Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Differentiering kapacitet af menneskelige aorta Perivascular fedt stamceller

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

Målet med denne protokol er at teste stamceller afledt af menneskelige perivascular fedtvæv evne til at differentiere i flere celle lineages. Differentiering sammenlignet med mesenkymale stamceller fra menneskelige knoglemarven, som er kendt for at differentiere sig til adipocyt, osteocyte og Chondrocyt lineages er afledt.

Abstract

Fedtvæv er en rig kilde af multi potent mesenchymale stamceller (MSC) i stand til at differentiere i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic slægter. Adipogenic differentieringen af stamceller er en vigtig mekanisme kørsel fedtvæv ekspansion og dysfunktion i svar til fedme. Forståelse ændringer til perivascular fedtvæv (PVAT) er således klinisk relevant i metabolisk sygdom. Tidligere undersøgelser har dog været overvejende udføres i musen og andre dyre modeller. Denne protokol bruger menneskelige thorax PVAT prøver indsamlet fra patienter, der gennemgår koronararterie bypass graft operation. Fedtvæv fra den opstigende aorta blev indsamlet og brugt til explantation af det stromale vaskulære brøkdel. Vi har tidligere bekræftet tilstedeværelsen af adipøst stamceller i menneskelige PVAT med kapacitet til at differentiere i lipid-holdige adipocytter. I denne undersøgelse analyseret vi yderligere differentiering potentiale af celler fra de stromale vaskulære fraktion, der formentlig indeholder flere potent stamceller. Vi sammenlignet PVAT-afledte celler til menneskelig knoglemarv MSC for differentiering af adipogenic, osteogenic, og chondrogenic slægter. Efter 14 dage af differentiering, bestemt pletter blev udnyttet til at opdage lipid ophobning i adipocytter (olie røde O), forkalkede indlån i osteogenic celler (Alizarin rød), eller glycosaminoglycans og kollagen i chondrogenic celler (Masson's Trichrome). Mens knoglemarv MSC effektivt differentieret i alle tre slægter, PVAT-afledte celler havde adipogenic og chondrogenic potentiale, men manglede robust osteogenic potentiale.

Introduction

Fedtvæv er en rig kilde af multi potent mesenchymale stamceller (MSC) i stand til at differentiere i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic lineages1. Dette væv udvider gennem hypertrofi af modne adipocytter og de novo differentiering af hjemmehørende MSC til adipocytter. Perivascular fedtvæv (PVAT) omgiver blodkar og regulerer vaskulære funktion2,3. Fedme-induceret PVAT ekspansion forværrer hjerte-kar-sygdomme. Mens den Multipotente potentiale af MSC fra menneskelige subcutan fedt depoter er blevet godt undersøgt4,5, har ingen undersøgelser eksplanterede og evalueret differentiering kapaciteten af menneskelige PVAT-afledte stamceller, sandsynligvis skyldes invasionsevne af indkøb. Målet med dette arbejde er således, at fremlægge en metodologi til explant og udbrede stamceller fra menneskelige aorta PVAT fra patienter med hjerte-kar-sygdom og til at teste deres tilbøjelighed til at differentiere til osteogenic, chondrogenic og adipogenic slægter. Vores PVAT er fra stedet, hvor anastomose af bypass graft på opstigende aorta af overvægtige patienter, der gennemgår koronararterie bypass graft operation. Frisk isoleret PVAT er enzymatisk adskilles og stromale vaskulære brøken er isoleret og opformeret in vitro, gør det muligt for os at teste for første gang differentiering kapaciteten af menneskelige PVAT-afledte stamceller.

Hjælp af primære kulturperler menneskelige PVAT stromale vaskulære brøkdel, testede vi tre assays designet til at fremkalde stem/stamceller til at differentiere mod adipogenic, osteogenic, eller chondrogenic slægter. Vores forudgående undersøgelse identificeret en befolkning på CD73 +, CD105 + og PDGFRa + (CD140a) celler, der kan håndfast differentiere i adipocytter6, selv om deres multipotency ikke var testet. PVAT regulerer direkte vaskulære tone og betændelse7. Begrundelsen for afprøvning differentiering potentialet i denne roman celle population er at begynde at forstå den specialiserede indflydelse af PVAT på vaskulære funktion, og mekanismer for PVAT ekspansion under fedme. Denne metode øger vores forståelse af funktionerne af fedtvæv afledte stamceller og gør det muligt for os at identificere og sammenligne ligheder og forskelle af stamceller fra forskellige væv kilder. Vi bygge på etablerede og validerede metoder til isolering og differentiere MSC mod forskellige slægter og optimere procedurerne for at maksimere levedygtigheden af menneskelige PVAT-afledte stamceller. Disse teknikker har brede anvendelsesmuligheder inden for stilk og stamfader celle forskning og fedtvæv udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brugen af humane væv i denne undersøgelse blev evalueret og godkendt af den institutionelle Review Board af Maine Medical Center, og alle medarbejdere modtaget passende uddannelse før eksperimenter.

