Summary
Her præsenterer vi en protokol, der beskriver isolation og dyrkning af brusk bruskeksplantater fra kvæg knæ. Denne metode giver et let og tilgængeligt værktøj til at beskrive vævs ændringer som reaktion på biologiske stimuli eller nye Therapeutics rettet mod leddet.
Abstract
Ex vivo kultur systemer dækker en bred vifte af eksperimenter dedikeret til at studere væv og cellulære funktion i en Native indstilling. Brusk er et unikt væv vigtigt for korrekt funktion af synovialleddet og er sammensat af en tæt ekstracellulær matrix (ECM), rig på proteoglycan og type II kollagen. Chondrocytter er den eneste celletype, der findes inden for brusk og er udbredt og relativt lav i antal. Ændrede eksterne stimuli og cellulære signalering kan føre til ændringer i ECM sammensætning og forringelse, som er vigtige patologiske kendetegn i sygdomme som slidgigt (OA) og reumatoid arthritis.
Ex vivo brusk modeller tillade 1) profilering af af medierede ændringer af brusk væv omsætning, 2) visualisering af brusk ECM sammensætning, og 3) af omlægning direkte i vævet. Profilering disse ændringer som reaktion på stimuli eller behandlinger er af stor betydning i forskellige aspekter af brusk biologi, og supplere in vitro eksperimenter i isolerede chondrocytter, eller mere komplekse modeller i levende dyr, hvor eksperimentelle betingelser vanskeligere at kontrollere.
Brusk bruskeksplantater præsentere en translationel og let tilgængelig metode til vurdering af vævs remodeling i brusk ECM i kontrollerbare indstillinger. Her beskriver vi en protokol til isolering og dyrkning af levende kvæg brusk udstillinger. Metoden bruger væv fra kvæg knæet, som er let tilgængeligt fra det lokale slagteri. Både bruskeksplantater og konditioneret kulturmedium kan analyseres for at undersøge vævs omsætning, ECM sammensætning, og af funktion, og dermed profilering ECM modulation.
Introduction
Chondrocytter producerer og vedligeholder brusk matrixen. For at studere biologi af chondrocytter og hvordan de og de omgivende ECM reagerer på eksterne stimuli, er det afgørende at afhøre dem i deres oprindelige miljø1,2. Undersøgelse brusk omsætning væv er vigtigt at forøge forståelsen af de underliggende mekanismer i fælles sygdomme som OA, en sygdom, som der er i øjeblikket ingen sygdomsmodificerende behandling. Der er derfor et betydeligt behov for bedre oversættelses modeller2.
Ex vivo karakterisering af celle-og vævs effekter er afgørende for at supplere andre prækliniske modeller, både in vitro, såsom af enkeltlags kulturer, og in vivo, såsom kirurgi-induceret OA modeller eller autoimmune kollagen-induceret arthritis model (CIA ). Talrige undersøgelser har fremhævet forskellene mellem, hvordan celler opfører sig i 2D enkeltlags kulturer og 3D-strukturer eller i deres indfødte væv3,4. Mange celler i 2D lag vedtage unaturlige morfologier, herunder forskelle i celle polaritet og væv fastgørelse, hvilket resulterer i både visuelle og funktionelle forskelle i celler i indfødte væv5. Forskellene er også tydeligt i funktionaliteten af cellerne, som kan skifte protein ekspression, hvilket fører til dybt ændrede differentierings mønstre, regulerings maskineri og celle funktionalitet5,6,7 ,8.
Brusk ECM består hovedsageligt af type II kollagen giver en matrix ramme, og aggrecan, en proteoglycan, der hjælper med at bevare væske i vævet. Andre matrix molekyler såsom kollagen type IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectin, brusk oligomerisk protein (COMP), biglycan, decorin og perlecan er også til stede9.
Mens ætiologi af OA forbliver uklart10,11, sygdommens indtræden menes at være forårsaget af ubalancer i vævs omsætning og reparationsprocesser12,13. Nedbrydningen af ledbrusken er et kendetegn for OA. Brusk-residente chondrocytter eller celler i det omgivende væv øger deres frigivelse af cytokiner, stimulerer forhøjet produktion af proteinaser såsom matrix metalloproteinaser (MMPs) og aggrecanaser, hvilket øger nedbrydningen af brusk ECM 14. denne nedbrydning resulterer i frigivelse af små unikke proteinfragmenter kaldet neo-epitopes, som kan kvantificeres i serum, urin, eller kulturmedium15. Ved dannelse og modning af kollagen frigives såkaldte profragmenter også; disse kan kvantificeres som et mål for matrix produktion16.
