Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di testare la capacità di cellule progenitrici derivate dal tessuto adiposo umano perivascolare di differenziarsi in stirpi multipli delle cellule. La differenziazione è stata confrontata alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano, che è noto per differenziare in adipociti, Osteocita e lignaggi di condrociti.
Abstract
Il tessuto adiposo è una ricca fonte di multi-potente cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di differenziarsi in osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi. Adipogenico differenziazione delle cellule progenitrici è un meccanismo importante che guida l'espansione del tessuto adiposo e disfunzione in risposta all'obesità. Capire i cambiamenti al tessuto adiposo perivascolare (PVAT) così è clinicamente rilevanti nella malattia metabolica. Tuttavia, gli studi precedenti sono stati prevalentemente eseguiti in altri animali e il mouse modelli. Questo protocollo utilizza campioni a PVAT toracici umani raccolti da pazienti sottoposti a chirurgia dell'innesto di bypass coronarico. Tessuto adiposo dall'aorta ascendente è stato raccolte e utilizzato per espianto della frazione vascolare stromal. Abbiamo precedentemente confermato la presenza di cellule progenitrici adipose in PVAT umano con la capacità di differenziarsi in contenenti lipidi adipociti. In questo studio, abbiamo analizzato ulteriormente il potenziale di differenziazione delle cellule dalla frazione vascolare stromal, presumibilmente contenente cellule progenitrici multi-potente. Abbiamo confrontato le cellule derivate da PVAT al midollo osseo umano MSC per differenziazione in adipogenico, osteogenica e condrogenica lignaggi. Dopo 14 giorni di differenziazione, macchie specifiche sono state utilizzate per rilevare l'accumulo di lipidi negli adipociti (O olio rosso), i depositi calcificanti in cellule osteogeniche (Alizarin Red.), o di glicosaminoglicani e di collagene nelle cellule condrogenica (Trichrome di Masson). Mentre midollo osseo MSC differenziate in modo efficiente in tutti e tre i stirpi, cellule derivate da PVAT avevano adipogenico e condrogenica potenziale, ma mancava il potenziale osteogenico robusto.
Introduction
Il tessuto adiposo è una ricca fonte di multi-potente cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di differenziarsi in osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi1. Questo tessuto si espande attraverso l'ipertrofia dei adipocytes maturi e de novo differenziazione delle MSC residente ai adipocytes. Tessuto adiposo perivascolare (PVAT) circonda i vasi sanguigni e regola la funzione vascolare2,3. Espansione di PVAT indotta da obesità aggrava patologie cardiovascolari. Mentre il potenziale multipotente di MSC da depositi adiposi sottocutanei umani sono stati ben studiato4,5, nessuno studio hanno espiantati e valutate la capacità di differenziazione delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani, probabile causa di l'invasività degli appalti. Così, l'obiettivo di questo lavoro è fornire una metodologia per explant e propagare cellule progenitrici da umano PVAT aortica da pazienti con malattie cardiovascolari e per testare la loro propensione a differenziare a osteogenica, condrogenica e adipogenico lignaggi. La nostra fonte di PVAT è dal sito dell'anastomosi dell'innesto del bypass su aorta di pazienti obesi sottoposti a chirurgia dell'innesto di bypass coronarico ascendente. PVAT appena isolato è enzimaticamente-dissociata e la frazione vascolare stromal è isolata e propagata in vitro, che ci permette di testare per la prima volta la capacità di differenziazione delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani.
Utilizzando primaria coltura umana PVAT stromal frazione vascolare, abbiamo testato tre saggi progettati per indurre le cellule staminali/progenitrici a differenziarsi verso adipogenico, osteogenica, o condrogenica lignaggi. Il nostro studio precedente identificato una popolazione di CD73 +, CD105 + e cellule PDGFRa + (CD140a) che robustamente possono differenziare in adipociti6, anche se non è stata testata loro multipotenza. PVAT regola direttamente il tono e l'infiammazione vascolare7. La spiegazione razionale per testare il potenziale di differenziazione di questa popolazione cellulare romanzo è cominciare a comprendere l'influenza specializzato di PVAT sulla funzione vascolare e meccanismi di espansione di PVAT durante l'obesità. Questa metodologia migliora la nostra comprensione delle funzioni di cellule progenitrici derivate del tessuto adiposo e ci permette di identificare e confrontare le somiglianze e le differenze delle cellule progenitrici da fonti differenti del tessuto. Costruiamo su approcci stabiliti e convalidati per isolare e differenziare MSC verso diversi lignaggi e ottimizzare le procedure per massimizzare la vitalità delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani. Queste tecniche hanno vaste applicazioni nei settori di sviluppo del tessuto adiposo e ricerca delle cellule staminali e progenitrici.