1. præparater

  1. Gøre dissociation buffer af erstatningsgodtgørelse 50 mg dyr-gratis collagenase/dispase blend jeg løsning med 1 mL af nanopure H2O. Forbered 1 mg/mL brugsopløsning ved at tilføje 49 mL af høje glukose DMEM indeholdende 1% w/v BSA til den rekonstituerede collagenase / dispase løsning. Gemme 5 mL arbejder alikvoter ved-20 ° C og varme til 37 ° C ved hjælp af et vand bad før for at bruge.
  2. Gør antibiotika løsning ved tilsætning af 1 mL af 100 x antibiotikum/antimykotikum løsning (endelig koncentration er 200 enheder/mL penicillin, 200 enheder/mL streptomycin og 0,5 µg/mL fungizone) til 49 mL af HBSS, og opbevares på is.
  3. Forberede gelatine løsning (0,2% w/v) ved at opløse 200 mg gelatine fra kvæg hud i 100 mL af nanopure H2O. autoklave løsning i 20 min. og opbevares ved 4 ° C.
  4. Forberede 500 mL af PVAT vækst medier: høje glukose DMEM/F12 med Glutamin supplement, natrium pyruvat og natriumbikarbonat, suppleret med 10% FBS og 100 µg/mL antimikrobiel agent (Se Tabel af materialer).
  5. Forberede 50 mL adipogenic induktion medier: 40,8 mL høje glukose DMEM, suppleret med 7,5 mL PVAT vækst medier, 500 µL af 100 x antibiotikum/antimykotikum løsning (endelig koncentration er 100 enheder/mL penicillin, 100 enheder/mL streptomycin og 0,25 µg/mL fungizone), 0,5 mM IBMX (500 mM lager i 0,1 M NaOH), 1 µM dexamethason (1 mM lager i ethanol), 5 µM rosiglitazon (5 mM lager i DMSO), 33 µM biotin (66 mM lager i DMSO), 100 nM insulin (200 µM lager i 0,1% eddikesyre) og 20 µM Pantothensyre (100 mM lager i H2 O).
  6. Forberede adipogenic slægt 50 mL af kontrol induktion medier: 40,8 mL høje glukose DMEM suppleret med 7,5 mL PVAT vækst medier og 500 µL af pen-strep (100 x bestand).
  7. Forberede 50 mL adipogenic vedligeholdelse medier: 41,5 mL høje glukose DMEM suppleret med 7,5 mL PVAT vækst medier fra trin 1.3, 500 µL pen-strep (100 x lager), 1 µM dexamethason (1 mM lager i EtOH), 33 µM biotin (66 mM lager i DMSO), 100 nM insulin (200 µM lager i 0,1% ac Etic syre), og 20 µM Pantothensyre (100 mM lager i H2O).
  8. Forberede osteogenic og chondrogenic lineages 500 mL af vækst medier: høje glukose αMEM suppleret med 10% FBS, 1 x Glutamin supplement (Se Tabel af materialer), og 5 mL af pen-strep (100 x bestand).
  9. Forberede den osteogenic slægt 50 mL af induktion medier: 50 mL af knoglemarven MSC vækst medier suppleret med 10 nM dexamethason og 10 mM β-glycerophosphate.
  10. Forberede chondrogenic slægt 50 mL af induktion medier: 50 mL af knoglemarven MSC vækst medier suppleret med 100 nM dexamethason, 50 µg/mL natrium Ascorbat-2-fosfat og 10 ng/mL TGFβ1. For de osteogenic og chondrogenic, vil basal knoglemarv MSC vækst medier fungere som ikke-induktion medier.

2. protokol 1: Kultur menneskelige PVAT celler fra de stromale vaskulære brøkdel

Bemærk: PVAT resektion fra stedet, knogletransplantation anastomose på bedøvede patienter, der gennemgår koronararterie bypass graft procedurer opstigende aorta. Aorta PVAT er placeret i en 15 mL konisk indeholdende 10 mL is kold høje glukose DMEM F12 og overført fra operationsstuen til laboratoriet inden 2 h af resektion. Aorta PVAT er kasseret væv under bypass proceduren og har været betragtet som ikke-menneskelige emner forskning af Maine Medical Centers interne Review Board.

