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Biochemistry

Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Präsentiert sind hier Protokolle für die immunhistochemische Charakterisierung und Lokalisierung von Orexin-Peptid, Orexin-Rezeptoren, und Endocannabinoid-Rezeptoren im Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten Adipositas (DIO) erwachsene Zebrafisch-Modelle mit Immunperixidase und Doppelimmunfluoreszenzmethoden.

Abstract

Immunhistochemie (IHC) ist eine hochsensible und spezifische Technik, die beim Nachweis von Zielantigenen in Gewebeabschnitten mit markierten Antikörpern beteiligt ist. Es ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem die Optimierung jedes Schritts entscheidend ist, um das optimale spezifische Signal zu erhalten. Durch IHC kann die Verbreitung und Lokalisierung spezifischer Biomarker nachgewiesen werden, die Informationen zur evolutionären Konservierung aufzeigen. Darüber hinaus ermöglicht IHC das Verständnis von Expression und Verteilung simonischen Veränderungen von Biomarkern unter pathologischen Bedingungen, wie Fettleibigkeit. IHC, hauptsächlich die Immunfluoreszenztechnik, kann bei erwachsenen Zebrafischen verwendet werden, um die Organisation und Verteilung von phylogenetisch konservierten Molekülen zu erkennen, aber ein Standard-IHC-Protokoll ist nicht veröffentlicht. Orexin und Endocannabinoid sind zwei hochkonservierte Systeme, die an der Kontrolle der Nahrungsaufnahme und Adipositaspathologie beteiligt sind. Berichtet werden hier Protokolle verwendet, um Informationen über Orexin Peptid (OXA), Orexin-Rezeptor (OX-2R) und Cannabinoid-Rezeptor (CB1R) Lokalisierung und Verteilung in den Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten adipösen (DIO) erwachsenen Zebrafisch-Modelle zu erhalten. Ebenfalls beschrieben sind Methoden zur Immunperoxidase und doppelten Immunfluoreszenz sowie die Herstellung von Reagenzien, Fixierung, Paraffin-Einbettung und Kryoschutz von Zebrafischgewebe und Vorbereitung auf einen endogenen Aktivitätsblockierungsschritt und Hintergrund Gegenfärbung. Der vollständige Satz von Parametern wird aus früheren IHC-Experimenten gewonnen, durch die wir gezeigt haben, wie Immunfluoreszenz beim Verständnis von OXs, OX-2R und CB1R-Verteilung, Lokalisierung und Erhaltung der Expression in erwachsenen Zebrafischen helfen kann. Gewebe. Die resultierenden Bilder mit hochspezifischer Signalintensität führten zur Bestätigung, dass Zebrafische geeignete Tiermodelle für immunhistochemische Studien der Verteilung, Lokalisierung und evolutionären Konservierung spezifischer Biomarker in physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die hier vorgestellten Protokolle werden für IHC-Experimente an erwachsenen Zebrafischen empfohlen.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) ist eine etablierte klassische Technik zur Identifizierung von Zell- oder Gewebekomponenten (Antigene) durch Antigen-Antikörper-Interaktion1,2. Es kann verwendet werden, um die Lokalisierung und Verteilung von Zielbiomolekülen innerhalb eines Gewebes zu identifizieren. IHC verwendet immunologische und chemische Reaktionen, um Antigene in Gewebeabschnitten3zu erkennen. Die wichtigsten Marker, die für die Visualisierung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen verwendet werden, sind Fluoreszenzfarbstoffe (Immunfluoreszenz) und Enzym-Substrat-Farbreaktionen (Immunoperoxidase), die beide mit Antikörpern konjugiert sind4. Mittels mikroskopischer Beobachtung ist es möglich, die Lokalisation von markiertem Gewebe zu bestimmen, was in etwa der Lokalisation des Zielantigens im Gewebe entspricht.

Es gibt zwei Methoden für fluoreszierende oder chromogene Reaktionen zum Nachweis von Proteinen: die direkte Detektionsmethode, bei der der spezifische Primärantikörper direkt gekennzeichnet ist; und die indirekte Detektionsmethode, bei der der primäre Antikörper unkonjugiert wird, während der sekundäre Antikörper das Etikett5,6,7trägt. Die indirekte Methode hat einige Vorteile, die vor allem ihre Signalverstärkung ist. Darüber hinaus ist es im Gegensatz zu anderen molekularen und zellulären Techniken mit Immunfluoreszenz möglich, die Verteilung, Lokalisierung und Koexpression von zwei oder mehr Proteinen, die in Zellen und Geweben differenziell exprimiert werden, zu visualisieren7. Die Wahl der verwendeten Erkennungsmethode hängt von experimentellen Details ab.

Bis heute ist IHC in der Grundlagenforschung als ein leistungsfähiges und wesentliches Werkzeug zum Verständnis der Verteilung und Lokalisierung von Biomarkern und der allgemeinen Profilierung verschiedener Proteine im biologischen Gewebe vom Menschen bis zu den wirbellosen Tieren 8, 9 , 10 , 11. Die Technik hilft, eine Karte der Proteinexpression in einer großen Anzahl von normalen und veränderten tierischen Organen und verschiedenen Gewebetypen anzuzeigen, was eine mögliche Down- oder Up-Regulierung der Expression zeigt, die durch physiologische und pathologische Veränderungen induziert wird. IHC ist eine hochsensible Technik, die Genauigkeit und die richtige Wahl der Methoden erfordert, um optimale Ergebnisse zu erzielen12. Zuallererst können viele verschiedene Faktoren wie Fixierung, Kreuzreaktivität, Antigenabruf und Empfindlichkeit von Antikörpern zu falsch positiven und falsch negativen Signalen führen13. Die Auswahl der Antikörper ist einer der wichtigsten Schritte in IHC und hängt von der Antigenspezifität und ihrer Affinität zu dem untersuchten Protein und den untersuchten Artenab 7.

Kürzlich haben wir die IHC-Technik optimiert, um Mitglieder von Orexin/Hypocretin- und Endocannabinoidsystemen in erwachsenem Zebrafischgewebe zu erkennen. Wir haben uns hauptsächlich auf Fixierung, Gewebeeinbettung mit zwei verschiedenen Ansätzen konzentriert, Schnitt und Montage (die Auflösung und Detail während der mikroskopischen Analyse beeinflussen können), und Blockierung (um falsch positive Positivmeldungen zu verhindern und Hintergrund zu reduzieren)14. Weitere wichtige Merkmale sind die Antikörperspezifität und Selektivität und Reproduzierbarkeit einzelner IHC-Protokolle. Der Schlüssel zur Bereitstellung von Antikörperspezifität ist die Verwendung von Negativkontrollen (einschließlich aller primären Antikörper oder Gewebe, von denen bekannt ist, dass sie die Zielproteine nicht ausdrücken) sowie positiver Kontrollen (einschließlich Gewebe, das bekanntermaßen die Zielproteine ausdrückt)15 . Die Auswahl von Antikörpern für IHC erfolgt auf der Grundlage ihrer Artenspezifität (die Wahrscheinlichkeit, mit der sie mit dem Antigen von Interesse reagieren) und den Antigen-Antikörper-Bindungsdetektionssystemen, die verwendet werden4,5,6 ,7. Bei Der Immunperoxidase wird die Farbe der Reaktion durch die Auswahl des niederschlagsbestimmenden Chromogens, in der Regel Diaminobenzidin (braun)16bestimmt. Auf der anderen Seite nutzt immunofluoreszenz Antikörper, die mit einem Fluorophor konjugiert sind, um die Proteinexpression in gefrorenen Gewebeabschnitten zu visualisieren und ermöglicht eine einfache Analyse mehrerer Proteine in Bezug auf das chromogene Detektionssystem. 5 , 7.

