Summary
이 프로토콜의 목적은 여러 셀 혈통으로 차별 하는 인간의 혈관 주위 지방 조직에서 파생 된 조상 세포의 능력을 테스트 하는. 체형, osteocyte, 및 chondrocyte 혈통으로 차별화 하는 데 알려져 있다 인간의 골 수에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 분화와 비교 되었다.
Abstract
지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보. Adipogenic 조상 세포의 분화 응답 비만으로 지방 조직 확장 및 부전을 운전 하는 주요 메커니즘입니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT)에 대 한 이해 변경 임상 관련 대사 질환에 따라서 이다. 그러나, 이전 연구는 주로 마우스와 다른 동물에서 수행 되었습니다 모델. 이 프로토콜은 관상동맥 바이패스 접목 수술 환자에서 인간의 흉부 PVAT 샘플을 사용 합니다. 오름차순 대동맥에서 지방 조직 수집 되었고 stromal 혈관 분수의 explantation에 대 한 사용. 우리는 이전을 포함 하는 지질으로 차별화 하는 수 용량을 가진 인간 PVAT에 많은 조상 세포의 존재 확인 adipocytes. 이 연구에서 우리가 더 분석 stromal 혈관 분수에서 세포의 감 별 법 잠재력 아마도 다 강력한 조상 세포를 포함 하. 우리는 인간의 골 수 MSC osteogenic, adipogenic 및 chondrogenic 계보에 차별화를 PVAT 파생 셀 비교. 차별화의 14 일, 다음 특정 얼룩 adipocytes (기름 빨간 O)에서 지질 축적을 감지 활용 했다 osteogenic 셀 (Alizarin Red), 또는 있다 chondrogenic 셀 (Masson의 Trichrome) 콜라겐에 calcific 예금. MSC는 효율적으로 모든 3 개의 계보에 분화 하는 골 수, 동안 셀 PVAT 파생 했다 adipogenic 및 chondrogenic 잠재적인, 하지만 강력한 osteogenic 잠재력 부족.
Introduction
지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보1. 이 조직을 통해 성숙한 adipocytes의 비 대와 드 노 보 차별화 adipocytes에 거주 MSC의 확장합니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT) 혈관을 포위 하 고 조절 관 기능2,3. PVAT 확장 비만 유발 심혈 관 병 리 악화. 동안 인간의 피하 지방이 많은 저장소에서 MSC의 multipotent 잠재력 잘 공부4,5, 아니 연구 explanted 고로 인해 가능성이 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 용량 평가 조달의 침입입니다. 따라서,이 작품의 목표 explant에서 심장 혈관 질병을 가진 환자에서 인간의 대동맥 PVAT 조상 세포를 전파 하 고 그들의 성향에 osteogenic 차별화, chondrogenic, 및 adipogenic 계보를 테스트 하는 방법을 제공 하는 것 이다. 관상동맥 바이패스 접목 수술 비만 환자의 대동맥 오름차순에 바이패스 이식의 문 합의 사이트에서 PVAT의 우리의 소스가입니다. 갓 격리 PVAT 효소 해리 이며 stromal 혈관 분수 격리 및 생체 외에서, 처음으로 인간의 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 능력 테스트를 전파.
기본 교양된 인간 PVAT stromal 혈관 분수를 사용 하 여, 줄기/뿌리 세포 osteogenic, adipogenic 또는 chondrogenic 계보 차별화를 유도 하도록 설계 된 3 개의 분석 테스트. 우리의 이전 연구 식별 CD73 +, CD105 + 및 PDGFRa + (CD140a) 튼튼하게 adipocytes6, 차별화 수 있는 세포의 인구 그들의 multipotency 테스트 하지는 않지만. PVAT는 직접 혈관 음색 및 염증7을 통제 한다. 이 새로운 세포 인구의 차별화 가능성을 테스트 하기 위한 근거 혈관 기능에 PVAT의 특수 영향 및 비만 중 PVAT 확장의 메커니즘을 이해 하기 시작 하는. 이 방법론은 지방 조직 파생된 조상 세포의 기능에 대 한 우리의 이해를 강화 하 고 식별 하 고 유사점과 다른 조직 소스에서 조상 세포의 차이점을 비교할 수 있습니다. 우리는 분리 하 고 다른 혈통으로 MSC 차별화에 대 한 설립 및 검증 된 방법에 따라 구축 하 고 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 생존 능력을 극대화 하는 절차를 최적화. 이러한 기술은 줄기와 조상 세포 연구와 지방 조직 개발의 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.
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Protocol
이 연구에서 인간의 조직에의 사용 되었다 평가 하 고는 제도적 검토 보드의 메인 의료 센터에 의해 승인 모든 인사 실험 전에 적절 한 훈련을 받았다.