Formålet med denne protokol er at etablere en ex vivo-brusk model for at sammenligne virkningen af stimulation og/eller narkotikabehandling på ECM-vævs omsætningen. Brusk omsætningen profileret ved at måle matrix-afledte neo-epitope biomarkører direkte i det konditionerede kulturmedium ved hjælp af ELISA: AGNx1 (reflekterende aggrecanaseaktivitet), C2M (reflekterende matrix MMP aktivitet) og ProC2 (reflekterende type II kollagen dannelse). Resultaterne kan verificeres ved histologisk farvning af ECM, som også visualiserer organiseringen af chondrocytter i de enkelte explants. Den beskrevne protokol kan bruges til at teste effekten af nye behandlinger på af funktion og brusk ECM omsætning. En række undersøgelser har brugt brusk bruskeksplantater til at beskrive biologiske processer eller virkningen af intervention på cytokinudfordrede bruskeksplantater ved hjælp af kvantitative histologiske eller immunhistokemiske tilgange, mRNA, protein ekspression eller proteomics2 ,17,18. Men disse protokoller er uden for rammerne af det nuværende manuskript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vævs isolering
- Vævs forsyning
- Udfør hele afsnittet om vævs forsyning uden for en laminar flow hætte i et aseptisk miljø.
- Fra det lokale slagteri, få en hel fersk kvæg tibiofemoral knæfælles fra kalve mellem 1,5 og 2 år.
- Forsigtigt dissekere læggen knæ ved først at fjerne det overskydende kød, afdække kondyles, meniscus, sener, og synovialmembranen. Skær sener og synovial membran, gør det muligt for fælles at Dismember. Fjern menisk for at afsløre femorale kondyler.
- Isolerer bruskeksplantater fra det bærende område af femorale kondyler ved hjælp af en 3 mm biopsi Puncher og frigør dem fra den artikulære overflade ved at skære med en skalpel parallelt med og så tæt på subchondral knoglen som muligt. Den hårde struktur af den subchondrale knogle bør sikre, at bruskeksplantater ikke indeholder forkalcificeret matrix. Stræbe efter bruskeksplantater med ensartet højde.
- Opbevar og bland straks bruskeksplantater i DMEM/F12-glutamax + 1% P/S kulturmedium i et 50 ml rør eller Petri skål. Bland ikke bruskeksplantater fra forskellige ko knæ, men hold adskilt for hver undersøgelse.
- Vævsdyrkning
- Overfør explanterne til en steril 96-brønd plade i en laminar flow hætte.
- Vask bruskeksplantater 3 gange i kulturmedium eller PBS og kultur dem i 200 μl af kulturmedium pr. brønd indtil eksperimentet påbegyndes. Brug en udvaskningen periode på 1 dag til at synkronisere biopsi cellulære aktivitet og passiv biomarkør frigivelse.
- Kultur explanterne op til 10 uger i en 37 °C inkubator med 5% CO2. Placer alle replikater inden for hver gruppe diagonalt i kultur pladen for at minimere variationen induceret ved fordampning. For yderligere at undgå fordampning af supernatanten tilsættes PBS til kultur pladens udvendige brønde.
2. behandling af bovinbrusk og vurdering af metabolisk aktivitet
- Kulturmedium ændring og behandling
- Skift kulturmediet hver 2-3 dage i en laminar flow hætte.
- Hvis du anvender nogen behandlinger, forberede disse før udskiftning af mediet. Forbered behandlingerne til den ønskede koncentration i forklaringsboringen ved fortynding i dyrkningsmediet.
- Fjern forsigtigt supernatanten fra hver brønd og overfør den til en ny 96 brønd plade. Supernatanten opbevares med tætnings tape ved − 20 °C for biomarkør analyse af vævs omsætning og protein ekspression.
- Tilsæt straks 200 μL frisk dyrkningsmedium eller behandling pr. brønd. Lad ikke explanterne tørre ud under medium forandring og sørg for, at alle bruskeksplantater er helt nedsænket i det nye medium.
- Resazurin-farvning
- Måle metabolisk aktivitet én gang ugentligt som en indirekte måling af cellens levedygtighed. Resazurin-testen er en nem måde at vurdere, om explanternes metaboliske aktivitet forringes for en individuel explant på grund af celledød eller cellulære ændringer. Explants i kulturmedium alene har en relativt stabil resazurin-aflæsning i hele eksperiment perioden.