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Protocol
L'uso di tessuti umani in questo studio è stato valutato e approvato dall'istituzionale Review Board del Maine Medical Center, e tutto il personale ha ricevuto una formazione adeguata prima della sperimentazione.
1. preparati
- Rendere dissociazione buffer mediante ricostituzione 50mg privo di animale collagenasi/dispase ho miscela soluzione con 1 mL di soluzione di lavoro 1 mg/mL di nanopure H2O. preparare aggiungendo 49 mL di alto glucosio DMEM contenente 1% w/v BSA per la collagenosi ricostituita / soluzione di dispase. Conservare le aliquote di lavoro di 5 mL a-20 ° C e riscaldare a 37 ° C, utilizzando una prima vasca di acqua da utilizzare.
- Rendere la soluzione antibiotica aggiungendo 1 mL di soluzione antibiotico/antimicotico di 100 x (concentrazione finale è di 200 unità/mL penicillina, 200 unità/mL di streptomicina e 0,5 µ g/mL fungizone) a 49 mL di HBSS e conservare il ghiaccio.
- Preparare la soluzione di gelatina (0,2% w/v) sciogliendo gelatina 200 mg da pelle bovina in 100 mL di nanopure H2O. Autoclave la soluzione per 20 min e conservare a 4 ° C.
- Preparare 500 mL di coltura PVAT: alto glucosio DMEM/F12 con integratore di glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, completati con 10% FBS e agente antimicrobico 100 µ g/mL (Vedi Tabella materiali).
- Preparare il supporto di induzione adipogenico 50ml: alto glucosio 40,8 mL DMEM, completato con media di 7,5 mL PVAT sviluppo, 500 µ l di 100 x soluzione antibiotico/antimicotico (concentrazione finale è di 100 unità/mL penicillina, 100 unità/mL di streptomicina e fungizone 0,25 µ g/mL), 0,5 mM IBMX (stock di 500 mM in 0.1 M NaOH), desametasone di 1 µM (stock di 1 mM in etanolo), 5 µM rosiglitazone (stock di 5 mM in DMSO), 33 µM biotina (stock di 66 mM in DMSO), insulina di 100 nM (200 Stock in µM in 0,1% di acido acetico) e acido pantotenico 20 µM (stock di 100 mM in H2 O).
- Preparare 50 mL di media di induzione di controllo per il lignaggio adipogenico: 40,8 mL elevati del glucosio DMEM completate con 7,5 mL PVAT crescita media e 500 µ l di penna-strep (stock x 100).
- Preparare il supporto di manutenzione adipogenico 50ml: 41,5 mL elevati del glucosio DMEM completate con 7,5 mL PVAT crescita media dal passaggio 1.3, 500 µ l penna-strep (stock x 100), desametasone 1 µM (stock di 1 mM in EtOH), 33 biotina µM (stock di 66 mM in DMSO), insulina di 100 nM (stock di 200 µM in 0,1% ac Etic acido) e 20 µM l'acido pantotenico (stock di 100 mM in H2O).
- Preparare 500 mL di terreno di crescita per i lignaggi osteogenici e chondrogenic: αMEM alto glucosio supplementato con 10% FBS, glutammina x 1 supplemento (Vedi Tabella materiali) e 5 mL di penna-strep (stock x 100).
- Preparare 50 mL di media di induzione per la linea osteogenica: 50 mL dei media di crescita del midollo osseo MSC completati con 10 nM desametasone e β-glicerofosfato di 10 mM.
- Preparare 50 mL di media di induzione per il lignaggio di chondrogenic: 50 mL dei media di crescita del midollo osseo MSC completati con 100 nM desametasone, 50 µ g/mL sodio ascorbato-2-fosfato e 10 ng/mL TGFβ1. Per le condizioni osteogeniche e condrogenica, i media di crescita basale del midollo osseo MSC servirà come i media non-induzione.
2. il protocollo 1: Cultura umana PVAT cellule dalla frazione vascolare Stromal
Nota: PVAT è resecato dal sito dell'anastomosi innesto sull'aorta ascendente di anestetizzati pazienti sottoposti a procedure di innesto di bypass coronarico. PVAT aortica è collocato in un 15 mL conica contenente 10 mL ghiaccio freddo alto glucosio DMEM F12 e trasferito dalla sala operatoria al laboratorio entro 2 h di resezione. PVAT aortica è tessuto scartato durante la procedura di esclusione ed è stata giudicata come ricerca di soggetti non umani da comitato di revisione interna di Maine Medical Center.
- Questo protocollo è per un pezzo di ~ 500 mg di PVAT umano (circa 3 x 1 x 0,5 cm3). Trasferimento PVAT umano fresco da DMEM a una provetta conica da 50 mL contenente 25 mL di soluzione antibiotica. Incubare con dondolo per 20 min a 4 ° C. Mentre il PVAT è in soluzione antibiotica, scongelare un'aliquota di tampone di dissociazione a 37 ° C.