  1. Denne protokol er for en ~ 500 mg stykke af menneskelige PVAT (ca. 3 x 1 x 0,5 cm3). Overføre frisk menneskelige PVAT fra DMEM til en 50 mL konisk rør indeholdende 25 mL antibiotika løsning. Der inkuberes med vuggende i 20 min. ved 4 ° C. Mens PVAT er i antibiotisk løsning, tø en alikvot af dissociation buffer ved 37 ° C.
  2. Tilsæt 50 µL af 100 x antibiotikum/antimykotikum løsning til 5 mL dissociation buffer og sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm sprøjte filter. Tilsættes 1 mL gelatine til 1 godt af en 24-godt plade. I en laminar flow hætte, bruge steril pincet og saks til at overføre PVAT fra den antibiotiske løsning til en steril petriskål. Der tilsættes 1 mL af pre varmede dissociation buffer til væv og fint hakkekød hele vævet ind i en gylle (ingen stykker større end ~ 2 x 2 mm2) ved hjælp af steril pincet og dissektion saks.
  3. Overføre 1 mL gylle til 4 mL dissociation buffer og inkuberes røret på sin side i en pre varmede 37 ° C orbitalryster på 200 rpm i 1 time. Efter 1 time, ingen synlige væv stykker vil være til stede, og løsningen vil fremstå som en overskyet cellesuspension.
  4. Opløsningen filtreres gennem et 70 µm celle si på toppen af en 50 mL konisk slange. Skyl si med en yderligere 10 mL antibiotika løsning til at fange så mange celler som muligt. Ikke klemme sien.
  5. Sammenpresse cellerne i 12 min. ved 300 x g i en swingende spand centrifuge.
    Bemærk: Efter centrifugering opdeles røret i en fede øverste lag af adipocytter, en interfase og en pellet. Pellet er de stromale vaskulære fraktion indeholdende endotelceller, immunceller, blod celler og stamceller.
  6. Resuspenderes i 10 mL af HBSS og centrifugeres i 5 min. ved 300 x g. Gentag dette trin for en total af 2 vasker i HBSS. Efter den sidste vask, ikke lyse røde blodlegemer. Gentagne forsøg med flere kommercielt tilgængelige buffere og inkuberingstider har ført til markante reduktioner i stamfader celle udlæg og levedygtighed.
  7. Opsug gelatine fra 24-godt plade. Forsigtigt vaske den godt 1 x med HBSS til at fjerne ubundne gelatine.
  8. Resuspend stromale vaskulære brøkdel pellet med intakt røde blodlegemer i 1 mL af vækst medier og frø på gelatine-belagt godt. Tilføje menneskelige FGF2 (genopslemmes i PBS suppleret med 0,01% BSA w/v) til en endelig koncentration på 25 ng/mL i dyrkningsmediet. Der inkuberes i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
  9. Den næste dag wells Fjern vækst medier og vask 5 x med HBSS til at fjerne røde blodlegemer og døde celler. Tilføj i 1 mL frisk vækst medier suppleret med 25 ng/mL FGF2.
  10. Ændre medierne hver 48 h, og sørg for at supplere med 25 ng/mL frisk FGF2 hver gang.
  11. Celler typisk nå 100% sammenløbet 7-10 dage efter eksplantat; passage celler derefter:
    1. Opsug vækst medier og vask éncellelag 2 x i 1 mL HBSS. Opsug alle HBSS fra brøndene og tilføje et par dråber af celle dissociation løsning.
    2. Tryk på og swirl pladen flere gange og der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 til 5-7 min til at løfte cellerne. ~ 1 mL frisk næringssubstratet tilsættes til de fritliggende celler og distribuere 500 µL til 2 brønde af en 24-godt plade, hver indeholdende 500 µL vækst medier og 25 ng FGF2.
  12. Fortsætte med at udvide menneskelige PVAT-afledte celler, som angivet i det forrige trin. Hver passage bør ikke være større end en 1:2-split. Celler er passaged 5-7 gange før tildeling af for differentiering assays.

3. protokol 2: Kultur menneskelige knoglemarv MSC kolonier

Bemærk: Menneskelige knoglemarv MSC, isoleres som beskrevet8 og gemt som tidlige passage frosne bestande fryse medier (70% FBS 20% basal DMEM og 10% DMSO) på ~ 100.000 celler/mL i flydende Nielsen2.