In der Immunoperoxidase-Technik wird der sekundäre Antikörper mit Biotin konjugiert, einem Linkermolekül, das in der Lage ist, ein chromogenes Reportermolekül [Avidin-Biotin-Komplex (ABC)] zu rekrutieren, was zur Verstärkung des Färbesignals führt. Mit der ABC-Reportermethode reagiert das Enzym Peroxidase mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) und erzeugt eine intensiv braun gefärbte Färbung, bei der das Enzym an den Sekundärantikörper bindet, der dann mit einem gewöhnlichen Lichtmikroskop analysiert werden kann. ABC-Färbung, aufgrund der hohen Affinität von Avidin für Biotin, produziert eine schnelle und optimale Reaktion, mit wenigen sekundären Antikörpern an der Stelle der primären Antikörperreaktivität befestigt. Diese chromogene Detektionsmethode ermöglicht die densitometrische Analyse des Signals und liefert semiquantitative Daten, die auf der Korrelation brauner Signalniveaus mit den Proteinexpressionsstufen18basieren.

Mit Immunfluoreszenz-Techniken ist der gleichzeitige Nachweis mehrerer Proteine aufgrund der Fähigkeit verschiedener Fluorchrome möglich, Licht bei einzigartigen Wellenlängen auszusenden, ist jedoch wichtig, Fluorchrome sorgfältig zu wählen, um spektrale Überlappungen zu minimieren. 5. Darüber hinaus minimiert die Verwendung primärer Antikörper bei verschiedenen Wirtsarten Schwierigkeiten bei der Kreuzreaktivität. In diesem Fall erkennt jeder artspezifische sekundäre Antikörper nur einen Primärantikörpertyp. Fluoreszierende Reporter sind kleine organische Moleküle, einschließlich kommerzieller Derivate, wie Alexa FluorFarbstoffe.

Viele Tiermodelle werden verwendet, um bestimmte physiologische und pathologische Bedingungen zu verstehen. Bis heute ist fest, dass viele Stoffwechselwege im Laufe der Evolution konserviert werden. Daher können IHC-Studien an Modellorganismen wie Zebrafischen Einblicke in die Entstehung und Aufrechterhaltung pathologischer und nichtpathologischer Erkrankungen geben17. Ziel dieses Berichts ist es, IHC-Protokolle zu veranschaulichen, die auf erwachsenem Zebrafischgewebe durchgeführt werden können und verwendet werden, um detaillierte Bilder der Verteilung und Lokalisierung von OXA, OX-2R und CB1R auf peripherer und zentraler Ebene zu erhalten. Ebenfalls berichtet sind Protokolle für die Anwendung von zwei wichtigen iHC indirekten Methoden in peripheren und zentralen Geweben von erwachsenen Zebrafischen. Beschrieben wird die indirekte Methode, die eine Signalverstärkung in Fällen ermöglicht, in denen ein sekundärer Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Immunfluoreszenzmethode) oder Enzymreporter (Immunoperoxidase-Methode) konjugiert wird. Sowohl chromogene als auch fluoreszierende Detektionsmethoden haben Vor- und Nachteile. In diesem Protokoll wird berichtet, dass IHC, hauptsächlich Immunfluoreszenz, bei erwachsenen Zebrafischen verwendet wird, ein Tiermodell, das weit verbreitet ist, um Systeme zu untersuchen, die evolutionär unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen konserviert werden.

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Protocol

1. Immunperoxidase-Protokoll

HINWEIS: Die Zebrafische wurden von Prof. Omid Safari (Department of Fisheries, Faculty of Natural Resources and Environment, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10gewonnen.