- Aggiungere 50 µ l di soluzione di antibiotico/antimicotico x 100 a 5 mL di tampone di dissociazione e sterilizzare usando un filtro di siringa 0,22 µm. Aggiungere 1 mL di soluzione di gelatina 1 bene di una piastra a 24 pozzetti. In una cappa a flusso laminare, utilizzare forbici e pinze sterili per trasferire una capsula di Petri sterile PVAT dalla soluzione antibiotica. Aggiungere 1 mL di tampone di dissociazione pre-riscaldato al tessuto e tritare finemente l'intero tessuto in un impasto semiliquido (nessun pezzi più grandi di ~ 2 x 2 mm2) utilizzando pinze sterili e forbici di dissezione.
- Trasferire l'impasto di 1 mL a 4 mL di tampone di dissociazione e incubare la provetta su un fianco in un agitatore orbitale pre-riscaldato 37 ° C a 200 giri/min per 1 h. Dopo 1 h, pezzi di tessuto visibile non sarà presenti, e la soluzione apparirà come una sospensione cellulare nuvoloso.
- Filtrare la soluzione attraverso un colino di cella µm 70 adagiato sulla cima di una provetta conica da 50 mL. Risciacquare il filtro con un ulteriori 10 mL di soluzione antibiotica per acquisire il numero di celle possibili. Non strizzare il filtro.
- Appallottolare le celle per 12 min a 300 x g in una centrifuga di Benna oscillante.
Nota: Dopo centrifugazione, il tubo sarà divisi in uno strato grasso di adipociti, un'interfase e una pallina. Il pellet è la frazione vascolare stromal contenente cellule endoteliali, cellule del sistema immunitario, le cellule del sangue e cellule progenitrici. - Risospendere il pellet in 10 mL di HBSS e centrifugare per 5 minuti a 300 x g. Ripetere questo passaggio per un totale di 2 lavaggi in HBSS. Dopo il lavaggio finale, non lisare cellule rosse del sangue. Ripetuti tentativi con diversi tamponi disponibili sul mercato e tempi di incubazione hanno portato a profonde riduzioni nel collegamento delle cellule progenitrici e vitalità.
- Aspirare la gelatina dalla piastra a 24 pozzetti. Lavare delicatamente il bene 1x con HBSS rimuovere gelatina non associato.
- Risospendere il pellet di stromal frazione vascolare con globuli rossi intatti in 1 mL di crescita media e seme sulla gelatina-rivestito bene. Aggiungere umano FGF2 (risospesi in PBS completati con BSA 0,01% w/v) a una concentrazione finale di 25 ng/mL nel terreno di coltura. Incubare per 24 h a 37 ° C con 5% CO2.
- Il giorno successivo, Rimuovi crescita media e lavaggio pozzetti 5x con HBSS per rimuovere cellule rosse del sangue e le cellule morte. Aggiungere 1 mL di coltura fresca addizionata di 25 ng/mL FGF2.
- Cambiare il supporto ogni 48 h, assicurandosi di completare con 25 ng/mL FGF2 fresco ogni volta.
-
Cellule in genere raggiungere 100% confluenza 7-10 giorni dopo espianto; cellule di passaggio quindi:
- Aspirare la crescita media e lavaggio dello strato monomolecolare 2 x in 1 mL HBSS. Aspirare tutti i HBSS dai pozzetti e aggiungere poche gocce di soluzione di dissociazione delle cellule.
- Toccare e mescolare la piastra e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 5 – 7 minuti sollevare le cellule. Aggiungi ~ 1 mL di terreno di coltura fresco alle cellule indipendente e distribuire 500 µ l 2 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, ogni mezzi di sviluppo contenente 500 µ l e 25 ng FGF2.
- Continuare a espandere le cellule umane PVAT-derivato, come indicato nel passaggio precedente. Ogni passaggio deve essere non maggiore di una divisione di 1:2. Le celle sono attraversate 5 – 7 volte prima di allocare per le analisi di differenziazione.
3. protocollo 2: Colonie di coltura del midollo osseo umano MSC
Nota: Midollo osseo umano MSC sono isolato come descritto8 e archiviati come passaggio precoce congelato scorte nel congelare media (70% FBS 20% basale DMEM e 10% DMSO) presso ~ 100.000 cellule/mL nel liquido N2.
- Rapidamente scongelare una fiala del midollo osseo MSC dal liquido N2 in un bagno di acqua di 37 ° C e la piastra in un pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti contenenti 3 mL di coltura MSC e incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO2.