  1. Hurtigt optø et hætteglas med knoglemarv MSC fra flydende N2 i et 37 ° C vandbad og plade til én brønd af et 6-godt kultur plade der indeholder 3 mL af MSC vækst medier og inkuberes natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Den næste dag, Aspirér MSC dyrkningsmedier og vaske cellerne 3 x 2 ml HBSS. På 100% confluence, Aspirér vækst medier og vaske cellerne 3 x 2 ml HBSS. Tilsættes 500 µL/brønd celle detachement opløsning og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 5 min. Tryk pladen til at sikre, at alle celler er forskubbet og jævnt distribuere indholdet til 2 huller i en 6-godt pladen som indeholder 2 mL MSC vækst medier.
  3. Udvide den menneskelige knoglemarven og PVAT-afledte MSC parallelt for ca 5-7 passager eller indtil tilstrækkelige mængder for test er opnået.

4. protokol 3: Plade og fremkalde Adipogenic, Osteogenic, og Chondrogenic slægter

  1. Plade passende numre af knoglemarven og PVAT-afledte celler pr. brønd af et 12-godt plade og passende replikater for hver eksperimentelle betingelse. Adipogenic og osteogenic betingelser, ~ 200, er 000-225.000 celler/brønd nødvendigt, for chondrogenic betingelser, 150.000-175.000 celler/brønd er nødvendige.
    Bemærk: Vi kørte et minimum af N = 3 Repliker brønde for kontrol og induceret betingelser for hver eksperimentelle afstamning for en total af 2 uafhængige kører (N = 6 replikater samlede).
  2. Fjerne tilknytningen af celler fra både den menneskelige PVAT stamfader celle befolkning og den menneskelige knoglemarv MSC befolkning ved hjælp celle detachement løsning og inkubation ved 37 ° C og 5% CO2 til 5 min. Pool populationer i separate 15 mL konisk hætteglas. Spin hætteglas ned på 500 x g i 7 min at sammenpresse cellerne. Resuspend i 1 mL PBS og bruge en hemocytometer til at anslå den celle nummer.
  3. Plade celler i 12-godt retter som angivet i trin 4.1. Give separat retter for induceret og ikke-induceret adipogenic, osteogenic, og betingelser, så den ikke-induceret betingelse kan fastgøres på et tidligere tidspunkt uden at forstyrre fortsatte kultur af den inducerede betingelse.
  4. Tilføje 1,5 mL af adipogenic og osteogenic induktion medier til hver brønd af den inducerede betingelse. Tilføje 1,5 mL af adipogenic og osteogenic ikke-induktion medier til hvert hul i den ikke-induceret betingelse. Begynde inkubation af adipogenic og osteogenic induceret og ikke-induceret cellepopulationer ved 37 ° C og 5% CO2.
  5. Spin ned den resterende mængde PVAT stamfader menneskeceller og menneskelige knoglemarv MSCs i 7 min. ved 500 x g.
  6. Bestemme mængden skulle resuspend resterende knoglemarven og PVAT-afledte celle pellets til at opnå en tæthed af 100.000 celler/10 µL (106 celler/mL). Resuspend pellets i den beregnede mængde af MSC vækst medier for chondrogenic afstamning induktion. Forsigtigt flytte volumen af cellerne op og ned ved hjælp af en pipette til at sikre en homogen fordeling.
  7. Der afpipetteres en 10 µL dråbe af koncentreret celle løsning i midten af hver brønd til at danne en micromass af 100.000 celler. Placer 1 mL sterilt H2O i den tilstødende godt at forhindre fordampning. Inkubér micromass kulturer i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2 til at tillade micromass til aggregat.
  8. Efter 2 timer, Tilføj forsigtigt chondrogenic differentiering media tilsat 10 ng/mL menneskelige TGFβ1 til hver af induceret betingelse brønde. Forsigtigt tilføje 1,5 mL af ikke-induktion medier (knoglemarv MSC vækst medier) til ikke-induceret betingelse brønde. Bruge separate 12-godt plader for induceret og ikke-induceret betingelserne, så den ikke-induceret betingelse kan fastgøres på et tidligere tidspunkt.

5. protokol 4: Kultur Adipogenic, Osteogenic, og Chondrogenic Lineages i 14 dage

  1. Kultur induceret og ikke-induceret betingelserne for alle tre slægter i 4 dage ved 37 ° C og 5% CO2, forfriskende media hver 2 dage. På dag 4, ændre den inducerede adipogenic afstamning betingelse fra induktion medier til vedligeholdelse medier for resten af analysen.
  2. Fix alle ikke-induceret betingelser i 10% formalin til 12 h. bortskaffe formalin og vask alle faste brønde 2 x i PBS til at fjerne alle spor af formalin. Gemme plader i PBS ved 4 ° C indtil behandling.
  3. Kultur induceret betingelserne for ialt 14 dage, forfriskende media hver 2 dage. Tilføje friske TGFβ1 på 10 ng/mL endelige koncentration med hver opdatering af chondrogenic induktion medier. Fortsat kultur adipogenic slægt i adipogenic vedligeholdelse medier og osteogenic afstamning induktion medier, forfriskende hver 2 dage. På dag 14, løse alle induceret betingelser for 12 h i 10% formalin til farvning.
  4. Skrabe eller hæld micromass i den inducerede chondrogenic tilstand i en kassette til indlejring. Dehydrere micromass i en række mere og mere koncentreret alkohol bade i 5 min, begyndende ved 70%, så 80%, to gange i 95%, og to gange mere i absolut alkohol. Placer kassetten i en dealcoholization agent og derefter integrere endelig kassetten i paraffin voks til skæring og farvning.