1입니다. 준비
- 버퍼를 분리 하 게 50 mg을 재구성 하 여 동물 무료 콜라/dispase 혼합 나 솔루션 nanopure H2o. 준비 1 mg/mL 작업 솔루션의 1 mL 높은 포도 당 1 %w / v BSA 재구성된 콜라에 포함 된 DMEM의 49 mL을 추가 하 여 / dispase 솔루션입니다. -20 ° C와 따뜻한 물 목욕 전에 사용 하 여 사용 하는 37 ° c에서 5 mL 작업 aliquots을 저장 합니다.
- HBSS, 49 mL를 100 x 항생제/antimycotic 솔루션 (최종 농도 200 단위/mL 페니실린, 200 단위/mL 스 및 0.5 µ g/mL fungizone)의 1 mL을 추가 하 여 항생제 솔루션을 확인 하 고 얼음에 저장.
- Nanopure H2o. 압력솥 20 분에 대 한 솔루션의 100 ml에서 소 피부에서 200mg 젤라틴 용 해 하 여 젤라틴 솔루션 (0.2 %w / v)을 준비 하 고 4 ° c.에 저장
- PVAT 성장 매체의 500 mL를 준비: 높은 포도 당 DMEM/F12 글루타민 보충, 나트륨 pyruvate와 나트륨 중 탄산염, 보충 10 %FBS 100 µ g/mL 항균 에이전트 ( 재료의 표참조).
- 50 mL adipogenic 유도 미디어 준비: 40.8 mL 높은 포도 당 DMEM, 7.5 mL PVAT 성장 매체, 500 µ L 항생제/antimycotic 솔루션 (최종 농도 100 단위/mL 페니실린, 100 단위/mL 스 0.25 µ g/mL fungizone), x 100의 보충 0.5 m m IBMX (0.1 M NaOH의 주식 500 m m), 1 µ M dexamethasone (에탄올의 주식 1 m m), 5 μ rosiglitazone (DMSO의 주식 5 m m), 33 µ M biotin (DMSO에 66 m m 재고), 100 nM 인슐린 (200 µ M 주식 0.1% 초 산), 그리고 20 µ M 판토텐산 (100 m m H2 에서 재고 O)입니다.
- Adipogenic 계보에 대 한 제어 유도 미디어의 50 mL를 준비: 40.8 mL 높은 포도 DMEM 7.5 mL PVAT 성장 매체와 펜-strep (100 x 주식)의 500 µ L 보충.
- 50 mL adipogenic 유지 보수 미디어 준비: 41.5 mL 높은 포도 DMEM 7.5 mL PVAT 성장 미디어 단계의 1.3, 500 µ L 펜 strep (100 x 사진), 1 µ M dexamethasone (EtOH에 1 m m 재고), 33 µ M biotin (DMSO에 66 m m 재고), 100 nM 인슐린 (0.1 %ac 200 µ M 재고 보충 etic 산), 그리고 20 µ M pantothenic 산 (H2O의 주식 100 m m).
- 성장 매체의 500 mL osteogenic 및 chondrogenic 계보에 대 한 준비: 높은 포도 당 αMEM 보충 10 %FBS, 1 x 글루타민 보충 ( 재료의 표참조), 펜-strep (100 x 사진)의 5 ml.
- 유도 미디어의 50 mL osteogenic 혈통에 대 한 준비: 50ml 10 nM dexamethasone와 10 m m β-glycerophosphate 보충 골 MSC 성장 매체의.
- Chondrogenic 계보에 대 한 유도 미디어의 50 mL를 준비: 100 nM dexamethasone, 50 µ g/mL 하는데-2-인산 나트륨, 그리고 10 ng/mL TGFβ1 보충 골 MSC 성장 매체의 50 mL. Osteogenic chondrogenic 조건에 대 한 기저 골 MSC 성장 매체 비 유도 미디어 될 것입니다.
2. 프로토콜 1: 문화 인간 PVAT 셀 Stromal 혈관 분수에서
참고: PVAT는 마 취 환자 관상동맥 우회 이식 절차의 오름차순 대동맥에 문 합 이식의 사이트에서 잘라냅니다. 대동맥 PVAT는 15 mL 원뿔 포함 10 mL 얼음 차가운 높은 포도 당 DMEM F12에에서 배치 하 고 수술 실에서 절제의 2 h 이내 실험실으로 전송 됩니다. 대동맥 PVAT 우회 절차 동안 폐기 조직 이며 메인 의료 센터의 내부 검토 위원회에 의해 비 인간 대상 연구로 간주 되었습니다.
- 이 프로토콜의 인간 PVAT (약 0.5 c m3x 1 x 3) ~ 500 mg 조각입니다. DMEM의 신선한 인간의 PVAT 25 mL 항생제 솔루션을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 락을 4 ° c.에 20 분을 품 어 항생제 솔루션에는 PVAT를 실행 하는 동안 37 ° c.에 분리 버퍼의 약 수를 녹여
- 5 mL 분리 버퍼에 100 x 항생제/antimycotic 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 필터 주사기 0.22 μ m를 사용 하 여 소독. 1 24-잘 접시의 젤라틴 해결책의 1 mL를 추가 합니다. 층 류 두건에 멸 균 페 트리 접시에 항생제 솔루션에서 PVAT를 전송 소독 집게와가 위를 사용 합니다. 조직에 미리 데워 진된 분리 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 잘게 (조각 ~ 2 x 2 m m2보다 더 큰) 슬러리에 전체 조직을 말하다 소독 집게와 해 부가 위를 사용 하 여.
- 4 mL 분리 버퍼에 1 mL 슬러리를 전송 하 고 1 시간에 200 rpm에서 37 ° C에 미리 데워 진된 궤도 통에서 옆에 튜브를 품 어. 1 시간 후 아니 보이는 조직 조각 있을 것입니다, 그리고 솔루션 흐린 세포 현 탁 액으로 표시 됩니다.
- 50 mL 원뿔 튜브 위에 설정 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 솔루션을 필터링 합니다. 가능한 많은 셀을 캡처하는 추가 10 mL 항생제 솔루션 여과기를 헹 구 십시오. 스 트 레를 짠 다 하지 않습니다.
- 300 x g 스윙 양동이 원심 분리기에서 12 분에 대 한 셀 작은
참고: 원심, 후 튜브 adipocytes를 interphase 및 펠 릿의 지방 상위 계층으로 구분 됩니다. 펠 릿은 내 피 세포, 면역 세포, 혈액 세포, 및 조상 세포를 포함 하는 실질 혈관 분수. - HBSS 300 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 10 mL에 펠 릿을 resuspend. HBSS 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후 붉은 혈액 세포를 lyse 하지 마십시오. 여러 상용 버퍼와 보육 시간 반복된 시도 조상 세포 부착 및 생존에서 표시 된 감소에 들어서있다.
- 24-잘 접시에서 젤라틴 발음 부드럽게 씻어 HBSS 언바운드 젤라틴을 제거 하는 잘 1 x.
- 성장 매체와 젤라틴 코팅에 씨의 1 mL에 그대로 적혈구와 펠 릿 stromal 혈관 분수 resuspend 잘. 문화 매체에 25 ng/mL의 최종 농도에 인간 FGF2 (0.01% BSA w/v로 보충 하는 PBS에 resuspended)를 추가 합니다. 5% CO2와 37 ℃에서 24 h에 대 한 품 어.
- 다음 날, 제거 성장 미디어와 세척 적혈구 세포와 죽은 세포를 제거 하는 HBSS 5 x 우물. 25 ng/mL FGF2 보충 하는 신선한 성장 매체의 1 mL에 추가 합니다.
- 미디어 25 ng/mL로 보충을 확인 하 고 모든 48 h 변경 신선한 FGF2 각 시간.
-
셀은 일반적으로 도달 100% 합류 explant; 후 7-10 일 다음 통로 셀:
- 성장 미디어와 세척 단층 2 발음 1 ml HBSS x. 우물에서 모든 HBSS 발음 하 고 세포 분리 솔루션의 몇 방울을 추가 합니다.
- 그리고 소용돌이 격판덮개 여러 번 누르고 5% CO2 셀 리프트 5-7 분 동안 37 ° C에서 품 어. 분리 된 세포에 신선한 문화 매체의 ~ 1 mL을 추가 하 고 24-잘 접시, 각 포함 500 µ L 성장 매체 및 25의 2 웰 스에 500 µ L를 배포 FGF2 ng.
- 이전 단계에 표시 된 대로 인간의 PVAT 파생 셀 확장을 계속 합니다. 각 통로 1:2 분할 보다 더 큰 되어야 합니다. 세포 감 별 법 분석에 대 한 할당 하기 전에 5-7 번 passaged는.
3. 프로토콜 2: 문화 인간 골 MSC 식민지
참고: 인간의 골 MSC 설명된8 로 고립 되 고 초기 통로 주식을 냉동으로 저장 액체 N2~ 100000 셀/mL에서 미디어 (70% FBS 20% 기저 DMEM과 10 %DMSO)를 고정 합니다.
- 빠르게 MSC 성장 매체의 3 mL를 포함 하는 6-잘 문화 접시의 한 잘에 37 ° C 물 목욕 및 격판덮개에 액체 N2 에서 골 수 MSC의 유리병을 해 동 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.
- 다음 날, MSC 문화 미디어를 발음 하 고 3 세포를 씻어 HBSS 2 mL에 x. 100% 합류에 성장 매체를 발음 하 고 3 세포를 씻어 HBSS 2 mL에 x. 500 µ L/잘 세포 분리 솔루션을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 5 분 모든 셀 수 있도록 접시 dislodged 탭에서 품 어 2 웰 스 2 mL MSC 성장 매체를 포함 하는 6-잘 접시의 내용을 균일 하 게 배포.
- 인간의 골 수 및 PVAT 파생 MSC 병렬 약 5-7 구절 또는 테스트에 대 한 충분 한 수량 달성 되었습니다 때까지 확장 합니다.
4. 3 프로토콜: 접시 그리고 Osteogenic, Adipogenic 및 Chondrogenic 계보를 일으킬
- 골 고 잘 12-잘 접시 및 적절 한 당 PVAT 파생 셀의 플레이트 적절 한 숫자는 각 실험 조건에 대 한 복제합니다. Adipogenic 및 osteogenic 조건, ~ 200, 000-225000 셀/잘 필요, chondrogenic 조건, 150000-175, 000 셀/잘 필요 합니다.
참고: 우리는 N의 최소 실행 제어를 위한 3 복제 우물 = 고 2 독립의 총 실행 각 실험 혈통에 대 한 조건을 유도 (N = 총 6 복제). - PVAT 조상 세포 인구를 사용 하 여 셀 분리 솔루션 및 부 화 37 ° C, 5% CO2 별도 15 mL 원뿔 튜브로 5 분 풀 인구에 대 한 인간의 골 MSC 인구 세포 연결이 해제 됩니다. 500 x g 7 분 작은 셀에서 아래로 유리병을 회전 합니다. PBS의 1 mL에 resuspend를 사용 하는 hemocytometer 셀 번호를 예상.
- 4.1 단계에서 표시 된 대로 셀 12 잘 요리에서 접시. 비 유도 상태 유발된 상황의 문화를 계속 방해 하지 않고 이전 시간에서 고정 될 수 있도록 유도 및 유도 비 adipogenic, osteogenic, 그리고 조건에 대 한 별도 요리를 제공 합니다.
- 각 잘 유발 조건에 adipogenic 및 osteogenic 유도 미디어의 1.5 mL를 추가 합니다. 각 잘 유도 되지 않은 상태를 adipogenic 및 osteogenic 비 유도 미디어의 1.5 mL를 추가 합니다. Adipogenic 및 osteogenic 유도 및 비-유도 세포 인구 37 ° C, 5% CO2의 부 화를 시작 합니다.
- 500 x g7 분에 대 한 인간의 골 MSCs 및 인간 PVAT 조상 세포의 나머지 볼륨 아래로 회전 합니다.
- 나머지 골 및 100, 000 셀/10 µ L (106 셀/mL)의 밀도 달성 하기 위해 펠 릿 PVAT 파생 셀 resuspend 하는 데 필요한 볼륨을 결정 합니다. Chondrogenic 계보 유도 MSC 성장 매체의 계산된 볼륨에 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 위아래로 피펫으로 균일 분포를 사용 하 여 셀의 볼륨을 이동 합니다.
- 각 잘 100, 000 셀의 micromass를 중심으로 집중된 셀 솔루션의 10 µ L 드롭릿 플라스틱. 증발을 방지 하기 위해 인접 한 잘에 살 균 H2O의 1 mL를 배치 합니다. 2 h 37 ° C, 5% CO2 는 micromass를 허용에 대 한 micromass 문화를 품 어 집계에.
- 2 시간 후, 신중 하 게 chondrogenic 차별화 미디어 10 ng/mL와 함께 아군을 추가 유발 조건 우물의 각 인간 TGFβ1. 신중 하 게 비 유도 조건 우물에 비 유도 미디어 (골 MSC 성장 미디어)의 1.5 mL를 추가 합니다. 유도 및 유도 비 조건에 대 한 별도 12-잘 접시를 사용 하 여 비 유도 조건 이전 시간에서 고정 될 수 있도록.
5. 프로토콜 4: 문화 Adipogenic, Osteogenic, 그리고 14 일에 대 한 Chondrogenic 계보
- 37 ° C, 5% CO2, 상쾌한 미디어 매 2 일에서 4 일 동안 모든 3 개의 계보의 유도 및 비 유도 조건 문화. 하루에 4, 분석 결과의 나머지 부분에 대 한 유지 보수 미디어 사용 유도 미디어에서 유도 adipogenic 계보 조건을 변경 합니다.
- 12 헤 포 르 말린의 Dispose에 대 한 10% 포 르 말린에 비 유발 조건을 모두를 해결 하 고 세척 모든 고정 포 르 말린의 모든 흔적을 제거 하는 PBS에 2 x 우물. 처리까지 4 ° C에서 PBS에 접시 저장 합니다.
- 14 일, 2 일 마다 미디어를 새로 고침의 총 유도 조건 문화. 10 ng/mL 최종 농도에서 각 새로 고침으로 chondrogenic 유도 미디어의 신선한 TGFβ1를 추가 합니다. Adipogenic 유지 보수 미디어와 osteogenic 혈통 유도 미디어, 2 일 마다 상쾌한 adipogenic 혈통 문화를 계속 합니다. 14 일에 얼룩에 대 한 10% 포 르 말린에 12 h에 대 한 모든 유도 조건 수정.
- 긁어 또는 포함을 위한 카세트에 유도 chondrogenic 조건에는 micromass를 부 어. 5 분, 70%, 80%, 95%에서 두번 그리고 두번 절대 알코올에 더에서 시작 점점 더 집중된 알코올의 시리즈에서 micromass를 탈수. Dealcoholization 에이전트에 카세트를 놓고 마지막으로 파라핀 왁 스 단면 및 얼룩에 카세트를 포함 합니다.
6. 프로토콜 5: Adipogenic 상태 기름 얼룩 빨간 O
- 100% 소 프로 파 놀의 100 ml에서 기름 빨간 O의 350 mg를 용 해 하 여 기름 빨간 O 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 저 어 바와 진공 2 h에 대 한 믹스. 재고 솔루션 1 년 동안 실 온에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.
- 기름 빨간 O 3 부품 2 부품 diH20 재고 솔루션 (예: 60 mL 40 mL diH20 재고 솔루션)를 혼합 하 여 솔루션을 작업을 준비 합니다. 작업 솔루션에 기름 빨간 O의 최종 농도 2.1 mg/mL 이다.
- 우물에서 모든 액체를 제거 합니다. 워시 60% 소 프로 파 놀, 완전히 우물의 측면에서 모든 물을 제거 있는지와 각 잘 2 배. 60% 소 프로 파 놀을 발음 하 고 신속 하 게 표지 하단에 우물의 벽을 건드리지 않고도 기름 빨간 O 작업 솔루션을 추가 합니다. 그래서 우물 건조 하지 않습니다이 단계를 신속 하 게 수행이 중요 하다.
- 일단 기름 빨간 O 추가 되 면 부드러운 락으로 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- 모든 기름 빨간 O를 제거 하 고 즉시 증류수 H2o. 세척 증류수 H2O 10 m 언바운드 기름 빨간 o.를 제거 하기 시작을 위한 추가 10 분 후 기름 빨간 O 발음 하 고 세척 절차 3 반복 x.
- 세척 완료 되 면, PBS를 추가 하 고 셀을 이미지. 4 ° c.에 PBS에 얼룩진된 셀 저장
7. 프로토콜 6: 얼룩 알리자린 레드 Osteogenic 조건
- 각 우물에서 모든 액체를 제거 합니다. 각 잘 (12-잘 접시 잘 당 1.5 mL)을 2% 알리자린 레드 얼룩 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 솔루션은 완전히 우물의 바닥을 커버 때까지 부드럽게 접시 측면을 기울기.
- 실 온에서 15 분 동안 품 어. 우물에서 알리자린 레드를 제거 합니다. 부드럽게 증류수 H2O, 주의 하지 칼슘 결정을 꺼내 려 복용 4 시간 각각 잘 린스. 건조를 허용 합니다.
8. 7 프로토콜: Trichrome Masson의 Chondrogenic 상태를 얼룩
-
구워 30 분 동안 60 ℃ 건조 오븐에서 슬라이드 증류수를 Deparaffinize 및 수화물 섹션.
- Dealcoholization 에이전트, 이어서 다음과 같이 알코올 농도 하강에 5 분 외피와 3 5 분 외피에 슬라이드 rehydrate, 장소: 100% (절대 에탄올) 2, 95% 알코올에 2, 2에서 80%, 70%, 2 개 그리고 마지막으로 두에 소 주 H2H2O Bouin의 정착 제를 준비 하는 동안 유지 수 O. 슬라이드.
- (발견) 플라스틱 microwavable coplin jar에 Bouin의 정착 액의 장소 40 mL. 55 ° c 온도가지고 높은 전자 레인지 장소 슬라이드 20 분;에 대 한 열 솔루션 카운터에 하자 스탠드 커버. 실행 10 분 동안 또는 노란 색의 모두 사라질 때까지 수돗물에 씻어.
- 10 분 동안 수돗물을 실행에 10 분 세척에 대 한 Weigert의 hematoxylin에 섹션을 얼룩.
- 10 분 씻어 수돗물에 3 x 10 분에 대 한 Beibrich의 스 칼 렛 산 fuchsin 솔루션 섹션을 얼룩. 슬라이드 10 분 phosphotungstic/phosphomolybdic 산 성 솔루션에 반 린스 하지 않습니다.
- 10 분 린스 수돗물에 2 개의 짧은 딥으로 아닐린 블루 솔루션에 직접 슬라이드를 배치 합니다.
- 5.4 단계 및 합성 수 지로 산에서 1 분 장소 1 분 Dehydrate에 대 한 95% 에탄올에 대 한 수도 물에 3 ~ 5 분 세척에 대 한 1% 초 산 용액에 슬라이드를 놓습니다.
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Representative Results
인간 PVAT에서 stromal 혈관 분수의 절연
그림 1A 는 오름차순 대동맥 overlying PVAT 획득 했다 해 부 지역의 회로도 보여준다. 우리는 이전 관상동맥 바이패스 접목에서이 샘플은 파생된6받고 환자 인구를 설명 합니다. 그림 1B 수술 후 얻은 인간 PVAT의 예를 보여 줍니다. 그림 1C Masson의 Trichrome 얼룩으로 얼룩이 대표 PVAT 조직 섹션을 보여 줍니다. 그림 1D 차별화 이전 확장 단계 동안 PVAT 파생 stromal 세포의 인구를 보여주는 단계 계약 현미경 사진 이다. 셀 확장 하 고 차후 사용을 위해 얼 수 있습니다. 세포는 일반적으로 2.5 x 70%로 구성 된 미디어에서 105 셀/mL의 조밀도에 냉동 FBS, 20% 기저 (항생제 무료) 24 h 및 긴-t 액체 N2 냉장고의 액체 단계로 이동-80 ° C에서 소 프로 파 놀 cryochamber에서 DMEM F12 및 10 %DMSO erm 스토리지입니다.
Adipogenic 차별화
연구는 인간 골 수 유래 MSC (그림 2AB)와 (그림 2CD) PVAT에서 파생 된 조상 세포 병렬로 수행 했다. 그림 2 의 왼쪽된 패널 없는 지질 축적은 분명 유발 되지 않은 상태를 표시 합니다. 오른쪽 패널 표시 세포 adipocyte 차별화 하며 오일 레드 오와 중립 지질의 얼룩 인간의 대동맥 PVAT 파생 된 세포에서 분화의 정도 더 강력한, 모두 인간의 세포 원 전시 adipogenic 혈통으로 차별 하는 능력.
Osteogenic 차별화
Osteogenic 차별화 프로토콜은 인간의 골 수 파생 된 MSC (그림 3A-C) 및 PVAT에서 파생 된 세포 (그림 3D-F)에 사용 됩니다. 비-유도 된 세포 (그림 3AD) 알리자린 레드 얼룩 하지 않았다. Osteogenic 차별화 프로토콜 후 인간 MSC 개발 (그림 3B– C), 알리자린 레드 스테인드 석 회화 혹 인간의 대동맥 PVAT 파생 셀 하지 않았다 하는 동안 (그림 3E-F). 이러한 데이터 표시는 인간의 stromal 혈관 부분에서 셀의 우리의 준비 PVAT 부족 창시자의 상당수 받을 수와 함께 골. 차별화의 연구 및 시간 과정에 따라 그것은 osteogenic 혈통 약속 (예: RUNX2, osterix, 알칼리 성 인산 가수분해 효소) 또는 osteoblasts (osteopontin, 정의 하는 분자 마커 검출 표준 얼룩을 구명 하는 것이 좋습니다. osteocalcin, 알칼리 성 인산 가수분해 효소, BAP1)입니다.
Chondrogenic 차별화
모두 인간의 골 MSC (그림 4A)에서 파생 된 셀 및 인간 PVAT (그림 4B) 표시는 micromass에 풍부한 콜라겐 누적 된 chondrogenic 차별화의 기능 특성. MSC 인간의 골 수에서 형성 하는 Micromasses 및 대동맥 PVAT 파생 셀 또한 전시 하 고 있다 (파란색)의 풍부한 축적 Alcian 블루 얼룩으로 표시 (그림 4C– D, 각각). 형태학 상으로, 비슷한 격차 구조 셀 콜라겐 증 착 (그림 4, 화살표)을 둘러싼 충 치에 앉아 발견 했다. 차별화, 특정 chondrogenic 마커 (aggrecan, 콜라겐 유형 II, osteonectin, Sox9)의 탐지의 연구 및 시간 과정에 따라 유용 하다.
그림 1: 인간 PVAT의 형태학 특성. (A) 인간의 대동맥 주위 PVAT (노랑) (적색)의 묘사를 만화. 화살표는 오름차순 대동맥을 나타냅니다. (B) A의 분리 이전 DMEM에서 관상 환자에서 인간의 대동맥 PVAT 480 mg 조각. 포 르 말린 고정 파라핀 포함 하는 인간 PVAT의 (C) Masson의 trichrome 얼룩 (어두운 갈색/검은색 = 핵, 파란색/보라색 결합 조직, 핑크 = = 세포질; 참고, RBC 붉은 핑크 표시 됩니다. (D) 문화에서 7 일 explanted PVAT stromal 세포의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Adipogenic 차별화. (A) 단계 유발 되지 않은 상태에서 인간의 골 수 MSC의 현미경 차별화의 증거를 보여줍니다. (B)는 14 일 후 기름 빨간 O와 스테인드 유도 adipogenic 상태에서 인간의 골 수 MSC의 위상 현미경 보여줍니다 몇 가지 차별화 및 중성 지질, 동원 정지. (C) 단계 인간의 대동맥 PVAT 파생 비 유도 adipogenic 상태에서 세포의 현미경 차별화의 증거를 보여줍니다. (D)는 14 일 후 기름 빨간 O와 스테인드 인간의 대동맥 PVAT 파생 유도 adipogenic 상태에서 셀의 위상 현미경 강력한 차별화 및 중성 지질, 동원 정지 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Osteogenic 차별화. (A) 위상 비 유도 osteogenic 상태에서 인간의 골 수 MSC의 현미경 osteogenic 혈통으로 차별의 증거를 보여줍니다. (B) 단계 문화에서 14 일 후에 유도 된 상태에서 인간의 골 수 MSC의 현미경 보여줍니다 차별화의 증거와 칼슘 예금 Alizarin Red (화살표)로 얼룩진의 형성. (C) 필요는 잘 포함 하는 알리자린 레드 얼룩 다음 유도 osteogenic 상태에서 인간의 골 수 MSC의 이미지 나타냅니다 풍부한 칼슘 증 착, 성공적인 차별화 osteogenic 계보 (화살표를 향해 제안 칼슘 증 착)입니다. (D) 단계 osteogenic 혈통으로 차별화의 징후를 전시 하는 대동맥 인간 PVAT 파생 비 유도 osteogenic 상태에서 세포의 현미경. (E) 단계 대동맥 인간 PVAT 파생 문화에서 14 일 후 유도 osteogenic 상태에서 세포의 현미경 osteogenic 혈통으로 차별화의 증거 또는 칼슘만 알리자린 레드 스테인드 하는 경우의 표시 일반적인 얼룩입니다. (F) 필요는 잘 포함 하는 인간의 대동맥 PVAT 파생 알리자린 레드와 함께 다음 얼룩이 표시만 일반적인 유도 osteogenic 상태에서 셀의 이미지 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Chondrogenic 차별화. (A, B) micromass의 섹션의 가벼운 현미경 문화에서 14 일 후 조상 세포 (B) 유도 chondrogenic 상태에서에서 인간의 골 MSC (A) 또는 인간의 대동맥 PVAT에 의해 형성 하 고 그 후로 얼룩진 Masson의 Trichrome 나타내는 중요 한 콜라겐 (파란색)의 chondrogenic 혈통으로 성공적인 차별화를 제안. (C, D) micromass의 섹션의 가벼운 현미경 검사 법에 의해 형성 된 인간의 골 MSC (C) 또는 인간의 대동맥 PVAT 조상 세포 (D) 유도 chondrogenic 상태에서 14 일 후에 문화 하 고 산 성의 나타내는 이후에 물 Alcian 블루, proteoglycans (예를 들어 있다)로 일반적으로 연골에서 발견 된다. Counterstain, 핵 빠른 빨강; 화살표, 격차 같은 구조입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
다른 플랫폼에서 많은 조상 세포 표현 형 및 차별화 잠재적인9에서 넓게 변화 한다. 3 다른 계보 다운 동시 유도 단일 환자 기증자에서 PVAT 파생 창시자 경작, osteogenic, adipogenic 그리고 chondrogenic,이 소설의 만능 용량 잘 제어 조사에 대 한 수 수 조상 세포의 인구입니다. 인간의 PVAT에서 조상 세포의 분화 능력을 테스트 하 고 PVAT pathologies 및 혈관 음색 통제에 그들의 기능을 이해 하는 것이 보고서에 설명 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 이 방법의 몇 가지 장점은 단순 하 고 관상 동맥에서 기본 인간 조직의 사용 환자, 심한 심장 혈관 질병을 가진 환자에서 PVAT 조상 세포 기능 조사 활성화를 우회. 그러나, explants는 500 mg 조직에서에서 일반적으로 항복 < 1000 점착 세포 및 따라서이 접근에 1 개의 중요 한 경고를 강조는 적절 한 숫자를 5-7 구절을 필요. 트라이-혈통 차별화 실험의 성공을 위한 중요 한 기증자 PVAT에서에서 초기 셀 explant의 품질이입니다. 잘게 다진 효소 분리 이전에 철저 하 게 조직에 필수적 이다. 또한, 다른 explant 프로토콜 달리 우리는 도금 전에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하는 경우 휴대폰 번호, 생존 및 전반적인 품질의 극적인 손실 발견. 대신, 그것은 좋습니다 (붉은 혈액 세포를 포함 하 여) 전체 stromal 혈관 분수 접시를. 24 시간 후 부착 셀 첨부 됩니다 하 고 붉은 혈액 세포 비 lysed HBSS로 반복된 세척을 통해 제거할 수 있습니다. PVAT에서 파생 된 stromal 세포의 뿌리고 1:2 분할 보다 더 큰 되어야 합니다. 셀 분할 1:3 이상 때 성장 율에 있는 감소를 관찰 합니다.
