Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לבחון את היכולת של ובתאים נגזר רקמת שומן perivascular האדם להתמיין שושלות תאים מרובים. בידול היה לעומת גזע mesenchymal הנגזרות מח אנושי, אשר ידועה להבדיל לתוך adipocyte, osteocyte ו- chondrocyte שושלות.
Abstract
רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, ו chondrogenic שושלות. Adipogenic הבידול של ובתאים הוא מנגנון מרכזי הנהיגה הרחבה רקמת שומן ועל תפקוד בתגובה השמנת יתר. הבנת שינויים רקמת שומן perivascular (PVAT) היא לפיכך הרלוונטית קלינית במחלה מטבולית. עם זאת, מחקרים קודמים היו יוכפל לאחר המרתו הופיעה העכבר, חיה אחרת מודלים. פרוטוקול זה משתמש אנושי דגימות PVAT בית החזה שנאספו בחולים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. רקמת שומן מן העורקים נאסף ומשומשים עבור explantation של השבר בכלי הדם סטרומה. לנו קודם לכן אישר את הנוכחות של אדיפוז ובתאים ב PVAT האדם את היכולת להתמיין המכילים שומנים בדם adipocytes. במחקר זה, בהמשך ניתחנו את פוטנציאל התמיינות של תאים מן השבר בכלי הדם סטרומה, ככל הנראה המכיל ובתאים רב עוצמה. השווינו נגזר PVAT לתאי מח עצם האדם MSC עבור בידול לתוך adipogenic, osteogenic, chondrogenic שושלות. לאחר 14 ימים של בידול, כתמים מסוימים נוצלו לאתר הצטברות שומנים בדם adipocytes (שמן אדום O), פיקדונות calcific תאים osteogenic (Alizarin אדום), או glycosaminoglycans, קולגן בתאים chondrogenic (Trichrome של מאסון). בזמן מח העצם MSC ביעילות הבדיל לתוך כל שלוש שושלות, תאים PVAT, נגזר היה adipogenic ו- chondrogenic פוטנציאל, אבל חסרה פוטנציאל osteogenic חזקים.
Introduction
רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, chondrogenic שושלות1. רקמה זו מרחיבה דרך היפרטרופיה של בוגרת adipocytes de novo הבידול של תושב MSC כדי adipocytes. רקמת שומן Perivascular (PVAT) המקיף את כלי הדם, מווסת את תפקוד כלי הדם2,3. השמנת יתר-induced PVAT הרחבה מחריף פתולוגיות לב וכלי דם. ואילו הפוטנציאל multipotent של MSC מן האדם מחסני אדיפוז תת עורית כבר למד היטב4,5, מחקר explanted, הערכת הקיבולת בידול של האדם נגזר PVAT ובתאים, סביר בשל invasiveness הרכש. לפיכך, מטרת עבודה זו היא לספק מתודולוגיה אל explant, להפיץ ובתאים של האדם PVAT של אבי העורקים של חולים עם מחלת לב וכלי דם, כדי לבדוק את הנטייה להבחין ל osteogenic, chondrogenic ו adipogenic שושלות שלהם. מקור שלנו PVAT הוא אתר של השקה של המעקף על עולה אבי העורקים של חולים שמנים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. PVAT בודדים טרי enzymatically-חלופה מועדפת, השבר בכלי הדם סטרומה בודד ולאחר מופצות במבחנה, ומאפשרת לנו לבחון בפעם הראשונה את יכולת התמיינות של האדם נגזר PVAT ובתאים.
השימוש העיקרי תרבותי אנושי PVAT סטרומה וסקולרית שבר, בדקנו שלושה מבחני מתוכנן לגרום גזע/ובתאים להבדיל לכיוון adipogenic, osteogenic, או chondrogenic שושלות. המחקר שלנו מוקדמת לזהות אוכלוסייה של CD73 + CD105 +, תאים PDGFRa + (CD140a) יכולים להתמיין robustly adipocytes6, למרות multipotency שלהם לא נבדקה. PVAT ישירות מסדיר את הטון ודלקת כלי הדם7. הרציונל לבדיקת הפוטנציאל בידול של אוכלוסייה זו תא הרומן היא להתחיל להבין את השפעת PVAT על תפקוד כלי דם מיוחדות, ומנגנונים של התרחבות PVAT במהלך השמנת יתר. מתודולוגיה זו משפרת את ההבנה שלנו של הפונקציות של רקמת שומן נגזרת ובתאים, מאפשרת לנו לזהות ולהשוות והשונה של ובתאים ממקורות רקמות שונות. עלינו לבנות על גישות הוקמה המאומת בידוד, המבדילים MSC לכיוון שושלות שונות, לייעל את ההליכים כדי למקסם את הכדאיות של האדם נגזר PVAT ובתאים. טכניקות אלה יש שימושים רחב בתחומים של גזע קדמון תא רקמת שומן ומחקר ופיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש ברקמות אנושיות במחקר זה היה מוערך ואושרו על-ידי מוסדיים סקירה הלוח של מיין המרכז הרפואי, כל אנשי הצוות קיבל הכשרה מתאימה לפני הניסויים.