6. protokol 5: Farvning Adipogenic tilstand med olie røde O

  1. Forberede olie røde O stamopløsning ved at opløse 350 mg af olie røde O i 100 mL 100% isopropanol. Bland for 2 h med en røre bar og vakuum gennem en 0,2 µm filter. Stamopløsningen kan opbevares i mørke ved stuetemperatur i 1 år.
  2. Forberede olie røde O arbejder løsning ved at blande 3 dele stamopløsning til 2 dele diH20 (f.eks. 60 mL af stamopløsningen til 40 mL diH20). Den endelige koncentration af olie røde O i brugsopløsning er 2,1 mg/mL.
  3. Fjerne alle væsken fra brøndene. Vask hver godt 2 x med 60% isopropanol, og sørg for at helt at fjerne alt vand fra siderne af brøndene. Opsug 60% isopropanol og hurtigt tilføje olie røde O brugsopløsning uden at røre væggene i wells til at dække bunden. Det er afgørende, at dette skridt er gjort hurtigt, så brøndene ikke tørre.
  4. Når olie røde O er tilføjet, inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur med blid vuggende.
  5. Fjerne alle olie røde O og straks tilføje destilleret H2O. Wash med destilleret H2O til 10 m til at begynde at fjerne ubundne olie røde O. Efter 10 min, Aspirér olie røde O og Gentag proceduren vask 3 x.
  6. Når vask er fuldført, tilføje PBS og image cellerne. Opbevar farvede celler i PBS ved 4 ° C.

7. protokol 6: Farvning Osteogenic tilstand med Alizarin rød

  1. Fjern alle væsken fra hver brønd. Tilføje passende volumen af 2% Alizarin rød plet løsning til hver brønd (1,5 mL pr. brønd for en 12-godt plade) og forsigtigt vippe den plade side til side, indtil løsningen dækker helt i bunden af brønden.
  2. Inkuber i 15 min ved stuetemperatur. Fjerne Alizarin rød fra brøndene. Skyl forsigtigt hver godt fire gange med destilleret H2O, at tage forsigtighed at ikke løsne calcium krystaller. Lad det tørre.

8. protokol 7: Farvning Chondrogenic tilstand med Masson's Trichrome

  1. Bage dias i en 60 ° C tør ovn i 30 min. Deparaffinize og hydrat sektioner til destilleret vand.
    1. For at rehydrere, placere dias i tre 5 min inkubationer med dealcoholization agenter, efterfulgt af 5 min inkubationer i faldende alkohol koncentrationer som følger: to på 100% (absolut ethanol), to på 95% alkohol, to på 80%, to på 70%, og endelig to i destilleret H2O. Slides kan forblive i H2O mens Bouins fiksativ er parat.
  2. Sted 40 mL Bouins fiksativ i en plastik mikrobølger coplin jar (utildækket). Mikrobølgeovn på high at bringe temp til 55 ° C. Placer slide i opvarmet løsning i 20 min.; Lad stå på tælleren er omfattet. Vaskes i rindende vand i 10 min, eller indtil alle af den gule farve forsvinder.
  3. Pletten sektioner i Weigerts hæmatoxylin i 10 min. Skyl i rindende vand i 10 min.
  4. Pletten sektioner i Beibrichs karminrøde syre fuchsin løsning i 10 min. Skyl 3 x 10 min. i vand fra hanen. Bejdsefarvestoffer dias i phosphorwolfram/phosphormolybdæn syre i 10 min. Ikke skylles.
  5. Placer dias direkte i anilin blå løsning i 10 min. Skyl med to korte dips i vand fra hanen.
  6. Placer dias i 1% eddikesyreopløsning for 3-5 min. Skyl i postevand i 1 min. sted i 95% ethanol i 1 min. Dehydrate, som angivet i trin 5.4 og mount med syntetisk harpiks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering af stromale vaskulære fraktion fra menneskelige PVAT

