Summary
Aquí, presentamos un protocolo que describe el aislamiento y el cultivo de explantes de cartílago de rodillas bovinas. Este método proporciona una herramienta fácil y accesible para describir los cambios de tejido en respuesta a estímulos biológicos o nuevas terapias dirigidas a la articulación.
Abstract
Los sistemas de cultivo ex vivo cubren una amplia gama de experimentos dedicados al estudio de la función tisular y celular en un entorno nativo. El cartílago es un tejido único importante para el correcto funcionamiento de la articulación sinovial y está constituido por una matriz extracelular densa (ECM), rica en proteoglicano y colágeno tipo II. Los condrocitos son el único tipo de célula presente dentro del cartílago y son generalizados y relativamente bajos en número. Los estímulos externos alterados y la señalización celular pueden conducir a cambios en la composición y el deterioro de la ECM, que son importantes señas de identidad patológicas en enfermedades como la osteoartritis (OA) y la artritis reumatoide.
Los modelos de cartílago ex vivo permiten 1) perfilar alteraciones mediadas por condrocitos de rotación de tejido de cartílago, 2) visualizar la composición del cartílago ECM y 3) reorganizar condrocitos directamente en el tejido. La elaboración de perfiles de estas alteraciones en respuesta a estímulos o tratamientos son de gran importancia en diversos aspectos de la biología del cartílago, y complementan los experimentos in vitro en condrocitos aislados, o modelos más complejos en animales vivos donde las condiciones experimentales son más difíciles de controlar.
Los explantes de cartílago presentan un método traslacional y de fácil acceso para evaluar la remodelación de tejidos en el ECM del cartílago en entornos controlables. Aquí, describimos un protocolo para aislar y cultivar explantes vivos de cartílago bovino. El método utiliza tejido de la rodilla bovina, que es fácilmente accesible desde la carnicería local. Tanto los explantas como el medio de cultivo condicionado se pueden analizar para investigar la rotación de tejidos, la composición de ECM y la función de condrocitos, lo que genera perfiles de modulación de ECM.
Introduction
Los condrocitos producen y mantienen la matriz del cartílago. Con el fin de estudiar la biología de los condrocitos y cómo ellos y el ECM circundante reaccionan a los estímulos externos, es crucial interrogarlos en su entorno nativo1,2. El estudio de la rotación del tejido del cartílago es importante para aumentar la comprensión de los mecanismos subyacentes en enfermedades articulares como la OA, una enfermedad para la que actualmente no existe un tratamiento modificador de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de mejores modelos de traducción2.
La caracterización ex vivo de los efectos celulares y tisulares es esencial para complementar otros modelos preclínicos, tanto in vitro, como cultivos monocapa de condrocitos, como in vivo, como modelos de OA inducidos por cirugía o el modelo de artritis autoinmune inducida por colágeno (CIA ). Numerosos estudios han destacado las diferencias entre cómo se comportan las células en cultivos monocapa 2D y estructuras 3D o en su tejido nativo3,4. Muchas células en capas 2D adoptan morfologías no naturales, incluyendo diferencias en la polaridad celular y la unión tisular, lo que resulta en diferencias visuales y funcionales en las células dentro de los tejidos nativos5. Las diferencias también son evidentes en la funcionalidad de las células, que pueden desplazar la expresión de proteínas, lo que conduce a patrones de diferenciación profundamente alterados, maquinaria reguladora y funcionalidad celular5,6,7 ,8.
El eCM del cartílago consiste principalmente en colágeno tipo II que proporciona un marco de matriz, y agrecan, un proteoglicano que ayuda a retener el líquido dentro del tejido. Otras moléculas de matriz como colágeno tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteína oligomérica del cartílago (COMP), biglycan, decorin, y perlecan también están presentes9.
Mientras que la etiología de OA sigue sin estar clara10,11, la aparición de la enfermedad se cree que es causada por desequilibrios en los procesos de rotación y reparación de tejidos12,13. La degradación del cartílago articular es un sello distintivo de la OA. Los condrocitos o células residentes en el cartílago en los tejidos circundantes aumentan su liberación de citoquinas, estimulando la producción elevada de proteinasas como las metaloproteinasas matriciales (MMP) y las agresorasas, que aumentan la degradación del cartílago ECM 14. Esta degradación da lugar a la liberación de pequeños fragmentos de proteína únicos llamados neoepítos, que se pueden cuantificar en suero, orina o medio de cultivo15. Tras la formación y maduración del colágeno, también se liberan los llamados profragmentos; estos pueden cuantificarse como medida de la producción de matriz16.
El objetivo de este protocolo es establecer un modelo de cartílago ex vivo para comparar el efecto de la estimulación y/o el tratamiento farmacológico en la rotación de tejido SCM. La rotación del cartílago se perfila midiendo biomarcadores de neoepitopos derivados de la matriz directamente en el medio de cultivo condicionado utilizando ELISA: AGNx1 (que refleja la actividad de la agresorasa), C2M (que refleja la actividad de MMP de matriz) y ProC2 (reflejando colágeno tipo II formación). Los hallazgos pueden ser verificados por la tinción histológica del ECM, que también visualiza la organización de los condrocitos en los explantes individuales. El protocolo descrito se puede utilizar para probar el efecto de nuevos tratamientos sobre la función de condrocitos y la rotación de ECM de cartílago. Varios estudios han utilizado explantes de cartílago para describir procesos biológicos o el efecto de la intervención en explantes con problemas de citoquinas utilizando enfoques histológicos o inmunohistoquímicos cuantitativos, ARNm, expresión de proteínas o proteómica2 ,17,18. Sin embargo, estos protocolos están fuera del alcance del manuscrito actual.
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Protocol
1. Aislamiento de tejidos
- Abastecimiento de tejidos
- Realice toda la sección de abastecimiento de tejido fuera de una campana de flujo laminar en un entorno aséptico.
- Del matadero local, obtenga una articulación entera de rodilla tibiofemoral bovina fresca de terneros entre 1,5 y 2 años de edad.
- Disecciona suavemente la rodilla de la pantorrilla eliminando primero el exceso de carne, descubriendo los cóndilos, el menisco, los tendones y la membrana sinovial. Cortar los tendones y la membrana sinovial, permitiendo que la articulación se desmemse. Retire el menisco para exponer los cóndilos femorales.
- Aísle los explantes de la zona de carga del cóndilo femoral utilizando un punzante de biopsia de 3 mm y suéltelos de la superficie articular cortando con un bisturí paralelo y lo más cerca posible del hueso subcondral. La estructura dura del hueso subcondral debe asegurarse de que los explantes no contengan matriz calcificada. Esfuérzate por explantes con altura uniforme.
- Almacene y mezcle inmediatamente los explantes en DMEM/F12- GlutaMAX + 1% P/S médium de cultivo en un tubo de 50 ml o plato Petri. No mezcle explantes de diferentes rodillas de vaca, sino que se mantenga separado para cada estudio.
- Cultivo de tejido
- Transfiera los explantes a una placa estéril de 96 pocillos en una campana de flujo laminar.
- Lavar los explantes 3 veces en medio de cultivo o PBS y cultivarlos en 200 éL de medio de cultivo por pozo hasta el inicio del experimento. Use un período de lavado de 1 día para sincronizar la actividad celular de la biopsia y la liberación pasiva del biomarcador.
- Cultivo de los explantes hasta 10 semanas en una incubadora de 37oC con 5% deCO2. Coloque todas las réplicas dentro de cada grupo diagonalmente en la placa de cultivo para minimizar la variación inducida por la evaporación. Para evitar aún más la evaporación del sobrenadante, agregue PBS a los pocillos exteriores de la placa de cultivo.
2. Tratamiento explantado de cartílago bovino y evaluación de la actividad metabólica
- Cambio medio de cultivo y tratamiento
- Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días en una campana de flujo laminar.
- Si aplica algún tratamiento, prepárelos antes de cambiar el medio. Preparar los tratamientos a la concentración deseada en los pozos explantar por dilución en el medio de cultivo.
- Retire suavemente el sobrenadante de cada pocal y transfieralo a una nueva placa de 96 pocillos. Almacene el sobrenadante con cinta de sellado a 20 oC para el análisis de biomarcadores de la rotación de tejidos y la expresión de proteínas.
- Añadir inmediatamente 200 ml de medio de cultivo fresco o tratamiento por pocto. No deje que los explantes se sequen durante el cambio medio y asegúrese de que todos los explantes estén completamente sumergidos en el nuevo medio.
- Tinción de Resazurina
- Mida la actividad metabólica una vez por semana como una medición indirecta de la viabilidad celular. La prueba de resazurina es una manera fácil de evaluar si la actividad metabólica de los explantes se deteriora para una explanta individual debido a la muerte celular o cambios celulares. Los explantas en el medio de cultivo solo tienen una lectura de resazurin relativamente estable durante todo el período del experimento.
- Hacer una solución de medio de cultivo con 10% de resazurina.
- Cosecha el sobrenadante como se describe en el paso 2.1.3.
- Sumerja los explantes en una solución de resazurina del 10% durante 3 h a 37 oC o hasta que los sobrenadores se vuelvan púrpuras. Incluya 4 pozos sin explantes como controles de fondo.
- Transfiera la solución de resazurina condicionada y de control de fondo a una placa microtíter negra y mida la fluorescencia a una emisión de 540 nm/590 nm.
- Lavar bien 3 veces en medio de cultivo o PBS y sumergir los explantes en medio de lavado durante 5-10 min para permitir que la resazurina se difunda por completo. Añadir nuevo medio de cultivo o tratamientos si se utiliza.
3. Terminación, fijación y almacenamiento de muestras
- Terminación del período de cultivo
- Mida la actividad metabólica como se describe en el paso 2.2. Añadir 200 sL de PBS por pozo.
- Fijación y almacenamiento
- Retire el PBS, agregue 200 s de formaldehído por pozo y déjelo durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Deseche el formaldehído y agregue 200 sde PBS por pozo. Cubra la placa con cinta de sellado y guárdela a 4 oC para el análisis histoquímico. Recomendamos realizar análisis histoquímicos en un plazo de 3 meses.
4. Biomarcadores de rotación de tejidos (ELISA)
- ELISA competitivos indirectos
- Recubrir una placa de estreptavidina con el ensayo biotinilado específico objetivo-péptido diluido 1:100 en tampón de ensayo (100 l por pocto) durante 30 min a 20 oC.
- Lavar 5 veces con tampón de lavado estándar y añadir una muestra de sobrenadante (20 l por pozo) junto con anticuerpo monoclonal primario contra el péptido objetivo de ensayo diluido 1:93.3 para ProC2 y 1:100 en tampón de ensayo para AGNx1 (100 l por pozo) e incubar durante 2 h a 20 oC a 20 oC con temblor para ProC2 y 3 h a 20oC para AGNx1.
NOTA: El volumen de la muestra se toma directamente de las placas sobrenadantes almacenadas. Si la concentración medida está fuera del rango de medición del ensayo, diluya el sobrenadante en una placa de dilución con fondo en V en PBS o tampón de ensayo. - Lavar 5 veces con tampón de lavado estándar e incubar con anticuerposecundario etiquetado por peroxidasa diluido 1:100 en tampón de ensayo (100 ml por poca) durante 1 h a 20 oC.
- Lavar 5 veces con tampón de lavado estándar e incubar con agitación durante 15 minutos en la oscuridad a 20 oC con tetrametilbenzidina (TMB) como sustrato de peroxidasa (100 ml por pozo).
- Finalice la reacción con una solución de parada estándar, 0,1 M H2SO4 (100 ml por poca).
- Lea la reacción colorimétrica a 450 nm de absorbancia utilizando una absorbancia de referencia a 650 nm en un lector de placas de laboratorio estándar.
- ELISA competitivas directas para la medición de la rotación del tejido del cartílago en el sobrenadante
NOTA: Esto cuantifica C2M.- Recubrir una placa de estreptavidina con un ensayo biotinilado específico objetivo-péptido diluido 1:100 en tampón de ensayo (100 l por pocto) durante 30 min a 20 oC.
- Lávese 5 veces con tampón de lavado y agregue el sobrenadante de muestra junto con 100 l de anticuerpo monoclonal etiquetado con peroxidasa contra el péptido objetivo del ensayo diluido 1:100 en el tampón de ensayo (20 ml por pozo). Incubar durante 20 h a 2-8oC con agitación.
NOTA: El volumen de la muestra se toma directamente de las placas sobrenadantes almacenadas. Si la concentración medida está fuera del rango de medición del ensayo, diluya el sobrenadante en una placa de dilución con fondo en V en PBS o tampón de ensayo. - Lavar 5 veces con tampón de lavado estándar e incubar con agitación durante 15 minutos en la oscuridad a 20 oC con TMB como sustrato de peroxidasa (100 ol por pozo).
- Finalice la reacción con una solución de parada estándar, 0,1 M H2SO4 (100 ml por poca).
- Lea la reacción colorimétrica a 450 nm de absorbancia con una absorbancia de referencia a 650 nm en un lector de placas de laboratorio estándar.
- AGNx1
- Cuantifique la degradación del aggrecan midiendo la liberación del neoepitopo AGNx1. Este ensayo ELISA competitivo indirecto se dirige al péptido C-terminal (NITEGE373)generado por ADAMTS-4 y 5 cleavage. El anticuerpo monoclonal reconoce todos los fragmentos con un epítopo NITEGE expuesto. Los detalles experimentales del ensayo se han publicado en otros19.
- ProC2
- Cuantificar la formación de colágeno tipo II midiendo la liberación del profragmentación del colágeno tipo II. Este ensayo ELISA competitivo indirecto se dirige al epítopo del propéptido PIIBNP (QDVRQPG) generado por N-propeptidasas durante el recorte del colágeno tipo II recién sintetizado. Los detalles experimentales del ensayo se han publicado en otros16.
- C2M
- Cuantifique la degradación del colágeno tipo II midiendo la liberación del fragmento de neoepitopo C2M. Este ELISA competitivo directo reconoce el péptido C-terminal rolado MMP (KPPGRDGAAG1053). Este ensayo difiere de AGNx1 y ProC2, ya que es el anticuerpo primario que está etiquetado con peroxidasa y, por lo tanto, se utiliza como detector. Los detalles experimentales del ensayo se han publicado en otros20.
5. Análisis histológico
- Infiltración, incrustación y corte
- Coloque los explantes fijados (véase el paso 3.2) en casetes etiquetados individualmente. Incluya tanto una etiqueta dentro del cassette como casetes de etiquetas para garantizar la identificación.
- Transfiera los cassettes que contienen explantes a una máquina procesadora de tejidos. Luego infíltrate en los explantes con parafina en una serie de pasos de deshidratación e infiltración de parafina.
- Deshidratar con 96% de etanol durante 90 min sin ajuste de temperatura. Repita este paso 3 veces.
- Limpie el etanol con tolueno durante 90 min sin ajuste de temperatura. Repita este paso 2 veces.
- Limpiar el etanol con tolueno durante 90 min a 60oC.
- Infiltrar con cera de parafina durante 30 min a 60oC.
- Infiltrar con cera de parafina durante 60 min a 60oC.
- Infiltrar con cera de parafina durante 90 min a 60oC.
- Para cada paso, añada las soluciones a la cámara de muestra con flujos de bombeo y bombeo lentos de menos de 33-34 kPa. Ejecute el proceso de infiltración en un ciclo de presión/vacío con un vacío máximo de 65 a 70 kPa.
- Después de la infiltración, coloque los cassettes en un bloque de calentamiento para permitir la eliminación cuidadosa de los explantes del cassette. Incruste suavemente los explantes infiltrados en bloques de parafina individuales. Con fórceps calentados, coloque los explantes con el cartílago articular superficial y los lados del hueso subcondral perpendiculares a la superficie de corte, asegurando la visualización de las diferentes capas de cartílago dentro de cada sección de la muestra.
- Corta 5 m de bloques de parafina enfriados con explantes incrustados en un microtome. Transfiera las secciones de corte a un baño de agua fría. Si es necesario, las secciones se pueden separar con un bisturí o un vaso de cubierta.
- Con un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento con cuidado, transfiera las secciones a un baño de agua tibia (50 oC), donde se despliegan las secciones. Levante cada sección sobre una diapositiva de cubierta etiquetada y colóquela en una placa caliente durante 30 minutos.
- Colocar los portaobjetos en una cesta e incubar a 60oC durante 1 h y luego mantenerlos durante la noche a 37oC. A partir de ahora, guarde los portaobjetos en recipientes cerrados a 4oC hasta la tinción.
- Safranin O/Fast Green tinción y visualización
- Colocar los portaobjetos para ser manchados en una cesta e incubar los portaobjetos a 60oC durante 1 h.
- Preparar y filtrar todos los reactivos con un filtro de 0,45 mm.
- En preparación para la tinción, vierta los reactivos filtrados en vasos de precipitados a un volumen que permita que las soluciones cubran completamente las diapositivas al sumergir la cesta. Los vasos utilizados requerían un volumen de 250 ml para cubrir las diapositivas.
- Deparaffinizar los portaobjetos fundidos sumergiendo la cesta en tolueno durante 10 minutos dos veces, 99% etanol para 2 min dos veces, 96% etanol para 2 min dos veces, y 70% etanol para 2 min dos veces. Luego, hidrata los portaobjetos en agua durante 2 min.
- Mancha los portaobjetos desparafinados e hidratados sumergiendo la cesta en la solución de hematoxilina de hierro de Weigert (pH 1.5) durante 10 minutos, sumérgete en 1% de HCl una vez y enjuaga con agua corriente del grifo durante aproximadamente 5 minutos o hasta que el exceso de color se haya lavado.
- A continuación, la mancha en 0.05% Solución Fast Green (pH: 5.75) durante 5 min, sumergir en 1% CH3COOH una vez, y la mancha en 0.1% Safranin O (pH: 6.5) para 20 min.
- Deshidratar y limpiar los portaobjetos sumergiendo dos veces en 70% etanol, 96% etanol para 2 min dos veces, 99% etanol para 2 min dos veces, y tolueno 2 min dos veces.
- Monte los portaobjetos de vidrio sin recubrimiento con un medio resinoso que cubra los portaobjetos de histología.
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Representative Results
Los explantes bovinos a profundidad fueron aislados, cultivados y tratados durante 3 semanas(Figura 1). El medio de cultivo se cambió con la adición de tratamiento 3 veces por semana. Una vez por semana, la actividad metabólica se midió mediante el ensayo de resazurina. Los biomarcadores de la rotación de ECM se midieron en el sobrenadante cosechado de la placa de cultivo 3 veces por semana. Los explantas se dividieron en 4 grupos para el tratamiento: 1) Oncostatin M y TNF (O+T); 2) O+T + GM6001 (GM6001); 3) Insulina como Factor de crecimiento-1 (IGF-1); y 4) un control sin tratamiento (sin o).
Actividad metabólica.
Para los cuatro grupos, la actividad metabólica fue relativamente estable durante las 3 semanas(Figura 2A). Hubo una tendencia para IGF-1 para aumentar la actividad metabólica ligeramente por encima del grupo sin oS y para los grupos O+T para disminuirlo. El ensayo de resazurina se utilizó para evaluar fácilmente la actividad de los condrocitos en cada explantación y para evaluar indirectamente la viabilidad celular sin extraer explantas del experimento. Si una explanta muestra una disminución sustancial de la actividad metabólica durante el experimento, la explanta puede excluirse de un análisis posterior.
Tratamiento catabólico.
O+T se aplicó 3 veces por semana a los pozos de cultivo para investigar la degradación del cartílago mediado por O+T(Figura 3, Figura 4). C2M y AGNx1 ELISA evaluaron la degradación del colágeno tipo II mediada por MMP y la degradación mediada por aggrecanasa. O+T aumentó la degradación del colágeno tipo II de los días 7-21(Figura 3A)y la degradación del aggrecan a partir de los días 3-14(Figura 4A)en comparación con el grupo sin sin tensión. Al añadir GM6001 (un inhibidor de MMP de amplio espectro) en combinación con el tratamiento Con O+T, se bloqueó la versión C2M mediada por O+T(Figura 3A,B). Se observó una disminución de la versión de AGNx1 al agregar GM6001 en los días 3-7, pero la liberación de AGNx1 alcanza su punto máximo en el día 10 a niveles similares al grupo O+T(Figura 4A),lo que indica que el GM6001 sólo disminuye la degradación del aggrecan en una medida limitada. Este patrón en la liberación AGNx1 y C2M es la imagen general observada en el modelo de cartílago bovino estimulado con O+T. En primer lugar, AGNx1 se libera desde aproximadamente el día 3 y picos en los días 10-14, lo que representa una degradación temprana del aggrecan. A continuación, después de 2 semanas de cultivo con O+T, la degradación del colágeno tipo II se observa medida por el biomarcador C2M.
Tratamiento anabólico.
Para investigar cómo la estimulación anabólica modula la rotación del cartílago ECM, Insulina como Factor de crecimiento-1 (IGF-1) se aplicó 3 veces por semana a explantes bovinos a profundidad completa. El efecto de IGF-1 en los explantes de cartílago se observó principalmente en las mediciones de la formación de colágeno tipo II, evaluado por ProC2, como se esperaba para los estímulos anabólicos (Figura 5). El día 0 en este modelo siempre muestra altas mediciones ProC2, tal vez como una reacción a la extracción de muestras. Estos altos niveles disminuyen sustancialmente y nivelan desde los días 7-21. Cuando se trata con IGF-1, los niveles de ProC2 disminuyen menos que los observados en el grupo sin sistema, lo que indica que IGF-1 estimula la formación de colágeno tipo II desde el día 7(Figura 5B). Los gráficos ProC2 también muestran la variación biológica de las vacas. Explantes de dos vacas se utilizaron en estos experimentos con 6 explantes por vaca por grupo. La primera vaca tenía cartílago más grueso y generaba explantes más grandes, lo que resultaba en niveles más altos de ProC2 al inicio, mientras que la segunda vaca era más pequeña con cartílago más delgado, lo que resultaba en niveles más bajos de ProC2 al inicio. Para los grupos w/o, IGF-1 y O+T, los niveles de ProC2 representados representan la media de los explantes de ambas vacas, pero GM6001 se midió sólo en la segunda vaca con explantes más delgados. Por lo tanto, el grupo GM6001 comenzó con niveles más bajos de ProC2 en el día 0, lo que es evidente en el área ProC2 bajo la curva (AUC)(Figura 5C). La normalización de los valores de ProC2 a los niveles del día 0 tiene en cuenta la varianza biológica, mostrando así la eficacia del tratamiento(Figura 5B,D).
Se realizaron tinciones histológicas Safranin O y Fast Green para visualizar el contenido de proteoglicano y la estructura del cartílago de la explanta a lo largo del experimento(Figura 6). En los días 0, 7, 14 y 21, explantes del grupo w/o, IGF-1 y O+T se fijaron para la tinción histológica(Figura 6). El grupo w/o y IGF-1 parecía tener una intensidad de tinción de Safranina O similar al día 0 explantar a lo largo del experimento, que se correlaciona con los resultados de los biomarcadores mostrando que ninguno de los dos grupos aumentó la liberación de AGNx1(Figura 4). El tratamiento con O+T resultó en una pérdida sustancial de contenido de proteoglicano en el día 7 y una pérdida completa el día 21. Además, la intensidad de tinción Fast Green disminuye de los días 14-21, lo que indica una pérdida de colágeno en consonancia con los resultados de C2M.
Figura 1: Visión general esquemática del método del cartílago bovino.
El día 1, los cóndilos femorales bovinos fueron aislados de la articulación tibiofemoral posterior. Explantes de cartílago de profundidad completa fueron liberados de los cóndilos con un bisturí y un punzante de biopsia. Los explantes extraídos fueron lavados y transferidos a una placa de cultivo estéril de 96 pozos. En los días 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 y 21, el sobrenadante fue cosechado de la placa de cultivo, transferido a una placa de almacenamiento, y mantenido a 20 oC, como se ilustra en el paso 1 de cambio medio. El sobrenadante almacenado fue desconectido posteriormente para la medición de los biomarcadores de rotación de tejidos mediante ensayos ELISA específicos. En Medium Change Paso 2, después de retirar el sobrenadante, se aplicó un nuevo medio de cultivo que contiene los diferentes tratamientos o ningún tratamiento para explantas de control. Los días 0, 7, 14 y 21, los explantas fueron incubados con una solución de resazurina del 10% durante 3 horas después de la cosecha del sobrenadante. El sobrenadante de resazurina del 10% fue transferido a una placa negra de 96 pocillos donde se midió la reacción colorimétrica. Los pozos de cultivo fueron lavados 3 veces antes de que se añadiera un nuevo medio de cultivo con o sin tratamiento a los explantes como se muestra en el Paso 2 de Cambio Medio. El día 21, después de la cosecha de la medición de sobrenadante y resazurina, los explantas fueron fijados por incubación con formaldehído durante 2 h. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Actividad metabólica medida por resazurina.
Los explantes bovinos de cartílago de profundidad completa fueron aislados y cultivados durante 3 semanas. El medio de cultivo se modificó con la adición de un nuevo tratamiento 3 veces por semana (n a 12 explantes de 2 vacas). El tratamiento consistió en IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL], y O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 m]. Se incluyó un grupo de control sin tratamiento (sin tratamiento). Para el grupo w/o, IGF-1 y O+T, se muestra el error medio y estándar de la media (SEM) de 12 réplicas de 2 vacas (6 réplicas por vaca). Para el grupo GM6001, se muestran la media y el SEM de 6 réplicas de 1 vaca. (A) Actividad metabólica medida por resazurina. (B) Zona bajo la curva (AUC) para los días 0-21 para los gráficos de actividad metabólica que se muestran en (A). p > 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Degradación del colágeno tipo II medida por C2M.
Los explantes bovinos de cartílago de profundidad completa fueron aislados y cultivados durante 3 semanas. El medio de cultivo se cambió con la adición de nuevo tratamiento 3 veces por semana. El tratamiento consistió en IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL], y O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 m]. Se incluyó un grupo de control sin tratamiento (sin tratamiento). Para los grupos w/o, IGF-1 y O+T, se muestran la media y el SEM de 12 réplicas de 2 vacas (6 réplicas por vaca). Para el grupo GM6001, se muestran la media y el SEM de 6 réplicas de 1 vaca. (A) Mediciones C2M. El nivel de significancia estadística de sin os se calculó mediante medidas repetidas (RM) ANOVA bidireccional con la prueba de comparación múltiple de Sidak. (B) AUC para los días 0-21 para los gráficos C2M mostrados en (A). La significancia estadística fue calculada por la prueba Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. p > 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Degradación de Aggrecan medida por AGNx1.
Los explantes bovinos de cartílago de profundidad completa fueron aislados y cultivados durante 3 semanas. El medio de cultivo se cambió con la adición de nuevo tratamiento 3 veces por semana. El tratamiento consistió en IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL], y O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 m]. Se incluyó un grupo de control sin tratamiento (sin tratamiento). Para el grupo w/o, IGF-1 y O+T, se muestran la media y el SEM de 12 réplicas de 2 vacas (6 réplicas por vaca). Para el grupo GM6001, se muestran la media y el SEM de 6 réplicas de 1 vaca. (A) Mediciones AGNx1. El nivel de significancia estadística de sin o se calculó mediante RM bidireccional ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Sidak. (B) AUC para los días 0-21 para los gráficos AGNx1 mostrados en (A). La significancia estadística fue calculada por la prueba Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. **p > 0.01, ***p > 0.001, ****p > 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Formación de colágeno tipo II medida por ProC2.
Los explantes bovinos de cartílago de profundidad completa fueron aislados y cultivados durante 3 semanas. El medio de cultivo se cambió con la adición de nuevo tratamiento 3 veces por semana. El tratamiento consistió en IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL], y O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 m]. Se incluyó un grupo de control sin tratamiento (sin tratamiento). Para el grupo w/o, IGF-1 y O+T, se muestran la media y el SEM de 12 réplicas de 2 vacas (6 réplicas por vaca). Para el grupo GM6001, la media y el SEM de 6 réplicas de 1 vaca se muestran de nuevo. (A) Mediciones ProC2 de los días 0-21. (B) Valores ProC2 normalizados al día 0 mediciones para cada explantación individual. Los resultados de ProC2 a menudo se benefician de la normalización del día 0 para descubrir el efecto de tratamiento que puede ser disfrazado por los altos niveles de biomarcadores en el día 0. En A y B, el nivel de significancia estadística fue calculado por RM bidireccional ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Sidak. (C) AUC para los días 0-21 para los gráficos ProC2 mostrados en (A). (D) AUC para los días 0-21 para el día 0 gráficos ProC2 normalizados mostrados en (B). En C y D, la significancia estadística fue calculada por la prueba Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. **p > 0.01, ***p > 0.001, ****p > 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Visualización histológica del contenido de proteoglicano por tinción Safranin O/Fast Green.
Los explantes bovinos de cartílago de profundidad completa fueron aislados y cultivados durante 3 semanas. El medio de cultivo se cambió con la adición de nuevo tratamiento 3 veces por semana. El tratamiento consistió en IGF-1 [100 ng/mL] y OSM + TNF (O+T) [10/20 ng/mL]. Se incluyó un grupo de control sin tratamiento (sin tratamiento). En los días 0, 7, 14 y 21, los explantes fueron fijados, infiltrados con parafina, incrustados en parafina, cortados en rodajas, colocados en diapositivas de cubierta, y manchados con hematoxilina, Safranin O y Fast Green. Para cada grupo de tratamiento y cada punto de tiempo, se muestra una explanta representativa. La barra de escala que se muestra en la muestra de línea base (día 0) representa 200 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado aquí para la elaboración de perfiles de rotación de tejido de cartílago en explantas de cartílago bovino se puede utilizar para caracterizar los efectos del tratamiento de muchos tipos de fármacos, incluidos los inhibidores de las vías intracelulares inflamatorias, los inhibidores de enzimas proteolíticas, o factores de crecimiento anabólicos.
En este protocolo se describieron dos configuraciones diferentes: una configuración anabólica en la que se estimularon los explantes con el factor de crecimiento insulina-like 1 (IGF-1), y una configuración catabólica que comprende la estimulación con TNF-alpha y Oncostatin M, en la que la rotación de tejidos puede ser inhibido mediante un inhibidor de MMP de amplio espectro. El producto principal en este método es la cuantificación de biomarcadores neoepitopos directamente en el medio acondicionado, que se cosecha a lo largo del período de cultivo. Varios biomarcadores se pueden medir en el sobrenadante, permitiendo la elaboración simultánea de perfiles de diferentes procesos catabólicos y anabólicos en la misma muestra. La tinción histológica con Safranin O/Fast Green se utilizó para validar los hallazgos del análisis de biomarcadores. Oncostatin M, TNF-alpha, y IGF-1 se utilizaron para describir el protocolo; sin embargo, el método no se limita a estimuladores específicos de citoquinas y estos pueden intercambiarse fácilmente por otros dependiendo de la hipótesis o tratamiento de prueba.
La interpretación de la salida de biomarcadores es un ejercicio temporal debido a los cambios dinámicos en la función de condrocitos y perfiles de expresión con estimulación anabólica o catabólica a lo largo del tiempo. En los explantes no tratados, la formación de colágeno tipo II medida por el biomarcador ProC2 disminuye rápidamente en los primeros 7-10 días. Estimulación con IGF-1 o factores de crecimiento similares mantiene la liberación de ProC2 en el medio acondicionado a un nivel comparable a la línea de base; por lo tanto, la disminución es más gradual, y la liberación se incrementa en relación con los explantes no tratados. En una configuración catabólica, las citoquinas proinflamatorias inducen una mayor expresión de proteasas por el condrocitos en los días 0-14; se trata principalmente de agresorasas. Esto causa un gran aumento inicial en los fragmentos de proteína derivados de la agrecanasa, incluyendo AGNx1. En las últimas etapas del cultivo, los condrocitos expresan más MMP, lo que impulsa el lanzamiento de marcadores generados por MMP, como C2M, alrededor del día 14 y en adelante. Por lo tanto, para perfilar el efecto de un tratamiento, es importante medir los biomarcadores en el intervalo de tiempo adecuado.
Como se describe, el tratamiento con citoquinas inflamatorias como el cóctel O+T causará degradación del tejido del cartílago con el tiempo. El grupo total de ECM está limitado por el tamaño de la explanta y debe tenerse en cuenta al analizar el perfil del biomarcador. En consecuencia, después del aumento inicial de la liberación de biomarcadores, los niveles pueden disminuir con el tiempo simplemente debido a la reducción de la cantidad restante de ECM explanta.
Anteriormente, la OA se consideraba principalmente una enfermedad del cartílago articular. Sin embargo, estudios recientes sugieren que la OA debe ser vista como una enfermedad de toda la articulación, donde los primeros cambios relacionados con la enfermedad en los compartimentos individuales de las articulaciones, el sinovium, el hueso y el cartílago, ocurren en paralelo, y con el tiempo resultan en falla articular12 ,21. Por lo tanto, es importante reconocer que en este sistema modelo, el cartílago está aislado del resto de la articulación (y organismo), limitando la influencia de los efectos de interacción tisular y factores sistémicos que pueden regular la homeostasis del tejido. En su lugar, se trata de un cultivo simplificado de un solo tejido donde las condiciones controladas experimentalmente se pueden modular para detectar cambios patológicos o intervencionistas en el tejido mediante técnicas bioquímicas, biomarcadores o visualización histológica. Debido a la arquitectura del cartílago, se espera variación en el número celular, composición de la matriz y variación de la cantidad entre explantas y entre fuentes de tejido. Dado que la magnitud relativa de la salida del biomarcador puede ser diferente entre los experimentos, se recomienda normalizar los conjuntos de datos para una mejor comparación.
Para asegurar la menor variación posible y los mejores resultados, es importante utilizar cartílago de las rodillas que son lo más frescos posible, preferiblemente entre 1 y 24 h después de la carnicería. El aislamiento del tejido del cartílago debe hacerse de forma homogénea con explantes que tienen aproximadamente el mismo grosor. Los explantas deben aislarse de las áreas de cartílago grueso, evitando las áreas más cercanas al medio. El tejido siempre debe estar húmedo para evitar la muerte celular y la descomposición de la matriz. La duración del experimento3,el tiempo entre los cambios medios, el momento de la estimulación de la citoquina y los intervalos de tratamiento se pueden ajustar para adaptarse al modo de acción hipotética del compuesto o mecanismo individual.
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Disclosures
CST, ACBJ y MK son empleados de Nordic Bioscience. ACBJ y MK poseen acciones en Nordic Bioscience. Los autores restantes no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al personal técnico de Nordic Bioscience el apoyo de laboratorio, así como a la Fundación Danesa de Investigación por el apoyo general a nuestra investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
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