Summary
该方案的目的是测试从人类血管周围脂肪组织衍生的祖细胞分化为多个细胞谱系的能力。将分化与人骨髓间充质干细胞进行了比较, 骨髓间充质干细胞被认为分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞谱系。
Abstract
脂肪组织是多功能间充质干细胞 (msc) 的丰富来源, 能够分化为成骨、脂肪生成和软骨生谱系。祖细胞的脂肪分化是推动脂肪组织扩张和肥胖功能障碍的主要机制。因此, 了解血管周围脂肪组织 (pvat) 的变化在临床上与代谢疾病有关。然而, 以前的研究主要是在老鼠和其他动物模型中进行的。该方案使用从冠状动脉旁路移植术患者中采集的人体胸腔 pvat 样本。从上升主动脉收集脂肪组织, 用于解释间质血管部分。我们先前证实了脂肪祖细胞在人 pvat 中的存在, 有能力分化为含有脂质的脂肪细胞。在这项研究中, 我们进一步分析了细胞从基质血管部分的分化潜力, 大概包含多能祖细胞。我们比较了 pvat 衍生细胞与人骨髓 msc 的分化, 分为脂原、成骨和软骨源谱系。经过14天的分化, 特定的污渍被用来检测脂肪细胞 (油红色 o) 的脂质积累, 成骨细胞 (alizarin 红) 的钙沉积, 或糖胺多糖和软骨细胞的胶原蛋白 (马松的三丁目)。骨髓 msc 有效地分化为所有三个谱系, pv 衍生细胞具有脂原和软骨生成的潜力, 但缺乏强大的成骨潜力。
Introduction
脂肪组织是多功能间充质干细胞 (msc) 的丰富来源, 能够分化为成骨、脂肪生成和软骨生谱系 1。该组织通过成熟脂肪细胞的肥大和常驻 msc 向脂肪细胞的新分化而扩张。血管周围脂肪组织 (pvat) 包围血管, 调节血管功能2,3。肥胖引起的 pvat 扩张加剧了心血管疾病。虽然人类皮下脂肪库中 msc 的多能潜力已经得到了 4,5的很好的研究, 但没有任何研究解释和评价人 pv 衍生祖细胞的分化能力, 这可能是由于采购的侵入性。因此, 这项工作的目的是提供一种方法, 以外植体和繁殖祖细胞从人主动脉 pvat 从心血管疾病患者, 并测试他们的倾向, 以分化为成骨性, 软骨原生, 和脂原系。我们的 pvat 来源来自正在接受冠状动脉旁路移植手术的肥胖患者主动脉上旁路移植术吻合部位。新鲜分离的 pvat 是酶样离解和间质血管部分在体外分离和繁殖, 使我们能够首次检测人 pvat 衍生祖细胞的分化能力。
我们使用原代培养的人 pvat 基质血管部分, 我们测试了三种检测方法, 旨在诱导干细胞祖细胞分化为脂肪原、成骨或软骨生谱系。我们先前的研究确定了 cd73 +、cd105 + 和 pdgfra + (cd140a) 细胞的数量, 这些细胞可以有力地分化为脂肪细胞6,尽管它们的多效力没有经过测试。pvat 直接调节血管张力和炎症7。测试这种新型细胞群体分化潜力的基本原理是开始了解 pvat 对血管功能的特殊影响, 以及 pvat 在肥胖期间扩张的机制。这种方法增强了我们对脂肪组织衍生祖细胞功能的理解, 使我们能够识别和比较来自不同组织来源的祖细胞的异同。我们建立在既定和经过验证的方法, 以分离和区分 msc 对不同的血统和优化程序, 以最大限度地提高人类 pv 衍生祖细胞的生存能力。这些技术在干细胞和祖细胞研究和脂肪组织发育领域有着广泛的应用。
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Protocol
这项研究中人体组织的使用情况得到缅因州医疗中心机构审查委员会的评估和批准, 所有人员在实验前都接受了适当的培训。
1. 准备工作
- 通过将50毫克无动物性胶原酶/分离酶与 1 ml 纳米 h 2 o混合物 i 溶液制成离解缓冲. 在重组后的胶原蛋白中加入含有 1% w/v bsa 的高 dmem 的 49 ml, 制备 1 mg/ml 工作溶液。溶解溶液。使用前使用前使用水浴, 将5毫升工作的等价物存放在-20°c, 并加热至37°c。
- 添加100μnomicic:arimeycyinycyesyesky 溶液1毫升 (最终浓度为 200 units/青霉素、200 unitsl 链霉素和 0.5μml fungizone), 使 hbss 的49毫升为 4 9 毫升, 并储存在冰上。
- 在100毫升的纳米 h2o. 高压灭菌器中溶解200毫克明胶, 制备明胶溶液 (0.2%w/v), 溶液 20分钟, 并存放在4°c。
- 制备500毫升的 pvat 生长介质: 高葡萄糖 dmem/f12, 补充谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠, 辅以10% 的 fbs 和100μgml 抗菌剂 (见材料表)。
- 制备50毫升脂原诱导介质: 40.8 ml 高血糖 dmem, 辅以 7.5 ml pvat 生长介质, 500μl 的100x 抗生素/抗生素抗真菌溶液 (最终浓度为 100 units/青霉素, 100 unitsl 链霉素和0.25 μgml fungizone),0.5 mm ibmx (0.1 m nM 中的 500 mm 库存), 1μm 地塞米松 (乙醇库存 1 mm), 5μm robherglazone (dmso 中的 5 mm 库存)、33μm 生物素 (dmso 中的 66 mm 库存)、100 mm 胰岛素 (0.1% 醋酸中的200μm 库存) 和20μm 泛酸 (h 2 中的 100 mm 库存)o)。
- 为脂原系制备50毫升的控制诱导介质: 40.8 ml 高血糖 dmem, 辅以 7.5 ml pvat 生长介质和500μl 的笔链球 (100x 库存)。
- 准备 50 毫升脂质维护介质 : 41 . 5 ml 高血糖 dmem , 再加上步骤 1 . 3 中 7 . 5 ml pvat 生长介质 , 500μl链球菌 ( 100x 库存 ) , 1μm地塞米松 ( etoh 中的 1 mm 库存 ) 、33μm生物素 ( dmso 中的 66 mm 库存 ) 、 100 nm 胰岛素 ( 0 . 1% 交流中的200μm库存 )和20μm 泛酸 (h2o 中的 100 mm 库存).
- 为成骨和软骨源谱系准备500毫升生长介质: 高糖αmem 补充 10% fbs, 1x 谷氨酰胺补充剂 (见材料表), 和5毫升的笔链球 (100x 股票)。
- 为成骨系准备50毫升诱导培养基:50 毫升的骨髓 msc 生长介质, 辅以 10 nm 地塞米松和 10 mm β-甘油磷酸盐。
- 为软骨源性谱系准备50毫升诱导培养基:50 毫升的骨髓 msc 生长介质, 辅以 100 nm 地塞米松、50μgml 抗坏血酸钠-2-磷酸酯和 10 ngml tgml tgfβ1。对于成骨和软骨病, 基础骨髓 msc 生长介质将作为非诱导介质。
2. 议定书 1: 从基质血管组分培养人 pvat 细胞
请注意:pvat 从接受冠状动脉旁路移植术的麻醉病人的上行主动脉上的移植吻合部位切除。主动脉 pvat 被放置在一个15毫升的锥形含有10毫升冰冷高葡萄糖 dmem f12, 并从手术室转移到实验室在2小时内的切除。主动脉 pvat 是在旁路手术中丢弃的组织, 并已被视为非人类的主题研究, 由缅因州医疗中心的内部审查委员会。
- 该协议适用于 ~ 500 毫克的人 pvat (约 3 x 1 x 0.5 厘米 3)。将新鲜的人 pvat 从 dmem 转移到含有25毫升抗生素溶液的50毫升锥形管中。在4°c 下摇晃20分钟。当 pvat 处于抗生素溶液中时, 在37°c 时解冻分离缓冲液。
- 在5毫升离解缓冲液中加入50μl 的100μl 抗生素-抗真菌溶液, 并使用0.22μm 注射器过滤器进行消毒。在24孔板的1井中加入1毫升的明胶溶液。在层流罩中, 使用无菌钳和剪刀将 pvat 从抗生素溶液转移到无菌培养皿中。在组织中加入1毫升预热分离缓冲液, 并使用无菌钳和解剖剪刀将整个组织细切成浆液 (不超过 2 x 2 毫米2的块)。
- 将 1 ml 浆料转移到4毫升离解缓冲液中, 并在预热的37°c 轨道振动台中孵育管, 每小时200转1小时。1小时后, 将不会出现可见的组织块, 溶液将显示为混浊细胞悬浮液。
- 通过在50毫升锥形管上设置的70μm 电池过滤器过滤溶液。用额外的10毫升抗生素溶液冲洗过滤器, 以捕获尽可能多的细胞。不要挤压过滤器。