Figur 1A viser en skematisk af anatomiske området hvor PVAT overliggende opstigende aorta blev opnået. Vi har tidligere beskrevet patientpopulationer gennemgår koronar bypass hvorfra disse prøver blev afledt6. Figur 1B viser et eksempel på den menneskelige PVAT fremstillet efter operationen. Figur 1 c viser et repræsentativt PVAT væv sektion farves med Masson's Trichrome pletten. Figur 1 d er en fase kontrakt Mikrograf viser en befolkning på PVAT-afledte stromale celler under ekspansionsfase før differentiering. Celler kan udvides og frosset til fremtidig brug. Celler er typisk frosset med en tæthed på 2,5 x 105 celler/mL i et medie, der består af 70% FBS, 20% basal (antibiotikum gratis) DMEM F12 og 10% DMSO i en isopropanol kammeret ved-80 ° C i 24 h og flyttede til den flydende fase af en flydende N2 fryser for længe-t ERM opbevaring.

Adipogenic differentiering

Undersøgelser blev udført sideløbende med menneskelige knoglemarv-afledte MSC (figur 2AB) og PVAT-afledte stamceller (figur 2 cD). De venstre paneler af figur 2 Vis ikke-induceret tilstand, hvor ingen lipid ophobning er indlysende. De rigtige paneler viser celler efter adipocyt differentiering og farvning af neutrale lipider med olie røde O. Mens graden af differentiering i de menneskelige aorta PVAT-afledte celler er mere robust, udstillet både humane celle kilder evnen til at skelne mod adipogenic slægt.

Osteogenic differentiering

Osteogenic differentiering protokol blev brugt til menneskelige knoglemarv-afledte MSC (figur 3A-C) og PVAT-afledte celler (figur 3D-F). Ikke-induceret celler (figur 3AD) ikke pletten med Alizarin rød. Efter osteogenic differentiering protokol, den menneskelige MSC udviklet forkalkede knuder, der farves med Alizarin rød (figur 3B-C), mens menneskelige aorta PVAT-afledte celler ikke (figur 3E-F). Disse data tyder på, at vores forberedelse af celler fra de stromale vaskulære brøkdel af menneskelige PVAT mangler betydeligt antal stamfaderen med evnen til at gennemgå osteogenesis. Afhængigt af den undersøgelse og tid løbet af differentiering er det tilrådeligt at følge op på standard pletter med påvisning af molekylære markører, der definerer osteogenic afstamning engagement (f.eks. RUNX2, osterix, alkalisk fosfatase) eller osteoblaster (osteopontin, osteocalcin, alkalisk fosfatase, BAP1).

Chondrogenic differentiering

Cellerne stammer fra både menneskelige knoglemarv MSC (figur 4A) og menneskelige PVAT (figur 4B) vise funktioner karakteristisk for chondrogenic differentiering, med rigelige kollagen ophobning i micromass. Micromasses dannet fra menneskelige knoglemarv MSC og aorta PVAT-afledte celler også udstillet rigelige ophobning af glycosaminoglycans (blå), som angivet af Alcian blå farvning (figur 4 c-D, henholdsvis). Morfologisk, blev strukturer svarer til huller opdaget med celler sidder i hulrum omkring ved kollagen deposition (figur 4, pile). Afhængigt af undersøgelse og tid løbet af differentiering, påvisning af specifikke chondrogenic markører (aggrecan, kollagen type II, osteonectin, Sox9) er nyttige.