Trilineage 차별화 분석 결과의 구성 하는 가장 어려운 요소 "micromass" 포함 하 고 단면 조직학 자란 셀의 보다 적게 일반적인 방법은 필요로 chondrogenic 상태입니다. 제대로 100000 셀 10 µ L 물방울 접시 고 문화 매체 추가에 질량을 방해 하지 않는 주의 해야 합니다. 우리는 여부는 micromass 접시를 준수 남아 또는 매체에 분석 실험 사이 변이 발견. 심지어 때 질량 남아 있지 않았다 준수, micromass 구조와 세포 생존 능력은 일관 된 남아 있었다.
혈관 microenvironment 내 줄기 또는 조상 세포 조직 복구 부상 또는 질병에 응답에 대 한 책임이 있습니다. 여부에 대 한 논란은 여전히 pericyte/adventitial 구획에서 파생 되는 인구는 가장 잘 특징 있다 인간10,11 이러한 인구의 표준화 된 분자 식별 . 이 프로토콜에서 우리는 특별히 osteogenic, chondrogenic 또는 adipogenic 계보를 차별화 하는 그들의 성향 테스트를 인간 PVAT에서 파생 된 조상 세포 인구를 공부. 우리는 인간의 골 수에서 MSC, 달리 인간 PVAT에서 조상 세포 하지 못했습니다 osteogenic 계보 (그림 3)으로 구분 하지만 강력한 전시 설명 착 기술을 사용 하 여 셀룰러 하겠다는 각 계보를 정의 adipogenic 차별화입니다. chondrogenic 차별화는 골 수와 PVAT 파생 셀 사이 비교 합니다. PVAT에서 파생 된 조상 세포 더 많은 리니지 골 MSC 보다 제한 된 것 또는 PVAT 창시자 osteogenic 혈통으로 쉽게 구분 하지 않습니다 나왔다. 미래 연구는 더 양적 PVAT 파생 된 세포의 분화 능력을 평가 하기 위해 각 혈통에 대 한 표식 유전자 및 단백질 식의 수사를 포함 해야 합니다.
지방 유래 줄기 세포 재생 의학 응용 프로그램, 쉬운 접근 및 지방 조직12,13에서 파생 될 수 있는 셀의 높은 숫자에 대 한 초점 되었습니다. 지방이 많은 직물의 실질 혈관 분수, 내 혈관 세포, 염증 세포, 섬유 아 세포, preadipocytes, 및 지방 유래 줄기 세포가 있다. 많은 창 고 및 체형 특성14의 해부학 적 위치에 따라 줄기 세포 인구에서 차이가 있다. 가장 중요 한 것은, 지방 유래 줄기 세포 뿐만 아니라 엽 계보15, 뿐만 아니라 신경16,17 및 표 피18 운명을 채택 가능성으로 분화 하는 능력을가지고 나타납니다.
수많은 연구 인간의 피하 흰색 adipose 조직에서 파생 된 줄기/뿌리 세포에 초점을 맞춘 하지만 거의 연구 PVAT에 조상 인구의 특성 해결. 최근 연구는 PVAT 주변 mesenteric 배 또는 쥐의 흉부 대동맥에서 체형 조상 세포 고립 있다. 이러한 CD34 + CD140a + 인구 아니었지만 다른 계보를 파생 하는 능력으로 adipocytes, 차별화 된 테스트19.
우리는 최근 고급 관상 동맥 질병6을 가진 환자에서 인간의 PVAT stromal 혈관 일부에서 파생 된 많은 조상 세포를 특징. 이 많은 조상 세포 CD73 + CD105 +, CD140a +, 되었고 효율적으로 adipocytes thermogenic 특성 (UCP1 식)6으로 분화. 현재 작업에서 우리는 부족 또는 다른 인간 지방 조직에서 특징 지방 유래 줄기 세포의 최소한의 인구 제안 골 파생 MSC에 비해 PVAT 파생 된 세포의 제한 된 계보 힘 발견. 이 프로토콜에 대 한 고려 사항은 PVAT 샘플 및 그들의 능력을 받아야 뚜렷한 계보를 분화 줄기/뿌리 세포의 수에 영향을 미칠 수 있습니다 인간의 표본 사이 예상된 변화 이다. 나이, 성별, BMI, 약물, 가능성이 다른 임상 매개 변수 PVAT 내의 조상 세포의 표현 형을 영향을 줍니다. 따라서,이 프로토콜의 예상된 미래의 수정 인간 PVAT, 및 가능 하 게 사용 하 여 셀 정렬 계보 연구에 대 한 특정 한 부분 모집단을 더 명확 하 게 정의 된 조상 인구를 기다리고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 임상 조직, Histopathology 및 메인 의료 센터 연구에서 Histomorphometry 코어 (1P20GM121301, L. Liaw PI 지원)의 조달을 위한 메인 의료 센터에서 연구 탐색의 도움을 인정 단면화 및 얼룩에 대 한 연구소입니다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01 HL141149 부여 (L. Liaw).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| Antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| Biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| Bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4 °C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| Bell strainer (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| Gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| Insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| Pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| Penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| Rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
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