- Lav en opløsning af kulturmedium med 10% resazurin.
- Høst supernatanten som beskrevet i trin 2.1.3.
- Explanterne nedsænkes i 10% resazurin-opløsning i 3 timer ved 37 °C, eller indtil Supernatanterne bliver lilla. Medtag 4 brønde uden bruskeksplantater som baggrundskontrol.
- Overfør konditioneret og baggrundskontrol resazurin-opløsningen til en sort mikrotiterplade, og mål fluorescens ved 540 nm excitation/590 nm emission.
- Vask grundigt 3 gange i dyrkningsmediet eller PBS og sænk explanterne i vaske mediet i 5-10 min for at give resazurin fuldstændig diffus ud. Tilføj nyt dyrkningsmedium eller behandlinger, hvis det bruges.
3. opsigelse, fiksering og prøve opbevaring
- Ophør af dyrkningsperioden
- Mål den metaboliske aktivitet som beskrevet i trin 2,2. Tilsæt 200 μL PBS pr. brønd.
- Fiksering og opbevaring
- Fjern PBS, tilsæt 200 μL formaldehyd pr. brønd, og lad det stå i 2 timer ved stuetemperatur.
- Bortskaf formaldehyd, og tilsæt 200 μL PBS pr. brønd. Dæk pladen med tætnings tape, og opbevar ved 4 °C for Histokemisk analyse. Vi anbefaler, at du udfører Histokemisk analyse inden for 3 måneder.
4. biomarkører med vævs omsætning (ELISA)
- Indirekte konkurrenceprægede ELISAs
- En streptavidin-plade med den specifikke biotinyleret assay Target-peptid fortyndet 1:100 i analyse buffer (100 μL pr. brønd) i 30 min ved 20 °C.
- Vask 5 gange med standard vaskebuffer og tilsæt prøve-supernatant (20 μL pr. brønd) sammen med det primære monoklonale antistof mod analyse målet-peptid fortyndet 1:93.3 for ProC2 og 1:100 i analyse buffer for AGNx1 (100 μL pr. brønd) og Inkuber i 2 timer ved 20 °C med rystning for ProC2 og 3 timer ved 20 °C for AGNx1.
Bemærk: prøvevolumenet tages direkte fra de lagrede supernatanten plader. Hvis den målte koncentration er ude af analyse måleområdet, fortyndes supernatanten i en v-bundet fortyndings plade i PBS eller analyse buffer. - Vask 5 gange med standard vaskebuffer og inkuberes med peroxidase-mærket sekundært antistof fortyndet 1:100 i analyse buffer (100 μL pr. brønd) i 1 time ved 20 °C.
- Vask 5 gange med standard vaskebuffer og Inkuber med omrystning i 15 minutter i mørke ved 20 °C med tetramethylbenzidin (TMB) som peroxidase substrat (100 μL pr. brønd).
- Afslut reaktionen med standard Stopopløsningen, 0,1 M H2så4 (100 μl pr. brønd).
- Læs den kolorimetriske reaktion ved 450 Nm absorbans ved hjælp af en reference absorbans ved 650 nm på en standard laboratorie plade læser.
- Direkte konkurrencedygtige ELISAs til måling af brusk omsætningen i supernatanten
Bemærk: dette kvantificerer C2M.- En streptavidin-plade med specifik biotinyleret assay Target-peptid fortyndet 1:100 i analyse buffer (100 μL pr. brønd) i 30 min ved 20 °C.
- Vask 5 gange med vaskebuffer og tilsæt prøve-supernatant sammen med 100 μL peroxidase-mærket monoklonalt antistof mod analyse målet-peptid fortyndet 1:100 i analyse buffer (20 μL pr. brønd). Inkuber i 20 timer ved 2 – 8 °C ved omrystning.
Bemærk: prøvevolumenet tages direkte fra de lagrede supernatanten plader. Hvis den målte koncentration er ude af analyse måleområdet, fortyndes supernatanten i en v-bundet fortyndings plade i PBS eller analyse buffer. - Vask 5 gange med standard vaskebuffer og Inkuber med omrystning i 15 minutter i mørke ved 20 °C med TMB som peroxidase substrat (100 μL pr. brønd).
- Afslut reaktionen med standard Stopopløsningen, 0,1 M H2så4 (100 μl pr. brønd).
- Den kolorimetriske reaktion aflæses ved 450 Nm absorbans med en reference absorbans ved 650 nm på en standard laboratorie plade læser.
