Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identifiering av Orexin och Endocannabinoid receptorer hos vuxna zebra fiskar med Immunoperoxidas och immunofluorescens metoder

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Presenteras här är protokoll för immunhistokemisk karakterisering och lokalisering av Orexin peptid, Orexin receptorer, och endocannabinoida receptorer i tarmen och hjärnor normala och kost-inducerad fetma (DIO) vuxna zebra fisk modeller med immunoperixidas och dubbla immunofluorescens-metoder.

Abstract

Immunhistokemi (IHC) är en mycket känslig och specifik teknik som är involverad i upptäckten av mål antigener i vävnads sektioner med märkta anti kroppar. Det är en process i flera steg där optimeringen av varje steg är avgörande för att få den optimala specifika signalen. Genom IHC kan distributionen och lokaliseringen av specifika bio markörer upptäckas, vilket avslöjar information om evolutionärt bevarande. Dessutom möjliggör IHC förståelsen av förändringar i uttryck och distribution av bio markörer vid sjukdoms tillstånd, såsom fetma. IHC, främst immunofluorescens teknik, kan användas i vuxen zebra fiskar att upptäcka organisation och distribution av fylogenetiskt bevarade molekyler, men en standard IHC-protokollet är inte estasblished. Orexin och endocannabinoida är två mycket bevarade system som deltar i kontrollen av födo intag och fetma patologi. Rapporterade här är protokoll som används för att få information om Orexin peptid (OXA), Orexin receptor (OX-2R), och cannabinoid receptor (CB1R) lokalisering och distribution i tarmen och hjärnan av normal och diet-inducerad feta (DIO) vuxen zebra fisk modeller. Dessutom beskrivs metoder för immunoperoxidas och dubbel immunofluorescens, samt beredning av reagenser, fixering, paraffin-inbäddning, och krysskydd av zebra fiskar vävnad och förberedelse för ett endogent aktivitet-blockerande steg och bakgrund motfärgning. Den kompletta uppsättningen parametrar erhålls från tidigare IHC experiment, genom vilka vi har visat hur immunofluorescens kan hjälpa till med förståelsen av OXS, ox-2R, och CB1R distribution, lokalisering, och bevarande av uttryck i vuxen zebra fiskar Vävnader. De resulterande bilderna med mycket specifik signalintensitet ledde till bekräftelsen att zebra fiskar är lämpliga djur modeller för immunhistokemiska studier av distribution, lokalisering och evolutionärt bevarande av specifika bio markörer i fysiologiska och patologiska tillstånd. De protokoll som presenteras här rekommenderas för IHC experiment i vuxen Zebrafish.

Introduction

Immunhistokemi (IHC) är en väletablerad klassisk teknik som används för att identifiera cellulära eller vävnads komponenter (antigener) genom antigen-antikroppsinteraktion1,2. Den kan användas för att identifiera lokalisering och distribution av målbiomoleculer inom en vävnad. IHC använder immunologiska och kemiska reaktioner för att detektera antigener i vävnads avsnitt3. De viktigaste markörer som används för visualisering av antigen-antikroppinteraktioner inkluderar fluorescerande färg ämnen (immunofluorescens) och enzym-substrat färg reaktioner (immunoperoxidas), båda konjugerade till anti kroppar4. Med hjälp av mikroskopisk observation är möjligt att bestämma lokalisering av märkt vävnad, som ungefär motsvarar lokalisering av målet antigen i vävnaden.

Det finns två metoder för fluorescerande eller kromogena reaktioner för att detektera protein: den direkta detektions metoden, där den specifika primära anti kroppen är direkt märkt; och den indirekta detektions metoden, där den primära anti kroppen är okonjugerad medan den sekundära anti kroppen bär etiketten5,6,7. Den indirekta metoden har några fördelar, som är främst dess signalamplifiering. Dessutom, till skillnad från andra molekyl ära och cellulära tekniker, med immunofluorescens, är det möjligt att visualisera distribution, lokalisering och kouttryck av två eller flera proteiner differentially uttrycks i celler och vävnader7. Valet av vilken detektions metod som används beror på experimentella detaljer.

Hittills är IHC allmänt används i grund forskning som ett kraftfullt och viktigt verktyg för att förstå distribution och lokalisering av bio markörer och den allmänna profilering av olika proteiner i biologisk vävnad från människa till ryggradslösa djur8, 9 för att , 10 , 11. tekniken hjälper till att visa en karta över protein uttryck i ett stort antal normala och förändrade djur organ och olika vävnads typer, som visar möjlig ned-eller uppreglering av uttryck som induceras av fysiologiska och patologiska förändringar. IHC är en mycket känslig teknik som kräver noggrannhet och rätt val av metoder för att uppnå optimala resultat12. Först av allt, många olika faktorer såsom fixering, cross-reaktivitet, antigen hämtning, och känslighet av anti kroppar kan leda till falskt positiva och falska negativa signaler13. Val av anti kroppar är ett av de viktigaste stegen i IHC och beror på antigen specificitet och dess affinitet till proteinet och arten under utredning7.

Nyligen har vi optimerat IHC teknik för att upptäcka medlemmar av Orexin/hypokretin och endocannabinoida system i vuxen zebra fiskar vävnad. Vi har främst fokuserat på fixering, vävnad inbäddning med två olika metoder, snittning och montering (som kan påverka upplösning och Detaljer under Mikroskopisk analys), och blockering (för att förhindra falska positiva och minska bakgrunden)14. Andra viktiga egenskaper är anti kroppspecificiteten och selektiviteten och reproducerbarheten hos enskilda IHC-protokoll. Nyckeln till att ge anti kropps specificitet är användningen av negativa kontroller (inklusive inga primära anti kroppar eller vävnad som är kända för att inte uttrycka mål proteiner) samt positiva kontroller (inklusive vävnad som är kända för att uttrycka mål proteiner)15 . Valet av anti kroppar mot IHC görs på grund val av deras artspecificitet (sannolikheten för att de reagerar med antigen av intresse) och de antigen-antikroppbindningssystem som används4,5,6 ,7. När det gäller immunoperoxidas bestäms färgen på reaktionen genom selektion av den utfällande kromogenen, vanligt vis diaminobenzidin (brun)16. Å andra sidan, jagmmunofluorescence använder anti kroppar konjugerade med en fluorophor att visualisera protein uttryck i frysta vävnad sektioner och möjliggör enkel analys av flera proteiner med avseende på kromogena detektions systemet 5 den femte , och 7.

I immunoperoxidastekniken konjugeras den sekundära anti kroppen med biotin, en linkermolekyl som kan rekrytera en kromogen reporter molekyl [avidin-biotin Complex (ABC)], vilket leder till förstärkning av infärgnings signalen. Med ABC reporter metod, reagerar enzymet peroxidas med 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB), producerar en intensivt brunfärgad färgning där enzymet binder till den sekundära anti kroppen, som sedan kan analyseras med en vanlig ljus Mikroskop. ABC-färgning, på grund av den höga affinitet av avidinen för Biotin, ger en snabb och optimal reaktion, med några sekundära anti kroppar som är knutna till platsen för den primära anti kropps reaktiviteten. Denna kromogena detektions metod möjliggör Densitometrisk analys av signalen, vilket ger semi-kvantitativa data baserat på sambandet mellan bruna signal nivåer och protein uttrycks nivåer18.

Med immunofluorescensteknik är samtidig detektion av multipla proteiner möjlig på grund av olika fluorchromes förmåga att avge ljus vid unika våg längder, men det är viktigt att noggrant välja fluorokromer för att minimera spektralöverlappning 5. Dessutom minimerar användningen av primära anti kroppar hos olika värd arter svårigheterna när det gäller kors reaktivitet. I detta fall identifierar varje artspecifik sekundär anti kropp endast en typ av primär anti kropp. Fluorescerande reportrar är små organiska molekyler, inklusive kommersiella derivat, såsom Alexa fluor färg ämnen.

Många djur modeller används för att förstå särskilda fysiologiska och sjukdoms tillstånd. Hittills är det fastställt att många metaboliska vägar bevaras under evolutionens gång. Därför kan IHC-studier i modellorganismer som zebra fisk ge insikt i uppkomsten och upprätthållandet av patologiska och icke-patologiska villkor17. Det är ett syfte med denna rapport att illustrera IHC protokoll som kan utföras på vuxna zebra fiskar vävnad och används för att få detaljerade bilder av distribution och lokalisering av Oxa, ox-2R, och CB1R på perifera och centrala nivåer. Också rapporter ATS är protokoll för tillämpning av två stora IHC indirekta metoder i perifera och centrala vävnader av vuxna Zebrafish. Beskrivs är den indirekta metoden, som möjliggör signalamplifiering i fall där en sekundär anti kropp konjugeras till ett fluorescerande färg ämne (immunofluorescens metod) eller enzym reporter (immunoperoxidasmetoden). Både kromogena och fluorescerande detektions metoder besitter fördelar och nack delar. Rapporterat i detta protokoll är användningen av IHC, främst immunofluorescens, i vuxen Zebrafish, en djur modell som ofta används för att studera system som är evolutionär bevaras över olika fysiologiska och patologiska förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. immunoperoxidasprotokoll

Obs: den zebra fiskar erhölls av prof. Omid Safari (Institutionen för fiske, fakulteten för naturresurser och miljö, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10.