- 在一个晃动的桶式离心机中, 以 300 x克的速度将细胞颗粒在一起12分钟。
请注意:离心后, 管将被分离成脂肪顶层的脂肪细胞, 一个周期, 和一个颗粒。颗粒是包含内皮细胞、免疫细胞、血细胞和祖细胞的基质血管部分。 - 在 300 x 克的情况下, 将颗粒在 hbss 和离心机的10毫升中重新使用5分钟。对 hbss 中总共洗2次操作重复此步骤。最后清洗后, 不要将红血球裂解。反复尝试与几个商业上可用的缓冲和孵化时间导致明显减少祖细胞依恋和生存能力。
- 从24孔板中吸收明胶。用 hbss 轻轻清洗1x 井, 去除未结合的明胶。
- 将完整的红血球在1毫升的生长培养基和种子中复制基质血管分数颗粒, 并将其保存在涂膜孔上。将人 fgf2 (重新悬浮在 pbs 中补充 0.01% bsa wv) 添加到培养基中的最终浓度为 25 ngml。用5% 的 co2 在37°c 下孵化 24小时.
- 第二天, 用 hbss 去除生长介质, 清洗5x 井, 去除红血球和死细胞。加入1毫升新鲜的生长介质, 辅以 25 ngml fgf2。
- 每48小时更换一次介质, 确保每次补充 25 ngml 新鲜 fgf2。
-
细胞在外植体后7-10 通常达到100% 融合;通过细胞, 然后:
- 在1毫升 hbss 中吸入生长介质和洗涤单层2倍。从井中吸收所有 hbss, 并添加几滴细胞离解溶液。
- 多次轻拍和旋涡, 用5% 的 co2 在37°c 下孵育 5-7分钟, 以提升细胞. 在分离细胞中加入 ~ 1 毫升的新鲜培养基, 并将500μl 分配到24孔板的2口井中, 每口都含有500μl 生长介质和25纳克 fgf2。
- 如上一步所述, 继续扩大人类 pv 衍生细胞。每个段落不应大于 1: 2 拆分。细胞在分配分化检测之前被传代5-7 次。
3. 议定书 2: 培养人类骨髓 msc 殖民地
请注意:人骨髓 msc 如所述,如所述, 在液体 n 2 中被分离并作为早期通道冷冻储存在冷冻培养基中 (70% fbs 20% 的基础 dmem 和 10% dmso).
- 在37°c 的水浴和板中, 从 n2 液体中快速解冻一小瓶骨髓 msc, 将其解冻到含有3毫升 msc 生长介质的6井培养板的井, 并在37°C 和 5% co 2 处孵育一夜。
- 第二天, 吸入 msc 培养基, 在 hbss 2 毫升中清洗细胞3倍。在100% 融合时, 吸入生长培养基, 在 hbss 2 毫升中清洗细胞3倍。加入 500μl/井细胞分离溶液, 在37°c 和 5% co2 下孵育 5分钟, 点击板, 确保所有细胞被移出, 并将含量均匀地分配到含有2毫升 msc 生长介质的6井板的2口井。
- 将人骨髓和 pvat 衍生的 msc 平行展开大约5-7 通道, 或直到达到足够的检测量。
4. 协议 3: 板和诱导脂肪生成, 骨质生, 软骨原系
- 板适当数量的骨髓和 pv 衍生细胞每孔12孔板和适当的复制为每个实验条件。对于脂肪生成和成骨条件, 需要 ~ 200000–225 000 细胞/井, 对于软骨生条件, 需要15000–175000细胞井。
请注意:我们运行了至少 n = 3 复制井, 用于控制每个实验谱系的诱导条件, 总共运行 2次 (n = 6个复制总数)。 - 利用细胞脱离溶液和37°c 和 5% co2 孵育5分钟池群将人类 pvat 祖细胞群和人骨髓 msc 群体中的细胞分离到单独的15毫升锥形小瓶中。将小瓶向下旋转, 在 500 x克下7分钟, 以颗粒细胞。在1毫升的 pbs 中重新移植, 并使用血细胞计估计细胞数量。
- 如步骤4.1 所示, 将细胞放在12井菜品中。为诱导和非诱导的脂原、成骨和条件提供单独的菜肴, 以便在不干扰诱导条件的持续培养的情况下, 在较早的时间点固定非诱发条件。
- 在诱导条件下的每口井中加入 1.5 ml 的脂原和成骨诱导培养基。在非诱导条件下的每口井中加入 1.5 ml 的脂原和成骨非诱导培养基。在37°c 和 5% co2 条件下开始培养脂肪原生、成骨诱导和非诱导细胞群。
- 将人 pvat 祖细胞和人骨髓骨髓 mscs 的剩余体积向下旋转 7分钟, 在 500 x克.
- 确定重新悬浮剩余骨髓和 pv 衍生细胞颗粒所需的体积, 以达到 100, 000 细胞的密度 10μl (106 细胞)。在 msc 生长介质的计算量中再利用颗粒进行软骨源诱导。使用管道轻轻上下移动细胞的体积, 以确保均匀分布。
- 将浓缩细胞溶液的10μl 液滴滴入每口井的中心, 形成一个由 100, 000个细胞组成的微囊。将1毫升无菌 h2o 放置在相邻的井中, 以防止蒸发.在37°c 和 5% co2 条件下培养微囊培养 2小时, 使微屁股聚集 。
- 2小时后, 小心地在每个诱导条件井中加入 10 ngml 人 tgfβ1的软骨分化培养基。在非诱导条件井中小心加入 1.5 ml 的非诱导介质 (骨髓 msc 生长介质)。对于诱导和非诱发条件, 使用单独的12孔板, 以便在较早的时间点固定非诱发条件。
5. 协议 4: 培养致病性、成骨性和软骨源性14天
- 在37°c 和 5% co2 条件下, 将所有三个系的诱导和非诱导条件培养 4天,每2天更新一次培养基。第4天, 在试验的剩余时间内, 将诱导的脂原谱系条件从诱导培养基改为维持介质。
- 将10% 福尔马林中的所有非诱导条件固定在12小时内, 在 pbs 中处理并清洗所有固定井 2倍, 以去除福尔马林的所有痕迹。在加工前, 将板材存放在 pbs 中。
- 培养诱导条件总共 14天, 每2天刷新一次媒体。在 10 ngml 的最后浓度下加入新鲜的 tgfβ1, 每次刷新软骨原诱导培养基。继续培养脂肪原维持介质和成骨系诱导培养基中的脂原谱系, 每2天清爽一次。在第14天, 将所有诱导条件固定在10% 福尔沙林中, 为染色提供12小时的诱导条件。
- 将诱导软骨生的情况下的微屁股刮成或倒进盒式磁带中嵌入。在一系列日益集中的酒精浴池中脱水 5分钟, 从70% 开始, 然后是 80%, 95%, 绝对酒精含量增加两倍。将盒式磁带放入脱碳剂中, 最后将盒式磁带嵌入石蜡中, 以便进行切片和染色。
6. 议定书 5: 用油红 o 染色脂肪生成条件
- 通过在100% 异丙醇的100毫升中溶解350毫克的油红色 o 来制备油红色 o 库存溶液。与搅拌棒混合 2小时, 并通过0.2μm 过滤器进行真空。库存溶液可在室温下在黑暗中储存1年。
- 通过将3个部分的库存溶液混合到 2份 dih 2 0 (例如,库存溶液的 60 ml 至 40 ml dih20) 来制备油红色 o 工作溶液。工作溶液中油红 o 的最终浓度为 2.1 mg/ml。
- 从井中取出所有液体。用60% 异丙醇清洗每口 2 x 的井, 确保完全去除井边的所有水。吸出60% 异丙醇, 快速添加油红 o 工作溶液, 而无需接触井壁覆盖底部。关键是要迅速完成这一步骤, 这样井就不会干涸。
- 一旦油红色 o 被添加, 孵育10分钟在室温与温和的摇晃。
- 取出所有油红色 o, 并立即加入蒸馏的h2o 与蒸馏的 h2 o10m, 开始去除未粘结的油红色 o。10分钟后, 吸气油红色 o, 并重复清洗程序3倍。
- 清洗完成后, 添加 pbs 并对细胞进行成像。将染色细胞存放在4°c 的 pbs 中。
7. 议定书 6: 用阿利扎林红染色成骨条件
- 从每口井中取出所有液体。在每口井中加入适当体积的 2% Alizarin 红色染色溶液 (12 孔板每口井 1.5 ml), 并轻轻倾斜板的一侧到另一侧, 直到溶液完全覆盖井底。
- 在室温下孵化15分钟。从井里取出阿利扎林红。用蒸馏的h2o轻轻冲洗每口井四次, 注意不要移开钙晶体。让它干燥。
8. 议定书 7: 用马松的三丁质染色软骨病
-
在60°c 的干烤箱中烘烤 30分钟, 将脱水和水合物部分放入蒸馏水中。
- 要补充水分, 请用脱碳剂在三个5分钟的孵育中滑行, 然后在酒精浓度下降的情况下进行5分钟的孵育, 具体如下: 两孵育在 100% (绝对乙醇), 两次在95% 乙醇时, 两孵育在 80%, 两次在70% 时, 最后在蒸馏中进行两分钟孵育h2o. 滑块可以保持在 h2o, 而 bouin 的固定剂准备好了.
- 将布宁固定剂的40毫升放入塑料微共蛋白罐 (未发现) 中。微波在高处, 使温度达到55°c。将滑块放入加热溶液中 20分钟;让站在柜台上。在自来水中清洗10分钟或直到所有的黄色消失。
- 在魏格特的血红素中染色 10分钟, 在自来水中清洗10分钟。
- 在北布里奇的朱红色酸富新溶液中染色片 10分钟, 在自来水中清洗3x10分钟。在磷钨酸溶液中的 mordant 滑动10分钟。不要冲洗。
- 将滑梯直接放入苯胺蓝色溶液中 10分钟, 在自来水中短暂浸渍两次冲洗。
- 将滑块放入1% 醋酸溶液 3 ~ 5分钟, 在自来水中清洗 1分钟, 在95% 乙醇中放置 1分钟, 脱水 1分钟, 然后用合成树脂安装。
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Representative Results
人 pvat 间质血管成分的分离
图 1a显示了在上升主动脉上方获得 pvat 的解剖区域示意图。我们之前描述了接受冠状动脉旁路移植术的患者群体, 这些样本是从这些样本中提取的。图 1 b显示了手术后获得的人类 pvat 的一个例子。图 1c显示了一个具有代表性的 pvat 组织部分染色马松的三氯甲烷染色。图 1d是一个相收缩显微图, 显示在分化前的扩张阶段, 有大量的 pvat 衍生基质细胞。可以对电池进行扩展和冻结, 以供将来使用。细胞通常在由 70% fbs、20%的基础 (无抗生素) dmem f12 和 10% dmso 组成的介质中以 2.5 x 10 5 细胞的密度冻结-80°c 时的异丙醇冷冻室中, 在-24小时内, 并移动到液体n 2冷冻室的液相中, 为长 t存储。
脂肪原分化
研究与人类骨髓源性 msc (图 2a、b) 和 pv 型祖细胞 (图 2A, d) 平行进行。图 2的左侧面板显示了非诱导条件, 其中没有脂质积累明显。右板显示脂肪细胞分化后的细胞, 并与油红色 o 染色中性脂质。虽然人主动脉 pv 衍生细胞的分化程度更强, 但两种人细胞来源都表现出向脂肪原谱系分化的能力。
成骨分化
人骨髓源性 msc (图 3a-c) 和 pv t 源细胞 (图 33-f) 采用成骨分化协议。非诱导细胞 (图 3a, d) 未与 alizarin red 染色。在成骨分化协议后, 人类 msc 开发了用 alisarin red 染色的钙化结节 (图 3b-c), 而人类主动脉 pv 衍生细胞则没有 (图 3e-f)。这些数据表明, 我们从人 pvat 的基质血管部分制备细胞的能力缺乏相当数量的有能力进行成骨的祖细胞。根据研究和分化的时间过程, 建议跟踪标准污渍与分子标记的检测, 定义成骨系承诺 (如 runx2, sterix, 碱性磷酸酶) 或成骨细胞 (骨桥蛋白,骨钙素, 碱性磷酸酶, bap1)。
软骨分化
从人骨髓 msc (图 4a) 和人 pvat (图 4A) 中提取的细胞具有软骨源分化的特征, 微细胞中胶原蛋白积累丰富。从人骨髓 msc 和主动脉 pv 衍生细胞形成的微虫也表现出大量的糖胺多糖 (蓝色), 如 alcian蓝染色所示 (分别为图 4c-d)。在形态学上, 类似于缝隙的结构被检测到, 细胞位于胶原蛋白沉积周围的腔中 (图 4, 箭头)。根据研究和分化的时间过程, 检测特定的软骨细胞标记 (琼脂糖, 胶原蛋白 ii 型, 骨联素, sox9) 是有用的。
图 1: 人 pvat 的形态特征.(a) 用周围的 pvat (黄色) 描绘人类主动脉 (红色) 的卡通。箭头表示上升的主动脉。(b) 在分离前, 从 dmem 的 cabg 患者身上提供480毫克的人主动脉 pvat。(c) 马松的三色染色福尔马林固定石蜡嵌入人 pvat (深棕色/黑色 = 细胞核, 蓝/紫色 = 结缔组织, 粉红色 = 细胞质;请注意, rbc 看起来呈红色粉红色。(d) 培养7天时 pvat 间质细胞的代表性图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 脂肪原分化.(a) 人骨髓 msc 在非诱导条件下的相位显微镜显示没有分化的证据。(b) 人骨髓 msc 在诱导脂质条件下的相显微镜显示中性脂质的分化和固定, 14天后被油红色 o 染色。(c) 人主动脉 pv 衍生细胞在非诱导的脂质条件下的相位显微镜显示没有分化的证据。(d) 人主动脉 pv 衍生细胞在诱导的脂质条件下的相位显微镜显示出活跃的分化和固定的中性脂质, 染色后油红色 o。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:成骨分化。(a) 人骨髓 msc 在非诱导成骨条件下的相显微镜显示, 没有证据表明向成骨谱系分化。(b) 人骨髓 msc 在培养14天后诱发条件的相显微镜显示出与阿利沙林红 (箭) 染色钙沉积的分化和形成的证据。(c) 在与 alisarin red 染色后诱发成骨条件时含有人骨髓 msc 的井的图像表明钙沉积丰富, 表明向成骨谱系 (箭头,钙沉积)。(d) 在非诱导成骨条件下, 主动脉人 pv 衍生细胞的相显微镜显示出分化没有向成骨谱系分化的迹象。(e) 在培养14天后诱导成骨条件下的主动脉人 pv 衍生细胞的相显微镜显示, 在与阿利沙林红染色时, 没有分化为成骨谱系或钙沉积的证据, 仅非特异性染色。(f) 在与 alisarin red 染色后诱导成骨条件下含有人主动脉 pv 衍生细胞的井的图像仅显示非特异性染色。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:软骨分化.(A、B)人骨髓 msc (a) 或人主动脉 pvat 祖细胞 (b) 在诱导软骨生条件下进行光镜观察, 在培养14天后, 随后用马松的三氯细胞染色, 这表明意义重大胶原蛋白 (蓝色) 的沉积, 并建议向软骨源的成功分化。(C, D)人骨髓 msc (c) 或人主动脉 pvat 祖细胞 (d) 在诱导软骨生条件下进行光镜观察, 在培养14天后, 随后用蓝色染色, 这表明酸性沉积蛋白聚糖 (如糖胺多糖), 通常存在于软骨中。反污, 核快红;箭头, 像缝隙一样的结构。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
不同仓库的脂肪祖细胞在表型和分化潜力上差异很大。从单个患者捐献者身上培养 pvat 衍生的祖细胞, 同时诱导出三个不同的谱系, 即脂原体、成骨和软骨遗传, 可以对这款小说的多能能力进行控制性的研究祖细胞的数量。本报告中描述的方法可用于检测人 pvat 祖细胞的分化能力, 并了解其在调节 pvat 病理和血管张力方面的作用。这项技术的一些好处是它的简单性和使用的原发性人体组织从冠状动脉旁路患者, 从而能够调查 pvat 祖细胞功能的严重心血管疾病患者。然而, 500 毫克组织中的外植体通常会产生和 lt;1000 粘附细胞, 因此需要5-7 个通道才能获得足够的数量, 这突出表明了对这种方法的一个重要警告。三系分化实验成功的关键是供体 pvat 的初始细胞外植体的质量。在酶解离之前, 必须对组织进行彻底的细切。此外, 与其他外植体协议不同的是, 我们发现, 在电镀前使用红细胞裂解缓冲液时, 细胞数量、活力和整体质量会大幅下降。相反, 强烈建议对整个间质血管部分 (包括红血球) 进行板块。24小时后, 粘附细胞将附着在一起, 通过与 hbss 反复清洗, 可以去除未裂解的红血球。pvat 衍生基质细胞的传递不应大于 1: 2 分裂。我们观察到, 当细胞分裂1:3 或更大时, 生长速度会下降。
三系分化试验中最困难的成分是软骨病, 因为它需要一种不太常见的方法来培养细胞在 "微肌" 和组织学嵌入和切片。必须注意正确地将 100, 000 细胞的10μl 液滴贴上板, 不要干扰添加培养基的质量。我们发现了关于微屁股是否仍然粘附在盘子上或悬浮在介质上的检测之间的差异。即使质量没有保持粘附, 微肌肉结构和细胞活力仍然是一致的。
血管微环境中的干细胞或祖细胞负责组织修复, 以应对损伤或疾病。最有特征的是来自于周长-外特许隔间的种群, 尽管在人类 10、11 中是否有标准化的分子鉴定仍有争议.在这个协议中, 我们研究了一个祖细胞群, 特别是从人类 pvat, 以测试他们的倾向, 分化为成骨, 软骨生或脂肪原系。使用染色技术来定义细胞对每个谱系的承诺, 我们证明, 与人类骨髓间海生器不同, 人类 pvat 的祖细胞无法分化为成骨谱系 (图 3), 但表现出强大的脂质分化。软骨基因分化能力可与骨髓和 pv 衍生细胞相媲美。这表明 pvat 衍生的祖细胞可能比骨髓 msc 更受血统限制, 或者 pvat 祖细胞不容易分化为成骨谱系。未来的研究应包括研究每个谱系标记的基因和蛋白质表达, 以更定量地评估 pvat 衍生细胞的分化能力。
脂肪干细胞一直是再生医学应用的重点, 因为容易获得, 而且可以从脂肪组织中获得大量细胞, 12、1 3.在脂肪组织的基质血管部分, 有血管细胞、炎症细胞、成纤维细胞、脂肪前细胞和脂肪源性干细胞。根据脂肪库的解剖位置和脂肪细胞特征 14, 干细胞种群存在差异.最重要的是, 脂肪源性干细胞似乎不仅有能力分化为间充质谱系 15, 而且还有可能采用 16、17和表皮18 命运的神经元。
大量的研究集中在从人皮下白色脂肪组织中提取的干细胞/祖细胞上, 但很少有研究涉及 pvat 中祖细胞群体的特征。最近的研究从大鼠肠系膜周围的 pvat 或胸主动脉中分离出脂肪细胞祖细胞。这些 CD34+/CD140a+ 种群分化为脂肪细胞, 尽管没有测试其他谱系的能力为19。
我们最近描述了从晚期冠心病患者的人 pvat 的间质血管分数中提取的脂肪祖细胞.这些脂肪祖细胞为 cd73 +、cd105 + 和 cd140a +, 有效地分化为具有热原性特征的脂肪细胞 (ucp1 表达)6。在目前的工作中, 我们发现 pvat 衍生细胞的血统效力有限, 与骨髓衍生的 msc 相比, 这表明缺乏或很少数量的脂肪衍生干细胞已从其他人类脂肪组织的特征。该协议的一个考虑因素是人类标本之间的预期变化, 这可能会影响 pvat 样品中的干细胞细胞的数量及其在不同谱系分化的能力。年龄、性别、bmi、药物和其他临床参数可能会影响 pvat 内祖细胞的表型。因此, 预计未来对该协议的修改将等待人类 pvat 中更明确界定的祖细胞群, 并可能使用细胞分类来分离特定的亚群进行传系研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢缅因州医学中心研究导航在协助临床组织采购方面的协助, 以及缅因州医学中心研究中心的组织病理学和组织形态测量核心 (由 1p20gm121301, l. liaw pi 提供支持)用于切片和染色的研究所。这项工作得到了国家卫生研究院 r01 hl141149 (l. liaw) 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| Antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| Biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| Bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4 °C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| Bell strainer (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| Gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| Insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| Pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| Penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| Rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
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