- AGNx1
- Kvantificere aggrecan nedbrydning ved at måle frigivelsen af AGNx1 neo-epitope. Denne indirekte konkurrencemæssige ELISA-analyse er rettet mod aggrecan C-Terminal peptid (NITEGE373) genereret af adamts-4 og 5 spaltning. Det monoklonale antistof genkender alle fragmenter med en eksponeret NITEGE epitope. De eksperimentelle detaljer i analysen er blevet offentliggjort andetsteds19.
- ProC2
- Kvantificere type II-kollagen dannelse ved at måle frigivelsen af profragmenter af type II kollagen. Denne indirekte konkurrencemæssige Elisa-analyse er rettet mod epitop af piibnp propeptid (qdvrqpg) genereret af N-propeptidaser under trimning af nyligt syntetiseret type II kollagen. De eksperimentelle detaljer i analysen er blevet offentliggjort andetsteds16.
- C2M
- Kvantificere type II kollagen nedbrydning ved at måle frigivelsen af C2M neo-epitope fragment. Denne direkte konkurrenceprægede ELISA genkender MMP-cleaved C-Terminal peptid (KPPGRDGAAG1053). Denne analyse adskiller sig fra AGNx1 og ProC2, da det er det primære antistof, der er peroxidase-mærket og dermed anvendes som detektor. De eksperimentelle detaljer i analysen er blevet offentliggjort andetsteds20.
5. histologisk analyse
- Infiltration, indlejring og skæring
- Anbring de fikseret bruskeksplantater (Se trin 3,2) i individuelt mærkede kassetter. Medtag både en etiket i kassetten og etiketkassetterne for at sikre identifikation.
- Kassetterne, der indeholder bruskeksplantater, overføres til en vævs forarbejdnings maskine. Derefter infiltrere bruskeksplantater med paraffin i en serie af dehydrering og paraffin infiltration trin.
- Dehydrat med 96% ethanol til 90 min uden temperatur justering. Gentag dette trin 3 gange.
- Ryd ethanol med toluen i 90 min. uden temperatur justering. Gentag dette trin 2 gange.
- Fjern ethanol med toluen i 90 min ved 60 °C.
- Infiltrere med paraffin i 30 min ved 60 °C.
- Infiltrere med paraffin til 60 min ved 60 °C.
- Infiltrere med paraffin til 90 min ved 60 °C.
- For hvert trin tilsættes løsningerne til prøvekammeret med langsomme pumpe-og pumpe strømme under 33 – 34 kPa. Kør infiltrations processen i en Tryk/vakuum cyklus med et maksimum vakuum på − 65 til − 70 kPa.
- Efter infiltration placeres kassetterne på en varmeblok for at muliggøre omhyggelig fjernelse af bruskeksplantater fra kassetten. Integrer forsigtigt de infiltrerede bruskeksplantater i individuelle paraffinblokke. Med opvarmede pincet placeres explanterne med den overfladiske artikulære brusk og subchondrale knogle sider vinkelret på skæroverfladen, hvilket sikrer visualisering af de forskellige brusk lag inden for hvert prøveafsnit.
- Skær 5 μm sektioner af kølede paraffinblokke med indlejrede bruskeksplantater på en mikrotom. Overfør de afskårne sektioner til et koldtvandsbad. Om nødvendigt kan sektioner adskilles ved hjælp af enten en skalpel eller et cover glas.
- Brug en ubelagt glas rutsjebane omhyggeligt til at overføre sektionerne til et varmt vandbad (50 °C), hvor sektionerne udfolder sig. Løft hver sektion op på et mærket dækglas, og Placer den på en kogeplade i 30 minutter.
- Placer gliderne i en kurv og Inkuber ved 60 °C i 1 time, og opbevar dem derefter natten over ved 37 °C. Herefter opbevares slides i lukkede beholdere ved 4 °C indtil farvning.
- Safranin O/hurtig grøn farvning og visualisering
- Placer slidene til at blive plettet i en kurv og inkubere gliderne ved 60 °C i 1 time.
- Forbered og Filtrer alle reagenser med et 0,45 mm filter.
- Som forberedelse til farvning hældes de filtrerede reagenser i bægre til et volumen, der gør det muligt for løsningerne helt at dække diasene, når kurven nedtreres. De anvendte bægre krævede et volumen på 250 mL til at dække gliderne.
- Deparaffinize de smeltede slides ved at nedsænke kurven i toluen i 10 minutter to gange, 99% ethanol i 2 minutter to gange, 96% ethanol i 2 minutter to gange, og 70% ethanol i 2 minutter to gange. Derefter hydreres diasene i vand i 2 minutter.