  1. Vävnad dissektion
    1. Offra zebra fiskar genom nedsänkning i isvatten (5 delar is/1 del vatten, 4 ° c); lämna dem tills alla rörelser har upphört för att säkerställa döden genom hypoxi.
    2. Snabbt ta bort tarmen och hjärnan med följande dissektion metod:
      1. Torka fisken på en pappers hand duk och placera den sagittally på en dissekera matta, blockerar den ventrala delen av ögat socket och köttiga del av svansen.
      2. För tarmen: skär huden och försiktigt bort huden och underliggande muskler från sidan av fisken tills de inre organen är synliga. Ta bort tarmen från kroppen hålighet sträcker ut den.
      3. För hjärnan: ta bort huvudet med ett rakblad. Ta bort mjuk vävnad från den ventrala sidan av skallen med pincett. Öppna skallen och ta bort benet från den ventrala sidan av hjärnan. Ta bort huden och skallbenet från rygg sidan av hjärnan. Ta bort hjärnan.
  2. Vävnad fixering
    1. Fixera dissekera vävnaderna genom nedsänkning i färsk 4% paraformaldeyde (PFA) i fosfatbuffert (PB, pH 7,4, 4 ° c) för 3 h vid rums temperatur (RT).
      1. Förbered 0,1 M PB genom att lösa upp 1,755 g av NaH2Po4H2O och 4,575 g av Na2HPO4 i 450 ml destillerat vatten (DH2O), och justera till ett pH på 7,4 med den nödvändiga mängden NaOH 1N.
      2. Förbered 4% PFA upplösning 4 g PFA i 100 mL 0,1 M PB (pH 7,4) genom agitation på en värme platta. När en temperatur på 60 ° c uppnås, tillsätt 2-4 droppar NaOH 1N för att få en klar lösning. Vänster PFA 4% vid RT och kontrol lera pH. Justera pH-värdet till 7,4.
        Obs: Vävnadsfixering i mer än 4 – 6 timmar kan leda till överfixering, som döljer antigener, vilket begränsar anti kropps-Epitope-bindningen. Tidpunkten för fixering beror på vävnads storlek.
  3. Inbakning av vävnader
    1. Skölj vävnaderna 5x i 5 min vardera, genom nedsänkning i 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Torka vävnaderna genom påföljande nedsänkning i alkohol 70% (6 min), 80% (6 min), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min), och 100% (1 min).
    3. Klargöra vävnaderna genom nedsänkning i 100% alkohol: xylen (1:1) för 10 min, sedan 2x i xylen för 5 min vardera.
    4. Infiltrera vävnaderna med paraffin vax (56 ° c) två gånger för 1 h vardera genom direkt nedsänkning i paraffin.
    5. Bädda in vävnaderna i paraffin block vid rums temperatur (RT) och förvara vid RT tills snittningen.
  4. Skärande bearbetning
    1. Skär vävnader i koronala eller sagittal sektioner med 8 μm tjocklek med en mikrotom, och samla in avsnitten i alternativa serier på själv häftande glas dia bilder på vattnet och värmde vid 38 ° c.
    2. Torka glasen med sektioner vid 37 ° c över natten.
  5. Deparaffinisering och rehydratering av vävnads sektioner
    1. Devax avsnitten genom nedsänkning i xylen för 5 min följt av nedsänkning i xylen för 3 min.
    2. Rehydrera avsnitten genom efterföljande dia bilder nedsänkning i alkohol 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), sedan placera bilderna i dH2O (5 min).
      Obs: helt devax avsnitten innan reaktionen påbörjas. Om avsnitten fortfarande har spår av paraffin, utföra en ytterligare nedsänkning i xylen i 5 minuter eller mer.
  6. Antigen-hämtning
    1. Behandla avsnitten med citratbuffert (0,01 M, pH 6,0) genom att doppa glasen i lösningen och värma i en mikrovågsugn i 5 min vid maximal effekt.
    2. Låt avsnitten svalna.
    3. Upprepa cykeln på 5 min i mikrovågsugnen vid maximal effekt för att slutföra antigen hämtningen.
      1. Bered citratbuffert (0,01 M, pH 6,0) genom att lösa upp 2,10 g citron syra i 100 mL dH2o och 5,882 g natriumcitrat i 200 ml DH2o. blanda natriumcitrat (0,01 m) med citron syra (0,01 m) med en 1:4-kvot i volym och justera pH-värdet till 6 använda HCl 0.1 N.
  7. Blockering av endogent peroxidas
    1. Avgränsa vävnads ytan på bilderna med en lösnings medels resistent penna.
    2. Skölj avsnitten 3 gånger, 5 min vardera, med tris-buffrad saltlösning (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. Förbered 0,1 M TBS genom att lösa upp 12,1 g trizma bas och 9 g NaCl i 950 mL dH2O och justera till pH 7,3 med HCL 0.1 n.
    3. Blockera den endogena peroxidasaktiviteten genom att nedsänkas i en lösning av 0,75% H2O2 för 5 min vid RT.
      1. Bered 0,75% H2o2 lösning upplösning 5 ml 30% h2o2 i 195 ml DH2o.
        Anmärkning: ndogena enzymer kan reagera med IHC-reagenser och ge falskt positiva resultat. Dessutom mycket vaskulariserad vävnader uttrycka många endogena peroxidas, vilket kan leda till intensiv ospecifik färgning och bakgrunds nivåer. Behandling med 0,75% H2O2 släcker endogena peroxidasoch minskar signifikant den icke-specifika bakgrunden.
  8. Blockering av icke-specifika Bindi ng platser och vävnads permeabiliseringen
    1. Inkubera vävnads sektionerna med en TBS/0,4% Triton (TBS-T) blockerande buffert, som innehåller det primära antiserumet (NRS), under 30 min vid RT för att blockera icke-specifika bindnings platser.
      1. Förbered 0,4% Triton genom att lösa upp 0,4 mL Triton X-100 i 100 mL av TBS.
      2. Bered den blockerande buffertlösningen TBS-T genom att lösa upp 1% normalt serum i TBS som innehåller 0,4% Triton X-100 (1 mL normalt serum + 8,2 mL av TBS + 0,8 mL 0,48 Triton X-100).
        Anmärkning: Välj den art av djuret serum beroende på värden av den sekundära anti kroppen (t. ex. När du använder en get anti-kanin sekundär anti kropp, använd normalt get serum).
  9. Vävnad inkubation med primär anti kropp
    1. Inkubera avsnitten över natten i en fuktig Box vid RT med primära anti kroppar utspädda i TBS-T. Färga avsnitten med följande primära anti kropp:
      1. Get anti kropp mot OX-2R utspädd 1:200, som erkänner C-terminalen av proteinet.
      2. Get anti kropp mot OX-A utspädd 1:200 [Orexin-A (C-19)], som erkänner C-terminalen av proteinet.
        Anmärkning: Säkerställ att den primära anti kroppen reagerar med den bio molekyl som är av intresse. Definiera med vilken epitop av bio molekyl den primära anti kroppen reagerar med hjälp av gen anpassningen. Till exempel har ox-a epitop kartlagts mellan AA 50 – 100 av mänsklig ox-a (O43612) medan ox-2R epitop har kartlagts nära den sista 50 AA vid C-terminalen av mänskliga.
  10. Vävnad inkubation med sekundära anti kroppar
    1. Skölj delarna 3x i 5 min vardera, med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Inkubera avsnitten för 1,5 h vid RT med biotinylated sekundär anti kropp och kanin anti-Goat immunglobulin (H + L) konjugerat med biotin, späd sedan 1:100 i TBS-T.
      Obs: testa och hitta de olika utspädningar av både primära och sekundära anti kroppar för att hitta den optimala utspädning som möjliggör minskning av bakgrunden.
  11. Peroxidasreaktion
    1. Skölj delarna 3x i 5 min vardera, med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Inkubera avsnitten med avidin-biotin Complex (ABC) för 1 h.
      1. Förbered ABC lösning lägga till två droppar av komponent A följt av två droppar av komponent B i 5 mL TBS.
    3. Skölj delarna 3x i 5 min vardera, med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Behandla avsnitten med kromogensubstratet 3, 3 '-diaminobenzidine-4 (DAB).
      1. Förbered DAB-lösningen genom att tillsätta en droppe (ca 30 μL) av DAB-kromogenkoncentrat till 1 mL DAB-spädnings vätska och blanda väl före användning.
        Obs: Förbered ABC-lösning minst 30 min före användning och Behåll komplexet vid 4 ° c tills det används för att möjliggöra stabil avidin/biotin-bindning. Förbered den fräscha DAB-arbetslösningen, applicera på vävnads sektionerna och utveckla tills färgen är lämplig. När kromogena reaktionen omvandlar epitop platser till en brun färg och intensiteten av signalen är lämplig för avbildning, gå vidare till nästa steg. Tidpunkten för DAB-utveckling kan variera från några sekunder till 10 min. För OX-A och OX-2R 1,2 min räcker. Hantera DAB varsamt, eftersom det är cancerframkallande.
  12. Vävnads Dehydrering och montering
    1. Skölj alla avsnitt 3x i 5 min vardera, med 0,1 M TBS (pH 7,3) för att stoppa DAB reaktionen.
    2. Torka av avsnitten med efterföljande dia bilder nedsänkning i alkohol 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Klargöra skivorna genom nedsänkning 2x i xylen 10 min vardera.
    4. Montera avsnitten med DPX (dibutylftalat-xylen) för histologi, tillsätt två droppar monterings material till dia bilder och toppning långsamt med täckglasen.
      Obs: eftersom nedsänkning av vävnad i ökande koncentrationer av alkohol under uttorkning resulterar i alkohol penetration av vävnad och utbyte av vatten med alkohol, bestämma en exakt uttorkning tid och inte över torka vävnaderna. Utför nedsänkning i xylen efter uttorkning för att klargöra vävnaden och ta bort eventuellt överskott eller kvarvarande alkohol.
  13. Kontroller
    1. Upprepa avsnitten 1.1 – 1.12, utelämna den primära anti kroppen och/eller Ersätt den primära anti kroppen eller den sekundära anti kroppen IgG med TBS (negativa kontroller).
    2. Upprepa avsnitt 1.1 – 1.12 pre-absorbera varje primär anti kropp med ett överskott av den relativa peptiden (100 mg peptid/1 mL utspätt antiserum).
    3. Upprepa avsnitten 1.1 – 1.12 med hjälp av olika vävnader som positiv kontroll (t. ex. mus vävnad).
      Obs: Förbered alla buffertar färska, strax före start. Ta försiktigt bort överflödig vätska i varje steg med en pipett eller filter papper runt avsnitten, alltid hålla avsnitten våta.
  14. Bild insamling och analys
    1. Förvärva digitala bilder under konstant ljus belysning och med samma förstoring med hjälp av ett Mikroskop utrustat med en digitalkamera.
    2. Utför en semikvantitativ analys av färgintensiteten med hjälp av bild hanterings program (se material tabell).
      1. Öppna de tagna bilderna, i. Lif-eller TIFF-filformat, för utvärdering av index för OX-A-eller OX2-R-positivitet.
      2. Välj knappen under mått och klicka på manuell counting. Räkna antalet färgade cell profiler direkt från skärmen genom att placera ett märke på positiva celler genom att klicka med musen.
      3. Välj en region av intresse (ROI) område (3 x 103 μm2) för att kvantifiera immunosignalens densitet (optisk densitet, OD).
      4. Bestäm pixeln med den högsta intensiteten (hög positiv) och minst intensitet (negativ) inuti den analyserade bilden för att tilldela noll som värdet av bakgrunden (dvs en del av vävnad saknar färgade celler).
      5. Bedöm OD genom att arbeta på en logaritmisk skala av absorbans. I den digitala bild analysen varierar DAB-pixelintensiteten från det mörkaste (0-värdet) till det lättaste (255 värde) skuggan.
      6. Bestäm OD genom att rita ett histogram av följande: log10(255/i), där "i" är pixelintensitetsvärdet som ges av programmet och bestäms genom att subtrahera bakgrunden.
        Anmärkning: den permanenta och stabila immunoperoxidasreaktionen kan när som helst analyseras under ett ljust fält Mikroskop. Utför inventering av märkta celler i ett alternativt avsnitt för att undvika dubbel räkning av samma cell från intilliggande avsnitt.

2. immunofluorescens-protokoll

  1. Vävnad dissektion
    1. Offra och dissekera djuren enligt beskrivningen i avsnitt 1,1.
  2. Vävnad fixering
    1. Fixera tarmen och hjärnan genom nedsänkning för 3 h i 4% PFA vid 4 ° c.
      1. Bered PB och 4% PFA enligt avsnitt 1.2.1.
        Obs: tidpunkten för fixering beror på vävnads storlek. Vävnads fixering i mer än 4 – 6 timmar kan leda till överfixering, som döljer antigener och begränsar anti kropps-Epitope-bindningen.
  3. Inbakning av vävnader
    1. Skölj vävnaderna 3x i 5 min vardera, med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. För krysskyddet överför vävnaderna till 20% sackaros i PB (0,1 M, pH 7,4) och hålls över natten vid 4 ° c. Överför sedan vävnaderna till 30% sackaros i 0,1 M PB (pH 7,4) och Behåll för ytterligare en natt vid 4 ° c.
    3. Bädda in vävnaderna i ett block av optimal skär temperatur (OCT) förening. För att göra detta, förbereda en liten Dewar av flytande kväve, ta aluminiumfolie, och skär den på mitten för att skapa en kastrull. Pannan som innehåller vävnader fyllda med ULT-föreningen måste doppas i flytande kväve tills ULT-substansen kyls. De frysta vävnaderna kan förvaras vid-80 ° c till snittningen.
  4. Skärande bearbetning
    1. Överför de frysta vävnads blocken till en kryostat vid-20 ° c och skär i koronala eller sagittal delar av 10 μm.
    2. Samla vävnaderna i alternativa seriella sektioner på själv häftande glas dia bilder lämpliga för immunhistokemi och förvara dem vid-20 ° c till användning.
      Obs: Förvara dia bilder mellan-20 ° c och 4 ° c i en mörk bild ruta eller bild bok.
  5. Blockering av ospecifik bindnings ställen och vävnad permeabilizzation
    1. Avgränsa vävnads ytan på bilden med en lösnings medels resistent penna.
    2. Skölj delarna 3x i 5 min vardera, med 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Inkubera avsnitten med 1% normalt åsnserum upplöst i permeabiliseringsbufferten PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) under 30 min vid RT för att permeabilisera cell membranet och blockera de ospecifik bindnings ställena.
      1. Förbered Triton X-100 0,3% upplösning 0,3 mL Triton X-100 i 100 mL 0,1 M PB (pH 7,4).
      2. Bered den blockerande lösningen med 1% normal Donkey serum i PB innehåll ande 0,3% TritonX-100.
        Anmärkning: de djur arter av serum som används i permeabiliseringen och blockerande buffertar är beroende av värden av den sekundära anti kroppen.
  6. Inkubation med blandning av primära anti kroppar
    1. Skölj delarna 3x i 5 min vardera, med 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Inkubera avsnitten över natten i en fuktig Box vid RT med en blandning av primära anti kroppar utspädda i PB-T. Följande blandningar av primära anti kroppar kan användas: get anti kropp mot OX-2R utspädd 1:100/kanin anti kropp mot CB1R utspädd 1:100, eller get anti kropp mot OX-A utspädd 1:100/kanin anti kropp mot CB1R utspädd 1:100.
  7. Inkubation med blandning av sekundära anti kroppar
    1. Skölj delarna 3x i 5 min vardera, med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Inkubera avsnitten för 2 h vid RT med 1) en blandning av åsna anti-kanin Alexa fluor 488-konjugerad sekundär anti kropp och åsna anti-Goat Alexa fluor 594-konjugerad sekundär anti kropp utspädd 1:100 i PB-T; eller 2) en blandning av åsna anti-Goat Alexa fluor 488-konjugerad sekundär anti kropp och åsna anti-kanin Alexa fluor 594-konjugerad sekundär anti kropp utspädd 1:100 i PB-T.
      Anmärkning: Använd sekundära anti kroppar som utvecklats i samma djur värd. Det normala serumet måste tillhöra samma art av sekundär anti kropp (t. ex. använda sekundära anti kroppar som utvecklats i åsnan och en åsna normal serum). Späd de primära och sekundära anti kropparna med blockerande buffert som innehåller rengörings medlet för att öka cellernas permeabilisering och reducera bakgrunden.
  8. Montering av vävnader
    1. Skölj delarna 3x i 5 min vardera, med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Motfärga avsnitten med kärn ämne DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindole) beredd upplösning 1,5 μL av DAPI (1 mg/mL) i 3 mL PB.
    3. Täckglasskarvar med monterings medium (se material tabell). Denna vattenhaltiga monterings medium stabiliserar vävnads provet och fläckar för långvarig användning. Fluorescerande prover kan förvaras i mörker vid 4 ° c. För att förlänga livs längden för fluoroforer, Använd ett antimatat monterings medium.
      Välj ett bra monterings medium. En av de viktigaste parametrarna för monterings medel är brytnings index (nD), som bör vara runt 1,5, den brytnings index av glas. Det monterings medium som används här kan användas speciellt med preparat preparerade för enzym-och lipidbestämningar (dvs. preparat som inte får dehydratiseras med en stigande alkohol halt).
  9. Kontroller
    1. Upprepa avsnitten 2.1 – 2.8, utelämna den primära eller sekundära anti kroppen eller Ersätt det primära eller sekundära antiserum med PB (negativ kontroll) i det specifika steget.
    2. Upprepa avsnitten 2.1 – 2.8, pre-absorbera varje primär anti kropp med ett överskott av den relativa peptiden (100 mg peptid/1 mL utspätt antiserum).
    3. Upprepa avsnitten 2.1 – 2.8 på skivor av mus hjärna (positiv kontroll).
      Obs: Förbered alla buffertar färska, strax före start. Ta bort överskotts vätskan noggrant vid varje steg med en pipett eller filter papper runt avsnitten, alltid hålla sektionen fuktig.
  10. Bild insamling
    1. Använd en konfokal Mikroskop utrustad med en x-y-z motoriserad scen, digitalkamera, och förvärv och bild analys program som NIS-Elements C att observera och analysera de immunofärgade avsnitten. Förvärva digitala bilder med 5-20-40x mål.
    2. Ta bilder av varje sektion vid låg förstoring (10x eller 20x mål) i varje av de tillgängliga kanalerna för att komponera en låg förstoring montage, ger en överblick över hela regionen för att under lätta lokalisering och dokumentation av OX-2R/CB1R anatomiska medexpression. Normalisera fluorescensbilderna till maximal kontrast och overlay före analysen.
    3. Samla seriella Z-stackar av bilder i hela området av intresse. Förvärva bilderna genom sex fokalplan (Z-steg) med fokus steg på 1 – 1,8 μm för att täcka vävnads volymen där OX-2R/CB1R coexpression visualiseras som gul puncta. För att göra denna samling för varje kanal (röd, grön, blå) separat, med hjälp av en Z-motoriserad Mikroskop.
    4. Använd en avbildning avfaltningen program vara för att deconvolve bilder genom tillämpning av tio iterationer och komprimera den seriella Z plan bilder till en enda maximal projektion bild.
    5. Justera mikrografer för ljus och kontrast med hjälp av Adobe Photoshop 6,01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      Obs: utför avfaltningen steg under observation för att ytterligare minska bakgrunden. Begränsa bildens exponering för ljus för att förhindra foto blekning.
  11. Bild analys
    1. Utför kvantitativ analys av OX-2R/CB1R coexpression på alternerade 10 μm tjocka sektioner (n = 5 djur per grupp) genom att täcka alla de regioner av intresse för varje djur.
    2. Kvantifiera ox-2R/CB1R coexpression som antal gula positiva Auktor med ett semiautomatiserat system för bild analys. Imagins program vara kan ge en högre detalj nivå, med kvantitativa uppgifter om regionerna överlappar varandra mellan olika fluorescerande sonder.
    3. Kvantifiera Auktor genom att använda tröskel hållande verktyg för signalintensitet i de två kanalerna. Öppna filen. Liff,. TIFF eller. jpg bilder och välj bild – tröskelvärde. Välj Auto Setting eller manuell metod och reglera tröskeln tills alla färgade Auktor är valda. Analysera fördelningen av pixel intensiteter i ett område av bilden som inte innehåller några immunomärkta objekt för att få bakgrunds tröskeln. Bestäm den här bakgrunden individuellt för varje bild. Programmet tar sedan bort bakgrunds tröskeln genom att ange bas linje för pixel intensiteter till bakgrundsvärdet.
    4. Välj analysera-mät och välj de parametrar som ska mätas (puncta intensitet-minimum, maximum och medelvärden, antal/densitet av den immunomärkta puncta).
    5. Räkna den gula Auktor längs volymen av vävnaden i 4 Z-stackar för varje sektion, med hjälp av stackarna omedelbart över eller under till bästa fokus planet. Utesluta out-of-fokus regioner från analysen.
      Obs: utför inventering av märkta celler i alternativ sektion för att undvika dubbel räkning av samma celler från angränsande sektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa data för immunoperoxidasfärgning visas i figur 1 och figur 2. Immunohistokemisk analys av ox-a och OX-2R distribution i tarmen av vuxna zebra fiskar visade olika lokaliserings platser av ox-a och OX-2R och deras ökningar i uttryck i tarm cellerna i Dio zebra fiskar. En intensiv brun färgning för OX-A observerades i cellerna i den mediala och främre tarmen (figur 1a, en1). Den immunoexpression av OX-A gav tydliga signaler i de olika tarm compartements, minskar från den främre mot mediala tarmen (figur 1b, B1). Den negativa kontrollen användes som referens för bakgrunden och för att bekräfta specificiteten hos OX-A-signalen (figur 1e). Den långvariga exponeringen för kromogen DAB resulterade i en ökning av bakgrunds intensiteten (figur 1d). Liknande resultat observerades för ox-2R immunoexpression i tarmen av Dio och kontroll diet zebra fiskar (figur 2). En ökad ox-A-signal i Dio-Adult zebra fisk åtföljdes av ett överuttryck av ox-2R i andra intestinal fack (figur 2b, B1).

Med hjälp av immunofluorescens bekräftades de data som erhållits genom immunoperoxidasanalys, som ligger till grund för ökningen av OX-A-och OX-2R-uttryck i tarmen hos vuxna DIO-Zebrafiskar med avseende på kontrollen (figur 3). Dessutom, med hjälp av dubbel immunofluorescens, var det möjligt att få information om uttrycket av endocannabinoida-receptorn CB1R och dess co-lokalisering med OX-A eller OX-2R i tarmen och hjärnan av kontroll diet och DIO-Adult zebra fisk. Fördelen med immunofluorescens är att det ger en mer detaljerad signal med mindre information om vävnadens morfologi, jämfört med immunoperoxidasteknik. Med hjälp av immunofluorescens-metoden har vi tidigare fastställt anatomiska interaktioner mellan OX-2R och CB1R i både tarmen och hjärnan10.

Den noggranna analysen av Immunofluorescerande bilder visade ökningen av ox-2R/CB1R co-lokalisering i tarmen av Dio vuxen zebra fiskar jämfört med kontroll diet zebra fiskar (figur 3b, C). En liknande situation observerades i olika hjärn regioner, såsom dorsala telencephalon, hypotalamus (lateral, ventrala, och dorsala zoner), optisk tectum, torus lateralis, och diffus kärna av sämre lob (figur 4). Den negativa (figur5a, B) och positiva (mus hjärna) (figur 5c) kontroller användes som referenser för bakgrunden och för att bekräfta specificiteten av CB1R och OX-2R signaler.

Dessutom, genom dubbel immunofärgning med OX-A/CB1R, det observerades i orexinergic nerv celler i hypotalamus att det fanns en ökning av co-lokalisering åtföljs av en ökning av OX-A fluorescerande signal (figur 6). Dessa resultat visar hur dubbel immunofluorescens kan bidra till att identifiera fysiologiskt konserveras protein uttryck, co-lokalisering av mål proteiner, och deras fördelning och/eller uttryck förändringar i olika sjukdoms tillstånd.

Figure 1
Figur 1: Orexin immunolokalisering i tarmen av DIO vs. Control diet vuxen Zebrafish. (A) ox-en immunoreaktivitet i cellerna i mediala tarmen av kontroll diet Zebrafish. (A1) OX-A immunoreaktivitet i cellerna i mediala tarmen av Dio Zebrafish. (B) ox-A immunoreaktivitet i cellerna i främre tarmen av kontroll diet Zebrafish. (B1) OX-A immunoreaktivitet i cellerna i främre tarmen av DIO Zebrafish. (A1, B1) En ökning av ox-A-positiva celler i olika vävnads fack av den mediala och främre tarmen av Dio Zebrafish. (C) ox-A immunoreaktivitet i cellerna i främre tarmen av Dio Zebrafish. Dimmunoperoxidasreaktion för ox-a efter långvarig exponering för DAB. E) negativ kontroll. Skalbar: 50 μm (A, A1, B, b1); 100 μm (C, D, E). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Orexin 2-receptorimmunolokalisering i tarmen av Dio vs. Control diet vuxen Zebrafish. (A) ox-2R immunoreaktivitet i cellerna i mediala tarmen av kontroll diet Zebrafish. (A1) OX-2R immunoreaktivitet i cellerna i den mediala tarmen av Dio Zebrafish. (B) ox-2R immunoreaktivitet i cellerna i främre tarmen av kontroll diet Zebrafish. (B1) OX-2R immunoreaktivitet i cellerna i främre tarmen av Dio Zebrafish. (A1, B1) En ökning av ox-2R positiva celler i olika vävnads fack av den mediala och främre tarmen av Dio Zebrafish. Scale bar: 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Distribution av ox-a (grön)/CB1R (röd) och OX-2R (röd)/CB1R (grön) och deras co-lokalisering med ox-2R/CB1R (gul) i tarmen av Dio vs. Control diet vuxen Zebrafish. (A) ox-A/CB1R-meduttryck i tarmen i kontroll kosten vuxen Zebrafish. (B) ox-2R/CB1R co-Expression i tarmen av kontroll diet Zebrafish. (C) ox-2R/CB1R-meduttryck i tarmen hos Dio-Adult zebrafisk. En ökning av OX-2R/CB1R co-localization (gula prickar) i tarmen av DIO Zebrafish. Scale bar: 25 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Distribution av ox-2R (röd) och CB1R (grön) och deras co-lokalisering med ox-2R/CB1R (gul) i hjärnans koronala sektioner av Dio vs. Control diet vuxen Zebrafish. (A) ox-2R/CB1R co-Expression i telencephalon av kontroll diet Zebrafish. (A1) OX-2R/CB1R co-Expression i telencephalon av DIO Zebrafish. (B) ox-2R/CB1R co-Expression inom den laterala, ventrala och dorsala zonen i hypotalamus, optisk tectum, torus lateralis, diffus kärna av sämre LOB av kontroll diet zebra fiskar (B1) ox-2R/CB1R meduttryck i sidled, ventrala, och dorsala zoner i hypotalamus, optisk tectum, torus lateralis, och diffus kärna av sämre LOB av DIO Zebrafish. (C) högre förstoring av optisk tectum visar co-Expression av ox-2R/CB1R (gul) i kontroll diet Zebrafish. (C1) Högre förstoring av optisk tectum visar co-Expression av OX-2R/CB1R (gul) i DIO Zebrafish. D) en särskild optisk teknik som visar fördelningen och MEDEXPRESSION av ox-2R/CB1R (gul) i Dio-zebrafisken. DAPI (blått) användes för att motfärga kärnor. CP: centrala bakre thalamic kärna; DD: dorsal; DC: centralt; Dl: lateral; DM: medial; DP: bakre delen av den dorsala telencephalon; HD: dorsala zonen i periventrikulära hypotalamus; HV: ventrala zonen i periventrikulära hypotalamus; LH: lateral del av hypotalamus; PGl: lateral och PGm: mediala preglomerulära kärnor; PGZ: periventrikulär grå zon av optisk tectum; TeO: optisk tectum; TL: torus longitudinalis; VD: dorsala del av den ventrala telencephalon. Skalbar: 50 μm (A, A1, c, c1); 250 μm (B och B1); med 25 μm (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: ox-2R och CB1R protein uttryck och specificitet i vuxen hjärna av zebrafisk och mus Hippocampus. A) negativ kontroll av ox-2R genom pre-absorption med den relativa peptiden. (B) negativ kontroll av CB1R genom pre-absorption med den relativa peptiden. Cpositiv kontroll av ox-2R/CB1R i mus Hippocampus. PGZ: periventrikulär gråzon av optisk tectum; TeO: optisk tectum. Skalbar: 100 μm (A, B); 250 μm (C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: distribution av ox-a (grön) och CB1R (röd) och deras co-lokalisering med ox-a/CB1R (gul) i hypotalamus koronala sektioner av Dio vs. Control diet vuxen Zebrafish. (A) ox-a/CB1R co-Expression i hypotalamus av kontroll diet zebra fiskar (a1) högre förstoring som visar ox-a/CB1R co-Expression i den laterala hypotalamus. Detalj av ox-a/CB1R co-Expression som visar en förmodade angränsande lokalisering av ox-a/CB1R eller co-lokalisering och överlappning av ox-a/CB1R i samma celler. (B) ox-a/CB1R-meduttryck i HYPOTHALAMUS i Dio-zebrafisk (b1) högre förstoring som visar det ökade Samuttrycket ox-a/CB1R i den laterala hypotalamus. Detalj av ox-a/CB1R co-Expression som visar en förmodade angränsande lokalisering av ox-a/CB1R eller co-lokalisering och överlappning av ox-a/CB1R i samma celler. LH: lateral del av hypotalamus. Skalbar: 50 μm (A, B); 25 μm (A1, B1). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prov beredning

Prov beredning är det första kritiska steget i IHC. Ett tillförlitligt protokoll möjliggör underhåll av Cellmorfologi, vävnads arkitektur och antigenicitet. Detta steg kräver korrekt vävnads uppsamling, fixering och snittning22,23. Syftet med fixering är att bevara vävnad och minska effekten av vävnads enzymer eller mikroorganismer. I synnerhet bevarar fixeringssteget cellulära komponenter och bio molekyler, förhindrar autolys och förskjutning av cell bestånds delar (såsom antigen och enzymer), stabiliserar cellulära material mot aversiva effekter av följande förfaranden, och underlättar immunofärgning4,7,24.

Före snittning bereds och bevaras vävnaden genom paraffin-inbäddning (immunoperoxidasmetod) eller frys bevaras (frysning i cryomedia, i flera immunofluorescensmetoder). Konserverings metoden är förknippad med typen av fixering7. Efter fixering och konservering, är vävnaderna skivade av en mikrotom om inbäddade i paraffin, eller av en kryostat om inbäddad i en cryomedia. Vävnaderna är typiskt skivade med ett tjocklek intervall på 8-10 μm och monterade på dia bilder. För immunoperoxidasfärgning kan provet kräva ytterligare åtgärder för att demaskera epitoperna för anti kropps bindning, inklusive deparaffinisering och antigen retrieveal25,26. Det bör hållas i åtanke att overfixation kan orsaka epitop maskering, medan underfixation kan orsaka liten eller ingen positiv signal med tung kant färgning.

Blockering och bakgrunds reducering

I immunoperoxidasmetoden är den höga affiniteten hos avidinen för Biotin sannolikt ansvarig för den snabba produktionen av bakgrunds färgning. Eftersom avidin-biotin-reaktionen är oåterkallelig kan inte heller bakgrunden avlägsnas18,27. Under IHC, hög bakgrund kan också produceras av ospecifik bindning till endogena vävnad biotiner. Hydrofoba och Joniska interaktioner (såsom de som produceras av kollagen och andra bindväv såsom epitel och adipocyter), liksom endogena enzym aktivitet, är viktiga orsaker till bakgrunds färgning. Endogena biotin eller enzymer och hydrofoba bindning måste minimeras innan anti kropp färgning, som kan uppnås genom tillsats av ett tvätt medel, såsom Triton X-100, i blockeringsbuffertar28.

Användningen av 0,3%-0,4% Triton X-100 i blockeringsbuffertarna möjliggör också full permeabilisering av anti kropparna i vävnads sektioner. Dessutom, även om anti kroppar är företrädes vis specifika för en epitop, partiell bindning till platser på ospecifik proteiner är möjligt, vilket leder till hög bakgrunds färgning29. De ospecifika bindningarna kan maskera signalen för mål-antigen30. För att minska icke-specifik bakgrunds färgning bör proverna inkuberas med en buffert som blockerar icke-specifika reaktiva platser. Vanliga blockeringsbuffertar är normal serum-eller bovint serum albumin30. Arten av det blockerande serumet ska vara densamma som värden för den sekundära anti kroppen. Det rekommenderas att bestämma den bästa inkubations tiden. Koncentrationen av det normala serumet i blockeringsbufferten är en annan viktig beslutsamhet31. För att eliminera bakgrunds färgning är det dessutom viktigt att använda den optimala utspädningen av primära och sekundära anti kroppar. Inkubations tiden måste därför väljas noggrant, utöver temperaturen (dvs. öka tiden om den uppträder vid 4 ° c, minska tiden vid RT) och detektions systemet.

Val av anti kroppar

Valet av anti kroppar mot IHC-färgning är viktigt och kan påverka experimentellt utfall32. För att säkerställa att anti kroppen kommer att reagera på rätt sätt, måste epitopen som erkänts av den övervägas. Förstå mål proteinet och dess funktion, vävnad och subcellulär lokalisering, och om det genomgår post-translationella modifieringar kan hjälpa till att bestämma valet av anti kropp. Ett annat viktigt steg är att testa olika koncentrationer av primär/sekundär anti kropp för att hålla bakgrunden och aspecificity på en minimi nivå kompatibel med en specifik signal. Dessutom är det viktigt att kontrol lera arten reaktivitet för att bekräfta primär och sekundär anti kropp kompatibilitet och förmågan hos den primära anti kroppen att känna igen antigen mål i sin ursprungliga kon formation. Ett annat viktigt steg för primär anti kropps val är gen anpassning. Detta säkerställer att den primära anti kroppen reagerar med bio molekyl av intresse och ger information om vilken epitop är erkänd av anti kroppen i en specifik djur modell. Gen anpassningen ger också möjlighet att välja anti kroppar som kan känna igen epitoper som är evolutionärt bevarade.

Kontroller

För att klargöra specificiteten hos anti kropparna är en viktig aspekt utförandet av kontrollerna, vilket gör det möjligt att detektera specifik färgning. Kontrollerna omfattar: i) en vävnad som är känd för att uttrycka antigenet som en positiv kontroll. II) en vävnad som är känd för att inte uttrycka antigenet som en negativ kontroll. III) utelämnandet av den primära anti kroppen eller absorptionen av den primära anti kroppen med en specifik peptid för att bekräfta att den sekundära anti kroppen inte korsrereagerar med andra vävnads komponenter14,33.

I IHC tekniker, flera steg kan orsaka problem innan du uppnår den slutliga färgning. Stark bakgrunds färgning och icke-specifik mål antigen färgning kan orsakas av endogent biotin eller Primär/sekundär anti kropp kors reaktivitet och dålig enzym aktivitet eller primär anti kropp potens, respektive. Bakgrunds färgning och icke-specifik bindning kan förhindras genom att de endogena enzymerna blockeras före inkubationen med den primära anti kroppen. Att använda normalt serum är det bästa sättet att blockera icke-specifika interaktioner30. Valet av blockeringsbuffert beror på vilken detektions metod som används. Dessutom kan en vävnad som är känd för att sakna uttrycket av mål antigen som negativ kontroll fungera som referens för att bestämma mängden bakgrunds färgning34. Nedfallet av kromogent eller fluorescerande signal i den negativa kontrollen bekräftar närvaron av icke-specifik färgning. Dessutom leder otillräcklig blockering tid blockering till en hög bakgrund, medan överdriven blockering leder till en låg signal35.

Vid immunoperoxidasfärgning är förekomsten av endogent peroxidas i vävnaden en annan orsak till brun bakgrunds deposition. Behandlingen med H2O2 före inkubationen med den primära anti kroppen blockerar den endogena peroxidasen36,37. Tvärtom, i immunofluorescens, fixering spelar en viktig roll i generationen av autofluorescence. För att undvika autofluorescens, den bästa fixeringmetoden, tidpunkten för fixering, och beredning av vävnader måste noga väljas. Ett annat viktigt steg i IHC är validering av den primära anti kroppen. En anti kropp anses giltig om den ger ett konsekvent och specifikt Färgnings mönster i en viss vävnad eller cell/subcellulära komponenter och om pre-absorption av den primära anti kroppen med en specifik peptid inte ger färgning38. I immunofluorescens visar icke-specifik bindning liknande fluorescerande intensitet under tre färgfluorescensdetektorer, medan signalen är variabel eftersom olika fluorescerande konjugerade sekundära anti kroppar används. Dessa aspekter av IHC vävnads beredning och färgning av anti kroppar måste åtgärdas för att övervinna färgning frågor.

IHC, även om en relativt enkel teknik, presenterar vissa begränsningar och beror på många faktorer39. En av de avgörande punkterna är formalin fixation, som kan förändra uttrycket av efter översättningen modifierade proteiner. Å andra sidan kan Formalinfixerade paraffin vävnader lagras på lång sikt vid rums temperatur, medan frysta vävnader endast kan förvaras i upp till ett år vid-80 ° c. Dessutom kan frysta vävnader skadas av bildandet av iskristaller, som kan påverka subcellulära Detaljer ändra IHC färgning40,41. När det gäller våra studier, den svåraste aspekten var att hitta specifika primära anti kroppar mot zebra fiskar molekyler. Även om zebra fiskar har erkänts som en giltig djur modell med en mycket bevarade grad av struktur, mycket få anti kroppar har utvecklats som kan känna igen specifika proteiner och andra molekyler i zebra fisk. För att övervinna dessa begränsningar är det viktigt att validera anti kropps specificitet genom Western blotting analys och gen anpassning.

Växande intresse för IHC-metoder har lett till utveckling av mycket specifik immunofärgning som kan hjälpa undersökande studier42. IHC används med ökande frekvens för att identifiera förekomsten av specifika molekyl ära markörer och deras förändringar i olika sjukdomar. De två metoder som illustreras här, immunoperoxidas och immunofluorescens, har respektive fördelar och nack delar43. Paraffin-inbäddad vävnad, som används i immunoperoxidastekniken, kan möjliggöra hög upplösning av celler och vävnad och avslöja Detaljer om fördelningen och mängden av mål proteiner44,45. Paraffin-inbäddade vävnader är dock inte lämpliga för immunofluorescens, eftersom paraffin kan maskera antigeniciteten och leda till icke-specifik fluorescens46. Å andra sidan, kryosektion av PFA-fast vävnad bevarar endogena antigeniciteten och leda till en minskning av ospecifik fluorescens. Även om den tekniska kvaliteten på krydedelar är mycket lägre än för paraffin-inbäddad vävnad, kan de ge giltiga resultat med hjälp av IHC teknik47.

Dessutom, medan paraffin inbäddning bättre bevarar morfologiska detaljer, frys förvaring bättre bevarar enzym och antigen uttryck, vilket leder till mer detaljerad immunofärgning. Den immunofluorescens teknik gör det också möjligt för samtida detektion av två eller tre olika bio molekyler, avslöjar möjliga interaktioner, som illustreras i vårt tidigare arbete för Orexin och endocannabinoida system10. Bland de tekniker som används för att upptäcka distribution och nivåer av specifika bio molekyler, IHC tillåter inte bara bestämning av specifika morfologiska uttryck och distribution av molekyler och proteiner, men också möjligheten att utföra kvantitativa Analys.

Med hjälp av immunofluorescens, kan samdistribution och kouttryck av bio molekyler också förstås ytterligare, samt möjliga interaktioner och deras förändringar i fall av olika patologier48. Konfokalmikroskopi, under de senaste 20 åren, har ofta använts för att studera cellulär och subcellulär distribution av många proteiner i däggdjurs hjärnan. Fluorescensmikroskopi möjliggör också visualisering (med hjälp av fluorofores eller fluorescerande färg ämnen) av specifika strukturer av intresse, såsom proteiner, organeller, och annan biologisk materia; sådana signaler kan användas i både fasta och levande biologiska system för att avbilda specifika subcellulära strukturer49. Den potentiella modulerande funktionen av bio molekyler i specifika cell utrymmen kan utforskas genom visualisering av deras uttrycks mönster, medan betydelsen av proteinsignalering i vävnaderna kan avslöjas via den neuroanatomiska fördelningen av metabola enzym uttrycket eller-receptorerna.

Det presenterade tekniska arbetet introducerar IHC metoder, främst immunofluorescens, att studera två mycket bevarade system, Orexin och endocannabinoid, i en vuxen zebra fiskar modell. I synnerhet kan immunofluorescens metoder användas för att bestämma fördelningen, relativ mängd, och anatomiska interaktioner av specifika proteiner i mål vävnaderna. Frys förvaring av PFA-fasta vävnader bättre bevarar mycket känsliga proteiner känsliga för snabb försämring. Dessutom är frys förvaring tros bättre bevara antigen och antigenicitet, och det möjliggör studier av efter översättning modifierade proteiner och DNA.

Även om frysta vävnader (jämfört med paraffin-inbäddade sektioner) är tjockare, vilket hämmar förmågan att iaktta vävnad morfologi i detalj, konfokalmikroskopi möjliggör prov visualisering i detalj och förbättrar Imaging kapacitet. Dessutom kan immunofluorescens användas för kvantitativ analys av infärgningsintensiteten, och Densitometrisk analys av signalen ger kvantitativa data. Detta gör det möjligt att fastställa korrelationer av fluorchrom signal nivåer med protein uttrycks nivåer genom att titta på områden av co-lokalisering. Detta arbete beskriver och illustrerar protokoll som kan användas för att studera evolutionärt bevarande av viktiga proteiner i den vuxna zebrafisken. Användning av IHC, främst immunofluorescens, hos vuxna zebra fiskar kan bidra till att belysa nyttan av denna djur modell vid studier av morfologiskt uttryck och distribution av mycket bevarade bio molekyler, samt avslöja eventuella förändringar över olika sjukdoms tillstånd som korrelera med mänsklig Fysiopatologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intresse konflikter.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, University of Sannio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Biokemi immunhistokemi immunoperoxidas Orexin receptor endocannabinoida receptor zebra fiskar hjärna zebra fisk tarmen
Identifiering av Orexin och Endocannabinoid receptorer hos vuxna zebra fiskar med Immunoperoxidas och immunofluorescens metoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imperatore, R., D'Angelo, L., De… More

Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter