Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Isolierung und Kultivierung von Knorpelexpflanzen von Rinderknien beschreibt. Diese Methode bietet ein einfaches und zugängliches Werkzeug, um Gewebeveränderungen als Reaktion auf biologische Reize oder neuartige Therapeutika, die auf das Gelenk abzielen, zu beschreiben.
Abstract
Ex-vivo-Kultursysteme decken eine breite Palette von Experimenten ab, die sich der Untersuchung von Gewebe und zellulärer Funktion in einer nativen Umgebung widmen. Knorpel ist ein einzigartiges Gewebe, das für die ordnungsgemäße Funktion des Synovials wichtig ist und aus einer dichten extrazellulären Matrix (ECM) besteht, die reich an Proteoglykan und Typ-II-Kollagen ist. Chondrozyten sind der einzige Zelltyp, der im Knorpel vorliegt und weit verbreitet und relativ gering ist. Veränderte äußere Reize und zelluläre Signalgebung können zu Veränderungen in der Zusammensetzung und Verschlechterung des ECM führen, die wichtige pathologische Kennzeichen bei Krankheiten wie Arthrose (OA) und rheumatoider Arthritis sind.
Ex-vivo-Knorpelmodelle ermöglichen 1) Profilierung von Chondrozyten vermittelten Veränderungen des Knorpelgewebeumsatzes, 2) Visualisierung der Knorpel-ECM-Zusammensetzung und 3) Chondrozyten-Umlagerung direkt im Gewebe. Die Profilierung dieser Veränderungen als Reaktion auf Reize oder Behandlungen ist in verschiedenen Aspekten der Knorpelbiologie von großer Bedeutung und ergänzt In-vitro-Experimente an isolierten Chondrozyten oder komplexere Modelle bei lebenden Tieren, bei denen experimentelle Bedingungen sind schwieriger zu kontrollieren.
Knorpelexplantationen stellen eine translationale und leicht zugängliche Methode zur Beurteilung der Gewebeumgestaltung im Knorpel-ECM in kontrollierbaren Einstellungen dar. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung lebender Rinderknorpelexplantationen. Die Methode verwendet Gewebe aus dem Rinderknie, das von der örtlichen Metzgerei leicht zugänglich ist. Sowohl Explanten als auch konditioniertes Kulturmedium können analysiert werden, um den Gewebeumsatz, die ECM-Zusammensetzung und die Chondrozytenfunktion zu untersuchen und so die ECM-Modulation zu profilieren.
Introduction
Chondrozyten produzieren und pflegen die Knorpelmatrix. Um die Biologie von Chondrozyten zu studieren und wie sie und das umgebende ECM auf äußere Reize reagieren, ist es entscheidend, sie in ihrer heimischen Umgebung zu befragen1,2. Die Untersuchung des Knorpelgewebeumsatzes ist wichtig, um das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen bei Gelenkerkrankungen wie OA zu erweitern, einer Krankheit, für die es derzeit keine krankheitsmodifizierende Behandlung gibt. Folglich besteht ein erheblicher Bedarf an besseren Übersetzungsmodellen2.
Die Ex-vivo-Charakterisierung von Zell- und Gewebeeffekten ist wesentlich, um andere präklinische Modelle zu ergänzen, sowohl in vitro, wie Chondrozyten-Monolayer-Kulturen, als auch in vivo, wie z. B. chirurgisch induzierte OA-Modelle oder das autoimmune Kollagen-induzierte Arthritis-Modell (CIA ). Zahlreiche Studien haben die Unterschiede zwischen dem Verhalten von Zellen in 2D-Monolayer-Kulturen und 3D-Strukturen oder in ihrem nativen Gewebe3,4hervorgehoben. Viele Zellen in 2D-Schichten übernehmen unnatürliche Morphologien, einschließlich Unterschiede in der Zellpolarität und Gewebebindung, was zu visuellen und funktionellen Unterschieden in Zellen innerhalb nativer Gewebeführt 5. Die Unterschiede zeigen sich auch in der Funktionalität der Zellen, die die Proteinexpression verschieben können, was zu tiefgreifend veränderten Differenzierungsmustern, regulatorischen Maschinen und Zellfunktionalität5,6,7 führt. ,8.
Der Knorpel ECM besteht hauptsächlich aus Typ-II-Kollagen, das ein Matrix-Framework bietet, und Aggrecan, einem Proteoglykan, der hilft, Flüssigkeit im Gewebe zu halten. Andere Matrixmoleküle wie Kollagen Typ IV, VI, IX, X, XI, XII, Fibronectin, Knorpel-Oligomerprotein (COMP), Biglycan, Decorin und Perlecan sind ebenfalls vorhanden9.
Während die Ätiologie von OA bleibt unklar10,11, der Beginn der Krankheit wird geglaubt, um durch Ungleichgewichte im Gewebeumsatz und Reparaturprozesse verursacht werden12,13. Der Abbau des Gelenkknorpels ist ein Markenzeichen von OA. Knorpelresidente Chondrozyten oder Zellen in den umgebenden Geweben erhöhen ihre Freisetzung von Zytokinen und stimulieren die erhöhte Produktion von Proteinasen wie Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und Aggrecanasen, die den Abbau von Knorpel ECM erhöhen 14. Dieser Abbau führt zur Freisetzung kleiner einzigartiger Proteinfragmente, sogenannteneo-Epitope, die in Serum, Urin oder Kulturmedium15quantifiziert werden können. Bei der Bildung und Reifung von Kollagen werden auch sogenannte Profragmente freigesetzt; diese können als Maß für die Matrixproduktion quantifiziert werden16.
Ziel dieses Protokolls ist es, ein ex vivo Knorpelmodell zu erstellen, um die Auswirkungen der Stimulation und/oder medikamentösen Behandlung auf den ECM-Gewebeumsatz zu vergleichen. Der Knorpelumsatz wird durch Messung von Matrix-abgeleiteten Neo-Epitop-Biomarkern direkt im konditionierten Kulturmedium mit ELISA profiliert: AGNx1 (reflektierende Aggrecanase-Aktivität), C2M (reflektierende Matrix-MMP-Aktivität) und ProC2 (reflektierendes Typ-II-Kollagen Bildung). Die Befunde können durch histologische Färbung des ECM überprüft werden, die auch die Organisation von Chondrozyten in den einzelnen Explants visualisiert. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung neuartiger Behandlungen auf chondrozytenfunktion und Knorpel-ECM-Umsatz zu testen. In einer Reihe von Studien wurden Knorpelexate verwendet, um biologische Prozesse oder die Wirkung von Interventionen auf zytokinbefragte Explanten mit quantitativen histologischen oder immunhistochemischen Ansätzen, mRNA, Proteinexpression oder Proteomik zu beschreiben2 ,17,18. Diese Protokolle fallen jedoch nicht in den Anwendungsbereich des aktuellen Manuskripts.
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Protocol
1. Gewebeisolierung
- Gewebebeschaffung
- Führen Sie den gesamten Gewebebeschaffungsbereich außerhalb einer laminaren Strömungshaube in einer aseptischen Umgebung durch.
- Vom örtlichen Schlachthof erhalten Sie ein ganzes frisches rindertibiofemorales Kniegelenk von Kälbern zwischen 1,5 und 2 Jahren.
- Sezieren Sie das Wadenknie vorsichtig, indem Sie zuerst das überschüssige Fleisch entfernen und die Kondylen, den Meniskus, die Sehnen und die Synovialmembran aufdecken. Schneiden Sie die Sehnen und die Synovialmembran, so dass das Gelenk zersplittert werden kann. Entfernen Sie den Meniskus, um die Femoralkondylen zu entblößen.
- Isolieren Sie Explanten aus dem tragenden Bereich der Femoralkondylen mit einem 3 mm Biopsie-Stanzer und lösen Sie sie von der Gelenkoberfläche, indem Sie mit einem Skalpell parallel zum subchondralen Knochen schneiden. Die harte Struktur des subchondralen Knochens sollte sicherstellen, dass Expflanzen keine verkalkte Matrix enthalten. Streben Sie nach Explants mit gleichmäßiger Höhe.
- Die Expflanzen sofort in DMEM/F12- GlutaMAX + 1% P/S Kulturmedium in einer 50 ml Tube oder Petrischale aufbewahren und mischen. Mischen Sie keine Expflanzen aus verschiedenen Kuhknien, sondern halten Sie sich für jede Studie getrennt.
- Gewebekultivierung
- Übertragen Sie die Explants auf eine sterile 96-Well-Platte in einer laminaren Strömungshaube.
- Waschen Sie die Explants 3 mal in Kulturmedium oder PBS und kulturen Sie sie in 200 l Kulturmedium pro Brunnen bis zum Beginn des Experiments. Verwenden Sie eine Auswaschzeit von 1 Tag, um die zelluläre Aktivität der Biopsie und die passive Freisetzung von Biomarkern zu synchronisieren.
- Die Explantieren bis zu 10 Wochen in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2. Platzieren Sie alle Replikationen innerhalb jeder Gruppe diagonal in der Kulturplatte, um die durch Verdunstung induzierte Variation zu minimieren. Um die Verdunstung des Überstandes weiter zu vermeiden, fügen Sie PBS an die äußeren Brunnen der Kulturplatte hinzu.
2. Rinderknorpelexplantationsbehandlung und Bewertung der metabolischen Aktivität
- Kulturmedium Veränderung und Behandlung
- Ändern Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage in einer laminaren Strömungshaube.
- Wenn Sie irgendwelche Behandlungen anwenden, bereiten Sie diese vor dem Wechsel des Mediums vor. Bereiten Sie die Behandlungen auf die gewünschte Konzentration in den Explantbrunnen durch Verdünnung im Kulturmedium vor.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig von jedem Brunnen und übertragen Sie ihn auf eine neue 96-Wellplatte. Bewahren Sie den Überstand mit Dichtband bei 20 °C für die Biomarkeranalyse des Gewebeumsatzes und der Proteinexpression auf.
- Fügen Sie sofort 200 l frisches Kulturmedium oder Behandlung pro Brunnen hinzu. Lassen Sie die Explants während des mittleren Wechsels nicht austrocknen und stellen Sie sicher, dass alle Expflanzen vollständig in das neue Medium getaucht sind.
- Resazurin Färbung
- Messen Sie die stoffwechselmetabolische Aktivität einmal wöchentlich als indirekte Messung der Zelllebensfähigkeit. Der Resazurin-Test ist eine einfache Möglichkeit zu beurteilen, ob sich die metabolische Aktivität der Explanten für eine einzelne Explantation aufgrund von Zelltod oder zellulären Veränderungen verschlechtert. Explanten im Kulturmedium allein haben während des gesamten Experimentierzeitraums eine relativ stabile Resazurin-Messung.
- Machen Sie eine Lösung der Kultur Medium mit 10% Resazurin.
- Ernten Sie den Überstand wie in Schritt 2.1.3 beschrieben.
- Die Expflanzen in 10% Resazurinlösung für 3 h bei 37 °C oder bis die Überstande violett werden. Schließen Sie 4 Brunnen ohne Explants als Hintergrundsteuerungen ein.
- Übertragen Sie die konditionierte und Hintergrundsteuerung Resazurin-Lösung auf eine schwarze Mikrotiterplatte und messen Sie fluoreszenz bei 540 nm Anregung/590 nm Emission.
- Waschen Sie gründlich 3 Mal in Kulturmedium oder PBS und tauchen Sie die Ex-Pflanzen in Waschmedium für 5-10 min, damit das Resazurin vollständig ausdiffus. Fügen Sie neue Kulturmedium oder Behandlungen, wenn verwendet.
3. Beendigung, Fixierung und Probenlagerung
- Beendigung der Kultivierungsfrist
- Messen Sie die metabolische Aktivität, wie in Schritt 2.2 beschrieben. Fügen Sie 200 L PBS pro Brunnen hinzu.
- Fixierung und Lagerung
- Entfernen Sie die PBS, fügen Sie 200 l Formaldehyd pro Brunnen hinzu und lassen Sie für 2 h bei Raumtemperatur.
- Das Formaldehyd entsorgen und 200 L PBS pro Brunnen hinzufügen. Bedecken Sie die Platte mit Dichtband und lagern Sie sie bei 4 °C für die histochemische Analyse. Wir empfehlen, die histochemische Analyse innerhalb von 3 Monaten durchzuführen.
4. Biomarker für den Gewebeumsatz (ELISA)
- Indirekte wettbewerbsfähige ELISAs
- Beschichten Sie eine Streptavidin-Platte mit dem spezifischen biotinylierten Assay-Zielpeptid verdünnt 1:100 im Assaypuffer (100 l pro Brunnen) für 30 min bei 20 °C.
- 5 Mal mit Standard-Waschpuffer waschen und Probenüberstand (20 l pro Brunnen) zusammen mit primärem monoklonalen Antikörper gegen das Assay-Target-Peptid verdünnt 1:93,3 für ProC2 und 1:100 im Assaypuffer für AGNx1 (100 l pro Brunnen) und 2 h bei 20 °C inkubieren mit Schütteln für ProC2 und 3 h bei 20 °C für AGNx1.
HINWEIS: Das Probenvolumen wird direkt von den gelagerten Überstandplatten entnommen. Wenn die gemessene Konzentration anicht im Test-Messbereich liegt, verdünnen Sie den Überstand in einer v-bodenförmigen Verdünnungsplatte in PBS oder Assaypuffer. - 5 Mal mit Standard-Waschpuffer waschen und mit peroxidasemarkiertem Sekundärantikörper 1:100 im Assaypuffer (100 l pro Brunnen) für 1 h bei 20 °C inkubieren.
- 5 Mal mit Standard-Waschpuffer waschen und mit Schütteln 15 min im Dunkeln bei 20 °C mit Tetramethylbenzidin (TMB) als Peroxidasesubstrat (100 l pro Brunnen) bebrüten.
- Beenden Sie die Reaktion mit einer Standard-Stopplösung, 0,1 M H2SO4 (100 l pro Brunnen).
- Lesen Sie die kolorimetrische Reaktion bei 450 nm Absorption mit einer Referenzabsorption bei 650 nm auf einem Standard-Laborplattenleser.
- Direkte wettbewerbsfähige ELISAs zur Messung des Knorpelgewebeumsatzes im Überstand
HINWEIS: Dies quantifiziert C2M.- Beschichten Sie eine Streptavidin-Platte mit spezifischem biotinylierten Assay-Target-Peptid verdünnt 1:100 im Assaypuffer (100 l pro Brunnen) für 30 min bei 20 °C.
- 5 Mal mit Waschpuffer waschen und Probenüberstand zusammen mit 100 l peroxidase-markiertem monoklonalen Antikörper gegen den Assay Target-Peptid verdünnt 1:100 im Assaypuffer (20 l pro Brunnen) hinzufügen. 20 h bei 2–8 °C mit Schütteln bebrüten.
HINWEIS: Das Probenvolumen wird direkt von den gelagerten Überstandplatten entnommen. Wenn die gemessene Konzentration anicht im Test-Messbereich liegt, verdünnen Sie den Überstand in einer v-bodenförmigen Verdünnungsplatte in PBS oder Assaypuffer. - 5 Mal mit Standard-Waschpuffer waschen und mit Schütteln 15 min im Dunkeln bei 20 °C mit TMB als Peroxidasesubstrat (100 l pro Brunnen) bebrüten.
- Beenden Sie die Reaktion mit einer Standard-Stopplösung, 0,1 M H2SO4 (100 l pro Brunnen).
- Lesen Sie die kolorimetrische Reaktion bei 450 nm Absorption mit einer Referenzabsorption bei 650 nm auf einem Standard-Laborplattenleser.
- AGNx1
- Quantifizieren Sie den Aggrecan-Abbau, indem Sie die Freisetzung des AGNx1 Neo-Epitops messen. Dieser indirekte wettbewerbsfähige ELISA-Test zielt auf das aggrecan C-Terminal Peptid (NITEGE373) ab, das von ADAMTS-4 und 5 Spaltung erzeugt wird. Der monoklonale Antikörper erkennt alle Fragmente mit einem exponierten NITEGE-Epitop. Die experimentellen Einzelheiten des Assays wurden an anderer Stelle veröffentlicht19.
- ProC2
- Quantifizieren Sie die Kollagenbildung typ II, indem Sie die Freisetzung des Profragments des Kollagentyps II messen. Dieser indirekte wettbewerbsfähige ELISA-Test zielt auf das Epitop des PIIBNP-Propeptids (QDVRQPG), das durch N-Propeptidasen beim Trimmen von neu synthetisiertem Typ-II-Kollagen erzeugt wird. Die experimentellen Einzelheiten des Assays wurden an anderer Stelle veröffentlicht16.
- C2M
- Quantifizieren Sie den Kollagenabbau vom Typ II, indem Sie die Freisetzung des C2M-Neo-Epitop-Fragments messen. Dieser direkt konkurrenzfähige ELISA erkennt das MMP-gesponnene C-Terminal-Peptid (KPPGRDGAAG1053). Dieser Assay unterscheidet sich von AGNx1 und ProC2, da er der primäre Antikörper ist, der peroxidase-markiert ist und somit als Detektor verwendet wird. Die experimentellen Einzelheiten des Assays wurden an anderer Stelle veröffentlicht20.
5. Histologische Analyse
- Infiltration, Einbettung und Schneiden
- Legen Sie die fixierten Explants (siehe Schritt 3.2) in einzeln beschriftete Kassetten. Fügen Sie sowohl ein Etikett in die Kassette als auch die Etikettenkassette ein, um die Identifizierung sicherzustellen.
- Übertragen Sie die Kassetten mit Explants auf eine Tissueprozessormaschine. Dann infiltrieren Sie die Expflanzen mit Paraffin in einer Reihe von Dehydrierung und Paraffin-Infiltrationsschritte.
- Mit 96% Ethanol für 90 min ohne Temperatureinstellung dehydrieren. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
- Löschen Sie das Ethanol mit Toluin für 90 min ohne Temperaturanpassung. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal.
- Das Ethanol mit Toluin 90 min bei 60 °C löschen.
- Mit Paraffinwachs 30 min bei 60 °C infiltrieren.
- Infiltrat mit Paraffinwachs für 60 min bei 60 °C.
- Infiltrat mit Paraffinwachs für 90 min bei 60 °C.
- Fügen Sie die Lösungen für jeden Schritt in die Probenkammer mit langsamen Pump-Out- und Pump-In-Strömen unter 33–34 kPa ein. Führen Sie den Infiltrationsprozess in einem Druck-/Vakuumzyklus mit einem maximalen Vakuum von 65 bis 70 kPa aus.
- Legen Sie die Kassetten nach dem Eindringen auf einen Heizblock, um eine sorgfältige Entfernung der Explants aus der Kassette zu ermöglichen. Die infiltrierten Expflanzen sanft in einzelne Paraffinblöcke einbetten. Mit erhitzten Zangen die Expflanzen mit dem oberflächlichen Gelenkknorpel und den subchondralen Knochenseiten senkrecht zur Schnittfläche platzieren, um die Visualisierung der verschiedenen Knorpelschichten innerhalb jedes Probenabschnitts zu gewährleisten.
- Schneiden Sie 5 m Abschnitte von gekühlten Paraffinblöcken mit eingebetteten Explants auf einem Mikrotom. Die Schnittabschnitte in ein Kaltwasserbad übertragen. Bei Bedarf können Abschnitte entweder mit einem Skalpell oder einem Deckglas getrennt werden.
- Übertragen Sie die Abschnitte mit einer unbeschichteten Glasrutsche vorsichtig in ein Warmwasserbad (50 °C), wo sich die Abschnitte entfalten. Heben Sie jeden Abschnitt auf eine beschriftete Abdeckungsrutsche und legen Sie sie 30 min auf eine Kochplatte.
- Die Dias in einen Korb geben und bei 60 °C 1 H bebrüten und dann bei 37 °C über Nacht aufbewahren. Danach lagern Sie Dias in geschlossenen Behältern bei 4 °C bis zur Färbung.
- Safranin O/Fast Green Färbung und Visualisierung
- Legen Sie die zu befleckenden Dias in einen Korb und bebrüten die Dias bei 60 °C für 1 h.
- Bereiten und filtern Sie alle Reagenzien mit einem 0,45 mm Filter.
- In Vorbereitung auf die Färbung, gießen Sie die gefilterten Reagenzien in Becher nakers auf ein Volumen, das es den Lösungen ermöglicht, die Dias vollständig zu decken, wenn sie den Korb untertauchen. Die verwendeten Becher benötigten ein Volumen von 250 ml, um die Dias abzudecken.
- Entparaffinisieren Sie die geschmolzenen Dias, indem Sie den Korb zweimal für 10 min in Toluin, zweimal 99% Ethanol für 2 min, 96% Ethanol für 2 min zweimal und 70% Ethanol für 2 min zweimal untertauchen. Dann hydratisieren Sie die Rutschen in Wasser für 2 min.
- Die deparaffinierten und hydratisierten Dias färben, indem man den Korb in Weigerts Eisenhämatoxylinlösung (pH 1,5) 10 min untertauchen, einmal in 1% HCl eintauchen und mit fließendem Leitungswasser ca. 5 min oder bis überschüssige Farbe weggespült hat, eintauchen.
- Als nächstes in 0,05% Fast Green Lösung (pH: 5,75) für 5 min, tauchen Sie in 1% CH3COOH einmal, und Flecken in 0,1% Safranin O (pH: 6,5) für 20 min.
- Dehydrieren und löschen Sie die Rutschen, indem Sie zweimal in 70% Ethanol, 96% Ethanol für 2 min zweimal, 99% Ethanol für 2 min zweimal und Zweimal Toluen 2 min.
- Montieren Sie die unbeschichteten Glasschlitten mit harzigem Medium, das die Histologie-Dias abdeckt.
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Representative Results
Rinder-Explanten mit voller Tiefe wurden isoliert, kultiviert und 3 Wochen lang behandelt (Abbildung 1). Das Kulturmedium wurde mit der Zugabe der Behandlung 3 mal pro Woche verändert. Einmal wöchentlich wurde die metabolische Aktivität durch den Resazurin-Assay gemessen. Biomarker des ECM-Umsatzes wurden in dem Überstand gemessen, der dreimal pro Woche von der Kulturplatte geerntet wurde. Die Explanten wurden zur Behandlung in 4 Gruppen eingeteilt: 1) Oncostatin M und TNF (O+T); 2) O+T + GM6001 (GM6001); 3) Insulin wie Wachstumsfaktor-1 (IGF-1); und 4) eine Kontrolle ohne Behandlung (w/o).
Metabolische Aktivität.
Für alle vier Gruppen war die Stoffwechselaktivität während der 3 Wochen relativ stabil (Abbildung 2A). Es gab eine Tendenz für IGF-1, die metabolische Aktivität leicht über der w/o-Gruppe zu erhöhen und für die O+T-Gruppen, um es zu verringern. Der Resazurin-Assay wurde verwendet, um die Aktivität der Chondrozyten in jeder Expflanze leicht zu bewerten und die Zelllebensfähigkeit indirekt zu bewerten, ohne Explanten aus dem Experiment zu extrahieren. Wenn eine Explantation während des Experiments einen erheblichen Rückgang der metabolischen Aktivität zeigt, kann das Explant von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.
Katabole Behandlung.
O+T wurde 3 mal wöchentlich auf die Kulturbrunnen angewendet, um die O+T-vermittelte Knorpeldegradation zu untersuchen (Abbildung 3, Abbildung 4). MMP-vermittelte Art-II-Kollagendegradation und Aggrecan-vermittelte Aggrecan-Degradation wurden von C2M- und AGNx1-ELISAs bewertet. O+T erhöhte Typ-II-Kollagenabbau von den Tagen 7-21 (Abbildung 3A) und Aggrecan-Abbau von den Tagen 3-14 (Abbildung 4A) im Vergleich zur w/o-Gruppe. Bei Zugabe von GM6001 (einem Breitspektrum-MMP-Hemmer) in Kombination mit O+T-Behandlung wurde die O+T-vermittelte C2M-Freisetzung blockiert (Abbildung 3A,B). Eine verringerte AGNx1-Freisetzung wurde bei der Zugabe von GM6001 an den Tagen 3-7 beobachtet, aber die AGNx1-Freisetzung erreicht spitzen am Tag 10 auf ähnlichen Werten wie die O+T-Gruppe (Abbildung 4A), was darauf hindeutet, dass der GM6001 den Aggrecan-Abbau nur in begrenztem Umfang verringert. Dieses Muster in AGNx1 und C2M Release ist das allgemeine Bild, das im Rinderknorpelmodell beobachtet wird, das mit O+T stimuliert wird. Erstens wird AGNx1 von etwa Tag 3 und Spitzen an den Tagen 10-14 freigegeben, was eine frühe Degradation von Aggrecan darstellt. Als nächstes wird nach 2 Wochen Kultivierung mit O+T der Kollagenabbau des Typs II beobachtet, gemessen am C2M-Biomarker.
Anabole Behandlung.
Um zu untersuchen, wie anabole Stimulation moduliert den Knorpel ECM Umsatz, Insulin wie Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) wurde 3 mal wöchentlich auf Rinder volltief Explants angewendet. Die Wirkung von IGF-1 auf die Knorpelexplantationen wurde hauptsächlich bei Messungen der Kollagenbildung des Typs II beobachtet, die von ProC2 wie erwartet für anabole Reize beurteilt wurden (Abbildung 5). Tag 0 in diesem Modell zeigt immer hohe ProC2-Messungen, vielleicht als Reaktion auf die Extraktion von Proben. Diese hohen Werte nehmen erheblich ab und gleichen sich von den Tagen 7-21 ab. Bei der Behandlung mit IGF-1 verringern sich die ProC2-Spiegel weniger als die in der w/o-Gruppe beobachteten, was darauf hindeutet, dass IGF-1 die Kollagenbildung typ II ab Tag 7 stimuliert (Abbildung 5B). Die ProC2-Diagramme zeigen auch die biologische Variation von Kühen. In diesen Experimenten wurden Explantationen von zwei Kühen mit 6 Expflanzen pro Kuh und Gruppe verwendet. Die erste Kuh hatte dickeren Knorpel und erzeugte größere Expflanzen, was zu höheren ProC2-Werten zu Beginn führte, während die zweite Kuh kleiner mit dünnerem Knorpel war, was zu niedrigeren ProC2-Werten zu Beginn führte. Für die Gruppen w/o, IGF-1 und O+T stellen die dargestellten ProC2-Werte den Mittelwert der Expflanzen beider Kühe dar, aber GM6001 wurde nur bei der zweiten Kuh mit dünneren Expflanzen gemessen. So startete die GM6001-Gruppe mit niedrigeren ProC2-Werten an Tag 0, was im ProC2-Bereich unter der Kurve (AUC) deutlich wird (Abbildung 5C). Die Normalisierung der ProC2-Werte auf die Tages-0-Werte berücksichtigt die biologische Varianz und zeigt damit die Wirksamkeit der Behandlung (Abbildung 5B,D).
Safranin O und Fast Green histologische Färbungen wurden durchgeführt, um den Proteoglykangehalt und die Knorpelstruktur des Explants während des gesamten Experiments zu visualisieren (Abbildung 6). An den Tagen 0, 7, 14 und 21 wurden Die Explanten der w/o-, IGF-1- und O+T-Gruppe für histologische Färbungen fixiert(Abbildung 6). Die w/o- und IGF-1-Gruppe schien während des gesamten Experiments eine ähnliche Safranin-O-Färbungsintensität wie der Tag 0-Explantation zu haben, der mit den Biomarker-Ergebnissen korreliert, die zeigen, dass keine der beiden Gruppen die AGNx1-Freisetzung erhöhte (Abbildung 4). Die Behandlung mit O+T führte zu einem erheblichen Proteoglykan-Gehaltsverlust am 7. Tag und einem vollständigen Verlust am 21. Tag. Darüber hinaus nimmt die Fast Green Färbeintensität ab den Tagen 14-21 ab, was auf einen Kollagenverlust in Übereinstimmung mit den C2M-Ergebnissen hindeutet.
Abbildung 1: Schematische Übersicht der Rinderknorpelmethode.
Am Tag Nr. 1 wurden rinderfemorale Kondylen aus dem hinteren tibiofemoralen Gelenk isoliert. Volltiefe Knorpelexplantationen wurden mit einem Skalpell und einem Biopsie-Stanzer aus den Kondylen freigesetzt. Die extrahierten Expflanzen wurden gewaschen und auf eine sterile 96 Brunnenkulturplatte übertragen. Am Tag 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 und 21 wurde der Überstand von der Kulturplatte geerntet, auf eine Lagerplatte übertragen und bei 20 °C aufbewahrt, wie in Medium Change Step 1 dargestellt. Der gespeicherte Überstand wurde später zur Messung der Gewebeumsatz-Biomarker durch spezifische ELISA-Assays aufgetaut. In Medium Change Step 2 wurde nach dem Entfernen des Überstandes ein neues Kulturmedium angewendet, das die verschiedenen Behandlungen oder keine Behandlung für Kontrollexplante enthält. Am Tag 0, 7, 14 und 21 wurden die Expflanzen nach der Ernte des Überstandes mit 10% Resazurinlösung für 3 h inkubiert. Der 10% Resazurin-Überstand wurde auf eine schwarze 96-Well-Platte übertragen, wo die kolorimetrische Reaktion gemessen wurde. Die Kulturbrunnen wurden dreimal gewaschen, bevor den Explants ein neues Kulturmedium mit oder ohne Behandlung hinzugefügt wurde, wie in Medium Change Step 2 gezeigt. Am 21. Tag, nach der Ernte der Überstand- und Resazurinmessung, wurden die Expflanzen durch Inkubation mit Formaldehyd für 2 h fixiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Metabolische Aktivität, gemessen durch Resazurin.
Rinder-Volltiefenknorpelexpflanzen wurden isoliert und für 3 Wochen kultiviert. Das Kulturmedium wurde mit der Zugabe einer neuen Behandlung 3 mal pro Woche verändert (n = 12 Explanten von 2 Kühen). Die Behandlung bestand aus IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL] und O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 m]. Eine Kontrollgruppe ohne Behandlung (w/o) wurde einbezogen. Für die W/o-, IGF-1- und O+T-Gruppe werden der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von 12 Replikationen von 2 Kühen (6 Wiederholungen pro Kuh) angezeigt. Für die GM6001-Gruppe werden der Mittelwert und das SEM von 6 Wiederholungen von 1 Kuh angezeigt. (A) Metabolische Aktivität gemessen durch Resazurin. (B) Fläche unter der Kurve (AUC) für Tage 0-21 für metabolische Aktivitätsdiagramme in (A). p > 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kollagenabbau typ II, gemessen mit C2M.
Rinder-Volltiefenknorpelexpflanzen wurden isoliert und für 3 Wochen kultiviert. Kulturmedium wurde mit der Hinzufügung einer neuen Behandlung 3 mal pro Woche geändert. Die Behandlung bestand aus IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL] und O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 m]. Eine Kontrollgruppe ohne Behandlung (w/o) wurde einbezogen. Für die Gruppen w/o, IGF-1 und O+T werden der Mittelwert und das SEM von 12 Replikationen von 2 Kühen (6 Wiederholungen pro Kuh) angezeigt. Für die GM6001-Gruppe werden der Mittelwert und das SEM von 6 Wiederholungen von 1 Kuh angezeigt. (A) C2M-Messungen. Das statistische Signifikanzniveau von w/o wurde durch wiederholte Messungen (RM) zweiseitig mit Sidaks Mehrfachvergleichstest berechnet. (B) AUC für Tage 0-21 für C2M-Diagramme in (A) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch den Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleichstest berechnet. p > 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Aggrecan-Abbau gemessen mit AGNx1.
Rinder-Volltiefenknorpelexpflanzen wurden isoliert und für 3 Wochen kultiviert. Kulturmedium wurde mit der Hinzufügung einer neuen Behandlung 3 mal pro Woche geändert. Die Behandlung bestand aus IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL] und O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 m]. Eine Kontrollgruppe ohne Behandlung (w/o) wurde einbezogen. Für die w/o-, IGF-1- und O+T-Gruppe werden der Mittelwert und die SEM von 12 Replikationen von 2 Kühen (6 Wiederholungen pro Kuh) angezeigt. Für die GM6001-Gruppe werden der Mittelwert und das SEM von 6 Wiederholungen von 1 Kuh angezeigt. (A) AGNx1-Messungen. Das statistische Signifikanzniveau von w/o wurde von RM-Zweiweg-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest berechnet. (B) AUC für tage 0-21 für AGNx1-Diagramme in (A) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch den Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleichstest berechnet. **p > 0,01, ***p > 0,001, ****p > 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Kollagenbildung Typ II, gemessen mit ProC2.
Rinder-Volltiefenknorpelexpflanzen wurden isoliert und für 3 Wochen kultiviert. Kulturmedium wurde mit der Hinzufügung einer neuen Behandlung 3 mal pro Woche geändert. Die Behandlung bestand aus IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL] und O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 m]. Eine Kontrollgruppe ohne Behandlung (w/o) wurde einbezogen. Für die w/o-, IGF-1- und O+T-Gruppe werden der Mittelwert und die SEM von 12 Replikationen von 2 Kühen (6 Wiederholungen pro Kuh) angezeigt. Für die GM6001-Gruppe werden der Mittelwert und das SEM von 6 Wiederholungen von 1 Kuh wieder angezeigt. (A) ProC2-Messungen aus den Tagen 0-21. (B) ProC2-Werte normalisiert auf Tag 0 Messungen für jede einzelne Explant. Die ProC2-Ergebnisse profitieren oft von tag 0 Normalisierung, um den Behandlungseffekt aufzudecken, der durch die hohen Biomarker-Spiegel an Tag 0 getarnt werden kann. In A und Bwurde das statistische Signifikanzniveau von RM-Zweiweg-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest berechnet. (C) AUC für Tage 0-21 für ProC2-Diagramme in (A) dargestellt. (D) AUC für die Tage 0-21 für Tag 0 normalisierte ProC2-Diagramme in (B). In C und Dwurde die statistische Signifikanz durch den Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleichstest berechnet. **p > 0,01, ***p > 0,001, ****p > 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Histologische Visualisierung von Proteoglykan-Inhalten durch Safranin O/Fast Green Färbung.
Rinder-Volltiefenknorpelexpflanzen wurden isoliert und für 3 Wochen kultiviert. Kulturmedium wurde mit der Hinzufügung einer neuen Behandlung 3 mal pro Woche geändert. Die Behandlung bestand aus IGF-1 [100 ng/mL] und OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL]. Eine Kontrollgruppe ohne Behandlung (w/o) wurde einbezogen. Am Tag 0, 7, 14 und 21 wurden Die Expflanzen fixiert, mit Paraffin infiltriert, in Paraffin eingebettet, in Scheiben geschnitten, auf Deckschlitten gelegt und mit Hämatoxylin, Safranin O und Fast Green befleckt. Für jede Behandlungsgruppe und jeden Zeitpunkt wird eine repräsentative Explantation angezeigt. Die In der Basisstichprobe (Tag 0) dargestellte Maßstabsleiste stellt 200 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll zur Profilierung des Knorpelgewebeumsatzes in Rinderknorpelexplanten kann zur Charakterisierung von Behandlungseffekten vieler Arten von Arzneimitteln verwendet werden, einschließlich Inhibitoren entzündlicher intrazellulärer Bahnen, proteolytische Enzyme oder anabole Wachstumsfaktoren.
In diesem Protokoll wurden zwei verschiedene Setups beschrieben: ein anaboles Setup, bei dem Exmodule mit Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) stimuliert wurden, und ein kataboles Setup mit Stimulation mit TNF-alpha und Oncostatin M, bei dem der Gewebeumsatz mit einem Breitspektrum-MMP-Hemmer gehemmt. Die Hauptleistung bei dieser Methode ist die Quantifizierung von Neo-Epitop-Biomarkern direkt im konditionierten Medium, das während der gesamten Kulturperiode geerntet wird. Mehrere Biomarker können im Überstand gemessen werden, was eine gleichzeitige Profilierung verschiedener kataboler und anaboler Prozesse in derselben Probe ermöglicht. Histologische Färbung mit Safranin O/Fast Green wurde verwendet, um die Ergebnisse der Biomarker-Analyse zu validieren. Oncostatin M, TNF-alpha und IGF-1 wurden verwendet, um das Protokoll zu beschreiben; Die Methode ist jedoch nicht auf spezifische Zytokin-Stimulatoren beschränkt und kann je nach Hypothese oder Testbehandlung leicht gegen andere ausgetauscht werden.
Die Interpretation der Biomarker-Ausgabe ist eine zeitliche Übung aufgrund der dynamischen Veränderungen der Chondrozytenfunktion und der Expressionsprofile mit anaboler oder kataboler Stimulation im Laufe der Zeit. Bei unbehandelten Explanten nimmt die mit dem Biomarker ProC2 gemessene Kollagenbildung typ II innerhalb der ersten 7-10 Tage rapide ab. Stimulation mit IGF-1 oder ähnlichen Wachstumsfaktoren hält ProC2-Freisetzung im konditionierten Medium auf einem Niveau vergleichbar mit Baseline; daher ist der Rückgang allmählicher, und die Freisetzung wird im Vergleich zu unbehandelten Explants erhöht. In einem katabolen Setup induzieren pro-inflammatorische Zytokine eine erhöhte Expression von Proteasen durch die Chondrozyte in den Tagen 0-14; diese besteht hauptsächlich aus Aggrecanasen. Dies führt zu einem anfänglichen starken Anstieg von Aggrecanase-abgeleiteten Proteinfragmenten, einschließlich AGNx1. In den späteren Stadien der Kultur drücken Chondrozyten mehr MMPs aus, was die Veröffentlichung von MMP-generierten Markern wie C2M um Tag 14 und höher antreibt. Um die Wirkung einer Behandlung zu profilieren, ist es daher wichtig, Biomarker im richtigen Zeitintervall zu messen.
Wie beschrieben, wird die Behandlung mit entzündlichen Zytokinen wie dem O+T-Cocktail im Laufe der Zeit zu einem Knorpelgewebeabbau führen. Der Gesamteinpool von ECM ist durch die Explantgröße begrenzt und sollte bei der Analyse des Biomarkerprofils berücksichtigt werden. Folglich können die Konzentrationen nach der anfänglichen Erhöhung der Biomarker-Freisetzung mit der Zeit abnehmen, einfach aufgrund der Verringerung der verbleibenden Menge an Explantations-ECM.
Zuvor galt OA vor allem als Krankheit des Gelenkknorpels. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass OA als eine Erkrankung des gesamten Gelenks betrachtet werden sollte, bei der frühe krankheitsbedingte Veränderungen in den einzelnen Gelenkbereichen, Synovium, Knochen und Knorpel parallel auftreten und im Laufe der Zeit zu einem Gelenkversagen führen12 ,21. Es ist daher wichtig zu erkennen, dass in diesem Modellsystem der Knorpel vom Rest des Gelenks (und organismus) isoliert ist, wodurch der Einfluss von Gewebeinteraktionseffekten und systemischen Faktoren, die die Homöostase des Gewebes regulieren können, begrenzt wird. Stattdessen handelt es sich um eine vereinfachte Einzelgewebekultur, in der experimentell kontrollierte Bedingungen moduliert werden können, um pathologische oder interventionelle Veränderungen des Gewebes mithilfe biochemischer Techniken, Biomarker oder histologischer Visualisierung zu erkennen. Aufgrund der Knorpelarchitektur wird sowohl zwischen Explanten als auch zwischen Gewebequellen eine Variation der Zellzahl, der Matrixzusammensetzung und der Mengenvariation erwartet. Da die relative Größe der Biomarker-Ausgabe zwischen den Experimenten unterschiedlich sein kann, wird empfohlen, Datensätze für einen besseren Vergleich zu normalisieren.
Um möglichst wenig Variation und beste Ergebnisse zu gewährleisten, ist es wichtig, Knorpel von Knien zu verwenden, die so frisch wie möglich sind, vorzugsweise zwischen 1 und 24 h nach dem Schlachten. Die Isolierung des Knorpelgewebes sollte auf homogene Weise erfolgen, wobei die Explanten ungefähr die gleiche Dicke aufweisen. Explanten sollten von Bereichen mit dickem Knorpel isoliert werden, um die Bereiche zu vermeiden, die der Mitte am nächsten sind. Das Gewebe sollte immer feucht sein, um Zelltod und Matrixzersetzung zu vermeiden. Die Länge des Experiments3, die Zeit zwischen mittleren Veränderungen, Timing der Zytokinstimulation und Behandlungsintervalle können an die hypothetische Wirkungsweise der einzelnen Verbindung oder des Mechanismus angepasst werden.
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Disclosures
CST, ACBJ und MK sind Mitarbeiter von Nordic Bioscience. ACBJ und MK halten Anteile an Nordic Bioscience. Die übrigen Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem technischen Personal von Nordic Bioscience für die Unterstützung des Labors sowie der Dänischen Forschungsstiftung für die allgemeine Unterstützung unserer Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
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