应。(E) 负控制.刻度条:50 μm (A, A1, B, B1);100 μm(C、D、E)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:Orexin 2受体免疫定位在DIO的肠道与控制饮食成年斑马鱼。(A) 控制饮食斑马鱼的中肠细胞中的OX-2R免疫反应。(A1)DIO斑马鱼中肠细胞中的OX-2R免疫反应。(B) 控制饮食斑马鱼前肠细胞的OX-2R免疫反应。(B1)DIO斑马鱼前肠细胞中的OX-2R免疫反应。(A1, B1)DIO斑马鱼中肠和前肠不同组织中OX-2R阳性细胞的增加。比例尺:50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:OX-A(绿色)/CB1R(红色)和OX-2R(红色)/CB1R(绿色)的分布及其与OX-2R/CB1R(黄色)在DIO肠道中的联合定位与控制饮食成年斑马鱼。(A) OX-A/CB1R 在控制饮食成年斑马鱼的肠道中共同表达.(B) OX-2R/CB1R 在控制饮食斑马鱼肠道内共表达。(C) OX-2R/CB1R 在DIO成年斑马鱼肠道内共表达。增加OX-2R/CB1R在DIO斑马鱼肠道中的共定位(黄点)。比例尺:25 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:OX-2R(红色)和CB1R(绿色)的分布及其与OX-2R/CB1R(黄色)在DIO脑日冕部分与控制饮食成年斑马鱼的共同定位。(A) OX-2R/CB1R 在控制饮食斑马鱼的端脑中共同表达.(A1)OX-2R/CB1R在DIO斑马鱼的端管中共同表达。(B) OX-2R/CB1R 共表达下丘脑、视管、圆环侧、下垂的下垂的侧、腹和背区共表达,控制饮食斑马鱼 (B1) OX-2R/CB1R 共表达侧、腹腔和下丘脑的背带,视性圆环,以及DIO斑马鱼下垂的漫射核。(C) 光学技术放大倍率较高,显示控制饮食斑马鱼中 OX-2R/CB1R(黄色)的共同表达。(C1)光学技术放大倍率较高,显示DIO斑马鱼中OX-2R/CB1R(黄色)的共同表达。(D) 显示 DIO 斑马鱼中 OX-2R/CB1R(黄色)分布和共表达的光学技术的特殊。DAPI(蓝色)用于对核进行染色。CP:中央后丘核;Dd: 背;Dc:中央;Dl:横向;Dm:中联;Dp:背端脑的后部;Hd:腹膜下丘脑的背带;Hv:腹腔下丘脑的腹腔区;LH:下丘脑的侧侧部分;PGl:侧和PGm:内侧球前核;PGZ:光学技术片的透膜灰色区域;TeO:光学技术;TL:圆环纵向;Vd:腹腔端膜的背部分。刻度条:50 μm (A, A1, C, C1);250 μm (B 和 B1);25 μm (D)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:斑马鱼和小鼠海马的成年大脑中OX-2R和CB1R蛋白表达和特异性。(A) OX-2R 通过预吸收相对肽进行负控制.(B) 通过预吸收相对肽对CB1R进行负控制。(C) 对小鼠海马中OX-2R/CB1R的正控制。PGZ:光学技术图的周下灰色区域;TeO:光学技术。刻度条:100 μm(A、B);250 μm (C)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:OX-A(绿色)和CB1R(红色)的分布及其与OX-A/CB1R(黄色)在DIO的下丘脑冠状部分与控制饮食成年斑马鱼的共同定位。(A) OX-A/CB1R 在控制饮食斑马鱼的下丘脑中共表达 (A1) 更高的放大倍率,显示 OX-A/CB1R 在侧下丘脑内的共同表达。OX-A/CB1R 共同表达的详细信息,显示 OX-A/CB1R 的假定相邻定位或同一单元中 OX-A/CB1R 的共同定位和重叠。(B) OX-A/CB1R 在 DIO 斑马鱼下丘脑 (B1)中共表达的更高放大倍率,显示侧下丘脑内增加的 OX-A/CB1R 共表达。OX-A/CB1R 共同表达的详细信息,显示 OX-A/CB1R 的假定相邻定位或同一单元中 OX-A/CB1R 的共同定位和重叠。LH:下丘脑的横向部分。刻度条:50 μm(A、B);25 μm (A1, B1)。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

样品制备

样品制备是IHC的第一个关键步骤。可靠的协议允许维持细胞形态、组织架构和抗原性。此步骤需要正确的组织收集、固定和切片22、23。固定的目的是保存组织,减少组织酶或微生物的作用。特别是,固定步骤可保留细胞成分和生物分子,防止细胞成分(如抗原和酶)的自解和转移,稳定细胞材料免受以下程序的逆变作用,以及促进免疫染色4,7,24。

在切片之前,组织通过石蜡嵌入(免疫过氧化物酶方法)或冷冻保存(冷冻在冷冻培养基中,在多种免疫荧光方法中)制备和保存。保存方法与固定7的类型相关联。固定和保存后,如果嵌入在石蜡中,则组织由微质被切片,如果嵌入低温培养基,则由冷冻器切片。组织通常在8-10μm的厚度范围内切片,并安装在幻灯片上。对于免疫过氧化物酶染色,样品可能需要额外的步骤来揭开表位抗体结合,包括脱蜡化和抗原检索25,26。应该记住,过度固定可能导致表位掩蔽,而贴面不足会导致严重边缘染色的轻微信号很少或根本没有。

阻塞和背景减少

在免疫过氧化物酶法中,生物蛋白的高亲和力可能是导致背景染色的快速产生的原因。此外,由于阿维丁-生物锡反应是不可逆的,因此不能去除背景18,27。在IHC期间,高背景也可以产生非特异性结合内源性组织生物汀。疏水性和离子相互作用(如胶原蛋白和其他结缔组织(如上皮和腺细胞)产生的相互作用,以及内源性酶活性,是背景染色的主要原因。内源性生物素或酶和疏水结合必须在抗体染色之前最小化,这可以通过在阻断缓冲液28中添加洗涤剂(如Triton X-100)来实现。

在阻塞缓冲液中使用0.3%-0.4%Triton X-100也允许将抗体完全渗透到组织部分。此外,虽然抗体对一个表位具有优先特异性,但有可能与非特异性蛋白质上的位点部分结合,导致高背景染色29。非特异性结合可以掩盖目标抗原30的信号。为了减少非特异性背景染色,样品应用缓冲液孵育,以阻断非特异性反应位点。常见的阻断缓冲液包括正常血清或牛血清白蛋白30。阻断血清的种类应与二次抗体的宿主相同。建议确定最佳孵育时间。正常血清在阻断缓冲液中的浓度是另一个重要的测定31。此外,为了消除背景染色,使用初级和次级抗体的最佳稀释至关重要。因此,除了温度(即,在4°C下执行,增加时间,如果在RT时减少时间)和检测系统,还必须谨慎选择孵育时间。

抗体选择

IHC染色抗体的选择很重要,会影响实验结果32。为了确保抗体反应得当,必须考虑抗体所识别的表位。了解靶蛋白及其功能、组织和亚细胞定位,以及是否经过转化后修饰,有助于确定抗体的选择。另一个重要步骤是测试不同浓度的原/二级抗体,以保持背景和特异性在与特定信号兼容的最低水平。此外,检查物种反应性以确认原抗体和二级抗体的相容性以及原抗体识别原生构象中的抗原靶点的能力也很重要。初级抗体选择的另一个重要步骤是基因对齐。这可确保原抗体与感兴趣的生物分子发生反应,并提供有关特定动物模型中的抗体识别哪些表位的信息。基因对齐也提供了选择能够识别进化保留的表位的抗体的可能性。

控制

为了澄清抗体的特异性,一个重要方面是控制的性能,它允许检测特定的染色。控制包括:i) 已知表达抗原为阳性对照的组织;ii) 已知不将抗原表示为阴性对照的组织;iii) 省略原抗体或吸收原抗体与特定肽,以确认二次抗体不与其他组织成分交叉反应14,33。

在 IHC 技术中,在实现最终染色之前,几个步骤可能会导致问题。强背景染色和非特异性靶向抗原染色分别由内源性生物锡或原源/二级抗体交叉反应和酶活性差或原抗体效力引起。背景染色和非特异性结合可以通过在原抗体孵育之前阻断内源性酶来预防。使用正常血清是阻止非特异性相互作用的最好方法30。阻塞缓冲区的选择取决于所使用的检测方法。此外,已知缺乏靶抗原表达为阴性的组织可以作为参考,以确定背景染色量34。在阴性对照中沉积的致色或荧光信号证实了非特异性染色的存在。此外,阻塞时间不足会导致高背景,而过度阻塞导致低信号35。

在免疫过氧化物酶染色中,组织内源性过氧化物酶的存在是棕色背景沉积的另一个原因。用H2O2在原生抗体孵育之前治疗阻断内源性过氧化物酶36,37。相反,在免疫荧光中,固定在自荧光的产生中起着关键作用。为了避免自荧光,必须仔细选择最佳的固定方法、固定时间和组织制备。IHC 的另一个关键步骤是验证原抗体。如果抗体在特定组织或细胞/亚细胞成分中产生一致和特定的染色模式,并且如果与特定肽的初级抗体的预吸收不产生染色38,则该抗体被认为是有效的。在免疫荧光中,非特异性结合在三色荧光检测器下显示相似的荧光强度,而信号是可变的,因为使用了不同的荧光结合二级抗体。IHC 组织制备和抗体染色的这些方面必须得到解决,以克服染色问题。

IHC,虽然是一个相对简单的技术,提出了一些限制,并依赖于许多因素39。关键点之一是形式固定,它可以改变翻译后修饰蛋白质的表达。另一方面,正式固定石蜡嵌入组织可在室温下长期储存,而冷冻组织只能在-80°C下储存长达一年。此外,冷冻组织可能因冰晶的形成而受损,从而影响改变IHC染色40、41的亚细胞细节。关于我们的研究,最困难的方面是找到针对斑马鱼分子的特定原抗体。虽然斑马鱼被公认为具有高度保守的结构的有效动物模型,但很少能识别斑马鱼中特定蛋白质和其他分子的抗体。为了克服这些限制,通过西方印迹分析和基因排列来验证抗体特异性非常重要。

对IHC方法的兴趣日益浓厚,导致发展高度特异性的免疫染色,可以帮助调查研究42。IHC 正被越来越多地用于识别特定分子标记的存在及其在不同病理中的变化。这里介绍的两种方法,免疫过氧化物酶和免疫荧光,各有优缺点43。用于免疫过氧化物酶技术的石蜡嵌入组织,可以允许细胞和组织高分辨率,并揭示目标蛋白44、45的分布和数量的细节。然而,石蜡嵌入组织不适合免疫荧光,因为石蜡可以掩盖抗原性,并导致非特异性荧光46。另一方面,PFA固定组织的低温节可保持内源性抗原性,并导致非特异性荧光减少。即使冷冻部分的技术质量远低于石蜡嵌入组织,它们也可以使用IHC技术47产生有效结果。

此外,虽然石蜡嵌入更好地保存形态细节,但冷冻保存更好地保存酶和抗原表达,导致更详细的免疫染色。免疫荧光技术还允许当代检测两个或三个不同的生物分子,揭示可能的相互作用,如我们以前对奥西辛和内分泌大麻素系统10的工作所示。在用于检测特定生物分子分布和水平的技术中,IHC不仅允许确定分子和蛋白质的特定形态表达和分布,还允许进行定量分析。

使用免疫荧光,生物分子的共分和共表达也可以进一步理解,以及不同病理病例的可能相互作用及其变化48。在过去20年中,共聚焦显微镜经常被用来研究哺乳动物大脑中许多蛋白质的细胞和亚细胞分布。荧光显微镜还允许(使用荧光光草或荧光染料)对感兴趣的特定结构进行可视化,如蛋白质、细胞器和其他生物物质;这种信号可用于固定和活生物系统,以成像特定的亚细胞结构49。通过可视化其表达模式,可以探索特定细胞室中生物分子的潜在调节功能,而蛋白质信号在组织中的作用可以通过神经解剖分布来发现。代谢酶表达或受体。

提出的技术工作介绍了IHC方法,主要是免疫荧光,研究两个高度保守的系统,当素和内分泌大麻素,在成人斑马鱼模型。特别是,免疫荧光方法可用于确定目标组织中特定蛋白质的分布、相对量和解剖相互作用。PFA固定组织的冷冻保存可以更好地保存高度敏感的蛋白质,易迅速变质。此外,低温保存被认为可以更好地保存抗原和抗原性,并允许研究翻译后修饰的蛋白质和DNA。

即使冷冻组织(与石蜡嵌入部分相比)较厚,这妨碍了详细观察组织形态的能力,共聚焦显微镜允许非常详细地进行样品可视化,并增强成像能力。此外,免疫荧光可用于染色强度的定量分析,信号的密度分析提供了定量数据。这允许通过观察共定位区域来确定荧光信号水平与蛋白质表达水平的相关性。这项工作描述和说明可用于研究成年斑马鱼中重要蛋白质的进化保护的规程。在成年斑马鱼中使用IHC,主要是免疫荧光,有助于突出这种动物模型在研究高度保守的生物分子的形态表达和分布方面的有用性,并揭示整个不同的病理条件与人类生理病理学有关。

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Disclosures

提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgments

这项研究得到了桑尼奥大学2015-2016年丰迪·赖斯尔卡·迪阿特内奥(FRA)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

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生物化学 问题 148 免疫性细胞化学 免疫过氧化物酶 异素受体 内分泌大麻素受体 斑马鱼脑 斑马鱼肠
使用免疫过氧化物酶和免疫荧光方法鉴定成年斑马鱼中的奥列辛和内他大麻素受体
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