- Pletten afparaffineret og hydrerede slides ved at nedsænke kurven i Weigerts jern Hematoxylin-opløsning (pH 1,5) i 10 min, dip i 1% HCl én gang, og skyl med rindende ledningsvand i ca. 5 min eller indtil overskydende farve har skyllet væk.
- Dernæst pletter i 0,05% hurtig grøn opløsning (pH: 5,75) i 5 min, dip i 1% CH3COOH én gang, og bejdsning i 0,1% safranin O (ph: 6,5) for 20 min.
- Dehydrat og rydde slides ved at dyppe to gange i 70% ethanol, 96% ethanol for 2 min to gange, 99% ethanol for 2 min to gange, og toluen 2 min to gange.
- Monter de ubestrøget glas glider med harpiksholdige medium, der dækker de histologiske slides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bovin fuld-dybde bruskeksplantater blev isoleret, dyrket og behandlet i 3 uger (figur 1). Dyrkningsmediet blev ændret med tilsætning af behandling 3 gange om ugen. En gang ugentligt blev metabolisk aktivitet målt ved resazurin-analysen. Biomarkører af ECM omsætning blev målt i supernatanten høstet fra kultur pladen 3 gange om ugen. Explants blev inddelt i 4 grupper til behandling: 1) Oncostatin M og TNFα (O + T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) insulin som vækstfaktor-1 (IGF-1); og 4) en kontrol uden behandling (w/o).
Metabolisk aktivitet.
For alle fire grupper var den metaboliske aktivitet forholdsvis stabil i løbet af de 3 uger (figur 2A). Der var en tendens til IGF-1 til at øge den metaboliske aktivitet lidt over w/o-gruppen og for O + T grupper til at sænke den. Resazurin-analysen blev anvendt til let at vurdere chondrocyternes aktivitet i hver forklaringog til indirekte at vurdere cellernes levedygtighed uden at udtrække explanter fra eksperimentet. Hvis en explant viser et betydeligt fald i metabolisk aktivitet under forsøget, kan forklaringen udelukkes fra yderligere analyse.
Katabolisk behandling.
O + T blev anvendt 3 gange ugentligt på kultur brøndene for at undersøge nedbrydningen af O + T-medieret brusk (figur 3, figur 4). MMP-medieret type II-kollagennedbrydning og aggrecanase-medieret aggrecan-nedbrydning blev vurderet af C2M og AGNx1 ELISAs. O + T øget type II kollagen nedbrydning fra dag 7-21 (figur 3a) og aggrecan nedbrydning fra dag 3-14 (figur 4a) sammenlignet med w/o-gruppen. Ved tilsætning af GM6001 (en bredspektret MMP-hæmmer) i kombination med O + T-behandling blev O + T-medieret C2M frigivelse blokeret (figur 3a, B). En nedsat AGNx1 frigivelse blev observeret, når du tilføjer GM6001 på dage 3-7, men AGNx1 frigivelse toppe på dag 10 på samme niveau til O + T-gruppen (figur 4A), hvilket indikerer GM6001 kun mindsker aggrecan forringelse i begrænset omfang. Dette mønster i AGNx1 og C2M frigivelse er det generelle billede observeret i kvæg brusk model stimuleret med O + T. For det første frigives AGNx1 fra ca. dag 3 og toppe på dage 10-14, hvilket repræsenterer en tidlig nedbrydning af aggrecan. Næste, efter 2 ugers dyrkning med O + T, type II kollagen nedbrydning observeres som målt af C2M biomarkør.
Anabolske behandling.
For at undersøge, hvordan anabolske stimulation modulerer brusk ECM omsætning, insulin som vækstfaktor-1 (IGF-1) blev anvendt 3 gange ugentligt til kvæg fuld dybde explants. Effekten af IGF-1 på brusk bruskeksplantater blev primært observeret på målinger af type II kollagen dannelse, vurderet af ProC2, som forventet for anabolske stimuli (figur 5). Dag 0 i denne model viser altid høje ProC2 målinger, måske som en reaktion på ekstraktionen af prøver. Disse høje niveauer falder betydeligt og niveau ud fra dage 7-21. Ved behandling med IGF-1, de ProC2 niveauer falder mindre end dem, der er observeret i w/o-gruppen, hvilket indikerer, at IGF-1 stimulerer type II kollagen dannelse fra dag 7 (figur 5B). De ProC2 grafer viser også den biologiske variation af køer. Der blev anvendt bruskeksplantater fra to køer i disse eksperimenter med 6 bruskeksplantater pr. ko pr. gruppe. Den første ko havde tykkere brusk og genereret større explants, hvilket resulterede i højere ProC2 niveauer ved baseline, mens den anden ko var mindre med tyndere brusk, hvilket resulterede i lavere ProC2 niveauer ved baseline. For w/o, IGF-1, og o + T grupper, de ProC2 niveauer afbildet repræsenterer middelværdien af de bruskeksplantater fra begge køer, men GM6001 blev målt kun i den anden ko med tyndere bruskeksplantater. Således startede GM6001 gruppen med lavere ProC2 niveauer på dag 0, hvilket er tydeligt i ProC2 området under kurven (AUC) (figur 5C). Normalisering af ProC2-værdierne til dag 0-niveauerne tager hensyn til den biologiske varians, hvilket viser behandlingens effektivitet (figur 5B, D).
Safranin O og hurtige grønne histologiske faringer blev udført for at visualisere proteoglycan-indholdet og brusk strukturen i forklarings hele forsøget (figur 6). På dag 0, 7, 14 og 21 blev bruskeksplantater fra w/o-, IGF-1-og o + T-gruppen fikseret til histologisk farvning (figur 6). W/o og IGF-1 gruppen syntes at have lignende safranin O farvning intensitet til dag 0 explant hele forsøget, som korrelerer med biomarkør resultater viser, at ingen af de to grupper øget AGNx1 frigivelse (figur 4). Behandling med O + T resulterede i betydelige proteoglycan tab af indhold på dag 7 og fuldstændig tab på dag 21. Desuden falder den hurtige grønne farvnings intensitet fra dag 14-21, hvilket indikerer et kollagen tab i overensstemmelse med de C2M resultater.
Figur 1: skematisk oversigt over metoden for kvæg brusk.
På dag − 1 blev bovine femorale kondyler isoleret fra bagtibiofemoral leddet. Fuld-dybde brusk bruskeksplantater blev frigivet fra kondyles med en skalpel og biopsi Puncher. De ekstraherede bruskeksplantater blev vasket og overført til en steril 96 brønd kultur plade. På dag 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 og 21 blev supernatanten høstet fra kultur pladen, overført til en opbevarings plade og holdt ved − 20 °C, som illustreret i medium Change trin 1. Den opbevarede supernatanten blev senere optøet til måling af biomarkører af vævs omsætningen ved specifikke ELISA-assays. I medium Change trin 2, efter fjernelse af supernatanten, blev der anvendt nyt dyrknings medium indeholdende de forskellige behandlinger eller ingen behandling for kontrol bruskeksplantater. På dag 0, 7, 14 og 21 blev explanterne inkuberet med 10% resazurin-opløsning i 3 timer efter høst af supernatanten. 10% resazurin supernatanten blev overført til en sort 96-brønd plade, hvor den kolorimetriske reaktion blev målt. Kultur brøndene blev vasket 3 gange, før nye dyrkningsmedier med eller uden behandling blev føjet til explanterne som vist i medium Change trin 2. På dag 21, efter høst af supernatanten og resazurin måling, blev bruskeksplantater fikseret ved inkubation med formaldehyd for 2 h. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: metabolisk aktivitet målt ved resazurin.
Bovin fyldig brusk bruskeksplantater blev isoleret og kultiveret i 3 uger. Kulturmediet blev ændret med tilføjelsen af ny behandling 3 gange om ugen (n = 12 bruskeksplantater fra 2 køer). Behandlingen bestod af IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL] og O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrolgruppe uden behandling (w/o) var inkluderet. For w/o-, IGF-1-og O + T-gruppen vises middelværdien og standardfejlen for middelværdien (SEM) på 12 replikater fra 2 køer (6 replikater pr. ko). For gruppen GM6001 vises middelværdien og SEM på 6 replikater fra 1 ko. A) metabolisk aktivitet målt ved resazurin. B) arealet under kurven (AUC) for dage 0-21 for de metaboliske aktivitets grafer, der er vist i litraa). p > 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: nedbrydning af type II-kollagen målt ved C2M.
Bovin fyldig brusk bruskeksplantater blev isoleret og kultiveret i 3 uger. Kulturmediet blev ændret med tilføjelsen af ny behandling 3 gange om ugen. Behandlingen bestod af IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL] og O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrolgruppe uden behandling (w/o) var inkluderet. For w/o-, IGF-1-og O + T-grupperne vises middelværdien og SEM på 12 replikater fra 2 køer (6 replikater pr. ko). For gruppen GM6001 vises middelværdien og SEM på 6 replikater fra 1 ko. A) C2M målinger. Statistisk signifikansniveau af w/o blev beregnet ved gentagne målinger (RM) to-vejs ANOVA med Sidaks multiple sammenligningstest. B) AUC for dage 0-21 for C2M grafer, der er vist i litraa). Den statistiske signifikans blev beregnet af Kruved-Wallis-testen med Dunns multiple sammenligningstest. p > 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: nedbrydning af Aggrecan målt ved AGNx1.
Bovin fyldig brusk bruskeksplantater blev isoleret og kultiveret i 3 uger. Kulturmedium blev ændret med tilføjelse af ny behandling 3 gange om ugen. Behandlingen bestod af IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL] og O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrolgruppe uden behandling (w/o) var inkluderet. For w/o-, IGF-1-og O + T-gruppen vises middelværdien og SEM på 12 replikater fra 2 køer (6 replikater pr. ko). For gruppen GM6001 vises middelværdien og SEM på 6 replikater fra 1 ko. A) AGNx1 målinger. Statistisk signifikansniveau af w/o blev beregnet af RM tovejs ANOVA med Sidaks multiple sammenligningstest. B) AUC for dage 0-21 for AGNx1 grafer, der er vist i litraa). Den statistiske signifikans blev beregnet af Kruved-Wallis-testen med Dunns multiple sammenligningstest. * *p > 0,01, * * *p > 0,001, * * * *p > 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: type II-kollagendannelse målt ved ProC2.
Bovin fyldig brusk bruskeksplantater blev isoleret og kultiveret i 3 uger. Kulturmediet blev ændret med tilføjelsen af ny behandling 3 gange om ugen. Behandlingen bestod af IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL] og O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrolgruppe uden behandling (w/o) var inkluderet. For w/o-, IGF-1-og O + T-gruppen vises middelværdien og SEM på 12 replikater fra 2 køer (6 replikater pr. ko). For GM6001 gruppen, den gennemsnitlige og SEM af 6 replikater fra 1 ko re vist. A) ProC2 målinger fra dag 0-21. (B) ProC2 værdier normaliseret til dag 0 målinger for hver enkelt explant. De ProC2 resultater nyder ofte godt af dag 0 normalisering for at afdække den behandlingseffekt, der kan være forklædt af de høje biomarkør niveauer på dag 0. I A og Bblev det statistiske signifikansniveau beregnet af RM tovejs ANOVA med sidaks multiple sammenligningstest. C) AUC for dage 0-21 for ProC2 grafer, der er vist i litraa). D) AUC for dage 0-21 for dag 0 normaliseret ProC2 grafer vist i (B). I C og Dblev den statistiske signifikans beregnet ved krutil-Wallis-testen med Dunns multiple sammenligningstest. * *p > 0,01, * * *p > 0,001, * * * *p > 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: histologisk visualisering af proteoglycan-indhold af safranin O/hurtig grøn farvning.
Bovin fyldig brusk bruskeksplantater blev isoleret og kultiveret i 3 uger. Kulturmediet blev ændret med tilføjelsen af ny behandling 3 gange om ugen. Behandling bestod af IGF-1 [100 ng/mL] og OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL]. En kontrolgruppe uden behandling (w/o) var inkluderet. På dag 0, 7, 14 og 21 blev bruskeksplantater fikseret, infiltreret med paraffin, indlejret i paraffin, skåret, anbragt på Cover slides og plettet med hematoxylin, safranin O og hurtig grøn. For hver behandlingsgruppe og hvert tidspunkt vises en repræsentativ forklaring. Den scalebar, der er vist i referenceprøven (dag 0), repræsenterer 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der her præsenteres for profilering af brusk omsætningen i kvæg brusk, kan anvendes til karakterisering af behandlingseffekterne af mange typer lægemidler, herunder hæmmere af inflammatoriske intracellulære veje, hæmmere af Proteolytiske enzymer eller anabolske vækstfaktorer.
To forskellige opsætninger blev beskrevet i denne protokol: en anabolsk setup hvor bruskeksplantater blev stimuleret med insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1), og en katabolisk opsætning omfattende stimulation med TNF-alpha og oncostatin M, hvor vævs omsætningen kan hæmmet ved hjælp af en bredspektret MMP-hæmmer. Det vigtigste output i denne metode er kvantificeringen af neo-epitope biomarkører direkte i det konditionerede medium, som høstes i hele kultur perioden. Flere biomarkører kan måles i supernatanten, giver mulighed for samtidig profilering af forskellige kataboliske og anabolske processer i samme prøve. Histologisk farvning med safranin O/fast Green blev anvendt til at validere resultaterne fra biomarkør analysen. Oncostatin M, TNF-alpha, og IGF-1 blev brugt til at beskrive protokollen; Men, metoden er ikke begrænset til specifikke cytokin Stimulatorer og disse kan nemt veksles til andre afhængigt af hypotesen eller test behandling.
Fortolkning af biomarkør output er en tidsmæssig øvelse på grund af de dynamiske ændringer i af funktion og udtryks profiler med anabolske eller kataboliske stimulation over tid. I ubehandlet explants falder type II-kollagendannelse målt ved biomarkør ProC2 hurtigt inden for de første 7-10 dage. Stimulation med IGF-1 eller lignende vækstfaktorer bevarer ProC2 frigivelse i konditioneret medium på et niveau, der kan sammenlignes med baseline; således er nedgangen mere gradvis, og frigivelsen er øget i forhold til ubehandlet explants. I en katabolisk opsætning inducerer pro-inflammatoriske cytokiner øget ekspression af proteaser af af i dag 0-14; Dette består hovedsagelig af aggrecanaser. Dette forårsager en første stor stigning i aggrecanase-afledte proteinfragmenter, herunder AGNx1. På de senere stadier af kulturen, chondrocytter udtrykker flere MMPs, som driver frigivelsen af MMP-genererede markører, såsom C2M, omkring dag 14 og fremefter. For at profilere effekten af en behandling er det derfor vigtigt at måle biomarkører i det rigtige tidsinterval.
Som beskrevet vil behandling med inflammatoriske cytokiner såsom O + T-cocktail medføre nedbrydning af brusk vævet over tid. Den samlede pulje af ECM er begrænset af explant størrelse og bør overvejes, når analysere biomarkør profil. Derfor, efter den indledende stigning i biomarkør frigivelse, niveauerne kan falde med tiden simpelthen på grund af reduktionen i den resterende mængde af explant ECM.
Tidligere, OA blev primært betragtet som en sygdom i artikulær brusk. Men, nylige undersøgelser tyder på, at OA bør betragtes som en sygdom i hele leddet, hvor tidlige sygdomsrelaterede ændringer i de enkelte fælles rum, synovium, knogle, og brusk, forekomme parallelt, og over tid resultere i ledfejl12 ,21. Det er derfor vigtigt at erkende, at i denne model system, brusken er isoleret fra resten af leddet (og organismen), begrænse indflydelsen af væv interaktion effekter og systemiske faktorer, der kan regulere homøostase af vævet. I stedet er det en forenklet enkelt vævskultur, hvor eksperimentelt kontrollerede forhold kan moduleres for at detektere patologiske eller interventionelle ændringer i vævet ved hjælp af biokemiske teknikker, biomarkører eller histologisk visualisering. På grund af arkitekturen i brusk, variation i celle nummer, matrix sammensætning, og mængden variation forventes både mellem bruskeksplantater og mellem vævs kilder. Fordi den relative størrelse af biomarkør output kan være forskellige mellem eksperimenter, anbefales det at normalisere datasæt for bedre sammenligning.
For at sikre den mindst mulige variation og de bedste resultater er det vigtigt at bruge brusk fra knæ, der er så friske som muligt, fortrinsvis mellem 1 og 24 timer efter butchering. Isolering af brusk væv bør ske på en homogen måde med bruskeksplantater er omtrent den samme tykkelse. Explants bør isoleres fra områder med tyk brusk, så de områder, der er tættest på midten, undgås. Vævet skal altid være fugtigt for at undgå celledød og matrix nedbrydning. Længden af eksperimentet3, tiden mellem medium ændringer, timing af cytokin stimulation, og behandlingsintervaller kan justeres til at passe den hypotese størrelse virkningsmekanisme af den enkelte sammensatte eller mekanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CST, ACBJ og MK er medarbejdere i Nordisk Bioscience. ACBJ og MK besidder aktier i Nordisk Bioscience. De resterende forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker det tekniske personale hos Nordic Bioscience for laboratorie støtte samt det danske forskningsinstitut for generel støtte til vores forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , Academic Press. New York. (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care? Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet? Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments? Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype? Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