1. תכשירים
- להפוך את מאגר דיסוציאציה מאת לשחזר 50 מ"ג ללא בעלי חיים collagenase/dispase תערובת אני פתרון עם 1 מ"ל של nanopure H2O. הכן 1 מ"ג/מ"ל הפתרון עובד על-ידי הוספת 49 מ של גלוקוז גבוהות DMEM המכיל 1% w/v BSA collagenase משוקם / פתרון dispase. חנות מ ל aliquots לעבוד ב-20 ° C וחמים עד 37 ° C באמצעות לכהן אמבט מים לשימוש.
- להפוך את פתרון לאנטיביוטיקה על-ידי הוספת 1 מ"ל של 100 x אנטיביוטיקה/antimycotic פתרון (הריכוז הסופי הוא 200 יחידות/mL פניצילין, 200 יחידות/mL סטרפטומיצין, 0.5 fungizone µg/mL) 49 מ של HBSS, לאחסן בקירור.
- להכין פתרון ג'לטין (0.2% w/v) על ידי המסת ג'לטין 200 מ ג של עור שור ב- 100 מ של nanopure H2או אוטוקלב הפתרון עבור 20 דקות ולאחסן ב 4 º C.
- הכנת 500 מ"ל של PVAT הצמיחה מדיה: גלוקוז גבוהות DMEM/F12 עם תוספת גלוטמין פירובט נתרן, סודיום ביקרבונט, בתוספת 10% FBS וסוכן µg 100/mL מיקרוביאלית (ראה טבלה של חומרים).
- להכין מדיה אינדוקציה adipogenic 50 מ ל: 40.8 mL גלוקוז גבוהות DMEM, בתוספת 7.5 mL PVAT הצמיחה מדיה, µL 500 של 100 x פתרון אנטיביוטיקה/antimycotic (ריכוז הסופי הוא 100 יחידות/mL פניצילין, 100 יחידות/mL סטרפטומיצין, fungizone µg 0.25/mL), 0.5 מ מ IBMX (מניות 500 מ מ של 0.1 M NaOH), 1 מיקרומטר דקסמתזון (1 מ מ מניות של אתנול) 5 מיקרומטר רוזיגליטזון (5 מ מ מניות של דימתיל סולפוקסיד), מיקרומטר 33 ביוטין (66 מ מ מניות של דימתיל סולפוקסיד), 100 ננומטר אינסולין (200 מניות מיקרומטר של 0.1% חומצה אצטית), חומצה פנטותנית 20 מיקרומטר (מניות 100 מ מ H2 O).
- להתכונן 50 מ של שליטה אינדוקציה מדיה השושלת adipogenic: 40.8 mL גלוקוז גבוהות DMEM בתוספת 7.5 mL PVAT הצמיחה ומדיה µL 500 של עט-דלקת (x 100 מניות).
- הכנת 50 מל adipogenic תחזוקה מדיה: 41.5 mL גלוקוז גבוהות DMEM בתוספת 7.5 mL PVAT הצמיחה מדיה משלב 1.3, 500 µL עט-דלקת (x 100 מניות), דקסמתזון 1 מיקרומטר (1 מ מ מניות ב- EtOH), מיקרומטר 33 ביוטין (66 מ מ מניות של דימתיל סולפוקסיד), 100 ננומטר אינסולין (200 מיקרומטר מניות ב- 0.1% ac חומצה etic), חומצה פנטותנית 20 מיקרומטר (100 מ מ מניות H2O).
- להתכונן 500 מ"ל של מדיה צמיחה שושלות osteogenic ו- chondrogenic: תוספת של גלוקוז גבוהות αMEM בתוספת 10% FBS, גלוטמין x 1 (ראה טבלה של חומרים), ו- 5 מ של עט-דלקת (x 100 מניות).
- להתכונן 50 מ של אינדוקציה מדיה השושלת osteogenic: 50 מ של מח העצם MSC צמיחה המדיה בתוספת 10 ננומטר דקסמתזון ו β-glycerophosphate 10 מ מ.
- להתכונן 50 מ של אינדוקציה מדיה השושלת chondrogenic: 50 מ של מח העצם MSC צמיחה המדיה בתוספת 100 ננומטר דקסאמתאזון, 50 µg/mL סודיום אסקורבט-2-פוספט ו- 10 ננוגרם למ"ל TGFβ1. עבור התנאים osteogenic, chondrogenic, התקשורת צמיחה MSC מח עצם הבסיס ישמש כלי התקשורת הלא-אינדוקציה.
2. פרוטוקול 1: התרבות האנושית PVAT תאים מן השבר בכלי הדם סטרומה
הערה: PVAT resected מהאתר של שתל השקה על העורקים של מרדימים חולים שעברו הליכים שתל מעקף עורקים. אבי העורקים PVAT ממוקם 15 מ"ל חרוט המכיל 10 מ"ל קרח קר גלוקוז גבוהות DMEM F12, יועברו מ חדר הניתוח למעבדה תוך שעתיים של כריתה. אבי העורקים PVAT רקמות שנזרקו במהלך תהליך מעקף, שסברו כמו מחקר בנושאים שאינם בני אדם על ידי ועדה פנימית של המרכז הרפואי מיין.
- פרוטוקול זה מיועד חתיכה ~ 500 מ"ג של PVAT האנושית (כ 3 x 1 x 0.5 ס מ3). להעביר PVAT האנושי טריים DMEM צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 25 מ ל ונעביר. דגירה עם נדנדה כעשרים דקות ב 4 º C. אמנם PVAT ונעביר, להפשיר aliquot של דיסוציאציה מאגר ב 37 º C.
- להוסיף µL 50 בפתרון אנטיביוטיקה/antimycotic x 100 מ ל דיסוציאציה מאגר ולחטא בעזרת מסנן 0.22 של מזרק מיקרומטר. להוסיף 1 מ"ל של פתרון ג'לטין 1 טוב של צלחת 24-. טוב. תא למינארי, להשתמש סטרילי מלקחיים ומספריים כדי להעביר PVAT הפתרון לאנטיביוטיקה צלחת פטרי סטריליות. להוסיף 1 מיליליטר דיסוציאציה מראש ומחוממת מאגר הרקמה, דק מינצ הרקמה כולה לתוך slurry (ללא חתיכות גדולות יותר מאשר ~ 2 x מ מ 22) שימוש סטרילי מלקחיים ומספריים לנתיחה.
- להעביר את slurry 1 מ"ל למאגר דיסוציאציה 4 מ"ל, דגירה הצינור על צידה ב מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס מסלולית שייקר ב 200 rpm לשעה. לאחר 1 h, אין חתיכות רקמה גלוי יהיה נוכח, הפתרון יופיע כהשעיה תא מעונן.
- לסנן את הפתרון דרך מסננת תא מיקרומטר 70 להגדיר על גבי צינור חרוטי 50 מ. יש לשטוף את מסננת עם פתרון לאנטיביוטיקה נוספים 10 מ"ל ללכוד תאים רבים ככל האפשר. לא לסחוט את מסננת.
- גלולה התאים במשך 12 דקות ב x 300 גרם ומפרידה דלי מתנדנדים.
הערה: לאחר צנטריפוגה, הצינור מופרדים לשכבה העליונה שומן של adipocytes, לאטמוספרה של גלולה. בגדר הוא השבר בכלי הדם סטרומה המכיל תאי אנדותל, תאים חיסוניים, תאי דם, ובתאים. - Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של HBSS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 300 גרם. חזור על שלב זה עבור סך של 2 שוטף ב- HBSS. לאחר השטיפה הסופית לא lyse כדוריות דם אדומות. ניסיונות חוזרים ונשנים עם מספר מאגרים זמין מסחרית ושעות הדגירה הובילו מסומן הפחתות קדמון תא המצורף ואת הכדאיות.
- האחות ג'לטין מהצלחת 24-. טוב. לשטוף בעדינות את x 1 טוב עם HBSS כדי להסיר את הג'לטין לא מאוגד.
- Resuspend השבר בכלי הדם סטרומה גלולה עם תאי דם אדומים שלמים ב 1 מ"ל זרע על גבי הג'לטין מצופים ומדיה צמיחה היטב. להוסיף FGF2 האנושית (resuspended ב- PBS בתוספת 0.01% BSA w/v) ריכוז סופי של 25 ננוגרם למ"ל במדיום תרבות. תקופת דגירה של 24 שעות ביממה ב 37 ° C עם 5% CO2.
- ביום הבא, הסר צמיחה מדיה ושטוף בארות 5 x עם HBSS כדי להסיר תאי דם אדומים, תאים מתים. להוסיף 1 מ"ל של מדיה צמיחה טרי בתוספת 25 ננוגרם למ"ל FGF2.
- לשנות את המדיה כל 48 שעות, מקפיד להשלים עם 25 ng/mL FGF2 טריים בכל פעם.
-
תאים בדרך כלל להגיע למפגש 100% 7-10 ימים לאחר explant; מעבר תאים ואז:
- תשאף צמיחה מדיה ושטוף חד שכבתי 2 ב 1 מ"ל HBSS-x. תשאף כל HBSS מן הבארות ולהוסיף כמה טיפות של התא דיסוציאציה פתרון.
- הקש על מערבולת שלוחית מספר פעמים, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך 5-7 דקות להרים את התאים. להוסיף ~ 1 מ"ל של טרי בינוני התרבות התאים מנותקת ולהפיץ µL 500 כדי בארות 2 של צלחת 24-. ובכן, כל המכילה 500 µL הצמיחה מדיה ו-25 ננוגרם FGF2.
- להמשיך ולהרחיב את התאים נגזר PVAT של האדם כפי שמצוין בשלב הקודם. כל קטע צריך להיות לא יותר מ פיצול 1:2. התאים הם passaged 5 – 7 פעמים לפני בהקצאת עבור מבחני בידול.
3. פרוטוקול 2: התרבות האנושית מח עצם MSC המושבות
הערה: מח אנושי MSC מבודדים כמו שמתואר8 ומאוחסן כמו בתחילת המעבר קפוא מניות להקפיא מדיה (70% FBS 20% הבזליים DMEM ו-10% דימתיל סולפוקסיד) ב ~ 100,000 תאים למ"ל N נוזלי2.
- במהירות להפשיר בקבוקון של מח העצם MSC נוזלי N2 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים, צלחת על אחד טוב של צלחת 6-ובכן תרבות המכיל 3 מ"ל של מדיה צמיחה MSC, דגירה בין לילה-37 ° C ו- 5% CO2.
- ביום הבא, תשאף MSC תרבות מדיה ותרחץ התאים 3 ב 2 מ של HBSS-x. ב- 100% הנהרות, תשאף צמיחה מדיה ותרחץ התאים 3 ב 2 מ של HBSS-x. להוסיף 500 פתרון ניתוק התא µL/טוב דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 5 דק. הקש על הלוח כדי להבטיח כל התאים הם רופף, פזר באופן שווה התוכן בארות 2 של צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ"ל MSC צמיחה מדיה.
- הרחב את מח העצם אנושי ' נגזר PVAT MSC במקביל כ 5-7 קטעים או עד בכמות מספקת לבדיקת הושגה.
4. פרוטוקול 3: צלחת, זירוז, Osteogenic, Adipogenic ו- Chondrogenic שושלות
- ומסרו המתאים של מח העצם ותאים נגזר PVAT לכל טוב של צלחת 12-ובכן, המתאים משכפל עבור כל תנאי הניסוי. עבור adipogenic ו- osteogenic תנאים, ~ 200, 000 – 225,000 תאים/טוב יש צורך, chondrogenic תנאים, 150,000 – 175,000 תאים/טוב נדרשים.
הערה: הרצנו מינימום של N = 3 בארות שכפל עבור פקד, בהשפעת התנאים עבור כל השושלת ניסיוני עבור סכום כולל של 2 עצמאית פועל (N = 6 משכפל סה כ). - בטל שיוך תאים מן האוכלוסייה האנושית של התא קדמון PVAT והן האוכלוסייה MSC מח אנושי באמצעות פתרון ניתוק התא, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לאוכלוסיות בריכה 5 דק לתוך צלוחיות חרוט נפרד 15 מ"ל. לסובב את המבחנה למטה ב x 500 g למשך 7 דקות הצניפה התאים. Resuspend ב 1 מ"ל של PBS ולהשתמש hemocytometer להעריך את מספר התאים.
- צלחת התאים במנות 12-ובכן כפי שמצוין בשלב 4.1. מספקים כלים נפרדים המושרה ו- induced adipogenic, osteogenic, ותנאים, כך ניתן לתקן את המצב הלא-induced בנקודת זמן קודמת מבלי לשבש את פעולת המשך תרבות של התנאי המושרה.
- להוסיף 1.5 מ של adipogenic ומדיה אינדוקציה osteogenic כל טוב של התנאי המושרה. להוסיף 1.5 מ של adipogenic והתקשורת הלא-אינדוקציה osteogenic כל טוב של המצב הלא-induced. מתחיל אינקובציה של adipogenic ו- osteogenic תא המושרה ו- induced אוכלוסיות-CO 37 ° C ו-5%2.
- ספין למטה כמות נותרת ובתאים PVAT האנושי ואת מח עצם האדם MSCs במשך 7 דקות ב 500 x g.
- לקבוע את אמצעי האחסון הדרושים כדי resuspend הנותרים מח עצם ותא PVAT, נגזר כדורי כדי להשיג צפיפות של תאים/10 100,000 µL (106 תאים/mL). Resuspend כדורי בהיקף מחושב MSC מדיה צמיחה עבור אינדוקציה השושלת chondrogenic. להניע בעדינות את עוצמת הקול של תאים למעלה ולמטה באמצעות pipet כדי להבטיח התפלגות הומוגנית.
- Pipette 10 µL droplet של הפתרון תא מרוכז אל המרכז בכל טוב כדי ליצור את micromass של תאים 100,000. מקום 1 מ"ל של סטרילי H2O הבאר סמוכים כדי למנוע התאיידות. דגירה התרבויות micromass עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי לאפשר את micromass להפעיל עליה פונקציית צבירה.
- לאחר שעתיים, בזהירות להוסיף מדיה בידול chondrogenic עם 10 ng/mL TGFβ1 אנושי לכל אחד מן הבארות המושרה-מצב. בזהירות להוסיף 1.5 מ של התקשורת הלא-אינדוקציה (מח עצם MSC צמיחה מדיה) הבארות תנאי שאינו-induced. השתמש. ובכן 12 צלחות נפרדות עבור התנאים המושרה ו- induced כך שניתן יהיה לתקן את המצב הלא-induced בנקודת זמן קודמת.
5. פרוטוקול 4: תרבות Adipogenic, Osteogenic, ו Chondrogenic שושלות למשך 14 ימים
- תרבות המושרה ו- induced תנאי כל שושלות שלושה ארבעה ימים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, מרעננים מדיה כל יומיים. יום 4, לשנות את התנאי השושלת adipogenic המושרה ממדיה אינדוקציה למדיה תחזוקה למשך שארית וזמינותו.
- לתקן את כל התנאים הלא-induced בפורמלין 10% עבור 12 ח היפטרו פורמלין, לשטוף כל קבוע בארות 2 x ב- PBS כדי להסיר כל עקבות של פורמלין. חנות צלחות ב- PBS ב 4 ° C עד עיבוד.
- תרבות התנאים המושרה עבור סכום כולל של 14 ימים, מרעננים מדיה כל יומיים. להוסיף TGFβ1 טריים בכל 10 ננוגרם למ"ל הסופי ריכוז עם כל רענון של התקשורת אינדוקציה chondrogenic. להמשיך תרבות השושלת adipogenic adipogenic תחזוקה מדיה, מדיה אינדוקציה השושלת osteogenic, רענון כל יומיים. יום 14, לתקן את תנאי מושרה כל 12 שעות בפורמלין 10% עבור צביעת.
- לגרד או שופכים את micromass במצב chondrogenic המושרה לתוך קלטת להטבעה. מייבשים את micromass בסדרה של אלכוהול מרוכז יותר ויותר אמבטיות במשך 5 דקות, שמתחילים ב- 70%, 80%, פעמיים ב-95%, ואז פעמיים יותר באלכוהול המוחלט. הכנס את הקלטת סוכן dealcoholization ולאחר מכן להטביע סוף סוף את הקלטת בפרפין חלוקתה, מכתים.
6. פרוטוקול 5: צביעת Adipogenic תנאי עם שמן אדום O
- להכין שמן אדום O מניות פתרון על ידי המסת 350 מ"ג של שמן אדום O ב- 100 מ של אלכוהול איזופרופיל 100%. מערבבים במשך שעתיים עם בר stir, ואקום דרך מסנן 0.2 µm. פתרון מניות ניתן לאחסן בחושך בטמפרטורת החדר במשך שנה 1.
- להכין שמן אדום O עובד פתרון על ידי ערבוב 3 חלקים מניות פתרון לשכפל חלקים 220 (למשל 60 מ"ל של פתרון מניות ל- 40 מ"ל לשכפל20). הריכוז הסופי של שמן אדום O בפתרון עובדים נמצא 2.1 מ"ג/מ"ל.
- הסר את כל הנוזלים מבארות. לשטוף כל x 2 טוב עם 60% אלכוהול איזופרופיל, מקפיד להסיר לחלוטין את כל המים ומהצדדים של הבארות. האחות 60% אלכוהול איזופרופיל, להוסיף שמן אדום O הפתרון עובד במהירות בלי לגעת בקירות הבארות כדי לכסות את החלק התחתון. . זה קריטי כי צעד זה נעשה מהר כדי לא לייבש בארות
- פעם נוספת שמן אדום O, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין.
- להסיר כל שמן אדום O ולהוסיף מיד מזוקקים H2O. לשטוף עם מזוקקים H2O ב-10 מ' להתחיל להסיר או שמן אדום לא מאוגד לאחר 10 דקות, תשאף שמן אדום O וחזור על התהליך כביסה 3 x.
- לאחר סיום הכביסה, להוסיף PBS, תמונה התאים. חנות צבעונית התאים ב- PBS ב 4 º C.
7. פרוטוקול 6: צביעת תנאי Osteogenic עם Alizarin אדום
- הסר את כל נוזל מכל קידוח. להוסיף נפח מתאים של פתרון הכתם האדום Alizarin 2% מכל קידוח (1.5 מ"ל לאדם. טוב בשביל צלחת 12-טוב), להטות בעדינות את לוחית--לצד עד הפתרון מכסה לחלוטין הבאר.
- תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר Alizarin אדום הבארות. לשטוף בעדינות כל טוב ארבע פעמים עם מזוקקים H2O, לוקח זהירות לא מכך גבישי סידן. אפשר להתייבש.
8. פרוטוקול 7: צביעת Chondrogenic תנאי עם מאסון Trichrome
-
אופים שקופיות בתנור יבש 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות מקטעים Deparaffinize ו מימה על מים מזוקקים.
- לשתות הרבה, מקום שקופיות incubations 3 5 דקות עם סוכנים dealcoholization, ואחריו 5 דקות incubations בסדר יורד ריכוז אלכוהול כדלקמן: שתיים ב- 100% (אתנול מוחלטת), שניים ב 95% אלכוהול, שניים ב 80%, שניים ב-70%, ולבסוף שניים באופן מזוקק או שקופיות יכולים להישאר H2H2O בזמן מקבע של Bouin מוכן.
- מקום 40 מיליליטר מקבע של Bouin בתוך צנצנת פלסטיק coplin פאנטרי (חשפו). מיקרוגל גבוה כדי להביא temp 55 מעלות צלזיוס. המקום שקופית בפתרון מחוממת כעשרים דקות; ולתת לעמוד על הדלפק מכוסה. רחץ פועל מי ברז למשך 10 דקות או עד כל הצבעים צהוב נעלם.
- כתם במקטעים hematoxylin של וייגארט במשך 10 דקות לשטוף במים ברז למשך 10 דקות.
- כתם במקטעים של Beibrich השני fuchsin חומצה הפתרון עבור 10 דקות לשטוף 3 x 10 דקות במי ברז. שקופיות mordant phosphotungstic/phosphomolybdic תמיסה חומצית למשך 10 דקות. לא שטוף.
- מקום שקופיות ישירות אנילין כחול פתרון עבור 10 דקות יש לשטוף עם שני מטבלים קצרה במי ברז.
- מקום שקופיות חומצה אצטית 1% פתרון עבור 3 עד 5 דקות לשטוף במי ברז עבור 1 מינימלית במקום אתנול 95% עבור 1 מינימלית Dehydrate כמצוין שלב 5.4, הר עם שרף סינתטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידוד של סטרומה השבר בכלי הדם מן האדם PVAT
איור 1A מראה סכימטי של האזור האנטומי שבו הושג PVAT המכסים של אבי העורקים. תיארנו קודם לכן החולה האוכלוסיות שעברו מעקף עורקים הרכבה שמהם הדגימות היו נגזרת6. איור 1B מראה דוגמה PVAT האנושית. שהושג לאחר הניתוח. איור 1C מראה קטע רקמה PVAT נציג צבעונית עם הכתם Trichrome מאסון. איור 1D היא מיקרוסקופ החוזה שלב מציג אוכלוסייה של PVAT, נגזר תאי סטרומה במהלך שלב הרחבה לפני בידול. התאים יכולה להיות מורחבת, קפוא לשימוש עתידי. תאים מוקפאים בדרך כלל על צפיפות של 2.5 x 105 תאים למ"ל בתקשורת המורכב 70% FBS, 20% הבזליים (אנטיביוטיקה חינם) דימתיל סולפוקסיד DMEM F12 ו 10% ב- אלכוהול איזופרופיל cryochamber ב-80 מעלות צלזיוס במשך 24 h. ועבר שלב נוזלי של מקפיא2 N נוזלי על לונג-t erm אחסון.
בידול Adipogenic
מחקרים בוצעו במקביל עם האדם MSC הנגזרות מח עצם (איור 2 אב'), PVAT, נגזר ובתאים (איור 2Cיח). הלוחות השמאלי של איור 2 הצג התנאי-induced, שבו אין הצטברות שומנים בדם מתבטא. הלוחות נכון להראות תאים בעקבות בידול adipocyte וצביעה של ליפידים ניטרליים עם שמן אדום O... אמנם דרגת התמיינות בתאים אנושיים אבי העורקים PVAT, נגזר עמידים יותר, שני מקורות תאי אדם הציג את היכולת להבחין לכיוון השושלת adipogenic.
בידול osteogenic
פרוטוקול בידול osteogenic שימש עבור האדם הנגזרות מח עצם MSC (איור 3 א– ג) ותאים נגזר PVAT (איור 3D-F). Non-induced תאים (איור 3 איח) אינו מכתים עם Alizarin אדום. לאחר פרוטוקול בידול osteogenic, MSC האדם פיתח גושים מסויד מוכתם Alizarin אדום (איור 3B– C), ואילו תאי נגזר PVAT של אבי העורקים אדם לא (איור 3E– F). נתונים אלה מצביעים על כך שלנו הכנה של תאים מן השבר בכלי הדם סטרומה של האדם PVAT חסר מספר משמעותי של אבות עם יכולת לעבור פרכת. בהתאם מסלול הלימוד והשעה של בידול, מומלץ לעקוב אחר כתמי סטנדרטי עם זיהוי סמנים מולקולריים המגדירים את המחויבות השושלת osteogenic (למשל RUNX2, osterix, phosphatase אלקליין) או תאי העצם (osteopontin, אוסטאוקלצין, phosphatase אלקליין, BAP1).
בידול Chondrogenic
תאים שמקורם במח העצם האנושי שני MSC (איור 4A) ולהציג PVAT האנושית (איור 4B) כולל מאפיין של בידול chondrogenic, עם קולגן שופע ההצטברות micromass. Micromasses נוצר מח אנושי MSC ו תאי אב העורקים PVAT, נגזר גם הציג שופע הצטברות glycosaminoglycans (כחול) כמצוין על-ידי Alcian כחול מכתים (איור 4C– D, בהתאמה). מורפולוגית, מבנים הדומה לקונות אותרו תאים יושבים בתוך חללים סביב מאת תצהיר קולגן (איור 4, חצים). בהתאם מסלול הלימוד וזמן בידול, זיהוי סמנים chondrogenic ספציפיים (אירה קוזלוב, קולגן מסוג II, osteonectin, Sox9) היא שימושית.
איור 1: מאפיינים מורפולוגיים של האדם PVAT. (א) קריקטורה תיאור של האאורטה אנושי (אדום) עם סביב PVAT (צהוב). החץ מצביע על העורקים. (B) א 480 מ ג פיסת האנושי PVAT של אבי העורקים ממטופל ניתוח מעקפים ב DMEM לפני דיסוציאציה. (C) מאסון trichrome מכתים של פורמלין-קבוע פרפין-מוטבע PVAT האנושית (חום כהה/שחור = גרעינים, כחול/סגול = רקמת חיבור, ורוד = הציטופלסמה; שימו לב, RBC מופיעים ורוד אדמדם. (ד) נציג תמונה של explanted PVAT-סטרומה תאים ב 7 ימים בתרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: בידול Adipogenic. (א) שלב מיקרוסקופיה של מח העצם MSC האדם במצב הלא-induced מציג הוכחות של בידול. (B) שלב מיקרוסקופיה של מח העצם MSC אנושי בתנאי adipogenic המושרה מראה כמה בידול, קיבעון של שומנים נייטרלי, מוכתם עם שמן אדום O לאחר 14 יום. (ג) שלב מיקרוסקופיה של האדם אבי העורקים נגזר PVAT תאים במצב הלא-induced adipogenic מציג הוכחות של בידול. (ד) שלב מיקרוסקופיה של האדם אבי העורקים נגזר PVAT תאים במצב adipogenic המושרה מראה בידול חזקים הנייח של שומנים נייטרלי, מוכתם עם שמן אדום O לאחר 14 יום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: בידול osteogenic. (א) שלב מיקרוסקופיה של מח העצם MSC אנושי בתנאי osteogenic-induced מציג הוכחות של בידול לכיוון השושלת osteogenic. שלב (B) מיקרוסקופיה של מח העצם MSC אנושי בתוך התנאי המושרה לאחר 14 ימים בתרבות מציגה עדות בידול ואת היווצרות פיקדונות סידן מוכתם Alizarin אדום (חיצים). (ג) תמונה של טוב המכיל את מח העצם האנושי MSC במצב osteogenic המושרה בעקבות כתמים אדומים Alizarin מציין בתצהיר סידן שופע, רומז בידול מוצלחת לכיוון השושלת osteogenic (חיצים, סידן בתצהיר). שלב (D) מיקרוסקופיה של אבי העורקים האדם נגזר PVAT תאים במצב osteogenic-induced תערוכות שום אינדיקציה בידול לכיוון השושלת osteogenic. שלב (E) מיקרוסקופיה של אבי העורקים האדם נגזר PVAT תאים במצב osteogenic המושרה לאחר 14 ימים בתרבות מציג הוכחות של בידול לכיוון השושלת osteogenic או בתצהיר של סידן כשהוא מוכתם Alizarin אדום, רק צביעת שאינם ספציפיים. (F) תמונה של טוב המכיל את אבי העורקים PVAT, נגזר תאים אנושיים בתנאי osteogenic המושרה מכתים הבאים עם Alizarin אדום מראה רק שאינם ספציפיים מכתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: בידול Chondrogenic. (A, B) מיקרוסקופ אור של קטע micromass הנוצרת על-ידי מח אנושי MSC (א) או האנושי PVAT של אבי העורקים ובתאים (ב) במצב chondrogenic המושרה לאחר 14 ימים בתרבות, לאחר מכן צבעונית עם Trichrome של מאסון, המציינת משמעותית בתצהיר של קולגן (כחול) ומציעה בידול מוצלח לקראת שושלת chondrogenic. (C, D) מיקרוסקופ אור של קטע micromass הנוצרת על-ידי מח אנושי MSC (C) או האנושי PVAT של אבי העורקים ובתאים (ד) מצב chondrogenic המושרה לאחר 14 ימים בתרבות, לאחר מכן מוכתם Alcian כחול, המציין הפקדת חומצי proteoglycans (למשל glycosaminoglycans) כמו מצויים בדרך כלל הסחוס. Counterstain, הגרעין האדום מהר; חיצים, מבנים דמויי לקונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אדיפוז ובתאים של מחסני שונים להשתנות באופן נרחב פוטנציאליים, פנוטיפ ובידול9. Culturing נגזר PVAT אבות מתורם יחיד החולה באינדוקציה סימולטני למטה שלוש שושלות שונות, adipogenic, osteogenic, ו chondrogenic, מאפשר חקירה ומבוקרות היטב pluripotent לקיבולת של הרומן הזה אוכלוסיית ובתאים. המתודולוגיה שתוארו בדו ח זה יכול לשמש כדי לבחון את יכולת התמיינות של ובתאים של האדם PVAT, כדי להבין את תפקידם בוויסות PVAT פתולוגיות וגוון כלי הדם. כמה יתרונות של טכניקה זו הפשטות שלו, השימוש העיקרי רקמה אנושית של עורקים לעקוף את המטופלים, ובכך מאפשר החקירה של פונקציה תא קדמון PVAT של חולים עם מחלת לב וכלי דם חמור. עם זאת, explants פיסת רקמה 500 מ ג בדרך כלל תשואה < 1000 מחסידי תאים, ובכך דורשים 5 – 7 קטעים כדי לקבל נאותה מספרים, סימון אזהרה חשובה אחת לגישה זו. קריטי בהצלחת הניסויים בידול tri-השושלת הוא איכות explant תא הראשונית של התורם PVAT. זה חיוני דק מינצ הרקמה ביסודיות לפני דיסוציאציה אנזימטיות. בנוסף, בניגוד פרוטוקולים אחרים explant, מצאנו ההפסד הדרמטי של מספר הטלפון הנייד, הכדאיות ואיכות הכללית כאשר תאי הדם האדומים פירוק המאגר שימש לפני ציפוי. במקום זאת, מומלץ מאוד על צלחת השבר בכלי הדם סטרומה כולו (כולל תאי דם אדומים). לאחר 24 שעות, תאים חסיד שיש המצורפת, תאי דם אדומים-lysed ניתן להסירו באמצעות מנקי חוזרות עם HBSS. Passaging של תאי סטרומה נגזר PVAT צריך להיות לא יותר מ- 1:2 פיצולים. הבחנו על הפחתת שיעור הצמיחה כאשר התאים היו לפצל 1:3 ומעלה.
המרכיב הכי קשה של trilineage בידול וזמינותו היא התנאי chondrogenic, כפי שהוא דורש שיטה פחות נפוץ של תאים culturing בולטים היסטולוגית הטבעה ואת חלוקתה של "micromass". חייבים להקפיד כראוי לוח ה-droplet µL 10 תאים 100,000, לא להפריע למיסה על הוספת תרבות בינוני. מצאנו וריאציה בין מבחני או לא micromass נותרה מודבקת לצלחת או הושעה במדיום. אפילו כאשר המסה לא השתהה מודבקת, הכדאיות של מבנה ותא micromass נשאר עקבי.
תאי גזע או קדמון בתוך microenvironment כלי הדם אחראים לתיקון רקמות בתגובה מפציעה או מחלה. הכי טוב מאופיין הם אוכלוסיות הנובעות מדורים pericyte/adventitial, אם כי עדיין יש מחלוקת אם יש זיהוי מולקולרי מתוקננת של אוכלוסיות אלה בני10,11 . ב פרוטוקול זה, נלמד אוכלוסיה תא קדמון במיוחד נגזר PVAT האנושי כדי לבדוק את הנטייה שלהם כדי להבדיל את השושלת osteogenic, chondrogenic או adipogenic. באמצעות טכניקות צביעת להגדרת הסלולר מחויבות כל השושלת, נדגים כי בניגוד MSC ממח העצם אנושי, ובתאים של האדם PVAT לא היו מסוגלים להבדיל לכיוון השושלת osteogenic (איור 3), אבל התערוכה חזקים בידול adipogenic. יכולת התמיינות chondrogenic משולה בין מח העצם ותאי נגזר PVAT. הדבר מצביע על שאולי נגזר PVAT ובתאים השושלת יותר מוגבל מאשר מח עצם MSC או כי המוצא לאגס PVAT לא ברצון להתמיין שושלות osteogenic. מחקרים עתידיים צריך לכלול חקירה של ביטוי גנים וחלבונים של סמנים עבור כל השושלת להעריך יותר באופן כמותי את קיבולת התמיינות של תאים PVAT, נגזר.
נגזר שומן בתאי גזע היו מוקד עבור רפואה רגנרטיבית יישומים, בשל גישה קלה ואת המספר הגבוה של תאים הנגזרות רקמת שומן12,13. בתוך השבר בכלי הדם סטרומה של רקמת שומן, יש כלי דם תאים תאים דלקתיים, fibroblasts, preadipocytes, נגזר שומן בתאי גזע. ישנם הבדלים באוכלוסיית תאי גזע בהתבסס על המיקום האנטומי של אדיפוז דיפו ו adipocyte מאפיינים14. והכי חשוב, תאי שומן-derived נראה יש את היכולת לא רק להתמיין שושלות mesenchymal15, אלא גם פוטנציאל לאמץ עצביים16,17 ו עוריות18 הגורלות.
מחקרים רבים התמקדו גזע/ובתאים שמקורם ברקמות אנושיות שומן תת עורי לבן, אך מעט מאוד מחקרים עסקו מאפייני האוכלוסיות קדמון ב- PVAT. מחקרים שנעשו לאחרונה שללו adipocyte ובתאים כלי מצע המעי העליון שמסביב PVAT או באב העורקים החזי של העכברוש. אלה CD34 + CD140a + אוכלוסיות הבדיל לתוך adipocytes, למרות היכולת להפיק שושלות אחרות לא היה נבדק19.
אנחנו לאחרונה מאופיין אדיפוז ובתאים נגזר מן השבר בכלי הדם סטרומה של האדם PVAT של חולים עם מחלת עורקים מתקדמת6. אלה ובתאים אדיפוז היו CD73 + CD105 +, CD140a +, הבדיל ביעילות לתוך adipocytes עם מאפיינים תרמוגנית (ביטוי UCP1)6. בשנת העבודה הנוכחית, מצאנו העוצמה השושלת מוגבלת של תאי PVAT, נגזר בהשוואה הנגזרות מח עצם MSC, רומז חוסר או מינימלי אוכלוסיית נגזר שומן בתאי גזע שאפיינו רקמות שומן אנושיים אחרים. שיקול עבור פרוטוקול זה הוא ההשתנות הצפוי בין דגימות האנושי, אשר עשוי להשפיע על המספר של גזע/ובתאים בתוך המדגם PVAT ואת היכולת שלהם עוברים בידול שושלות שונות. גיל, מגדר, BMI, תרופות, פרמטרים קליניים אחרים עשויים להשפיע על פנוטיפ של ובתאים בתוך PVAT. לפיכך, שינויים העתידי הצפוי של פרוטוקול זה ממתינים אוכלוסיה קדמון ברורה יותר בתוך PVAT האנושי, ואולי באמצעות מיון תא לבודד ספציפי תת אוכלוסיות למחקרי היוחסין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו להכיר את הסיוע של ניווט המחקר במרכז הרפואי מיין עבור סיוע הרכש של רקמות קליני, ואת Histopathology ליבה Histomorphometry (נתמך על-ידי 1P20GM121301, ל Liaw PI)-המחקר במרכז הרפואי מיין מכון חלוקתה, מכתים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH להעניק R01 HL141149 (ל' Liaw).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| Antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| Biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| Bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4 °C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| Bell strainer (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| Gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| Insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| Pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| Penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| Rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M.
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W.
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