  1. Gewebesektion
    1. Opfern Sie den Zebrafisch durch Eintauchen in Eiswasser (5 Teile Eis/1 Teil Wasser, 4 °C); lassen Sie sie bis zur Beendigung aller Bewegung, um den Tod durch Hypoxie zu gewährleisten.
    2. Entfernen Sie schnell den Darm und gehirn mit der folgenden Seziermethode:
      1. Trocknen Sie den Fisch auf einem Papiertuch und legen Sie ihn sagittal auf eine Sezierender Matte, blockiert den ventralen Teil der Augenhöhle und den fleischigen Teil des Schwanzes.
      2. Für den Darm: Schneiden Sie die Haut und entfernen Sie vorsichtig die Haut und den darunter liegenden Muskel von der Seite des Fisches, bis die inneren Organe sichtbar sind. Entfernen Sie den Darm aus der Körperhöhle, die ihn ausdehnt.
      3. Für das Gehirn: Entfernen Sie den Kopf mit einer Rasierklinge. Entfernen Sie Weichgewebe von der ventralen Seite des Schädels mit Zange. Öffnen Sie den Schädel und entfernen Sie den Knochen von der ventralen Seite des Gehirns. Entfernen Sie die Haut- und Schädelknochen von der Rückenseite des Gehirns. Entfernen Sie das Gehirn.
  2. Gewebefixierung
    1. Fixieren Sie das sezierende Gewebe durch Eintauchen in frische 4% Paraformaldeyd (PFA) in Phosphatpuffer (PB, pH 7,4, 4 °C) für 3 h bei Raumtemperatur (RT).
      1. Bereiten Sie 0,1 M PB vor, indem Sie 1,755 g NaH2PO4H2 O und 4.575 g Na2HPO4 in 450 ml destilliertem Wasser (dH2O) auflösen, und sich mit der erforderlichen Menge von NaOH 1N auf einen pH-Wert von 7,4 einstellen.
      2. Bereiten Sie 4% PFA Auflösung 4 g PFA in 100 ml von 0,1 M PB (pH 7,4) durch Rühren auf einer Wärmeplatte vor. Wenn eine Temperatur von 60 °C erreicht ist, fügen Sie 2-4 Tropfen NaOH 1N hinzu, um eine klare Lösung zu erhalten. Linke PFA 4% bei RT und kontrolleieren den pH . Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
        HINWEIS: Gewebefixierung für mehr als 4–6 h kann zu einer Überfixierung führen, die Antigene maskiert und die Bindung von Antikörper-Epitopen begrenzt. Die Zeitpunktderung hängt von der Gewebegröße ab.
  3. Gewebeeinbettung
    1. Spülen Sie die Gewebe 5x für je 5 min, durch Eintauchen in 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Dehydrieren Sie das Gewebe durch anschließendes Eintauchen in Alkohol 70% (6 min), 80% (6 min), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min) und 100% (1 min).
    3. Klären Sie das Gewebe durch Eintauchen in 100% Alkohol: Xylol (1:1) für 10 min, dann 2x in Xylol für jeweils 5 min.
    4. Infiltrieren Sie das Gewebe mit Paraffinwachs (56 °C) zweimal für jeweils 1 h durch direktes Eintauchen in Paraffin.
    5. Die Gewebe bei Raumtemperatur (RT) in Paraffinblöcke einbetten und bis zum Schnitt bei RT lagern.
  4. Gewebeschneiden
    1. Schneiden Sie Gewebe mit einem Mikrotom in koronale oder sagittale Abschnitte mit einer Dicke von 8 m und sammeln Sie die Abschnitte in wechselnder Reihe auf Klebeglasschlitten auf dem Wasser und werden bei 38 °C erwärmt.
    2. Trocknen Sie die Dias mit Abschnitten bei 37 °C über Nacht.
  5. Deparaffinierung und Rehydratation von Gewebeabschnitten
    1. Entwachsung der Abschnitte durch Eintauchen in Xylol für 5 min gefolgt von ein Tauchen in Xylol für 3 min.
    2. Rehydrieren Sie die Abschnitte durch nachfolgende Rutschen Eintauchen in Alkohol 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), dann legen Sie die Dias in dH2O (5 min).
      HINWEIS: Entfernen Sie die Abschnitte vollständig, bevor Sie die Reaktion starten. Wenn die Abschnitte noch Spuren von Paraffin haben, führen Sie ein zusätzliches Eintauchen in Xylol für 5 Minuten oder mehr durch.
  6. Antigen-Retrieval
    1. Behandeln Sie die Abschnitte mit Citratpuffer (0,01 M, pH 6,0), indem Sie die Dias in die Lösung eintauchen und 5 min bei maximaler Leistung in einen Mikrowellenherd einheizen.
    2. Lassen Sie die Abschnitte abkühlen.
    3. Wiederholen Sie den Zyklus von 5 min in der Mikrowelle bei maximaler Leistung, um den Antigen-Abruf abzuschließen.
      1. Citratpuffer (0,01 M, pH 6,0) durch Auflösen von 2,10 g Zitronensäure in 100 ml dH2O und 5,882 g Natriumcitrat in 200 ml dH2O. Natriumcitrat (0,01 M) mit Zitronensäure (0,01 M) bei einem Volumenverhältnis von 1:4 mischen und den pH-Wert auf 6 mit HCl 0.1N.
  7. Blockierung endogener Peroxidase
    1. Den Gewebebereich auf den Dias mit einem lösungsmittelresistenten Stift abgrenzen.
    2. Spülen Sie die Abschnitte 3 mal, jeweils 5 min, mit tris-gepufferter Salinlösung (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. 0,1 M TBS vorbereiten, indem Sie 12,1 g Trizmabasis und 9 g NaCl in 950 ml dH2O auflösen und sich mit HCl 0,1N auf pH 7,3 einstellen.
    3. Blockieren Sie die endogene Peroxidase-Aktivität durch Eintauchen ineine Lösung von 0,75% H2 O2 für 5 min bei RT.
      1. Bereiten Sie die 0,75%H2O2 Lösung auf, die 5 ml 30% H2 O2 in 195 ml dH2O auflöst.
        HINWEIS: Ndogenöse Enzyme können mit IHC-Reagenzien reagieren und falsch positive Ergebnisse liefern. Darüber hinaus exprimieren hochgradig vaskularisierte Gewebe viele endogene Peroxidase, die zu intensiven unspezifischen Färbungen und Hintergrundniveaus führen kann. Die Behandlung mit 0,75%H2O2-Aussen wäscht die endogene Peroxidase und reduziert den unspezifischen Hintergrund signifikant.
  8. Blockierung unspezifischer bindi ng-Sites und Gewebepermeabilisierung
    1. Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte mit dem TBS/0,4% Triton (TBS-T) Blockierpuffer, der das primäre Antiserum (NRS) enthält, für 30 min bei RT, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
      1. Bereiten Sie 0,4% Triton vor, indem Sie 0,4 ml Triton X-100 in 100 ml TBS auflösen.
      2. Bereiten Sie den Blockierpuffer TBS-T Lösung vor, indem Sie 1% normales Serum in TBS auflösen, das 0,4% Triton X-100 enthält (1 ml normales Serum + 8,2 ml TBS + 0,8 ml von 0,48 Triton X-100).
        HINWEIS: Wählen Sie die Art des Tierserums in Abhängigkeit vom Wirt des sekundären Antikörpers (z. B. bei Verwendung eines Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörpers, normales Ziegenserum verwenden).
  9. Gewebeinkubation mit primärem Antikörper
    1. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einer feuchten Box bei RT mit primären Antikörpern, die in TBS-T verdünnt sind. Färben Sie die Abschnitte mit dem folgenden primären Antikörper:
      1. Ziegenantikörper gegen OX-2R verdünnt 1:200, die das C-Terminal des Proteins erkennt.
      2. Ziegenantikörper gegen OX-A verdünnt 1:200 [Orexin-A (C-19)], der das C-Terminal des Proteins erkennt.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der primäre Antikörper mit dem Biomolekül von Interesse reagiert. Definieren Sie, mit welchem Epitop des Biomoleküls der Primärantikörper mit Hilfe der Genausrichtung reagiert. So wurde das OX-A-Epitop zwischen dem aa 50–100 des menschlichen OX-A (O43612) kartiert, während das OX-2R-Epitop in der Nähe der letzten 50 aa am C-Terminal des Menschen kartiert wurde.
  10. Gewebeinkubation mit sekundärem Antikörper
    1. Spülen Sie die Abschnitte 3x für je 5 min, mit 0,1 M TBS (pH 7.3).
    2. Inkubieren Sie die Abschnitte für 1,5 h bei RT mit biotinylierten Sekundärantikörpern und Kaninchen-Anti-Ziegen-Immunglobulin (H+L) konjugiert mit Biotin, dann verdünnen Sie 1:100 in TBS-T.
      HINWEIS: Testen und finden Sie die verschiedenen Verdünnungen von primären und sekundären Antikörpern, um die optimale Verdünnung zu finden, die eine Reduzierung des Hintergrunds ermöglicht.
  11. Peroxidase-Reaktion
    1. Spülen Sie die Abschnitte 3x für je 5 min, mit 0,1 M TBS (pH 7.3).
    2. Inkubieren Sie die Abschnitte mit Avidin-Biotin-Komplex (ABC) für 1 h.
      1. Bereiten Sie die ABC-Lösung vor, die zwei Tropfen der Komponente A hinzufügt, gefolgt von zwei Tropfen Komponente B in 5 ml TBS.
    3. Spülen Sie die Abschnitte 3x für je 5 min, mit 0,1 M TBS (pH 7.3).
    4. Behandeln Sie die Abschnitte mit dem Chromogensubstrat 3,3'-Diaminobenzidin-4 (DAB).
      1. Bereiten Sie die DAB-Lösung vor, bei der ein Tropfen (ca. 30 l) DAB-Chromogenkonzentrat zu 1 ml DAB-Verdünnungsstoff hinzugefügt wird, und mischen Sie sie vor dem Gebrauch gut.
        HINWEIS: Bereiten Sie die ABC-Lösung mindestens 30 min vor Gebrauch vor und halten Sie den Komplex bei 4 °C, bis sie verwendet werden, um eine stabile Avidin-/Biotinbindung zu ermöglichen. Bereiten Sie die frische DAB-Arbeitslösung vor, tragen Sie sie auf die Gewebeabschnitte auf und entwickeln Sie, bis die Farbe geeignet ist. Wenn die chromogene Reaktion die Epitopstellen in eine braune Farbe umwandelt und die Intensität des Signals für die Bildgebung geeignet ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Der Zeitpunkt der DAB-Entwicklung kann von wenigen Sekunden bis 10 Minuten variieren. Für OX-A und OX-2R 1 reichen 2 min. Behandeln Sie DAB mit Vorsicht, da es krebserregend ist.
  12. Gewebedehydratation und -montage
    1. Spülen Sie alle Abschnitte 3x für je 5 min, mit 0,1 M TBS (pH 7.3), um die DAB-Reaktion zu stoppen.
    2. Dehydrieren Sie die Abschnitte durch nachfolgende Rutschen Eintauchen in Alkohol 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Die Scheiben durch Eintauchen 2x in Xylol jeweils 10 min klären.
    4. Montieren Sie die Abschnitte mit DPX (Dibutylphthalatxylol) Mountant für die Histologie, fügen Sie zwei Tropfen Montagemedien zu Dias hinzu und bedecken Sie langsam mit Coverlips.
      HINWEIS: Da das Eintauchen von Gewebe in zunehmende Konzentrationen von Alkohol während der Dehydrierung führt zu Alkohol Penetration von Gewebe und Ersatz von Wasser mit Alkohol, bestimmen Sie eine genaue Dehydrierung Sendezeit und nicht über dehydrieren Sie das Gewebe. Führen Sie das Eintauchen in Xylol nach Dertrocknung durch, um das Gewebe zu klären und überschüssigen oder verbleibenden Alkohol zu entfernen.
  13. Steuerelemente
    1. Wiederholen Sie die Abschnitte 1.1–1.12, indem Sie den primären Antikörper weglassen und/oder den primären Antikörper oder den sekundären Antikörper IgG durch TBS ersetzen (Negative Kontrollen).
    2. Wiederholen Sie die Abschnitte 1.1–1.12 vorabsorbierend jeden primären Antikörper mit einem Überschuss des relativen Peptids (100 mg Peptid/1 ml verdünntes Antiserum).
    3. Wiederholen Sie die Abschnitte 1.1–1.12 mit unterschiedlichem Gewebe als Positivkontrolle (z. B. Mausgewebe).
      HINWEIS: Bereiten Sie alle Puffer kurz vor dem Start frisch vor. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit bei jedem Schritt vorsichtig mit einer Pipette oder Filterpapier um die Abschnitte, wobei die Abschnitte immer nass gehalten werden.
  14. Bildaufnahme und -analyse
    1. Erfassen Sie digitale Bilder unter konstanter Lichtbeleuchtung und bei gleicher Vergrößerung mit einem Mikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist.
    2. Führen Sie eine semiquantitative Analyse der Färbeintensität mit Bildgebungssoftware durch (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder im Dateiformat .lif oder .tiff, um Indizes der OX-A- oder OX2-R-Positivität auszuwerten.
      2. Wählen Sie die Schaltfläche unter Messen und klicken Sie auf Manual Counting. Zählen Sie die Anzahl der gebeizten Zellprofile direkt vom Bildschirm, indem Sie eine Markierung auf positive Zellen setzen, indem Sie mit der Maus klicken.
      3. Wählen Sie einen Bereich von Interesse (ROI) (3 x 103 m2 ), um die Immunsignaldichte (optische Dichte, OD) zu quantifizieren.
      4. Bestimmen Sie das Pixel mit der höchsten Intensität (hoch positiv) und der geringsten Intensität (negativ) innerhalb des analysierten Bildes, um die Null als Wert des Hintergrunds zuzuweisen (d. h. einen Teil des Gewebes ohne gebeizte Zellen).
      5. Bewerten Sie die OD, indem Sie an einer logarithmischen Absorptionsskala arbeiten. Bei der digitalen Bildanalyse reicht die DAB-Pixelintensität vom dunkelsten (0-Wert) bis zum hellsten (255-Wert)-Schatten.
      6. Bestimmen Sie OD, indem Sie ein Histogramm der folgenden Punkte zeichnen: log10(255/I), wobei "I" der vom Programm angegebene Pixelintensitätswert ist, der durch Subtrahieren des Hintergrunds bestimmt wird.
        HINWEIS: Die permanente und stabile Immunperoxidase-Reaktion kann jederzeit unter einem Hellfeldmikroskop analysiert werden. Führen Sie die Zählung der beschrifteten Zellen auf einem alternativen Abschnitt durch, um eine Doppelzählung derselben Zelle aus benachbarten Abschnitten zu vermeiden.

2. Immunfluoreszenzprotokoll

  1. Gewebesektion
    1. Opfern und sezieren Sie die Tiere, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben.
  2. Gewebefixierung
    1. Fixieren Sie Den Darm und das Gehirn durch Eintauchen für 3 h in 4% PFA bei 4 °C.
      1. Bereiten Sie PB und 4% PFA wie in Abschnitt 1.2.1 vor.
        HINWEIS: Die Zeit der Fixierung hängt von der Gewebegröße ab. Gewebefixierung für mehr als 4-6 h kann zu einer Überfixierung führen, die Antigene maskiert und die Antikörper-Epitop-Bindung begrenzt.
  3. Gewebeeinbettung
    1. Spülen Sie das Gewebe 3x für je 5 min, mit 0,1 M PB (pH 7.4).
    2. Zum Kryoschutz das Gewebe auf 20% Saccharose in PB (0,1 M, pH 7,4) übertragen und bei 4 °C über Nacht halten. Dann das Gewebe in 0,1 M PB (pH 7,4) auf 30% Saccharose übertragen und eine weitere Nacht bei 4 °C aufbewahren.
    3. Einbetten sie die Gewebe in einen Block mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung. Um dies zu tun, bereiten Sie einen kleinen Dewar von flüssigem Stickstoff, nehmen Sie Aluminiumfolie, und schneiden Sie es in die Hälfte, um eine Pfanne zu erstellen. Die Pfanne, die die mit der OCT-Verbindung gefüllten Gewebe enthält, muss in den flüssigen Stickstoff getaucht werden, bis die OCT-Verbindung abgekühlt ist. Das gefrorene Gewebe kann bis zum Schnitt bei -80 °C gelagert werden.
  4. Gewebeschneiden
    1. Die gefrorenen Gewebeblöcke bei -20 °C in einen Kryostat geben und in koronalen oder sagittalen Abschnitten von 10 m schneiden.
    2. Sammeln Sie das Gewebe in alternativen seriellen Abschnitten auf Klebeglasschlitten, die für die Immunhistochemie geeignet sind, und lagern Sie sie bei -20 °C bis zum Gebrauch.
      HINWEIS: Speichern Sie Dias zwischen -20 °C und 4 °C in einer dunklen Schiebebox oder einem Diabuch.
  5. Blockierung unspezifischer Bindungsstellen und Gewebepermeabilizzation
    1. Den Gewebebereich auf dem Dia mit einem lösungsmittelbeständigen Stift abgrenzen.
    2. Spülen Sie die Abschnitte 3x für je 5 min, mit 0,1 M PB (pH 7.4).
    3. Inkubieren Sie die Abschnitte mit 1% normalem Eselserum, die im Permeabilisationspuffer PB-Triton X-100 0.3% (PB-T) für 30 min bei RT gelöst werden, um die Zellmembran zu permeabilisieren und die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren.
      1. Bereiten Sie Triton X-100 0,3% Auflösung 0,3 ml Triton X-100 in 100 ml von 0,1 M PB (pH 7,4) vor.
      2. Bereiten Sie die Blockierlösung vor, die 1% normales Eselsserum in PB auflöst, das 0,3% TritonX-100 enthält.
        HINWEIS: Die Tierarten des Serums, das in den Permeabilisierungs- und Sperrpuffern verwendet wird, sind vom Wirt des sekundären Antikörpers abhängig.
  6. Inkubation mit Mischung von Primärantikörpern
    1. Spülen Sie die Abschnitte 3x für je 5 min, mit 0,1 M PB (pH 7.4).
      1. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einer feuchten Box bei RT mit einer Mischung von primären Antikörpern, die in PB-T verdünnt sind. Folgende Mischungen von Primärantikörpern können verwendet werden: Ziegenantikörper gegen OX-2R verdünnt 1:100/Kaninchen-Antikörper gegen CB1R verdünnt 1:100, oder Ziegenantikörper gegen OX-A verdünnt 1:100/Kaninchen-Antikörper gegen CB1R verdünnt 1:100.
  7. Inkubation mit Mischung von sekundären Antikörpern
    1. Spülen Sie die Abschnitte 3x für je 5 min, mit 0,1 M PB (pH 7.4).
    2. Inkubieren Sie die Abschnitte für 2 h bei RT mit 1) eine Mischung aus Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper und Esel Anti-Ziege Alexa Fluor 594-konjugierten sekundären Antikörper verdünnt 1:100 in PB-T; oder 2) eine Mischung aus Esel Anti-Ziege Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper und Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594-konjugiertsekundären Sekundärantikörper verdünnt 1:100 in PB-T.
      HINWEIS: Verwenden Sie sekundäre Antikörper, die im selben Tierwirt entwickelt wurden. Das normale Serum muss zu derselben Art des sekundären Antikörpers gehören (z. B. sekundäre Antikörper verwenden, die in Esel und einem Esel normales Serum entwickelt wurden). Verdünnen Sie die primären und sekundären Antikörper mit Sperrpuffer, der das Reinigungsmittel enthält, um die Zellpermeabilisation zu erhöhen und den Hintergrund zu reduzieren.
  8. Gewebemontage
    1. Spülen Sie die Abschnitte 3x für je 5 min, mit 0,1 M PB (pH 7.4).
    2. Gegenbeflecken Sie die Abschnitte mit Kernfarbstoff DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole) vorbereitet Lösen 1,5 l DAPI (1 mg/ml) in 3 ml PB.
    3. Coverslip-Folien mit Montagemedium (siehe Materialtabelle). Dieses wässrige Montagemedium stabilisiert die Gewebeprobe und Flecken für den langfristigen Einsatz. Fluoreszierende Proben können im Dunkeln bei 4 °C gelagert werden. Um die Lebensdauer von Fluoroforen zu verlängern, verwenden Sie ein antifed Montagemedium.
      HINWEIS: Wählen Sie ein gutes Montagemedium. Einer der wichtigsten Parameter der Montagemittel ist der Brechungsindex (nD), der etwa 1,5 betragen sollte, der Brechungsindex von Glas. Das hier verwendete Montagemedium kann insbesondere bei Proben verwendet werden, die für Enzym- und Lipidbestimmungen vorbereitet sind (d.h. Proben, die nicht mit einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert werden dürfen).
  9. Steuerelemente
    1. Wiederholen Sie die Abschnitte 2.1–2.8, ohne den primären oder sekundären Antikörper oder ersetzen Sie im spezifischen Schritt die primäre oder sekundäre Antisera durch PB (Negative Kontrolle).
    2. Wiederholen Sie die Abschnitte 2.1–2.8, wobei jeder primäre Antikörper mit einem Überschuss des relativen Peptids (100 mg Peptid/1 ml verdünntes Antiserum) vorabsorbiert wird.
    3. Wiederholen Sie die Abschnitte 2.1–2.8 auf Slices des Maushirns (positive Kontrolle).
      HINWEIS: Bereiten Sie alle Puffer kurz vor dem Start frisch vor. Entfernen Sie den Flüssigkeitsüberschuss bei jedem Schritt mit einer Pipette oder Filterpapier um die Abschnitte vorsichtig, wobei der Abschnitt immer feucht bleibt.
  10. Bildaufnahme
    1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, das mit einer x-y-z motorisierten Bühne, Einer Digitalkamera sowie einer Erfassungs- und Bildanalysesoftware wie NIS-Elements C ausgestattet ist, um die immunbefleckten Abschnitte zu beobachten und zu analysieren. Erfassen Sie digitale Bilder mit den 5-20-40x Objektiven.
    2. Nehmen Sie die Bilder jedes Abschnitts bei geringer Vergrößerung (10x oder 20x Objektiv) in jedem der verfügbaren Kanäle auf, um eine Montage mit niedriger Vergrößerung zu erstellen, die einen Überblick über die gesamte Region bietet, um die Lokalisierung und Dokumentation von OX-2R/CB1R zu erleichtern. anatomische Koexpression. Normalisieren Sie die Fluoreszenzbilder vor der Analyse auf maximalen Kontrast und Überlagerung.
    3. Sammeln Sie serielle Z-Stacks von Bildern im gesamten Interessengebiet. Erfassen Sie die Bilder über sechs Brennebenen (Z-Schritt) mit Brennschritten von 1–1,8 m, um das Gewebevolumen abzudecken, in dem ox-2R/CB1R Coexpression als gelbes Punktia visualisiert wird. Um diese Sammlung für jeden Kanal (rot, grün, blau) separat zu tun, mit einem Z-motorisierten Mikroskop.
    4. Verwenden Sie eine bildgebende Dekonvolution-Software, um Bilder durch Anwendung von zehn Iterationen zu dekonvolvenieren und die seriellen Z-Ebenenbilder in ein einziges maximales Projektionsbild zu reduzieren.
    5. Passen Sie die Mikrographen für Licht und Kontrast mit Adobe Photoshop 6.01 (Adobe Systems, San Jose, CA) an.
      HINWEIS: Führen Sie den Dekonvolutionschritt während der Beobachtung aus, um den Hintergrund weiter zu verringern. Beschränken Sie die Lichtexposition des Dias, um Photobleichungen zu verhindern.
  11. Bildanalyse
    1. Führen Sie eine quantitative Analyse der OX-2R/CB1R-Koexpression an abwechselnden 10 m dicken Abschnitten (n = 5 Tiere pro Gruppe) durch, indem Sie alle Interessenbereiche jedes Tieres abdecken.
    2. Quantifizieren Sie den OX-2R/CB1R-Koexpression als Anzahl gelber positiver Punktzeichen mit einem halbautomatischen System der Bildanalyse. Die Imagins-Software kann eine höhere Detailgenauigkeit mit quantitativen Daten über die Überlappungsbereiche zwischen verschiedenen Fluoreszenzsonden liefern.
    3. Quantifizieren Sie die Punktia mit Schwellenwerkzeugen für die Signalintensität in den beiden Kanälen. Öffnen Sie die Imagesdatei .liff, .tiff oder .jpg, und wählen Sie Image–Thresholdaus. Wählen Sie Auto-Einstellung oder manuelle Methode und regulieren Schwellenwert, bis alle gebeizten Puncta ausgewählt sind. Analysieren Sie die Verteilung der Pixelintensitäten in einem Bereich des Bildes, der keine immunmarkierten Objekte enthält, um den Hintergrundschwellenwert zu erhalten. Bestimmen Sie diesen Hintergrund für jedes Bild individuell. Das Programm entfernt dann den Hintergrundschwellenwert, indem es die Basislinie der Pixelintensitäten auf den Hintergrundwert festlegt.
    4. Wählen Sie Analysieren – Messen und wählen Sie die zu messenden Parameter (puncta-Intensity-Minimum-, Maximum- und Mittelwerte; Anzahl/Dichte des immunmarkierten Punktzeichens).
    5. Zählen Sie die gelbe Punktke entlang des Volumens des Gewebes in 4 Z-Stacks für jeden Abschnitt, mit den Stapeln unmittelbar über oder unter auf die beste Fokusebene. Schließen Sie die nicht fokussierten Regionen aus der Analyse aus.
      HINWEIS: Führen Sie die Zählung der beschrifteten Zellen auf einem alternativen Abschnitt durch, um eine Doppelzählung derselben Zellen aus benachbarten Abschnitten zu vermeiden.

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Representative Results

Repräsentative Daten für die Immunoperoxidase-Färbung sind in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Die immunhistochemische Analyse der OX-A- und OX-2R-Verteilung im Darm erwachsener Zebrafische zeigte verschiedene Lokalisationsstellen von OX-A und OX-2R und deren Expressioninitiierung in den Darmzellen von DIO-Zebrafischen. Eine intensive braune Färbung für OX-A wurde in den Zellen des medialen und vorderen Darms beobachtet (Abbildung 1A, A1). Die Immunexpression von OX-A gab klare Signale in den verschiedenen Darmkomdonten, die vom vorderen zum medialen Darm abnahmen (Abbildung 1B, B1). Die Negativkontrolle wurde als Referenz für den Hintergrund und zur Bestätigung der Spezifität des OX-A-Signals verwendet (Abbildung 1E). Die längere Exposition gegenüber dem Chromogen DAB führte zu einer Erhöhung der Hintergrundintensität (Abbildung 1D). Ähnliche Ergebnisse wurden für die OX-2R-Immunexpression im Darm von DIO und die Kontrolle von Diät-Zebrafischen beobachtet (Abbildung 2). Ein erhöhtes OX-A-Signal bei DI-Erwachsenenzebrafischen wurde von der Überexpression von OX-2R in anderen Darmkomproditieren begleitet (Abbildung 2B, B1).

Anhand der Immunfluoreszenz wurden die durch die Immunperoxidase-Analyse gewonnenen Daten bestätigt, die der Erhöhung der OX-A- und OX-2R-Expression im Darm erwachsener DIO-Zebrafische in Bezug auf die Kontrolle zugrunde lagen (Abbildung 3). Darüber hinaus war es mit Doppelter Immunfluoreszenz möglich, Informationen über die Expression des Endocannabinoidrezeptors CB1R und seine Kolokalisierung mit OX-A oder OX-2R im Darm und Gehirn der Kontrolldiät und DIO adulter Zebrafische zu erhalten. Der Vorteil der Immunfluoreszenz besteht darin, dass sie ein detaillierteres Signal mit weniger bereitgestellten Informationen über Gewebemorphologie liefert, im Vergleich zur Immunperoxidase-Technik. Mit der Immunfluoreszenzmethode haben wir zuvor anatomische Wechselwirkungen zwischen OX-2R und CB1R sowohl im Darm als auch im Gehirn10bestimmt.

Die genaue Analyse von immunfluoreszierenden Bildern zeigte die Zunahme der OX-2R/CB1R-Kolokalisierung im Darm von DIO erwachsenen Zebrafischen im Vergleich zur Kontrolldiät Zebrafische (Abbildung 3B, C). Eine ähnliche Situation wurde in verschiedenen Hirnregionen beobachtet, wie dem dorsalen Telencephalon, Hypothalamus (laterale, ventrale und dorsale Zonen), optischem Tectum, Torus lateralis und diffusem Kern des minderwertigen Lappens (Abbildung 4). Die negativen (Abbildung 5A,B) und positiven (Maushirn) (Abbildung 5C) Kontrollen wurden als Referenzen für den Hintergrund und zur Bestätigung der Spezifität von CB1R- und OX-2R-Signalen verwendet.

Darüber hinaus wurde bei der doppelten Immunfärbung mit OX-A/CB1R in den orexinergen Neuronen des Hypothalamus beobachtet, dass eine Zunahme der Kolokalisierung mit einer Erhöhung des OX-A-Fluoreszenzsignals einherging (Abbildung 6). Diese Ergebnisse zeigen, wie eine doppelte Immunfluoreszenz dazu beitragen kann, die physiologisch konservierte Proteinexpression, die Kolokalisierung von Zielproteinen und deren Verteilungs- und/oder Expressionsänderungen in verschiedenen pathologischen Bedingungen zu identifizieren.

Figure 1
Abbildung 1: Orexin-Immunlokalisation im Darm von DIO vs. Kontrolle Diät erwachsenen Zebrafisch. (A) OX-A Immunreaktivität in den Zellen des medialen Darms der Kontrolldiät Zebrafische. (A1) OX-A Immunreaktivität in den Zellen des medialen Darms von DIO Zebrafischen. (B) OX-A Immunreaktivität in den Zellen des vorderen Darms der Kontrolldiät Zebrafische. (B1) OX-A Immunreaktivität in den Zellen des vorderen Darms von DIO Zebrafischen. (A1, B1) Eine Zunahme von OX-A-positiven Zellen in verschiedenen Gewebebestandteilen des medialen und vorderen Darms von DIO-Zebrafischen. (C) OX-A-Immunreaktivität in den Zellen des vorderen Darms von DIO-Zebrafischen. (D) Immunperoxidase-Reaktion für OX-A nach längerer Exposition gegenüber DAB. (E) Negative Kontrolle. Skalenstange: 50 m(A, A 1, B, B1); 100 m (C, D, E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Orexin 2 Rezeptor-Immunlokalisierung im Darm von DIO vs. Kontrolle Diät erwachsenen Zebrafisch. (A) OX-2R Immunreaktivität in den Zellen des medialen Darms der Kontrolldiät Zebrafische. (A1) OX-2R Immunreaktivität in den Zellen des medialen Darms von DIO Zebrafischen. (B) OX-2R Immunreaktivität in den Zellen des vorderen Darms der Kontrolldiät Zebrafische. (B1) OX-2R Immunreaktivität in den Zellen des vorderen Darms von DIO Zebrafischen. (A1, B1) Eine Zunahme von OX-2R-positiven Zellen in verschiedenen Gewebekompartement des medialen und vorderen Darms von DIO Zebrafischen. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Verteilung von OX-A (grün)/CB1R (rot) und OX-2R (rot)/CB1R (grün) und deren Co-Lokalisierung mit OX-2R/CB1R (gelb) im Darm von DIOvs. Kontrolle erwachsenen Zebrafischen. (A) OX-A/CB1R Co-Expression im Darm der Kontrolldiät adulter Zebrafische. (B) OX-2R/CB1R Koexpression im Darm der Kontrolldiät Zebrafische. (C) OX-2R/CB1R Koexpression im Darm von DIO adulten Zebrafischen. Eine Zunahme der OX-2R/CB1R Kolokalisierung (gelbe Punkte) im Darm von DIO-Zebrafischen. Maßstabsleiste: 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Verteilung von OX-2R (rot) und CB1R (grün) und deren Kolokalisierung mit OX-2R/CB1R (gelb) in den hirnkoronalen Abschnitten von DIO vs. Kontrolle der Diät erwachsener Zebrafische. (A) OX-2R/CB1R Co-Expression im Telencephalon der Kontrolldiät Zebrafische. (A1) OX-2R/CB1R Koexpression im Telencephalon von DIO-Zebrafischen. (B) OX-2R/CB1R Koexpression innerhalb der lateralen, ventralen und dorsalen Zone von Hypothalamus, Optik tectum, Torus lateralis, diffuser Kern des unteren Lappens der Kontrolldiät Zebrafische (B1) OX-2R/CB1R Ko-Expression innerhalb der seitlichen, ventralen und dorsale Zonen des Hypothalamus, des optischen Tectums, des Torus lateralis und des diffusen Kerns des unteren Lappens des DIO-Zebrafisches. (C) Höhere Vergrößerung des optischen Tektums, das die Koexpression von OX-2R/CB1R (gelb) in der Kontrolldiät Zebrafische zeigt. (C1) Höhere Vergrößerung des optischen Tektums, das die Koexpression von OX-2R/CB1R (gelb) im DIO-Zebrafisch zeigt. (D) Ein bestimmter des optischen Tektums, das die Verteilung und Koexpression von OX-2R/CB1R (gelb) im DIO-Zebrafisch zeigt. DAPI (blau) wurde verwendet, um Nuklei zu vereisten. CP: zentraler posteriorer thalamischer Kern; Dd: dorsal; Dc: zentral; Dl: seitlich; Dm: medial; Dp: posteriorer Teil des dorsalen Telencephalons; Hd: Dorsale Zone des periventrikulären Hypothalamus; Hv: ventrale Zone des periventrikulären Hypothalamus; LH: seitlicher Teil des Hypothalamus; PGl: seitlich und PGm: mediale präglomeräre Kerne; PGZ: periventrikuläre Grauzone des optischen Tectums; TeO: optisches Tectum; TL: Torus longitudinalis; Vd: dorsaler Teil des ventralen Telencephalons. Skalenstange: 50 m (A, A1, C, C1 ); 250 m (B und B1); 25 m (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: OX-2R und CB1R Proteinexpression und Spezifität im erwachsenen Gehirn von Zebrafischen und Maus-Hippocampus. (A) Negative Kontrolle von OX-2R durch Vorabsorption mit dem relativen Peptid. (B) Negative Kontrolle von CB1R durch Vorabsorption mit dem relativen Peptid. (C) Positive Kontrolle von OX-2R/CB1R im Hippocampus der Maus. PGZ: periventrikuläre Grauzone des optischen Tectums; TeO: optisches Tectum. Skalenstange: 100 m (A, B); 250 m (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Verteilung von OX-A (grün) und CB1R (rot) und deren Kolokalisierung mit OX-A/CB1R (gelb) in den hypothalamischen koronalen Abschnitten von DIO vs. Kontrolle erwachsenen Zebrafischen. (A) OX-A/CB1R Co-Expression im Hypothalamus der Kontrolldiät Zebrafische (A1) Höhere Vergrößerung zeigt die OX-A/CB1R Ko-Expression innerhalb des lateralen Hypothalamus. Detail der OX-A/CB1R-Koexpression, die eine vermeintliche benachbarte Lokalisierung von OX-A/CB1R oder Co-Lokalisierung und Überlappung von OX-A/CB1R in denselben Zellen zeigt. (B) OX-A/CB1R Koexpression im Hypothalamus von DIO-Zebrafischen (B1) Höhere Vergrößerung, die die erhöhte OX-A/CB1R-Koexpression innerhalb des lateralen Hypothalamus zeigt. Detail der OX-A/CB1R-Koexpression, die eine vermeintliche benachbarte Lokalisierung von OX-A/CB1R oder Co-Lokalisierung und Überlappung von OX-A/CB1R in denselben Zellen zeigt. LH: seitlicher Teil des Hypothalamus. Skalenbalken: 50 m (A, B); 25 m (A1, B1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Probenvorbereitung

Die Probenvorbereitung ist der erste kritische Schritt im IHC. Ein zuverlässiges Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung der Zellmorphologie, Gewebearchitektur und Antigenität. Dieser Schritt erfordert die korrekte Gewebesammlung, Fixierung und Abschnitt22, 23. Der Zweck der Fixierung ist es, Gewebe zu erhalten und die Wirkung von Gewebeenzymen oder Mikroorganismen zu reduzieren. Insbesondere bewahrt der Fixierungsschritt zelluläre Komponenten und Biomoleküle, verhindert die Autolyse und Verschiebung von Zellbestandteilen (wie Antigenen und Enzymen), stabilisiert zelluläre Materialien gegen aversive Wirkungen der folgenden Verfahren und erleichtert die Immunfärbung4,7,24.

Vor dem Schnitt wird das Gewebe durch Paraffineinbettung (Immunoperoxidase-Methode) oder kryopserviert (Einfrieren in Kryomedien, in mehreren Immunfluoreszenzmethoden) hergestellt und konserviert. Die Konservierungsmethode ist mit dem Typ der Fixierung7verknüpft. Nach der Fixierung und Konservierung werden die Gewebe durch ein Mikrotome in Scheiben geschnitten, wenn es in Paraffin eingebettet ist, oder durch einen Kryostat, wenn es in ein Kryomedium eingebettet ist. Gewebe werden in der Regel in einem Dickenbereich von 8-10 m geschnitten und auf Dias montiert. Für die Immunoperoxidase-Färbung kann die Probe zusätzliche Schritte erfordern, um die Epitope für die Antikörperbindung zu entlarven, einschließlich Deparaffinierung und Antigen-Retrieval25,26. Es sollte im Auge behalten werden, dass Überfixierung Epitopmaskierung verursachen kann, während Unterfixierung wenig bis gar kein positives Signal mit schwerer Kantenfärbung verursachen kann.

Blockierung und Hintergrundreduktion

Bei der Immunoperoxidase-Methode ist die hohe Affinität von Avidin für Biotin wahrscheinlich für die schnelle Produktion von Hintergrundfärbungen verantwortlich. Da die Avidin-Biotin-Reaktion irreversibel ist, kann der Hintergrund nicht entfernt werden18,27. Während des IHC kann ein hoher Hintergrund auch durch unspezifische Bindung an endogene Gewebebiotine erzeugt werden. Hydrophobe und ionische Wechselwirkungen (wie sie durch Kollagen und andere Bindegewebe wie Epithel und Adipozyten entstehen) sowie endogene Enzymaktivität sind Hauptursachen für Hintergrundfärbungen. Endogenes Biotin oder Enzyme und hydrophobe Bindung müssen vor der Antikörperfärbung minimiert werden, was durch Zugabe eines Reinigungsmittels wie Triton X-100 in den Blockierpuffern28erreicht werden kann.

Die Verwendung von 0,3%-0,4% Triton X-100 in den Blockierpuffern ermöglicht auch eine vollständige Permeabilisierung der Antikörper in Gewebeabschnitte. Darüber hinaus ist, obwohl Antikörper bevorzugt spezifisch für ein Epitop sind, eine teilweise Bindung an Stellen auf unspezifischen Proteinen möglich, was zu einer hohen Hintergrundfärbung29führt. Die unspezifischen Bindungen können das Signal des Zielantigens30maskieren. Um unspezifische Hintergrundfärbungen zu reduzieren, sollten Proben mit einem Puffer inkubiert werden, der unspezifische reaktive Standorte blockiert. Häufige Blockierpuffer sind normales Serum oder Rinderserumalbumin30. Die Art des blockierenden Serums sollte mit dem Wirt des sekundären Antikörpers identisch sein. Es wird empfohlen, die beste Inkubationszeit zu bestimmen. Die Konzentration des normalen Serums im Sperrpuffer ist eine weitere wichtige Bestimmung31. Darüber hinaus ist es für die Beseitigung der Hintergrundfärbung entscheidend, die optimale Verdünnung der primären und sekundären Antikörper zu verwenden. Daher muss die Inkubationszeit sorgfältig gewählt werden, zusätzlich zur Temperatur (d. h. erhöhen Sie die Zeit bei 4 °C, verringern Sie die Zeit, wenn bei RT) und Detektionssystem.

Antikörperwahl

Die Auswahl von Antikörpern für die IHC-Färbung ist wichtig und kann das experimentelle Ergebnisbeeinflussen 32. Um sicherzustellen, dass der Antikörper angemessen reagiert, muss das von ihm anerkannte Epitop berücksichtigt werden. Das Verständnis des Zielproteins und seiner Funktion, Gewebe- und subzellulären Lokalisation und ob es post-translationalen Modifikationen unterzogen wird, kann helfen, die Wahl des Antikörpers zu bestimmen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Prüfung verschiedener Konzentrationen von Primär-/Sekundärantikörpern, um den Hintergrund und die Aspezifität auf einem Mindestniveau zu halten, das mit einem bestimmten Signal kompatibel ist. Darüber hinaus ist es wichtig, die Reaktivität der Arten zu überprüfen, um die primäre und sekundäre Antikörperkompatibilität und die Fähigkeit des primären Antikörpers zu bestätigen, das Antigenziel in seiner nativen Konformation zu erkennen. Ein weiterer wichtiger Schritt für die primäre Antikörperwahl ist die Genausrichtung. Dadurch wird sichergestellt, dass der Primärantikörper mit dem Biomolekül von Interesse reagiert und Auskunft darüber liefert, welches Epitop vom Antikörper in einem bestimmten Tiermodell erkannt wird. Die Genausrichtung bietet auch die Möglichkeit, Antikörper auszuwählen, die epitope Epitope erkennen können, die evolutionär konserviert sind.

Steuerelemente

Zur Klärung der Spezifität der Antikörper ist ein wichtiger Aspekt die Durchführung der Kontrollen, die die Erkennung spezifischer Färbungen ermöglicht. Die Kontrollen umfassen: i) ein Gewebe, das bekannt ermaßen das Antigen als positiv ausdrücken; ii) ein Gewebe, von dem bekannt ist, dass es das Antigen nicht als negative Kontrolle ausdrückt; iii) das Auslassen des primären Antikörpers oder die Absorption des primären Antikörpers mit einem spezifischen Peptid, um zu bestätigen, dass der sekundäre Antikörper nicht mit anderen Gewebekomponenten kreuzt14,33.

Bei IHC-Techniken können mehrere Schritte Probleme verursachen, bevor die endgültige Färbung erreicht wird. Starke Hintergrundfärbung und unspezifische Zielantigenfärbung können durch endogenes Biotin bzw. primäre/sekundäre Antikörper-Kreuzreaktivität bzw. schlechte Enzymaktivität bzw. primäre Antikörper-Potenz verursacht werden. Hintergrundfärbung und unspezifische Bindung können verhindert werden, indem die endogene Enzyme vor der Inkubation mit dem primären Antikörper blockiert werden. Die Verwendung von normalem Serum ist der beste Weg, um unspezifische Interaktionen zu blockieren30. Die Auswahl des Blockierungspuffers hängt von der verwendeten Erkennungsmethode ab. Darüber hinaus kann ein Gewebe, von dem bekannt ist, dass es die Expression des Zielantigens als negativer Kontrolle fehlt, als Referenz dienen, um die Menge der Hintergrundfärbung34zu bestimmen. Die Ablagerung von chromogenen oder fluoreszierenden Signalen in der Negativkontrolle bestätigt das Vorhandensein einer unspezifischen Färbung. Darüber hinaus führt eine unzureichende Sperrzeitsperre zu einem hohen Hintergrund, während übermäßige Blockierung zu einem niedrigen Signal35führt.

Bei der Immunperoxidase-Färbung ist das Vorhandensein von endogener Peroxidase im Gewebe eine weitere Ursache für die Abscheidung im braunen Hintergrund. Die Behandlung mit H2O2 vor der Inkubation mit dem Primärantikörper blockiert die endogene Peroxidase36,37. Im Gegenteil, bei der Immunfluoreszenz spielt die Fixierung eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von Autofluoreszenz. Um Autofluoreszenz zu vermeiden, muss die beste Fixierungsmethode, der Zeitpunkt der Fixierung und die Vorbereitung von Geweben sorgfältig ausgewählt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt von IHC ist die Validierung des primären Antikörpers. Ein Antikörper gilt als gültig, wenn er ein konsistentes und spezifisches Färbemuster in einem bestimmten Gewebe oder einer bestimmten Zelle/Subzellulären produziert und wenn die Vorabsorption des primären Antikörpers mit einem bestimmten Peptid keine Färbungergibt 38. Bei der Immunfluoreszenz zeigt die unspezifische Bindung eine ähnliche fluoreszierende Intensität unter drei Farbfluoreszenzdetektoren, während das Signal variabel ist, da verschiedene fluoreszierende konjugierte sekundäre Antikörper verwendet werden. Diese Aspekte der IHC-Gewebevorbereitung und Der Antikörperfärbung müssen angegangen werden, um Färbungsprobleme zu überwinden.

IHC, obwohl eine relativ einfache Technik, stellt einige Einschränkungen dar und hängt von vielen Faktorenab 39. Einer der entscheidenden Punkte ist die Formalfixierung, die die Expression von post-translation modifizierten Proteinen verändern kann. Andererseits können formalfixierte Paraffin-eingebettete Gewebe langfristig bei Raumtemperatur gelagert werden, während gefrorene Gewebe nur bis zu einem Jahr bei -80 °C gelagert werden können. Darüber hinaus können gefrorene Gewebe durch die Bildung von Eiskristallen beschädigt werden, was die subzellulären Details beeinflussen kann, die die IHC-Färbung40,41verändern. In Bezug auf unsere Studien war der schwierigste Aspekt, spezifische primäre Antikörper gegen Zebrafischmoleküle zu finden. Obwohl Zebrafische als gültiges Tiermodell mit einem hochkonservierten Strukturgrad anerkannt wurden, wurden nur sehr wenige Antikörper entwickelt, die bestimmte Proteine und andere Moleküle in Zebrafischen erkennen können. Um diese Einschränkungen zu überwinden, ist es wichtig, die Aphypperität durch western blotting Analyse und Genausrichtung zu validieren.

Wachsendes Interesse an IHC-Methoden hat zur Entwicklung einer hochspezifischen Immunfärbung geführt, die investigative Studien helfen kann42. IHC wird mit zunehmender Häufigkeit verwendet, um das Vorhandensein spezifischer molekularer Marker und ihre Veränderungen in verschiedenen Pathologien zu identifizieren. Die beiden hier dargestellten Ansätze Immunperoxidase und Immunfluoreszenz haben jeweils Vor- und Nachteile43. Paraffin-eingebettetes Gewebe, das in der Immunperoxidase-Technik verwendet wird, kann eine hohe Auflösung von Zellen und Gewebe ermöglichen und Details über die Verteilung und Menge der Zielproteine44,45offenbaren. Paraffin-eingebettete Gewebe sind jedoch nicht für die Immunfluoreszenz geeignet, da Paraffin die Antigenität verschleiern und zu unspezifischer Fluoreszenz46führen kann. Andererseits bewahrt die Kryosektion des PFA-fixierten Gewebes die endogene Antigenität und führt zu einer Abnahme der unspezifischen Fluoreszenz. Auch wenn die technische Qualität der Kryosektionen viel niedriger ist als die von Paraffin-eingebettetem Gewebe, können sie mit der IHC-Technik47zu validen Ergebnissen führen.

Während die Paraffineinbettung morphologische Details besser bewahrt, bewahrt die Kryokonservierung die Enzym- und Antigenexpression besser, was zu einer detaillierteren Immunfärbung führt. Die Immunfluoreszenztechnik ermöglicht auch den zeitgenössischen Nachweis von zwei oder drei verschiedenen Biomolekülen, die mögliche Wechselwirkungen aufzeigen, wie in unserer früheren Arbeit für Orexin- und Endocannabinoidsysteme10dargestellt. Unter den Techniken, die zum Nachweis der Verteilung und des Niveaus spezifischer Biomoleküle verwendet werden, ermöglicht IHC nicht nur die Bestimmung spezifischer morphologischer Expression und Verteilung von Molekülen und Proteinen, sondern auch die Möglichkeit, quantitative analyse.

Mit Hilfe der Immunfluoreszenz kann auch die Kodistribution und Koexpression von Biomolekülen weiter verstanden werden, ebenso wie mögliche Wechselwirkungen und deren Veränderungen bei verschiedenen Pathologien48. Die konfokale Mikroskopie wurde in den letzten 20 Jahren häufig verwendet, um die zelluläre und subzelluläre Verteilung zahlreicher Proteine im Säugetiergehirn zu untersuchen. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht auch die Visualisierung (mit Fluorophoren oder Fluoreszenzfarbstoffen) spezifischer Interessenstrukturen wie Proteine, Organellen und anderer biologischer Materie; solche Signale können sowohl in festen als auch in lebenden biologischen Systemen verwendet werden, um spezifische subzelluläre Strukturen abzubilden49. Die potentielle modulatorische Funktion von Biomolekülen in bestimmten Zellkompartimenten kann über die Visualisierung ihrer Expressionsmuster untersucht werden, während die Rolle der Proteinsignalisierung innerhalb der Gewebe über die neuroanatomische Verteilung metabolische Enzymexpression oder Rezeptoren.

Die vorgestellte technische Arbeit stellt IHC-Ansätze, hauptsächlich Immunfluoreszenz, vor, um zwei hochkonservierte Systeme, Orexin und Endocannabinoid, in einem erwachsenen Zebrafischmodell zu untersuchen. Insbesondere können Immunfluoreszenzmethoden verwendet werden, um die Verteilung, relative Menge und anatomische Wechselwirkungen bestimmter Proteine in Zielgeweben zu bestimmen. Die Kryokonservierung von PFA-fixierten Geweben bewahrt hochempfindliche Proteine besser, die für eine schnelle Verschlechterung empfänglich sind. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Kryokonservierung Antigen und Antigenität besser bewahrt und die Untersuchung von post-translation modifizierten Proteinen und DNA ermöglicht.

Auch wenn gefroreneGewebe (im Vergleich zu Paraffin-eingebetteten Abschnitten) dicker sind, was die Fähigkeit behindert, die Gewebemorphologie im Detail zu beobachten, ermöglicht die konfokale Mikroskopie eine detailbenahe Probenvisualisierung und verbessert die Bildgebungsfunktionen. Darüber hinaus kann die Immunfluoreszenz für die quantitative Analyse der Färbeintensität verwendet werden, und die densitometrische Analyse des Signals liefert quantitative Daten. Dies ermöglicht die Bestimmung von Korrelationen von Fluorchromsignalspiegeln mit Proteinexpressionsspiegeln, indem Bereiche der Kolokalisierung betrachtet werden. Diese Arbeit beschreibt und veranschaulicht Protokolle, die verwendet werden können, um die evolutionäre Konservierung wichtiger Proteine in den erwachsenen Zebrafischen zu untersuchen. Die Verwendung von IHC, hauptsächlich Immunfluoreszenz, bei erwachsenen Zebrafischen kann dazu beitragen, die Nützlichkeit dieses Tiermodells bei der Untersuchung der morphologischen Expression und Verteilung hochkonservierter Biomoleküle hervorzuheben und mögliche Veränderungen in allen verschiedenen pathologischen Bedingungen, die mit der menschlichen Physiopathologie korrelieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, University of Sannio, unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biochemie Ausgabe 148 Immunhistochemie Immunperoxidase Orexinrezeptor Endocannabinoidrezeptor Zebrafischhirn Zebrafischdarm
Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden
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Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

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