- Il giorno successivo, terreni di coltura MSC di aspirare e lavare le cellule 3 x in 2 mL di HBSS. Alla confluenza del 100%, crescita media di aspirare e lavare le cellule 3 x in 2 mL di HBSS. Aggiungere 500 µ l/pozzetto cella distacco soluzione e incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 5 min, toccare la piastra per garantire tutte le celle sono sloggiati e distribuire uniformemente il contenuto 2 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti contenente 2 mL MSC crescita media.
- Espandere il midollo osseo umano e MSC PVAT-derivato in parallelo per circa 5 – 7 passaggi o fino a quando una quantità sufficiente per il test è stato raggiunto.
4. protocollo n. 3: Piastra e indurre adipogenico, osteogenica e lignaggi condrogenica
- Numeri di targa appropriato del midollo osseo e PVAT-derivate cellule per pozzetto di una piastra 12-pozzetti e appropriato replica per ogni condizione sperimentale. Per adipogenico e condizioni osteogeniche, ~ 200, 000 – 225.000 cellule/pozzetto sono necessari, per condizioni condrogenica, 150.000 – 175.000 cellule/pozzetto sono necessari.
Nota: Abbiamo eseguito un minimo di N = 3 pozzi replicare per controllo e indotto condizioni per ogni stirpe sperimentale per un totale di 2 indipendenti piste (N = 6 ripetizioni in totale). - Dissociare le cellule da sia la popolazione di cellule progenitrici PVAT umana e la popolazione di MSC del midollo osseo umano utilizzando soluzione di distacco delle cellule e l'incubazione a 37 ° C e 5% CO2 per popolazioni piscina 5 min in fiale conica separato da 15 mL. Girare la fiala giù a 500 x g per 7 min agglomerare le cellule. Risospendere in 1 mL di PBS e utilizzare un emocitometro per stimare il numero di cellulare.
- Le cellule in piatti 12-pozzetti della piastra come indicato al punto 4.1. Fornire piatti separati per condizioni e indotto e indotto non adipogenico, osteogenica, in modo che la condizione di indotto non può essere fissata a un punto precedente del tempo senza interrompere continuando cultura della condizione indotta.
- Aggiungere 1,5 mL di adipogenico e media di induzione osteogenica in ciascun pozzetto della condizione indotta. Aggiungere 1,5 mL di adipogenico e osteogenica non-induzione media in ciascun pozzetto della condizione non-indotta. Iniziare l'incubazione del adipogenico e popolazioni di cellule osteogeniche indotta e indotto non a 37 ° C e 5% CO2.
- Rotazione verso il basso il volume residuo di cellule progenitrici PVAT e midollo osseo umano MSCs per 7 min a 500 x g.
- Determinare il volume necessario per risospendere rimanenti del midollo osseo e cellulari derivate PVAT pellet per ottenere una densità di 100.000 cellule/10 µ l (106 cellule/mL). Risospendere il pellet nel volume calcolato di MSC crescita media per induzione di lignaggio chondrogenic. Spostare delicatamente il volume delle cellule su e giù utilizzando una pipetta per garantire una distribuzione omogenea.
- Dispensare una goccia di 10 µ l della soluzione concentrata di cellule al centro di ciascun pozzetto per formare un micromass di 100.000 cellule. Posizionare 1 mL di sterile H2O nel pozzo adiacente per evitare l'evaporazione. Incubare le colture micromass per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO2 per consentire la micromass da aggregare.
- Dopo 2 ore, aggiungere cautamente media di differenziazione condrogenica addizionati con 10 ng/mL TGFβ1 umano a ciascuno dei pozzi stato indotto. Aggiungere con cautela 1,5 mL dei media non-induzione (midollo osseo MSC crescita media) ai pozzetti indotto non condizione. Utilizzare piatti 12-pozzetti separati per le condizioni indotte e indotto non in modo che la condizione indotto non può essere risolto in un momento precedente.
5. protocollo n. 4: Cultura adipogenico, osteogenica e condrogenica lignaggi per 14 giorni
- Le condizioni indotte e indotto non di tutti e tre i stirpi della coltura per 4 giorni a 37 ° C e 5% CO2, rinfrescante media ogni 2 giorni. Il giorno 4, è necessario modificare la condizione di lignaggio adipogenico indotta dal supporto di induzione per mezzi di manutenzione per il resto del saggio.
- Fissare tutte le condizioni di non-indotta in formalina al 10% per 12 h. Dispose di formalina e lavare tutti i fissi pozzetti 2x in PBS per rimuovere ogni traccia di formalina. Conservare piastre in PBS a 4 ° C fino al trattamento.
- Coltura le condizioni indotte per un totale di 14 giorni, rinfrescante media ogni 2 giorni. Aggiungere TGFβ1 fresco a 10 ng/mL concentrazione finale con ogni aggiornamento dei media di induzione condrogenica. Continuare a coltivare il lignaggio adipogenico nei mezzi di manutenzione adipogenico e linea osteogenica induzione media, rinfrescante ogni 2 giorni. Al giorno 14, Difficoltà tutto indotte condizioni per 12 h in formalina al 10% per la colorazione.
- Raschiare o versare il micromass nella condizione condrogenica indotto in una cassetta per l'incorporamento. Disidratare micromass in una serie di bagni di alcool sempre più concentrato per 5 min, cominciando al 70%, quindi 80%, due volte nel 95% e due volte più in alcool assoluto. Posizionare la cassetta in un agente di disalcoolazione e infine incorporare quindi la cassetta in cera di paraffina per sezionamento e colorazione.
6. protocollo n. 5: Colorazione adipogenico condizione con olio rosso O
- Preparare soluzione stock Oil Red O sciogliendo 350mg di Oil Red O in 100 mL di isopropanolo 100%. Mescolare per 2 h con ancoretta e vuoto attraverso un filtro da 0,2 µm. Soluzione madre può essere conservati al buio a temperatura ambiente per 1 anno.
- Preparare Oil Red O soluzione di lavoro mescolando 3 parti di soluzione di riserva a 2 parti diH20 (ad es. 60 mL della soluzione madre a 40ml diH20). La concentrazione finale di Oil Red O della soluzione di lavoro è di 2,1 mg/mL.
- Rimuovere tutto il fluido da pozzi. Lavare ogni bene 2x con 60% isopropanolo, facendo attenzione a rimuovere completamente tutta l'acqua dai lati dei pozzi. Aspirare il 60% isopropanolo e aggiungere rapidamente la soluzione di lavoro Oil Red O senza toccare le pareti dei pozzetti per coprire il fondo. È fondamentale che questo passaggio è fatta rapidamente quindi pozzetti non a secco.
- Una volta aggiunto l'Oil Red O, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con dolce dondolio.
- Rimuovere tutte le Oil Red O e immediatamente aggiungere acqua distillata H2O. Wash con acqua distillata di H2O per 10 m cominciare a rimuovere o non associato olio rosso. Dopo 10 min, aspirare Oil Red O e ripetere la procedura di lavaggio 3 x.
- Una volta che il lavaggio è completo, aggiungere PBS e le celle di immagine. Conservare cellule marcate in PBS a 4 ° C.
7. protocollo n. 6: Macchiatura osteogenica condizione con rosso alizarina
- Rimuovere tutto il liquido da ogni pozzetto. Aggiungere il volume appropriato di soluzione di macchia rosso alizarina 2% ad ogni pozzetto (1,5 mL per pozzetto per un piatto di 12-pozzetti) e inclinare delicatamente il piastra lato a lato fino a quando la soluzione copre completamente il fondo del pozzo.
- Incubare per 15 min a temperatura ambiente. Rimuovere rosso alizarina dai pozzi. Sciacquare delicatamente ogni ben quattro volte con acqua distillata H2O, fare attenzione a non rimuovere i cristalli di calcio. Lasciare per asciugare.
8. protocollo 7: Colorazione Chondrogenic condizione con Masson tricromica
-
Cuocere in forno diapositive in forno secco a 60 ° C per 30 min. sezioni Deparaffinize e idrato di acqua distillata.
- Per reidratare, mettere i vetrini in tre 5 min le incubazioni con agenti disalcoolazione, seguiti da 5 min incubazioni in decrescente concentrazioni di alcol come segue: due al 100% (etanolo assoluto), due al 95% di alcol, due a 80%, due al 70% e infine due in acqua distillata H2O. diapositive può rimanere in H2O mentre viene preparato fissativo del Bouin.
- Posto 40 mL di fissativo del Bouin in un barattolo di plastica coplin microwavable (scoperto). Forno a microonde in alto per portare la temperatura a 55 ° C. Porre il vetrino nella soluzione riscaldata per 20 min; Lasciate riposare sul bancone rivestito. Lavare in acqua corrente per 10 minuti o fino a quando tutto il colore giallo scompare.
- Macchia sezioni in ematossilina di Weigert per 10 min. lavare in acqua corrente per 10 min.
- Macchia di sezioni in soluzione scarlatto Fucsina acida di Beibrich per 10 min lavaggio 3 x 10 min in acqua di rubinetto. Diapositive in soluzione di acido fosfotungstico/fosfomolibdico per 10 min a mordente. Non risciacquare.
- Posizionare le diapositive direttamente nella soluzione dell'anilina blu per 10 minuti risciacquare con due brevi tuffi nell'acqua del rubinetto.
- Mettere i vetrini in soluzione di acido acetico 1% per un minimo di 3 a 5 lavare in acqua di rubinetto per un minimo di 1 posto in etanolo al 95% per 1 min. disidratare come indicato al punto 5.4 e montaggio con resina sintetica.
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Representative Results
Isolamento della frazione stromale vascolare da PVAT umano
Figura 1A Mostra un disegno schematico della regione anatomica dove il PVAT sovrastante l'aorta ascendente è stata ottenuta. Precedentemente abbiamo descritto le popolazioni di pazienti sottoposti a bypass coronarico da cui questi campioni erano derivate6. Figura 1B Mostra un esempio della PVAT umana ottenuta dopo la chirurgia. Figura 1 Mostra una sezione rappresentativa di PVAT tessuto macchiata con colorazione tricromica di Masson. Figura 1 è un micrografo di contratto fase mostrando una popolazione di cellule stromali derivate da PVAT durante la fase di espansione prima della differenziazione. Le cellule possono essere espansa e congelate per un uso futuro. Le cellule sono congelate in genere ad una densità di 2,5 x 105 cellule/mL in un media composto da 70% FBS, 20% basale (antibiotico gratuito) DMEM F12 e 10% DMSO in una criocamera isopropanolo a-80 ° C per 24 h e spostato alla fase liquida di un congelatore di2 N liquido per lungo-t deposito di ERM.
Adipogenico differenziazione
Gli studi sono stati effettuati in parallelo con MSC derivanti dal midollo osseo umano (Figura 2AB) e cellule progenitrici derivate PVAT (Figura 2D). I pannelli a sinistra della Figura 2 Visualizza la condizione di non-indotta, dove nessun accumulo di lipidi è evidente. I pannelli di destro mostrano cellule seguendo la differenziazione degli adipociti e colorazione dei lipidi neutri con olio rosso O. Mentre il grado di differenziazione in cellule aortiche umane PVAT-derivato è più robusto, entrambe le fonti di cellule umane ha esibito la capacità di differenziarsi verso il lignaggio adipogenico.
Differenziazione osteogenica
Il protocollo di differenziamento osteogenico è stato utilizzato per MSC umane derivate da midollo osseo (Figura 3A– C) e cellule derivate da PVAT (Figura 3D– F). Le cellule non-indotta (Figura 3AD) non hanno macchiato con colore rosso di alizarina. Dopo il protocollo di differenziazione osteogenica, MSC umana ha sviluppato i noduli calcificati che macchiati con colore rosso di alizarina (Figura 3B– C), mentre cellule aortiche umane PVAT-derivato non ha fatto (Figura 3E– F). Questi dati indicano che la nostra preparazione delle cellule dalla frazione vascolare stromal dell'essere umano PVAT mancanza significativo numero di cellule progenitrici con la capacità di subire l'osteogenesi. A seconda del corso di studio e tempo di differenziazione, si consiglia di follow-up tonalità standard con rilevazione di marcatori molecolari che definiscono l'impegno linea osteogenica (RUNX2, osterix, fosfatasi alcalina) o osteoblasti (osteopontina, osteocalcina, fosfatasi alcalina, BAP1).
Differenziazione chondrogenic
Cellule derivate da entrambi del midollo osseo umano MSC (Figura 4A) e umano PVAT (Figura 4B) visualizzare caratteristiche caratteristiche di differenziazione condrogenica, con l'accumulazione del collagene abbondanti nel micromass. Micromasse formata dal midollo osseo umano MSC e aortiche PVAT-derivate cellule inoltre hanno esibito abbondante accumulo di glicosaminoglicani (blu) come indicato dalla macchiatura Alcian blu (Figura 4– D, rispettivamente). Morfologicamente, strutture simili a lacune sono state rilevate con le cellule che si siede nelle cavità che circondano da deposizione di collagene (Figura 4, frecce). A seconda del corso di studio e tempo di differenziazione, l'individuazione di marcatori specifici condrogenica (Aggrecano, collagene di tipo II, osteonectin, Sox9) è utile.
Figura 1: caratteristiche morfologiche di umana PVAT. (A) Cartoon raffigurazione dell'aorta umana (rosso) con circostante PVAT (giallo). Freccia indica aorta ascendente. (B), un pezzo di 480 mg di PVAT aortica umana da un paziente di CABG in DMEM prima della dissociazione. Colorazione tricromica di Masson (C) di umano PVAT di paraffina-incastonato formalina-fisso (marrone scuro/nero = nuclei, blu/viola = tessuto connettivo, rosa = citoplasma; Nota, RBC appaiono rosa-rossastro. (D) immagine rappresentativa delle cellule PVAT-stromal espiantate a 7 giorni nella cultura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: differenziazione adipogenico. (A) fase microscopia del midollo osseo umano MSC nella condizione indotto non mostra nessuna prova di differenziazione. (B) fase microscopia del midollo osseo umano MSC nella condizione indotta adipogenico Mostra alcune differenziazione e immobilizzazione dei lipidi neutri, macchiato con Oil Red O dopo 14 giorni. (C) fase microscopia delle cellule umane di derivati PVAT aortiche nella condizione adipogenico indotto non mostra nessuna prova di differenziazione. (D) fase microscopia delle cellule umane di derivati PVAT aortiche nella condizione indotta adipogenico mostra differenziazione robusta e l'immobilizzazione dei lipidi neutri, macchiato con Oil Red O dopo 14 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Differenziamento osteogenico. (A) fase microscopia del midollo osseo umano MSC nella condizione osteogenica indotto non mostra nessuna prova di differenziazione verso una linea osteogenica. (B) fase microscopia del midollo osseo umano MSC nella condizione indotta dopo 14 giorni nella cultura Mostra prova di differenziazione e la formazione di depositi di calcio macchiati con colore rosso di alizarina (frecce). (C), un'immagine del bene che contiene il midollo osseo umano MSC nella condizione osteogenica indotto dopo colorazione con rosso alizarina indica il deposito del calcio abbondanti, suggerendo successo differenziazione verso una linea osteogenica (frecce, deposito del calcio). (D) fase microscopia delle aortiche PVAT-derivate cellule umane nella condizione osteogenica indotto non presenta alcuna indicazione di differenziazione verso una linea osteogenica. (E) fase microscopia delle aortiche PVAT-derivate cellule umane nella condizione osteogenica indotta dopo 14 giorni nella cultura mostra nessuna prova di differenziazione verso una linea osteogenica o la deposizione di calcio quando macchiati con colore rosso di alizarina, solo colorazione aspecifica. (F), un'immagine del bene che contiene le cellule umane di derivati PVAT aortiche nella condizione osteogenica indotta seguente colorazione con rosso alizarina Mostra solo non specifico di colorazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Differenziazione Chondrogenic. (A, B) Microscopia di una sezione del micromass formata da midollo osseo umano MSC (A) o PVAT aortico umano cellule progenitrici (B) nella condizione indotta condrogenica dopo 14 giorni nella cultura e successivamente colorati con Trichrome di Masson, che indica significativa deposizione di collagene (blu) e suggerisce di successo differenziazione verso un lignaggio di chondrogenic. (C, D) Microscopia ottica di una sezione della micromass formata da midollo osseo umano MSC (C) o PVAT aortica umana cellule progenitrici (D) nella condizione indotta condrogenica dopo 14 giorni nella cultura e successivamente colorati con Alcian blu, che indica la deposizione di acido proteoglicani (ad es. glicosaminoglicani) come sono in genere presenti nella cartilagine. Colorante di contrasto, nucleare rosso veloce; frecce, lacune-come le strutture. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Cellule progenitrici adipose da depositi differenti variano ampiamente nel fenotipo e differenziazione potenziali9. Coltura progenitori PVAT-derivati da un singolo donatore paziente in simultanea induzione giù tre stirpi differenti, adipogenico, osteogenica e condrogenica, permette un'indagine ben controllata della capacità pluripotenti di questo romanzo popolazione di cellule progenitrici. La metodologia descritta in questo rapporto può essere utilizzata per verificare la capacità di differenziazione delle cellule progenitrici da PVAT umana e capire la loro funzione nel regolare il tono vascolare e patologie PVAT. Alcuni vantaggi di questa tecnica sono la semplicità e uso di tessuto umano primario dall'arteria coronaria bypass pazienti, consentendo in tal modo l'indagine della funzione PVAT progenitrici delle cellule da pazienti con gravi malattie cardiovascolari. Tuttavia, espianti di un pezzo di 500 mg di tessuto in genere resa < aderente 1000 cellule e pertanto necessitano di 5 – 7 passaggi per ottenere i numeri sufficienti, evidenziando un importante avvertimento a questo approccio. Fondamentale per il successo degli esperimenti di differenziazione di tri stirpe è la qualità del explant iniziale delle cellule da donatori PVAT. È essenziale per tritare finemente il tessuto accuratamente prima della dissociazione enzimatica. Inoltre, a differenza di altri protocolli di espianto, abbiamo trovato una perdita drammatica di numero delle cellule, redditività e qualità complessiva quando il buffer di lisi delle cellule di anima rosse è stato utilizzato prima della placcatura. Al contrario, è consigliabile per piastra intera frazione vascolare stromal (tra cui globuli rossi). Dopo 24 h, cellule aderenti saranno hanno collegato e non lisati di cellule di anima rosse può essere rimosso attraverso ripetuti lavaggi con HBSS. Passaggio delle cellule stromal PVAT-derivato deve essere non maggiore di 1:2 divisioni. Abbiamo osservato una riduzione nel tasso di crescita quando le cellule sono state divise 1:3 o maggiore.
Il componente più difficile del test di differenziazione di trilineage è la condizione di condrogenica, in quanto richiede un metodo meno comune di coltura le cellule in un "micromass" ed istologici incorporamento e sezionamento. Deve prestare attenzione alla piastra correttamente la goccia di 10 µ l di 100.000 cellule e non disturbare la messa sull'aggiunta di terreno di coltura. Abbiamo trovato la variazione tra i test circa se o non il micromass rimase aderito alla piastra o sospese nel mezzo. Anche quando la massa non è rimasto aderita, la vitalità delle cellule e la struttura di micromass rimasto coerenza.
Cellule staminali o progenitrici all'interno del microambiente vascolare sono responsabili della riparazione del tessuto in risposta alla lesione o malattia. Più ben caratterizzati sono popolazioni che derivano dai compartimenti pericyte/adventitial, anche se c'è ancora polemica sul fatto che c'è una standardizzata identificazione molecolare di queste popolazioni in esseri umani10,11 . In questo protocollo, studiamo una popolazione di cellule progenitrici specificamente derivata da umano PVAT per testare la loro propensione a differenziare un Lineage osteogenico, chondrogenic o adipogenic. Utilizzando tecniche di colorazione per definire cellulare impegno per ogni stirpe, dimostriamo che a differenza di MSC da midollo osseo umano, cellule progenitrici da PVAT umano non erano in grado di differenziarsi verso una linea osteogenica (Figura 3) ma presentano robusti adipogenico differenziazione. La capacità di differenziazione condrogenica è paragonabile tra midollo osseo e cellule derivate da PVAT. Questo suggerisce che le cellule progenitrici derivate PVAT potrebbero essere lignaggio più ristretto di midollo osseo MSC o che i progenitori PVAT non prontamente differenziarsi in lignaggi osteogenici. Gli studi futuri dovrebbero includere un'indagine di espressione genica e proteica dei marcatori per ogni stirpe di più quantitativamente valutare la capacità di differenziazione delle cellule PVAT-derivate.
Cellule staminali adiposo-derivate sono stati un fuoco per applicazioni di medicina rigenerativa, a causa di facile accesso e l'elevato numero di cellule che possono essere derivate dal tessuto adiposo12,13. All'interno della frazione stromale vascolare del tessuto adiposo, ci sono cellule vascolari, cellule infiammatorie, fibroblasti, preadipocytes e cellule staminali adiposo-derivate. Ci sono differenze nella popolazione delle cellule staminali sulla base della posizione anatomica del adiposo depot e del adipocyte caratteristiche14. La cosa più importante, le cellule staminali adiposo-derivate sembra avere la capacità non solo di differenziarsi in lignaggi mesenchymal15, ma anche il potenziale di adottare un neurone16,17 ed epidermico18 destini.
Numerosi studi si sono concentrati sulle cellule staminali/progenitrici derivate da tessuti adiposi sottocutanei umani bianchi, ma molto pochi studi hanno affrontato caratteristiche delle popolazioni di cellule progenitrici in PVAT. Recenti studi hanno isolato le cellule progenitrici del adipocyte da circostanti vasi mesenterici PVAT o aorta toracica del ratto. Questi CD34 + CD140a + popolazioni differenziati in adipociti, anche se non era la capacità di derivare altri lignaggi testato19.
Abbiamo recentemente caratterizzato cellule progenitrici adipose derivate dalla frazione vascolare stromal di umana PVAT dai pazienti con di malattia dell'arteria coronaria avanzato6. Queste cellule progenitrici adipose sono state CD73 +, CD105 + e CD140a + e in modo efficiente differenziano in adipociti con caratteristiche termogenico (espressione di UCP1)6. Nel lavoro attuale, abbiamo trovato una potenza limitata lineage delle cellule derivate PVAT rispetto alle MSC derivate da midollo osseo, suggerendo una mancanza o minima popolazione di cellule staminali adiposo-derivate che sono stati caratterizzati da altri tessuti adiposo umani. Una considerazione per questo protocollo è la variabilità prevista tra esemplari umani, che possono influenzare il numero di cellule staminali/progenitrici entro il campione PVAT e la loro capacità di subire la differenziazione di diverse linee. Età, sesso, BMI, farmaci e altri parametri clinici probabile influenzano il fenotipo delle cellule progenitrici all'interno PVAT. Così, attesi future modifiche del presente protocollo attendono una più popolazione progenitrici chiaramente definiti all'interno di PVAT umano e possibilmente utilizzando l'ordinamento delle cellule per isolare specifiche sottopopolazioni per studi di lignaggio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo l'assistenza di ricerca navigazione a Maine Medical Center per assistere l'assicurato nella ricerca del tessuto clinico, istopatologia e istomorfometria Core (supportato da 1P20GM121301, L. Liaw PI) a Maine Medical Center Research Istituto per sezionamento e colorazione. Questo lavoro è stato supportato da NIH concedere HL141149 R01 (Liaw L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| Antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| Biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| Bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4 °C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| Bell strainer (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| Gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| Insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| Pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| Penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| Rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
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