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Biochemistry

면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

여기에 제시된 면역성 화학적 특성화 및 오렉스신 펩티드, 오렉스신 수용체, 및 정상 및 식이 유발 비만(DIO) 성인 제브라피시 모델의 장내 엔도칸나비노이드 수용체의 국소화를 위한 프로토콜이 제시되어 있다. 면역 페릭시다아제 및 이중 면역 형광 방법.

Abstract

면역 조직 화학 (IHC)는 표지된 항체를 가진 조직 단면도에 있는 표적 항원의 검출에서 관련시키는 높게 과민하고 특정 기술입니다. 최적의 특정 신호를 얻기 위해 각 단계의 최적화가 중요한 다단계 프로세스입니다. IHC를 통해 특정 바이오마커의 분포와 국소화를 감지하여 진화적 보존에 대한 정보를 공개할 수 있습니다. 더욱이, IHC는 비만과 같은 병리학적인 조건에서 바이오마커의 발현 및 분포 변화의 이해를 가능하게 한다. IHC, 주로 면역 형광 기술, 계통 유전학적으로 보존 된 분자의 조직 및 분포를 검출하기 위해 성인 얼룩말에서 사용할 수 있지만, 표준 IHC 프로토콜은 estasbled되지 않습니다. 오렉스신과 엔도칸나비노이드는 음식 섭취와 비만 병리의 통제에 관여하는 두 개의 고도로 보존된 시스템입니다. 여기에 보고된 프로토콜은 오덱신 펩티드(OXA), 오렉스신 수용체(OX-2R), 카나비노이드 수용체(CB1R) 국소화 및 정상 및 식이 유발 비만(DIO) 성인 제브라피시 모델의 장및 뇌분포에 대한 정보를 얻기 위해 사용된다. 또한 면역페록시다아제 및 이중 면역형광에 대한 방법뿐만 아니라 시약의 제제, 고정, 파라핀-임베딩, 제브라피시 조직의 극저온 보호 및 내인성 활성 차단 단계 및 배경을 위한 제제 역염색. 매개 변수의 전체 세트는 우리가 면역 형광이 OXs, OX-2R 및 CB1R 분포, 현지화 및 성인 얼룩말에서 표현의 보존의 이해에 도움이 될 수있는 방법을 보여 준 이전 IHC 실험에서 얻은 조직. 고도로 구체적인 신호 강도를 가진 결과 이미지는 제브라피쉬가 특정 바이오마커의 분포, 국소화 및 진화적 보존에 적합한 동물 모델이라는 것을 확인했습니다. 생리적 및 병리학적 조건. 여기에 제시된 프로토콜은 성인 얼룩말어의 IHC 실험에 권장됩니다.

Introduction

면역조직화학(IHC)은 항원-항체 상호작용1,2에의해 세포 또는 조직 성분(antigens)을 식별하는 데 사용되는 잘 확립된 고전 기술이다. 조직 내의 표적 생체분자의 국소화 및 분포를 식별하는데 사용될 수 있다. IHC는 조직 섹션에서 항원을 검출하기 위해 면역 학적 및 화학 반응을 사용3. 항원-항체 상호작용의 가시화에 사용되는 주요 마커는 형광 염료(immuno형광) 및 효소 기질 색 반응(면역페록시다아제)을 포함하며,둘 다 항체에 공액화된다 4. 현미경 관찰을 사용하여 표지 된 조직의 국소화를 결정할 수 있으며, 이는 조직 내의 표적 항원의 국소화에 약 대응합니다.

단백질을 검출하기 위해 형광 또는 발색 반응을 위해 존재하는 두 가지 방법이 있습니다 : 특정 1 차 항체가 직접 표지되는 직접 검출 방법; 및 간접 검출 방법은, 1차 항체가 비공화되고 이차 항체가 라벨5,6,7을운반하는 동안. 간접 방법은 주로 신호 증폭이다 몇 가지 장점을 갖는다. 더욱이, 다른 분자 및 세포 기술과 달리, 면역형광과 함께, 세포 및 조직 내에서 분화되는 2개 이상의 단백질의 분포, 국소화 및 공동발현을 가시화할 수있다7. 사용되는 검출 방법의 선택은 실험 세부 사항에 따라 달라집니다.

현재까지 IHC는 인간에서 무척추 동물까지 생물학적 조직에서 다양한 단백질의 분포 및 국소화및 일반적인 프로파일링을 이해하는 강력하고 필수적인 도구로 서 기초 연구에 널리 사용되고있다 8, 9개 , 10개 , 11. 이 기술은 많은 수의 정상 및 변경 된 동물 장기 및 다른 조직 유형에서 단백질 발현지도를 표시하여 생리적 및 병리학적 변화에 의해 유도 된 발현의 하향 또는 업 조절을 보여줍니다. IHC는 최적의 결과를 얻기 위해 정확성과 올바른 방법을 필요로 하는 매우 민감한 기술입니다12. 우선, 고정, 교차 반응성, 항원 검색 및 항체의 민감도와 같은 많은 상이한 인자는 거짓양성 및 거짓 음성 신호(13)로 이어질 수 있다. 항체의 선택은 IHC에서 가장 중요한 단계 중 하나이며 조사 중인 단백질 및 종에 대한 항원특이성 및 그 친화성에 의존한다 7.

최근, 우리는 성인 얼룩말 조직에서 오렌신 / 저크레틴 과 엔도 칸 나비 노이드 시스템의 구성원을 검출하기 위해 IHC 기술을 최적화했습니다. 우리는 주로 고정, 두 가지 접근법을 사용하여 조직 포함, 단면화 및 장착 (현미경 분석 중 해상도 및 세부 사항에 영향을 미칠 수 있음), 및 차단 (거짓 긍정을 방지하고 배경을 줄이기 위해)14. 다른 중요한 특성은 개별 IHC 프로토콜의 항체 특이성 및 선택성 및 재현성이다. 항체 특이성을 제공하는 열쇠는 음성 대조군(표적 단백질을 발현하지 않는 것으로 알려진 1차 항체 또는 조직을 포함하지 않음)뿐만 아니라 양성 대조군(표적 단백질을 발현하는 것으로 알려진 조직 포함)의 사용이다15 . IHC에 대한 항체의 선택은 그들의 종 특이성 (관심있는 항원과 반응할 가능성) 및 4,5,6에 사용되는 항원 항체 결합 검출 시스템에 기초하여 이루어집니다. ,7. 면역페록시다아제의 경우, 반응의 색은 침전 염색체, 보통 디아미노벤지딘(brown)16의선택에 의해 결정된다. 한편, immunofluorescence는 형광체와 공액된 항체를 활용하여 동결 조직 섹션에서 단백질 발현을 시각화하고 염색체 검출 시스템에 대하여 여러 단백질을 쉽게 분석할 수 있습니다. 5개 , 7.

면역페록시다아제 기술에서, 이차 항체는 염색체 리포터 분자[아비딘-비오틴 복합체(ABC)]를 모집할 수 있는 링커 분자인 비오틴에 공액화되어 염색 신호의 증폭을 유도한다. ABC 리포터 방법을 사용하면 효소 과산화 효소가 3,3'-다미노 벤지딘 (DAB)과 반응하여 효소가 이차 항체에 결합하는 강렬한 갈색 염색을 생성하여 일반 광 현미경으로 분석 할 수 있습니다. ABC 염색은 비오틴에 대한 아비딘의 높은 친화도 때문에 1 차 항체 반응성의 부위에 부착된 이차 항체가 거의 없는 신속하고 최적의 반응을 생성합니다. 이러한 발색 검출 방법은 신호의 밀도 분석을 허용하고, 단백질 발현 수준18과갈색 신호 수준의 상관관계에 기초하여 반정량적 데이터를 제공한다.

면역형광 기술을 사용하면 독특한 파장에서 빛을 방출하는 다양한 형광화의 능력으로 인해 여러 단백질을 동시에 검출할 수 있지만 스펙트럼 중복을 최소화하기 위해 형광화를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 5.또한, 상이한 숙주 종에서 1차 항체의 사용은 교차 반응성에 관한 어려움을 최소화한다. 이 경우, 각 종 특이적 이차 항체는 1차 항체의 한 가지 유형만을 인식한다. 형광 리포터는 알렉사 플루오르 염료와 같은 상업적 유도체를 포함하는 작은 유기 분자이다.

많은 동물 모델은 특정 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는 데 사용됩니다. 현재까지, 많은 신진 대사 경로 진화의 과정을 통해 보존 설립. 따라서, 제브라피시와 같은 모델 유기체에 대한 IHC 연구는 병리학적 및 비병리학적 조건의 기원 및 유지에 대한 통찰력을 제공할 수 있다17. 이 보고서의 목적은 성인 제브라피시 조직에서 수행될 수 있는 IHC 프로토콜을 설명하고 주변 및 중앙 수준에서 OXA, OX-2R 및 CB1R의 분포 및 국소화에 대한 상세한 이미지를 얻는 데 사용됩니다. 또한 성인 제브라피시의 말초 및 중앙 조직에서 두 가지 주요 IHC 간접 방법의 적용을 위한 프로토콜이 보고되었다. 설명된 간접 방법은 이차 항체가 형광 염료(면역형광 법) 또는 효소 리포터(면역페록시다아제 방법)에 공액화되는 경우에 신호 증폭을 허용하는 방법이다. 발색성 및 형광 검출 방법 모두 장점과 단점을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에 보고된 것은 IHC의 사용, 주로 면역형광, 성인 제브라피시, 상이한 생리학적 및 병리학적 조건에 걸쳐 진화적으로 보존되는 시스템을 연구하는 데 널리 사용되는 동물 모델이다.

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Protocol

1. 면역페록시다아제 프로토콜

참고 : 제브라피쉬는 오미드 사파리 교수 (수산학과, 천연 자원 및 환경 학부, 마슈하드, 마슈하드, 이란 의 페르도우시 대학)에 의해 얻어졌다10.

  1. 조직 해부
    1. 얼음물에 침수하여 제브라피시를 희생 (5 부분 얼음 / 1 부분 물, 4 ° C); 저산소증에 의한 죽음을 보장하기 위해 모든 운동이 중단 될 때까지 그들을 둡니다.
    2. 다음과 같은 해부 방법으로 창자와 뇌를 신속하게 제거하십시오.
      1. 종이 타월에 물고기를 건조하고 해부 매트에 처지게 배치, 눈 소켓의 복부 부분과 꼬리의 육체 부분을 차단.
      2. 장의 경우 : 피부를 잘라 조심스럽게 내부 장기가 볼 때까지 물고기의 측면에서 피부와 기본 근육을 제거합니다. 몸을 뻗어 몸 구멍에서 창자를 제거합니다.
      3. 뇌의 경우: 면도날로 머리를 제거합니다. 집게로 두개골의 복부 쪽에서 부드러운 조직을 제거하십시오. 두개골을 열고 뇌의 복부 쪽에서 뼈를 제거합니다. 뇌의 등쪽에서 피부와 두개골 뼈를 제거합니다. 뇌를 제거합니다.
  2. 조직 고정
    1. 실온(RT)에서 3시간 동안 인산완충제(PB, pH 7.4, 4°C)에 신선한 4% 파라포름데이드(PFA)에 침지하여 해부 조직을 고정한다.
      1. 증류수(dH2O)의 450 mL에서 NaH2PO 4H2 O 및 Na2HPO4의 1.755 g을 용해시킴으로써 0.1 M PB를 준비하고, 필요한 양의 NaOH 1N으로 7.4의 pH로 조정한다.
      2. 열판상에서 교반하여 0.1 M PB(pH 7.4)의 100 mL에서 4% PFA용 을 준비한다. 60 °C의 온도에 도달하면 NaOH 1N 2-4 방울을 추가하여 명확한 용액을 얻습니다. RT에서 PFA 4 %를 왼쪽및 pH를 제어합니다. pH를 7.4로 조정합니다.
        참고 : 4-6 시간 이상 조직 고정은 항원을 마스크하여 항체 - 에피토프 결합을 제한하는 과다 수정으로 이어질 수 있습니다. 고정 시간은 조직 크기에 따라 다릅니다.
  3. 조직 포함
    1. 0.1 M PB (pH 7.4)에 침지하여 조직을 5 x 5 분 동안 헹구는다.
    2. 알코올 70 % (6 분), 80 % (6 분), 95 % (5 분), 95 % (5 분), 100 % (1 분), 100 % (1 분)에 후속 침수에 의해 조직을 탈수하십시오.
    3. 100% 알코올에 침지하여 조직을 명확히 합니다: 자일렌(1:1)을 10분 동안, 자일렌에서 각각 5분 동안 2회.
    4. 파라핀 왁스 (56 °C)로 조직에 2 회 1 시간 동안 파라핀에 직접 침지하여 침투하십시오.
    5. 실온(RT)에서 파라핀 블록에 티슈를 포함하고 단면이 될 때까지 RT에 보관하십시오.
  4. 조직 절단
    1. 마이크로토메로 8 μm 두께의 관상 또는 시상 섹션으로 조직을 자르고, 38 °C에서 따뜻하게 한 접착 유리 슬라이드에 대체 시리즈의 섹션을 수집합니다.
    2. 슬라이드를 37°C에서 하룻밤 동안 건조시고 말립니다.
  5. 조직 절제의 탈파화 및 수화
    1. 5분 동안 자일렌에 담근 다음 3분간 자일렌에 담근 후 절편을 디왁스합니다.
    2. 알코올 100 % II (1 분), 100 % I (1 분), 95 % (1 분), 75 % (1 분), 50 % (1 분)에 슬라이드를 배치 한 다음, 다음 dH2O (5 분)에 슬라이드침에 의해 섹션을 다시 수화.
      참고 : 반응을 시작하기 전에 섹션을 완전히 제거하십시오. 섹션에 여전히 파라핀의 흔적이 있는 경우, 자일렌에 5분 이상 추가로 담그다.
  6. 항원 회수
    1. 용액의 슬라이드를 침지하고 전자 레인지에서 최대 전력으로 5 분 동안 가열하여 구연산염 완충제 (0.01 M, pH 6.0)로 섹션을 처리하십시오.
    2. 섹션을 식힙니다.
    3. 항원 회수를 완료하기 위해 최대 전력으로 전자레인지에서 5분 의 주기를 반복합니다.
      1. 구연산 완충액(0.01M, pH 6.0)을 dH2O100 mL에 구연산 2.10 g, 구연산 나트륨 5.882g에 200 mL의 dH 2O. 혼합 구연산(0.01M)을 구연산(0.01M)으로 1:4P 비율로 구연산(0.01M)으로 혼합하여 구연산완충(0.01M, pH 6.0)을 준비합니다. 6 HCl 0.1N을 사용 하 여.
  7. 내인성 과산화증 차단
    1. 용매 저항펜으로 슬라이드의 조직 영역을 분류합니다.
    2. 트리스 버퍼링 식염수(TBS)(0.1M, pH 7.3)로 각 부분을 3회, 5분간 헹구어 냅니다.
      1. dH2O의 950 mL에서 12.1 g의 트리즈마 염기 및 9 g의 NaCl을 용해시킴으로써 0.1 M TBS를 준비하고 HCl 0.1N으로 pH 7.3으로 조정합니다.
    3. RT에서 5분 동안 0.75%H2O2의 용액에 슬라이드침수에 의해 내인성 과산화아제 활성을 차단한다.
      1. dH2 O의 195 mL에서 30%H2O2의 5 mL용을 용해하는 0.75% H2 O 2 용액을 준비한다.
        참고: ndogenous 효소는 IHC 시약과 반응하고 거짓 양성 결과를 얻을 수 있습니다. 더욱이, 높게 혈관화한 조직은 강렬한 비특이적 염색 및 배경 수준으로 이끌어 낼 수 있는 많은 내인성 과산화증을 표현합니다. 0.75% H2O2로 처리하면 내인성 과산화아제내생을 담금질하고 비특이적 배경을 현저하게 감소시킨다.
  8. 비특이적 차단 빈디 (있는) ng 사이트 및 조직 투과
    1. 1차 항혈청(NRS)을 함유하는 TBS/0.4% 트리톤(TBS-T) 차단 완충제로 조직 절편을 30분 동안 RT에서 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단한다.
      1. TBS 100 mL에서 트리톤 X-1000 0.4 mL을 용해시켜 0.4 % 트리톤을 준비하십시오.
      2. 0.4% 트리톤 X-100을 함유하는 TBS에서 1% 정상 혈청을 용해시킴으로써 차단 완충액 TBS-T 용액을 준비한다(1 mL의 정상 혈청 + TBS 의 8.2 mL + 0.48 트리톤 X-100의 0.8 mL).
        참고 : 이차 항체의 숙주에 따라 동물 혈청의 종을 선택하십시오 (예를 들어, 염소 항 토끼 이차 항체를 사용하는 경우 정상 염소 혈청을 사용하십시오).
  9. 1 차적인 항체를 가진 조직 배양
    1. TBS-T에서 희석된 1차 항체로 RT의 습한 상자에 밤새 섹션을 배양합니다. 다음과 같은 1 차항체로 단면을 염색하십시오.
      1. OX-2R에 대하여 염소 항체는 단백질의 C 단자를 인식하는 1:200 희석했다.
      2. OX-A희석에 대한 염소 항체 1:200 [오렉스신-A (C-19)], 이는 단백질의 C 말단을 인식한다.
        참고: 1차 항체가 관심 있는 생체 분자와 반응하도록 하십시오. 생체 분자의 에피토프가 유전자 정렬을 사용하여 1 차 항체가 반응하는 것을 정의합니다. 예를 들어, OX-A 에피토프는 인간 OX-A(O43612)의 aa 50-100 사이에 매핑된 반면, OX-2R 에피토프는 인간의 C-터미널에서 마지막 50a 근처에 매핑되었습니다.
  10. 이차 항체를 가진 조직 배양
    1. 0.1 M TBS (pH 7.3)로 섹션을 각각 5 분 동안 3 x 헹구지 하십시오.
    2. 바이오틴과 공액된 생체면역항체와 토끼 항염소 면역글로불린(H+L)으로 RT에서 1.5시간 동안 섹션을 배양한 다음 TBS-T에서 1:100을 희석합니다.
      참고 : 테스트 하고 배경의 감소를 허용 최적의 희석을 찾기 위해 기본 및 이차 항체 모두의 다른 희석을 찾을 수 있습니다.
  11. 과산화아제 반응
    1. 0.1 M TBS (pH 7.3)로 섹션을 각각 5 분 동안 3 x 헹구지 하십시오.
    2. 아비딘 -비오틴 복합체 (ABC)로 섹션을 1 시간 동안 배양하십시오.
      1. TBS 5 mL에 성분 A 2 방울을 추가하고 성분 B 2 방울을 추가하는 ABC 솔루션을 준비합니다.
    3. 0.1 M TBS (pH 7.3)로 섹션을 각각 5 분 동안 3 x 헹구지 하십시오.
    4. 염색체 기판 3,3'-다미노벤지딘-4 (DAB)로 단면을 치료하십시오.
      1. DAB 염색체 농축액 1mL에 DAB 염색체 농축액 1방울(약 30 μL)을 첨가하고 사용하기 전에 잘 섞어 DAB 용액을 준비합니다.
        참고: 사용 하기 전에 적어도 30 분 ABC 용액을 준비 하 고 안정적인 아비딘/비오틴 바인딩을 허용 하기 위해 사용 될 때까지 4 °C에서 복잡 한 유지. 신선한 DAB 작업 용액을 준비하고, 조직 섹션에 적용하고, 색상이 적절할 때까지 개발하십시오. 발색 반응이 에피토프 부위를 갈색으로 변환하고 신호의 강도가 이미징에 적합할 때, 다음 단계로 진행한다. DAB 개발 의 타이밍은 몇 초에서 10 분까지 다를 수 있습니다. OX-A와 OX-2R 1의 경우 2분으로 충분합니다. 발암성이기 때문에 DAB를 조심스럽게 다루어 보시고 보시고 보시고 있습니다.
  12. 조직 탈수 및 장착
    1. DAB 반응을 중지하기 위해 0.1 M TBS (pH 7.3)로 모든 섹션을 각각 5 분 동안 3x 헹구십시오.
    2. 알코올 50 % (2 분), 75 % (2 분), 95 % (2 분), 100 % I (2 분), 100 % II (2 분)에 후속 슬라이드 침지에 의해 섹션을 탈수.
    3. 자일렌에 2x 침지하여 슬라이스를 10분씩 바개합니다.
    4. DPX(디부틸 프탈레이트 자일렌) 마운트로 섹션을 장착하고, 슬라이드에 마운팅 미디어 2방울을 추가하고 커버슬립으로 천천히 토핑합니다.
      참고 : 탈수 시 알코올 농도가 증가하면 조직이 알코올에 침투하고 알코올로 물을 대체하므로 정확한 탈수 시간을 결정하고 조직을 과도하게 탈수하지 마십시오. 탈수 후 자일렌에 침지하여 조직을 명확히하고 과잉 또는 잔여 알코올을 제거하십시오.
  13. 컨트롤
    1. 반복 섹션 1.1-1.12, 1 차 항체를 생략하고/또는 TBS(음성 대조군)에 의해 1차 항체 또는 이차 항체 IgG를 치규한다.
    2. 반복 섹션 1.1-1.12 상대 펩티드의 과잉으로 각 기본 항체를 미리 흡수 (희석 된 항세럼의 펩티드 / 1 mL 의 100 mg).
    3. 1.1-1.12 항을 양성 대조군으로 다른 조직을 사용하여 반복한다(예를 들어, 마우스 조직).
      참고: 시작하기 직전에 모든 버퍼를 새로 준비합니다. 각 단계에서 피펫이나 필터 용지로 각 단계에서 여분의 액체를 조심스럽게 제거하여 항상 섹션을 젖은 상태로 유지하십시오.
  14. 이미지 수집 및 분석
    1. 디지털 카메라가 장착된 현미경을 사용하여 일정한 조명과 동일한 배율로 디지털 이미지를 수집합니다.
    2. 이미징 소프트웨어를 사용하여 염색 강도의 반정량 분석을 수행합니다(재료 표참조).
      1. OX-A 또는 OX2-R 양성 지수를 평가하기 위해 캡처된 이미지를 .lif 또는 .tiff 파일 형식으로 엽니다.
      2. 측정에서 버튼을 선택하고 수동 Counting를 클릭합니다. 마우스를 클릭하여 양극 세포에 마크를 배치하여 화면에서 직접 염색된 셀 프로파일 수를 계산합니다.
      3. 관심 영역(ROI) 영역(3 x 103 μm 2)을 선택하여 면역 신호 밀도(광학 밀도, OD)를 정량화합니다.
      4. 분석된 이미지 내부에 가장 높은 강도(높은 긍정) 및 최소 강도(음수)가 있는 픽셀을 결정하여 0을 배경 값(즉, 염색된 세포가 없는 조직의 일부)으로 할당합니다.
      5. 흡수의 로그 스케일에서 작업하여 OD를 평가합니다. 디지털 이미지 분석에서 DAB 픽셀 강도는 가장 어두운(0값)에서 가장 밝은 음영(255값) 음영까지 다양합니다.
      6. 로그 10(255/I)의히스토그램을 플로팅하여 OD를 결정합니다.
        참고 : 영구적이고 안정적인 면역 페록시다아제 반응은 언제든지 밝은 필드 현미경으로 분석 할 수 있습니다. 인접한 섹션에서 동일한 셀의 이중 계수를 방지하려면 대체 섹션에서 레이블이 지정된 셀의 계산을 수행합니다.

2. 면역 형광 프로토콜

  1. 조직 해부
    1. 1.1절에 기재된 바와 같이 동물을 희생하고 해부한다.
  2. 조직 고정
    1. 4°C에서 4% PFA에서 3시간 동안 침지하여 장과 뇌를 고정시다.
      1. 섹션 1.2.1에서와 같이 PB 및 4% PFA를 준비합니다.
        참고 : 고정 시간은 조직 크기에 따라 다릅니다. 4-6 시간 이상에 대한 조직 고정은 항원을 마스크하고 항체 에피토프 결합을 제한하는 과다 수정으로 이어질 수 있습니다.
  3. 조직 포함
    1. 0.1 M PB (pH 7.4)로 조직을 각각 5 분 동안 3 x 헹구는다.
    2. 저온 보호를 위해, 조직을 PB(0.1 M, pH 7.4)에서 20% 자당으로 옮기고 4°C에서 하룻밤 동안 유지한다. 이어서, 0.1 M PB(pH 7.4)에서 30% 자당으로 조직을 옮기고 4°C에서 추가로 밤을 유지한다.
    3. 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물의 블록에 조직을 포함. 이렇게하려면, 액체 질소의 작은 dewar을 준비, 알루미늄 호일을 가지고, 팬을 만들기 위해 반으로 잘라. OCT 화합물로 채워진 조직을 함유하는 팬은 OCT 화합물이 냉각될 때까지 액체 질소에 담근다. 동결된 조직은 단면화될 때까지 -80°C에서 보관될 수 있다.
  4. 조직 절단
    1. 동결된 조직 블록을 -20°C에서 저온 저온 으로 옮기고 10 μm의 관상 동맥 또는 시상 절편으로 절단한다.
    2. 면역조직화학에 적합한 접착제 유리 슬라이드상에 대체 직렬 섹션의 조직을 수집하고 사용할 때까지 -20°C에 보관합니다.
      참고: 어두운 슬라이드 상자 나 슬라이드 북에 -20 °C와 4 °C 사이의 슬라이드를 저장합니다.
  5. 비특이적 결합 부위 및 조직 투과열 차단
    1. 용매 저항펜으로 슬라이드의 조직 영역을 분류합니다.
    2. 0.1 M PB (pH 7.4)로 섹션을 각각 5 분 동안 3 x 헹구어냅니다.
    3. 투과 버퍼PB-트리톤 X-100 0.3% (PB-T)에 용해된 1% 정상 당나귀 혈청으로 섹션을 30분 동안 RT에서 투과하여 세포막을 투과하고 비특이적 결합 부위를 차단한다.
      1. 트리톤 X-100 0.3% 0.3 mL의 트리톤 X-100을 0.1 M PB(pH 7.4)의 100 mL에 용해준비한다.
      2. 0.3% 트리톤X-100을 함유하는 PB에서 1% 정상 당나귀 혈청을 용해시키는 차단 용액을 준비한다.
        참고: 투과 및 차단 완충제에 사용되는 혈청의 동물 종은 이차 항체의 숙주에 의존한다.
  6. 1 차항체의 혼합을 가진 배양
    1. 0.1 M PB (pH 7.4)로 섹션을 각각 5 분 동안 3 x 헹구어냅니다.
      1. PB-T에서 희석된 1차 항체를 혼합하여 RT의 습한 상자에 밤새 섹션을 배양합니다. 1 차 항체의 다음 혼합은 사용될 수 있습니다: 1:100 희석 된 CB1R에 대하여 OX-2R 희석 된 1:100 / 토끼 항체에 대한 염소 항체 1:100, 또는 CB1R 희석 에 대하여 1:100 / 토끼 항체에 대한 염소 항체 1:100.
  7. 이차 항체의 혼합을 가진 배양
    1. 0.1 M PB (pH 7.4)로 섹션을 각각 5 분 동안 3 x 헹구어냅니다.
    2. 1) 당나귀 항토끼 알렉사 플루어 488-컨쥬게이트 이차 항체및 당나귀 항염소 알렉사 플루어 594-컨쥬게이트 이차 항체를 PB-T에서 1:100희석한 혼합체와 함께 RT에서 2시간 동안 배양; 또는 2) 당나귀 항염소 알렉사 플루어 488-컨쥬게이트 이차 항체및 당나귀 항토끼 알렉사 플루어 594-컨쥬게이트 이차 항체를 PB-T에서 1:100 희석한 혼합체.
      참고: 동일한 동물 숙주에서 개발된 이차 항체를 사용한다. 정상 혈청은 이차 항체의 동일한 종에 속해야 한다(예를 들어, 당나귀 및 당나귀 정상 혈청에서 개발된 이차 항체를 사용). 세제를 함유하는 차단 완충제로 1차 및 2차 항체를 희석하여 세포 투과를 증가시키고 배경을 감소시다.
  8. 티슈 마운팅
    1. 0.1 M PB (pH 7.4)로 섹션을 각각 5 분 동안 3 x 헹구어냅니다.
    2. 핵염료 DAPI(4', 6-디아미디노-2-페니린들)로 단면을 3 mL에 DAPI(1 mg/mL)의 1.5 μL을 용해시키는 것을 제조하였다.
    3. 장착 매체가 있는 커버슬립 슬라이드(재료 표참조). 이 수성 장착 매체는 장기 사용을 위해 조직 샘플과 얼룩을 안정화시고 있습니다. 형광 샘플은 4°C에서 어둠 속에서 보관할 수 있다. 플루오로피의 수명을 연장하려면 반공급 장착 매체를 사용하십시오.
      참고 : 좋은 장착 매체를 선택하십시오. 마운팅 제의 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 굴절률 (nD)이며, 이는 유리의 굴절률 약 1.5이어야합니다. 여기에서 사용되는 마운팅 배지는 특히 효소 및 지질 측정을 위해 제조된 시편(즉, 오름차순 일련의 알코올로 탈수해서는 안 되는 시편)에 사용될 수 있다.
  9. 컨트롤
    1. 반복 섹션 2.1-2.8, 1 차 또는 이차 항체를 생략하거나, PB(음성 대조군)를 가진 1차 또는 이차 항혈청을 특정 단계에서 치규한다.
    2. 반복 섹션 2.1-2.8, 상대 펩티드의 과잉으로 각 기본 항체를 미리 흡수 (희석 된 항세럼의 펩티드 / 1 mL 의 100 mg).
    3. 마우스 뇌 조각(양성 대조군)에서 2.1-2.8절을 반복합니다.
      참고: 시작하기 직전에 모든 버퍼를 새로 준비합니다. 각 단계에서 피펫이나 필터 용지를 조심스럽게 제거하여 항상 섹션을 습하게 유지하십시오.
  10. 이미지 수집
    1. x-y-z 전동 단계, 디지털 카메라, NIS-Elements C와 같은 수집 및 이미지 분석 소프트웨어가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 면역 염색 된 부분을 관찰하고 분석합니다. 5-20-40배 목표를 사용하여 디지털 이미지를 수집합니다.
    2. 낮은 배율 몽타주를 구성하기 위해 사용 가능한 각 채널에서 낮은 배율(10x 또는 20배 대)으로 각 섹션의 이미지를 가져가서 OX-2R/CB1R의 현지화 및 문서화를 용이하게 하기 위해 전체 영역의 개요를 제공합니다. 해부학 공동 표현. 분석 전에 형광 이미지를 정규화하여 대비를 극대화하고 오버레이합니다.
    3. 관심 영역 전체에 걸쳐 이미지의 직렬 Z 스택을 수집합니다. OX-2R/CB1R 공동 발현이 노란색 puncta로 시각화되는 조직 볼륨을 커버하기 위해 1-1.8 μm의 초점 단계로 6 개의 초점 평면 (Z 단계)을 통해 이미지를 획득합니다. Z 전동 현미경을 사용하여 각 채널(적색, 녹색, 파랑)에 대해 이 컬렉션을 별도로 수행합니다.
    4. 이미징 데선볼루션 소프트웨어를 사용하여 10번의 반복을 적용하여 이미지를 데선볼로 만들고 직렬 Z 평면 이미지를 단일 최대 프로젝션 이미지로 축소합니다.
    5. 어도비 포토샵 6.01 (어도비 시스템즈, 산호세, 캘리포니아)를 사용하여 빛과 대비를 위한 현미경 을 조정합니다.
      참고: 관찰 하는 동안 deconvolution 단계를 수행 하면 배경을 더 줄일 수 있습니다. 광표백을 방지하기 위해 슬라이드 노출을 빛으로 제한하십시오.
  11. 이미지 분석
    1. 각 동물의 관심 영역을 모두 커버하여 교대로 10 μm 두께의 단면(그룹당 동물 5개)에서 OX-2R/CB1R 공동발현의 정량적 분석을 수행합니다.
    2. OX-2R/CB1R 공동 표현을 이미지 분석의 반자동 시스템으로 노란색 양수 puncta의 수로 정량화합니다. Imagins 소프트웨어는 서로 다른 형광 프로브 간의 중첩 영역에 대한 정량적 데이터와 함께 더 높은 수준의 세부 정보를 제공할 수 있습니다.
    3. 두 채널의 신호 강도에 대한 임계값 도구를 사용하여 puncta를 정량화합니다. .liff, .tiff 또는 .jpg 이미지 파일을 열고 이미지 임계값을선택합니다. 자동 설정 또는 수동 방법을 선택하고 스테인드 된 모든 puncta가 선택 될 때까지 임계 값을 조절합니다. 배경 임계값을 얻기 위해 면역 표지된 객체를 포함하지 않는 이미지 영역에서 픽셀 강도의 분포를 분석합니다. 모든 이미지에 대해 이 배경을 개별적으로 결정합니다. 그런 다음 픽셀 강도 기준선을 배경 값으로 설정하여 백그라운드 임계값을 제거합니다.
    4. 분석-측정을 선택하고 측정할 매개변수를 선택합니다(puncta 강도 최소값, 최대 값 및 평균 값, 면역 라벨이 지정된 puncta의 개수/밀도).
    5. 각 섹션에 대한 4 Z 스택에서 조직의 볼륨을 따라 노란색 puncta를 계산, 바로 위 또는 아래 스택을 사용하여 최고의 초점 평면에. 분석에서 초점이 벗어난 영역을 제외합니다.
      참고: 인접한 섹션에서 동일한 셀을 두 번 계산하지 않도록 대체 섹션에서 레이블이 지정된 셀수를 계산합니다.

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Representative Results

면역페록시다아제 염색에 대한 대표적인 데이터는 도 1 및 도 2에도시되어 있다. 성인 제브라피시의 장에서 OX-A 및 OX-2R 분포의 면역조직화학적 분석은 DIO 제브라피시의 장세포에서의 OX-A 및 OX-2R의 상이한 국소화 부위 및 이들의 발현 증가를 보여주었다. OX-A에 대한 강렬한 갈색 염색은 내측 및 전방 장의 세포에서 관찰되었다 (도1A,A 1). OX-A의 면역 발현은 다른 창자 구성에서 명확한 신호를 주었고, 내측 장으로 전방에서 감소하였다 (그림1B,B 1). 음극 대조군을 배경에 대한 참조로서 사용하였고 OX-A신호의 특이성을 확인하였다(도 1E). 염색체 DAB에 장기간 노출되면 배경 강도의 증가가 발생하였다(도1D). DIO 및 조절 식이제브라피시의 OX-2R 면역발현에 대해 유사한결과가 관찰되었다(도 2). DIO 성체 제브라피시에서 증가된 OX-A 신호는 다른 장 내 구성에서 OX-2R의 과발현을 수반하였다(도2B,B 1).

면역형광을 이용하여, 면역페록시다아제 분석에 의해 얻어진 데이터를 확인하였고, 대조군과 관련하여 성인 DIO 제브라피시의 장에서 OX-A 및 OX-2R 발현의 증가를 기초로 하였다(도 3). 더욱이, 이중 면역형광을 이용하여, 엔도칸나비노이드 수용체 CB1R의 발현에 대한 정보를 얻을 수 있었고, 그 공제식이및 DIO 성체 제브라피시의 장내 및 뇌에서 OX-A 또는 OX-2R과의 공동 국소화를 가능하게 하였다. 면역형광의 장점은 면역페록시다아제 기술에 비해 조직 형태에 대한 정보가 적게 제공된 더 상세한 신호를 산출한다는 것입니다. 면역 형광 방법을 사용하여, 우리는 이전에 창자와 두뇌 둘 다에 있는 OX-2R과 CB1R 사이 해부학 상호 작용을 결정했습니다10.

면역형광 이미지의 정확한 분석은 대조군 식단에 비해 DIO 성체 얼룩말어의 장에서 OX-2R/CB1R 공동 국소화의 증가를 보였다(도3B,C). 등쪽 말살기암, 시상하부(측면, 복부 및 등쪽 영역), 광학 지각, 토러스 측삭, 열등한 로브의 확산 핵과 같은 상이한 뇌 영역에서도 유사한상황이 관찰되었다(그림 4). 음의(도5A,B) 및 양성(마우스 브레인) (도5C)대조군을 배경에 대한 참조로서 사용되었고 CB1R 및 OX-2R 신호의 특이성을 확인하였다.

더욱이, OX-A/CB1R로 이중 면역염색함으로써, 시상하부의 오렉시네르지성 뉴런에서 OX-A 형광 신호의 증가와 함께 공동 국소화의 증가가 있었다는 것을 관찰하였다(도 6). 이 결과는 이중 면역형광이 생리적으로 보존된 단백질 발현, 표적 단백질의 공동 국소화, 그리고 다른 병리학적 조건에서의 분포 및/또는 발현 변화를 식별하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 를 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: DIO의 장에서 오렉스신 면역 국소화 대. 제어 다이어트 성인 얼룩말. (a) 조절식이제브라피시의 내측장의 세포에서 OX-A 면역반응성. (A1) DIO 제브라피시의 내측 장의 세포에서 OX-A 면역 반응성. (B) OX-A 면역반응성 대조군 제브라피시의 전방 장의 세포에서의 면역반응성. (B1) DIO 제브라피시의 전방 장의 세포에서 OX-A 면역 반응성. (A1, B1) DIO 제브라피시의 내측 및 전방 장의 상이한 조직 구성에서 OX-A 양성 세포의 증가. (C) DIO 제브라피시의 전방 장의 세포에서 OX-A 면역 반응성. (D) DAB에 장기간 노출된 후 OX-A에 대한 면역페록시다아제 반응. (E) 네거티브 컨트롤. 스케일 바: 50 μm(A, A 1, B, B1); 100 μm (C, D, E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: Orexin 2 수용체 면역 국소화DIO 대대조 군성 체형 체형. (a) 조절식이제브라피시의 내측장의 세포에서 OX-2R 면역반응성. (A1) DIO 제브라피시의 내측 장의 세포에서 OX-2R 면역 반응성. (B) OX-2R 면역반응성 대조군 제브라피쉬의 전방 장의 세포에서의 면역반응성. (B1) DIO 제브라피시의 전방 장의 세포에서 OX-2R 면역 반응성. (A1, B1) DIO 제브라피시의 내측 및 전방 장의 상이한 조직 구성에서 OX-2R 양성 세포의 증가. 배율 표시줄: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: DIO 대 제어 다이어트 성인 얼룩말피시의 장에서 OX-A (녹색)/CB1R (빨간색)/CB1R (녹색)과 OX-2R/CB1R (노란색)와 의 공동 지역화의 분포. (A) OX-A/CB1R 대조군 다이어트 성인 제브라피쉬의 장에서 공동 발현. (B) OX-2R/CB1R 대조군 다이어트 제브라피쉬의 장 내에서 공동 발현. (C) DIO 성인 제브라피쉬의 장 내에서 OX-2R/CB1R 공동 발현. DIO 제브라피시의 장에서 OX-2R/CB1R 공동 국소화(노란색 점)의 증가. 배율 표시줄: 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: DIO 대 제어 다이어트 성인 얼룩말의 뇌 관상 섹션에서 OX-2R (빨간색) 및 CB1R (녹색)과 그들의 공동 지역화의 분포. (A) 제어 식이 제브라피시의 말렌치에서 OX-2R/CB1R 공동 발현. (A1) DIO 제브라피시의 텔렌팔론에서 OX-2R/CB1R 공동 발현. (B) OX-2R/CB1R 시상 하부, 광학 지각, 토러스 측삭, 제어 식이제말피의 열등한 엽의 확산 핵(B1) OX-2R/CB1R 내 측면, 벤탈 및 시상 하부, 광학 tectum, torus 측점의 등대 지역, 및 DIO 제브라피시의 열등한 로브의 확산 핵. (C) 제어 식이제브라피쉬에서 OX-2R/CB1R(옐로우)의 공동 발현을 나타내는 광학 지각의 배율이 높다. (C1) DIO 제브라피시에서 OX-2R/CB1R(노란색)의 공동 발현을 나타내는 광학 지각의 더 높은 배율. (D) DIO 제브라피시에서 OX-2R/CB1R(노란색)의 분포 및 공동 발현을 나타내는 광학 지각의 특정. DAPI(파랑)는 핵을 염색하는 데 사용되었다. CP: 중앙 후방 탈라믹 핵; DD: 등쪽; DC: 중앙; DL: 측면; Dm: 내측; Dp: 등쪽 텔렌세팔론의 후방 부분; HD: 심실 시상 하부의 등쪽 영역; Hv: 심실 시상 하부의 복실 영역; LH: 시상 하부의 측면 부분; PGl: 측측 및 PGm: 내측 구체핵; PGZ: 광학 지각의 심실 회색 영역; TeO: 광학 지각; TL: 토러스 경도; Vd: 복부 말순뇌골의 등도 부분. 스케일 바: 50 μm (A, A1, C, C 1); 250 μm (B및 B 1); 25 μm (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 제브라피시 및 마우스 해마의 성인 뇌에서 OX-2R 및 CB1R 단백질 발현 및 특이성. (A) 상대 펩타이드와의 사전 흡수에 의한 OX-2R의 음성 대조군. (B) 상대 펩타이드와의 사전 흡수에 의한 CB1R의 음성 대조군. (C) 마우스의 해마에서 OX-2R /CB1R의 긍정적 인 제어. PGZ: 광학 지각의 심실 회색 영역; TeO: 광학 지각. 스케일 막대: 100 μm (A, B); 250 μm (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: DIO 대 대조군 식단 성인 제브라피시의 시상 하부 관상 동맥 섹션에서 OX-A(녹색) 및 CB1R(빨간색)과 이들의 공동 지역화 분포. (a) OX-A/CB1R 대조군 식이제브라피쉬의 시상하부에서 공동 발현 (A1)측면 시상 하부 내에서 OX-A/CB1R 공동 발현을 나타내는 더 높은 배율. OX-A/CB1R 의 국면화 또는 동일한 셀에서 OX-A/CB1R의 공동 지역화 및 중첩을 보여주는 OX-A/CB1R 공동 발현의 세부 사항. (B) DIO 제브라피쉬의 시상하부에서 OX-A/CB1R 공동 발현 (B1)더 높은 배율은 측면 시상 하부 내에서 증가된 OX-A/CB1R 공동 발현을 나타낸다. OX-A/CB1R 의 국면화 또는 동일한 셀에서 OX-A/CB1R의 공동 지역화 및 중첩을 보여주는 OX-A/CB1R 공동 발현의 세부 사항. LH: 시상 하부의 측면 부분. 스케일 막대: 50 μm (A, B); 25 μm(A 1, B 1). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

샘플 준비

시료 전형은 IHC의 첫 번째 중요한 단계입니다. 신뢰할 수 있는 프로토콜을 통해 세포 형태, 조직 구조 및 항원성을 유지보수할 수 있습니다. 이 단계는 올바른 조직 수집, 고정및 절편22,23이필요합니다. 고정의 목적은 조직을 보존하고 조직 효소 또는 미생물의 작용을 감소시키는 것입니다. 특히, 고정 단계는 세포 성분과 생체 분자를 보존하고, 세포 성분(예: 항원 및 효소)의 자가 분해 및 이동을 방지하고, 다음 절차의 비역적 효과에 대해 세포 물질을 안정화시키고, 4,7,24.

절편되기 전에, 조직은 파라핀 임베딩 (면역 페록시다아제 방법) 또는 냉동 보존 (저온 매체에서 동결, 다중 면역 형광 방법)을 통해 제조및 보존된다. 보존 방법은 고정 7의 유형과관련이 있습니다. 고정 및 보존 후, 조직은 파라핀에 내장된 경우 마이크로토임에 의해 슬라이스되거나, 저온 미디어에 내장된 경우 저온 유지에 의해 슬라이스된다. 조직은 일반적으로 8-10 μm의 두께 범위에서 슬라이스하고 슬라이드에 장착됩니다. 면역페록시다아제 염색의 경우, 샘플은 탈파라핀화 및 항원회수(25,26)를포함하는 항체 결합을 위한 에피토프를 마스크 해제하는 추가단계를 요구할 수 있다. 과다 고착은 에피토프 마스킹을 일으킬 수 있지만, 과속은 가장자리가 무겁고 긍정적인 신호가 거의 또는 전혀 발생하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

차단 및 백그라운드 감소

면역페록시다아제 방법에서, 비오틴에 대한 아비딘의 높은 친화도는 배경 염색의 신속한 생산에 책임이 있다. 또한, 아비딘 - 비오틴 반응은 돌이킬 수 없기 때문에 배경은18,27을제거 할 수 없습니다. IHC 동안, 높은 배경은 또한 내인성 조직 바이오틴에 대한 비특이적 결합에 의해 생성될 수 있다. 소수성 및 이온 상호 작용 (예 : 콜라겐및 상피 및 지방 세포와 같은 다른 결합 조직에 의해 생성 된 것과 같은) 내인성 효소 활성뿐만 아니라 배경 염색의 주요 원인입니다. 내인성 비오틴 또는 효소 및 소수성 결합은 항체 염색 전에 최소화되어야 하며, 이는 트리톤 X-100과 같은 세제를 차단 완충제(28)에 첨가함으로써 달성될 수 있다.

차단 완충제에서 0.3%-0.4% Triton X-100을 사용하면 또한 조직 섹션으로 항체의 완전한 투과화를 허용합니다. 더욱이, 항체는 1개의 에피토프에 대해 우선적으로 특이적이지만, 비특이적 단백질상의 부위에 부분결합이 가능하여, 높은 배경 염색(29)을 유도한다. 비특이적 결합은 표적 항원(30)의 신호를 마스크할 수 있다. 비특이적 배경 얼룩을 줄이려면 비특이적 반응성 사이트를 차단하는 버퍼로 샘플을 배양해야 합니다. 일반적인 차단 버퍼에는 일반 혈청 또는 소 혈청 알부민(30)이 포함됩니다. 차단 혈청의 종은 이차 항체의 숙주와 동일해야 한다. 최적의 배양 시간을 결정하는 것이 좋습니다. 차단 버퍼 내의 정상 혈청의 농도는또 다른 중요한 결정(31)이다. 더욱이, 배경 염색을 제거하기 위해, 1차 및 2차 항체의 최적 희석을 사용하는 것이 중요하다. 따라서, 인큐베이션 시간은 온도(즉, 4°C에서 수행하는 경우 시간을 증가시키고, RT에서 시간을 감소) 및 검출 시스템에 더하여 신중하게 선택되어야 한다.

항체 선택

IHC 염색을 위한 항체의 선택은 중요하며 실험 결과32에영향을 미칠 수 있습니다. 항체가 적절하게 반응할 수 있도록 하기 위해, 항체에 의해 인식된 에피토프를 고려해야 한다. 표적 단백질 및 그 기능, 조직 및 세포외 국소화를 이해하고, 번역 후 변형을 겪는지 여부는 항체의 선택을 결정하는 데 도움이 될 수 있다. 또 다른 중요한 단계는 특정 신호와 호환되는 최소 수준에서 배경 및 특이성을 유지하기 위해 1 차/이차 항체의 상이한 농도의 테스트입니다. 더욱이, 종 의 반응성을 확인하여 1차 및 2차 항체의 호환성 및 원발성 항체의 능력을 확인하여 그 고유의 형태에서 항원 표적을 인식하는 것이 중요하다. 1 차적인 항체 선택을 위한 또 다른 중요한 단계는 유전자 정렬입니다. 이것은 1 차적인 항체가 관심있는 생체 분자와 반응하고 특정 동물 모델에서 항체에 의해 인식되는 에피토프에 대한 정보를 제공한다는 것을 보장합니다. 유전자 정렬은 또한 진화적으로 보존되는 에피토프를 인식할 수 있는 항체를 선택할 수 있는 가능성을 제공한다.

컨트롤

항체의 특이성을 명확히하기 위해, 중요한 측면은 특정 염색의 검출을 허용하는 대조군의 성능이다. 대조군: i) 항원을 양성 대조군으로 발현하는 것으로 알려진 조직; ii) 항원을 음성 대조군으로 발현하지 않는 것으로 알려진 조직; iii) 이차 항체가 다른 조직 성분과 상호 반응하지 않는 것을 확인하기 위해 특정 펩티드를 가진 원발성 항체또는 1차 항체의 흡수의 생략(14,33).

IHC 기술에서 최종 염색을 달성하기 전에 몇 단계의 문제가 발생할 수 있습니다. 강한 배경 염색 및 비특이적 표적 항원 염색은 내인성 비오틴 또는 1차/이차 항체 교차 반응성 및 불량한 효소 활성 또는 1차 항체 효능에 의해 각각 유발될 수 있다. 배경 염색 및 비특이적 결합은 1차 항체와 배양하기 전에 내인성 효소를 차단함으로써 방지될 수 있다. 일반 혈청을 사용하는 것이 비특이적 상호 작용30을차단하는 가장 좋은 방법입니다. 차단 버퍼의 선택은 사용되는 검색 방법에 따라 달라집니다. 더욱이, 표적 항원의 발현이 결여된 것으로 알려진 조직은 음성 대조군으로서 배경염색량(34)을 결정하는 기준로서 작용할 수 있다. 음성 대조군에서 발색성 또는 형광 신호의 침착은 비특이적 염색의 존재를 확인한다. 더욱이, 블로킹 시간 차단이 부족하면 높은 배경으로 이어지며, 과도한 차단은 낮은신호(35)로이끈다.

면역 페록시다아제 염색에서 조직에 내인성 과산화아제의 존재는 갈색 배경 침착의 또 다른 원인입니다. H2O2를 선행하여 1차 항체를 가진 배양전에 내인성 과산화를차단하고,37. 반대로 면역 형광에서 고정은 자가 형광 생성에 중요한 역할을합니다. 자가 형광을 피하려면 최선의 고정 방법, 고정 시간 및 조직의 준비를 신중하게 선택해야합니다. IHC의 또 다른 중요한 단계는 1차 항체의 검증이다. 항체는 특정 조직 또는 세포/세포 내 세포 구성 요소에서 일관되고 특이적인 염색 패턴을 생성하고 특정 펩티드를 가진 1차 항체의 사전 흡수가 염색을 생성하지 않는 경우 유효하다고 여겨진다38. 면역형광에서 비특이적 결합은 3가지 색 형광 검출기 하에서 유사한 형광 강도를 나타내고, 한편 신호는 상이한 형광 공액 이차 항체가 사용되기 때문에 가변적이다. IHC 조직 제제 및 항체 염색의 이러한 양상은 염색 문제를 극복하기 위해 해결되어야 합니다.

IHC는 비교적 간단한 기술이지만 몇 가지 한계를 제시하고 많은 요인39에따라 달라집니다. 중요한 점 의 한은 번역 후 수정된 단백질의 표정을 바꿀 수 있는 포르말린 고정입니다. 다른 한편으로는, 포르말린 고정 파라핀 내장 된 조직은 실온에서 장기간 보관 할 수 있지만 냉동 조직은 -80 °C에서 최대 1 년 동안만 보관 할 수 있습니다. 더욱이, 동결된 조직은 얼음 결정의 형성에 의해 손상될 수 있으며, 이는 IHC 염색 을 변경하는 세포 내 세부 사항에 영향을 미칠 수 있으며,40,41. 우리의 연구 결과에 관하여, 가장 어려운 양상은 zebrafish 분자에 대하여 특정 1 차적인 항체를 찾아내는 것이었습니다. 제브라피쉬는 매우 보존된 구조의 유효한 동물 모델로 인식되었지만, 제브라피시의 특정 단백질 및 기타 분자를 인식할 수 있는 항체는 거의 개발되지 않았습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 서쪽 블로팅 분석 및 유전자 정렬에 의한 항체 특이성을 검증하는 것이 중요하다.

IHC 방법에 대한 관심이 높아짐에 따라 조사 연구42에도움이 될 수 있는 고도로 특이적인 면역 염색의 개발이 이해지고 있다. IHC는 특정 분자 마커의 존재와 다른 병리전반에 걸친 그들의 변화를 확인하기 위해 증가하는 주파수와 함께 사용되고 있습니다. 여기에 예시된 두 가지 접근법, 면역페록시다아제 및 면역형광은 각각의 장점과 단점을 갖는다43. 면역페록시다아제 기술에 사용되는 파라핀 내장 조직은 세포 및 조직의 고분해능을 허용하고 표적 단백질의 분포 및 양에 대한 세부 사항을 공개할 수 있다44,45. 그러나, 파라핀-내장된 조직은 항원성을 가릴 수 있고 비특이적 형광(46)을 유발할 수 있기때문에 면역형광에 적합하지 않다. 한편, PFA 고정 조직의 저온 절은 내인성 항원성을 보존하고 비특이적 형광의 감소로 이어진다. 저온 절의 기술적 품질이 파라핀 내장 조직보다 훨씬 낮더라도 IHC 기술47을사용하여 유효한 결과를 얻을 수 있습니다.

또한, 파라핀을 더 잘 포함시키면서 형태학적 세부 사항을 보존하는 동안, 동결 보존은 효소와 항원 발현을 더 잘 보존하여 보다 상세한 면역 염색을 이끌어냅니다. 면역형광 기술은 또한 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 시스템(10)에 대한 우리의 이전 작업에서 예시된 바와 같이,가능한 상호작용을 드러내는 2개 또는 3개의 상이한 생체분자의 현대적 검출을 허용한다. 특정 생체 분자의 분포 와 수준을 감지하는 데 사용되는 기술 중 IHC는 분자 및 단백질의 특정 형태 학적 발현 및 분포의 측정뿐만 아니라 정량적 능력을 발휘할 수있는 가능성을 허용합니다. 분석.

면역형광을 사용하여, 생체분자의 공동분포 및 공동발현은 또한 상이한 병리학의 경우 가능한 상호작용 및 이들의 변화뿐만 아니라 더 이해될 수 있다48. 공초점 현미경 검사법은, 마지막 20 년 도중, 포유류 두뇌에 있는 수많은 단백질의 세포 그리고 subcellular 분포를 공부하기 위하여 수시로 이용되었습니다. 형광 현미경 검사법은 또한 단백질, 세포기관 및 그밖 생물학 물질과 같은 관심있는 특정 구조물의 시각화 (형광단 또는 형광 염료를 사용하여)를 허용합니다; 이러한 신호는 고정 및 살아있는 생물학적 시스템 모두에서 사용될 수 있으며, 이는 특정 세포내 구조를 이미지화하기 위해49. 특정 세포 구획에 있는 생체 분자의 잠재적인 변조 기능은 그들의 발현 패턴의 시각화를 통해 탐구될 수 있습니다, 조직 내의 단백질 신호의 역할은 신경 해부학적인 분포를 통해 폭로될 수 있는 반면 신진 대사 효소 발현 또는 수용체.

제시된 기술 적인 일은 성인 얼룩말 모형에 있는 2개의 고도로 보존된 시스템, orexin 및 endocannabinoid를 공부하기 위하여 IHC 접근을, 주로 면역 형광소개합니다. 특히, 면역형광 방법은 표적 조직에서 특정 단백질의 분포, 상대적 양 및 해부학적 상호작용을 결정하는데 사용될 수 있다. PFA 고정 조직의 동결 보존은 급속한 악화에 취약한 매우 민감한 단백질을 더 잘 보존합니다. 더욱이, 동결 보존은 항원 및 항원성을 더 잘 보존하기 위하여 생각되고, 번역 후 수정된 단백질 및 DNA의 공부를 허용합니다.

동결 된 조직 (파라핀 내장 섹션에 비해)이 두껍더라도 조직 형태를 자세히 관찰하는 기능을 방해하므로 공초점 현미경 검사법은 시료 시각화를 매우 자세하게 허용하고 이미징 기능을 향상시킵니다. 더욱이, 면역형광은 염색 강도의 정량적 분석에 사용될 수 있고, 신호의 치밀성 분석은 정량적 데이터를 제공한다. 이를 통해 공동 국소화 영역을 살펴보면 단백질 발현 수준과 플루오로크롬 신호 수준의 상관 관계를 결정할 수 있습니다. 이 연구는 성인 얼룩말어에서 중요한 단백질의 진화적 보존을 연구하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명하고 설명합니다. 성인 제브라피시에서 주로 면역 형광을 사용하는 IHC는 고도로 보존 된 생체 분자의 형태학적 발현 및 분포를 연구하는 데이 동물 모델의 유용성을 강조하고 가능한 변화를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 인간의 물리 병리학과 상관 관계가있는 다른 병리학 적 조건.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 폰디 리체르카 디 아테네오 (FRA)에 의해 지원되었다 2015-2016, 산니오 대학.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

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