Figure 1
Figur 1: morfologiske karakteristika af menneskelige PVAT. (A) tegneserie skildring af menneskelige aorta (rød) med omgivende PVAT (gul). Pilen angiver opstigende aorta. (B) en 480 mg stykke af menneskelige aorta PVAT fra en CABG patienten i DMEM før dissociation. (C) Masson trichrome farvning af formalin-fast paraffin-integrerede menneskelige PVAT (mørk brun/sort = kerner, blå/lilla = bindevæv, pink = cytoplasmaet; Bemærk, RBC vises rødlig-lyserød. (D) repræsentativt billede af eksplanterede PVAT-stromale celler på 7 dage i kultur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Adipogenic differentiering. (A) fase mikroskopi af den menneskelige knoglemarv MSC i den ikke-induceret tilstand viser ingen tegn af differentiering. (B) fase mikroskopi af den menneskelige knoglemarv MSC i den inducerede adipogenic tilstand viser nogle differentiering og immobilisering af neutrale lipider, farves med olie røde O efter 14 dage. (C) fase mikroskopi af de menneskelige aorta PVAT-afledte celler i ikke-induceret adipogenic tilstand viser ingen tegn af differentiering. (D) fase mikroskopi af de menneskelige aorta PVAT-afledte celler i den inducerede adipogenic tilstand viser robust differentiering og immobilisering af neutrale lipider, farves med olie røde O efter 14 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Osteogenic differentiering. (A) fase mikroskopi af den menneskelige knoglemarv MSC i den ikke-induceret osteogenic tilstand viser ingen tegn af differentiering mod en osteogenic afstamning. (B) fase mikroskopi af den menneskelige knoglemarv MSC i den inducerede tilstand efter 14 dage i kultur viser bevis for differentiering og dannelsen af kalkaflejringer farves med Alizarin rød (pile). (C) et billede af den godt indeholdende den menneskelige knoglemarv MSC i den inducerede osteogenic tilstand efter farvning med Alizarin rød angiver rigelige calcium deposition, tyder på vellykket differentiering mod en osteogenic afstamning (pile, aflejring af calcium). (D) fase mikroskopi af de aorta menneskelige PVAT-afledte celler i den ikke-induceret osteogenic stand udstiller ingen angivelse af differentiering mod en osteogenic afstamning. (E) fase mikroskopi af aorta menneskelige PVAT-afledte celler i den inducerede osteogenic tilstand efter 14 dage i kultur viser ingen tegn på differentiering mod en osteogenic afstamning eller aflejring af calcium når farves med Alizarin rød, kun uspecifik farvning. (F) en afbildning af den godt med de menneskelige aorta PVAT-afledte celler i den inducerede osteogenic betingelse følgende farvning med Alizarin rød viser kun ikke-specifik farvning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Chondrogenic differentiering. (A, B) Lysmikroskopi af en del af micromass dannet af menneskelige knoglemarv MSC (A) eller menneskelige aorta PVAT stamceller (B) i den inducerede chondrogenic tilstand efter 14 dage i kultur og efterfølgende farves med Masson's Trichrome, hvilket indikerer betydelige aflejring af kollagen (blå) og foreslår vellykket differentiering mod en chondrogenic afstamning. (C, D) Lysmikroskopi af en del af micromass dannet af menneskelige knoglemarv MSC (C) eller menneskelige aorta PVAT stamceller (D) i den inducerede chondrogenic tilstand efter 14 dage i kultur og efterfølgende farves med Alcian blå, som angiver aflejring af sure proteoglycaner (fx glycosaminoglycans) som findes typisk i brusk. Kontrastfarve, nukleare hurtig rød; pile, lakuner-lignende strukturer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adipøst stamceller fra forskellige depoter varierer meget i fænotype og differentiering potentielle9. Dyrkning af PVAT-afledt ophav fra en enkelt patient donor i samtidige induktion ned tre forskellige slægter, adipogenic, osteogenic, og chondrogenic, giver mulighed for et godt kontrolleret undersøgelse af pluripotente kapacitet af denne roman befolkningen i stamceller. Den metode, der er beskrevet i denne rapport kan bruges til at teste differentiering kapaciteten af stamceller fra menneskelige PVAT og forstå deres funktion i reguleringen af PVAT patologier og vaskulære tone. Nogle fordele ved denne teknik er dets enkelhed og brug af primære humant væv fra koronararterie bypass patienter, således at undersøgelsen af PVAT stamfader cellefunktion fra patienter med svær hjerte-kar-sygdom. Dog explants fra en 500 mg stykke væv typisk udbytte < 1000 tilhænger celler og således kræve 5 – 7 passager til at opnå tilstrækkelig numre, fremhæve en vigtig advarsel til denne tilgang. Afgørende for succes af tri-lineage differentiering eksperimenter er kvaliteten af den oprindelige celle eksplantat fra donor PVAT. Det er vigtigt at fint hakkekød væv grundigt før enzymatisk dissociation. Desuden, i modsætning til andre eksplantat protokoller fandt vi en dramatisk tab af celle nummer, levedygtighed og generelle kvalitet når røde blodlegemer lysisbuffer blev brugt før plating. I stedet anbefales det kraftigt at plade den hele stromale vaskulære fraktion (herunder røde blodlegemer). Efter 24 h, vedhængende celler vil have tilknyttet og ikke-mængden røde blodlegemer kan fjernes gennem gentagne skylninger med HBSS. Passaging af de PVAT-afledte stromale celler skal være ikke større end 1:2 spalter. Vi observerede en reduktion i væksten når cellerne blev split 1:3 eller større.

Den vanskeligste del af trilineage differentiering assay er chondrogenic betingelse, da det kræver en mindre udbredt metode til dyrkningsbaserede celler i en "micromass" og histologiske indlejring og skæring. Pleje skal tages korrekt plade 10 µL slipværktøjet 100.000 celler og ikke forstyrre massen på tilføjelse af næringssubstratet. Vi fandt variation mellem assays, om micromass forblev overholdt til pladen eller suspenderet i medium. Selv når massen ikke forblive overholdt, forblev micromass struktur og celle levedygtighed konsekvent.

Stilken eller stamfader celler inden for det vaskulære mikromiljø er ansvarlig for væv reparation som reaktion på skade eller sygdom. Mest godt karakteriseret er befolkninger, der stammer fra pericyte/adventitial rum, selv om der er stadig uenighed om, hvorvidt der er en standardiseret Molekylær identifikation af disse befolkningsgrupper i mennesker10,11 . I denne protokol studerer vi en stamfader celle population specifikt stammer fra human PVAT til at teste deres tilbøjelighed til at differentiere til en osteogenic, chondrogenic eller adipogenic afstamning. Ved hjælp af farvning teknikker til at definere cellulære engagement i hver slægt, viser vi, at i modsætning til MSC fra menneskelige knoglemarv, stamceller fra menneskelige PVAT ikke var købedygtig skelne mod en osteogenic afstamning (figur 3), men udviser solid adipogenic differentiering. Chondrogenic differentiering kapacitet er sammenlignelige mellem knoglemarven og PVAT-afledte celler. Dette tyder på, at PVAT-afledte stamceller kunne være mere lineage begrænset end knoglemarv MSC eller at PVAT progenitorceller ikke let skelner i osteogenic slægter. Fremtidige studier bør omfatte en undersøgelse af gen- og protein udtryk markører for hver slægt mere kvantitativt evaluere differentiering kapaciteten af PVAT-afledte celler.

Fedt-afledte stamceller har været fokus for regenerativ medicin programmer, på grund af nem adgang og det høje antal celler, der kan udledes af fedtvæv12,13. Inden for de stromale vaskulære brøkdel af fedtvæv er der vaskulære celler, inflammatoriske celler, fibroblaster, preadipocytes og fedt-afledte stamceller. Der er forskelle i befolkningens stamcelle baseret på anatomiske placering af de fedt depot og adipocyt karakteristika14. Vigtigst, synes stamceller fedt-afledt at have kapacitet ikke kun til at differentiere i mesenchymale lineages15, men også potentiale til at vedtage neuronal16,17 og epidermal18 skæbner.

Talrige undersøgelser har fokuseret på stem/stamceller afledt af menneskelige subcutan hvidt fedtvæv, men meget få undersøgelser har behandlet Karakteristik af stamfader populationer i PVAT. Nylige undersøgelser har isoleret adipocyt stamceller fra PVAT omkringliggende mesenteriallymfeknuderne skibe eller torakal aorta af rotten. Disse CD34 +/ CD140a + populationer opdeles i adipocytter, selv om kapaciteten til at udlede andre slægter ikke blev testet19.

Vi kendetegnet for nylig adipøst stamceller afledt af det stromale vaskulære brøkdel af menneskelige PVAT fra patienter med avanceret koronararterie sygdom6. Disse adipøst stamceller var CD73 +, CD105 + og CD140a + og opdeles effektivt i adipocytter med termogeniske egenskaber (UCP1 udtryk)6. I den nuværende arbejde fandt vi en begrænset lineage styrken af de PVAT-afledte celler sammenlignet med knoglemarv-afledte MSC, tyder på en manglende eller minimal befolkning af fedt-afledte stamceller, der har været præget af andre menneskers fedtvæv. Vederlag for denne protokol er den forventede variabiliteten mellem humant prøvemateriale, der kan påvirke antallet af stem/stamceller i eksemplet PVAT og deres kapacitet til at gennemgå differentiering til forskellige slægter. Alder, køn, BMI, medicin og andre kliniske parametre kan påvirke Fænotypen af stamceller inden for PVAT. Således afventer forventede fremtidige ændringer af denne protokol en mere klart defineret stamfader befolkning inden for menneskelige PVAT, og eventuelt ved hjælp af cellen sortering til at isolere bestemte delpopulationer for lineage undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi anerkender assistance forskning navigation på Maine Medical Center for at hjælpe med indkøb af kliniske væv, og histopatologi og histomorfometri Core (støttet af 1P20GM121301, L. Liaw PI) på Maine Medical Center forskning Institut for skæring og farvning. Dette arbejde blev støttet af NIH give R01 HL141149 (L. Liaw).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
  2. Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
  3. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  4. Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
  5. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  6. Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  7. Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
  10. de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
  11. Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
  12. Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
  13. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  14. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
  15. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  16. Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
  17. Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
  18. Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
  19. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).

Tags

Biologi sag 145 menneskelige perivascular fedtvæv adipøst stamceller mesenkymale stamceller chondrogenesis osteogenesis adipogenesis Celledifferentiering hjerte-kar-sygdom
Differentiering kapacitet af menneskelige aorta Perivascular fedt stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M.,… More

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter