Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver isolering och odling av brosk växter från nötkreatur knän. Denna metod ger ett enkelt och lättillgängligt verktyg för att beskriva vävnadsförändringar som svar på biologiska stimuli eller nya Therapeutics riktade mot leden.
Abstract
Ex vivo kultur system omfattar ett brett spektrum av experiment som ägnas åt att studera vävnad och cellulär funktion i en ursprunglig miljö. Brosk är en unik vävnad viktigt för korrekt funktion av LED leden och utgörs av en tät extracellulär matris (ECM), rik på proteoglykan och typ II kollagen. Chondrocyter är den enda celltypen som finns inom brosk och är utbredd och relativt låg till antalet. Förändrade yttre stimuli och cellulär signalering kan leda till förändringar i ECM sammansättning och försämring, som är viktiga patologiska kännetecken vid sjukdomar som artros (OA) och reumatoid artrit.
Ex vivo brosk modeller tillåter 1) profilering av Chondrocyte medierade förändringar av broskvävnad omsättning, 2) visualisera brosket ECM sammansättning, och 3) kondrocyte rearrangering direkt i vävnaden. Profilering av dessa förändringar som svar på stimuli eller behandlingar är av stor betydelse i olika aspekter av broskbiologi, och komplettera in vitro-experiment i isolerade kondrocyter, eller mer komplexa modeller i levande djur där experimentella tillstånd är svårare att kontrollera.
Brosk djur presentera en translationell och lättillgänglig metod för att bedöma vävnad remodeling i brosk ECM i kontrollerbara inställningar. Här beskriver vi ett protokoll för att isolera och odla levande nötkreatur brosk växter. Metoden använder vävnad från bovint knä, som är lättillgänglig från den lokala slakteri. Både djur och konditionerade odlingssubstrat kan analyseras för att undersöka vävnads omsättningen, ECM-sammansättningen och Chondrocyte-funktionen, och därmed profilera ECM-modulering.
Introduction
Chondrocyter producera och underhålla brosk Matrix. För att studera biologin av kondrocyter och hur de och den omgivande ECM reagerar på yttre stimuli, är det viktigt att förhöra dem i deras infödda miljö1,2. Att studera broskvävnad omsättning är viktigt att öka förståelsen av de bakomliggande mekanismerna i gemensamma sjukdomar som OA, en sjukdom för vilken det för närvarande inte finns någon sjukdomsmodifierande behandling. Därför finns det ett stort behov av bättre översättnings modeller2.
Ex vivo karakterisering av cell-och vävnads effekter är viktigt att komplettera andra prekliniska modeller, både in vitro, såsom kondrocyte enskiktslager kulturer, och in vivo, såsom kirurgi-inducerad OA modeller eller den autoimmuna kollagen-inducerad artrit modell (CIA ). Många studier har belyst skillnaderna mellan hur celler beter sig i 2D enskiktslager kulturer och 3D-strukturer eller i deras ursprungliga vävnad3,4. Många celler i 2D-skikt anta onaturliga morfologier, inklusive skillnader i cellpolaritet och vävnad kvarstad, vilket resulterar i både visuella och funktionella skillnader i celler inom infödda vävnader5. Skillnaderna är också uppenbara i funktionaliteten hos cellerna, som kan skifta proteinuttryck, vilket leder till djupt förändrad differentiering mönster, reglerande maskiner och cellfunktioner5,6,7 ,8.
Brosk ECM består huvudsakligen av typ II kollagen som ger en matris ram, och aggrecan, en proteoglykan som hjälper till att behålla vätska i vävnaden. Andra Matrix molekyler som kollagen typ IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectin, brosk oligomeriska protein (COMP), biglycan, Decorin och perlecan finns också9.
Medan etiologi OA fortfarande oklar10,11, uppkomsten av sjukdomen tros orsakas av obalanser i vävnad omsättning och reparationsprocesser12,13. Nedbrytningen av ledbrosk är ett kännetecken för OA. Brosk-bosatt chondrocyter eller celler i de omgivande vävnaderna öka deras frisättning av cytokiner, stimulera förhöjd produktion av proteinaser såsom Matrix metalloproteinaser (MMPs) och aggrecanases, som ökar nedbrytningen av brosk ECM 14. denna nedbrytning resulterar i frisättning av små unika proteinfragment kallas neo-epitopes, som kan kvantifieras i serum, urin, eller kultur medium15. Vid bildandet och mogningen av kollagen, så kallade profragment frigörs också; dessa kan kvantifieras som ett mått på matris produktion16.
Syftet med detta protokoll är att upprätta en ex vivo brosk modell för att jämföra effekten av stimulering och/eller läkemedelsbehandling av ECM-vävnadens omsättning. Brosket omsättningen profileras genom att mäta matris-härledda Neo-epitop biomarkörer direkt i den konditionerade odlingssubstrat med hjälp av ELISA: AGNx1 (reflekterande aggrecanase aktivitet), C2M (reflekterande Matrix MMP aktivitet), och ProC2 (reflekterande typ II kollagen bildning). Resultaten kan verifieras genom histologisk färgning av ECM, som också visualiserar organisationen av chondrocyter i enskilda explants. Det beskrivna protokollet kan användas för att testa effekten av nya behandlingar på Chondrocyte funktion och brosk ECM omsättning. Ett antal studier har använt brosk djur för att beskriva biologiska processer eller effekten av intervention på cytokin-utmanade djur med hjälp av kvantitativa histologiska eller immunohistokemiska metoder, mRNA, proteinuttryck eller proteomik2 ,17,18. Dessa protokoll finns dock utanför tillämpningsområdet för det aktuella manuskriptet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vävnads isolering
- Vävnads anskaffning
- Utför hela vävnads sourcing sektionen utanför ett laminärt flödeshuv i en aseptisk miljö.
- Från det lokala slakteriet, skaffa en hel färsk bovint hos knäled från kalvar mellan 1,5 och 2 års ålder.
- Försiktigt dissekera kalv knäet genom att först ta bort överflödigt kött, avslöja kondylerna, menisken, senor, och LED membran. Skär senor och LED membran, vilket gör att leden till Dismember. Ta bort menisken för att exponera femorala kondylerna.
- Isolera djur från den bärande delen av femorala kondylerna med en 3 mm biopsi hålslag och släpp dem från den artikulära ytan genom att skära med en skalpell parallellt med och så nära subkondrala benet som möjligt. Den hårda strukturen hos det subkondrala benet bör se till att djur inte innehåller förkalkade matris. Sträva efter djur med jämn höjd.
- Omedelbart lagra och blanda djur i DMEM/F12-glutamax + 1% P/S odlingssubstrat i en 50 ml tub eller petriskål. Blanda inte djur från olika Ko knän men håll isär för varje studie.
- Vävnadsodling
- Överför explantorna till en steril 96-brunn platta i ett laminärt flöde huva.
- Tvätta djur 3 gånger i odlingsmedium eller PBS och odla dem i 200 μl odlingssubstrat per brunn fram till början av experimentet. Använd en blekt period av 1 dag för att synkronisera biopsi cellulära aktivitet och passiv biomarkör release.
- Odla djur upp till 10 veckor i en inkubator på 37 ° c med 5% Co2. Placera alla replikat inom varje grupp diagonalt i odlingsplattan för att minimera variationen som induceras av avdunstning. För att ytterligare undvika avdunstning av supernatanten, tillsätt PBS till de yttre brunnarna på odlingsplattan.
2. behandling av bovint brosk explantat och bedömning av metabolisk aktivitet
- Kultur medium förändring och behandling
- Ändra odlingsmediet varje 2-3 dagar i ett laminärt flöde huva.
- Om du applicerar någon behandling, Förbered dessa innan du byter medium. Förbered behandlingarna på den önskade koncentrationen i explantbrunnar genom utspädning i odlingsmediet.
- Ta försiktigt bort supernatanten från varje brunn och överför den till en ny 96 bra skylt. Förvara supernatanten med tätningsband vid − 20 ° c för biomarkör analys av vävnads omsättning och proteinuttryck.
- Tillsätt omedelbart 200 μL färskt odlingsmedium eller behandling per brunn. Låt inte explantorna torka ut under medelförändringen och se till att alla djur är helt nedsänkt i det nya mediet.
- Resazurin färgning
- Mät metabolisk aktivitet en gång per vecka som en indirekt mätning av cellernas lönsamhet. Den resazurin testet är ett enkelt sätt att bedöma om den metaboliska aktiviteten av djur försämras för en enskild explantat på grund av celldöd eller cellulära förändringar. Explants i odlingssubstrat har ensamt en relativt stabil resazurin-läsning under hela experiment perioden.
- Gör en lösning av kultur medium med 10% resazurin.
- Skörda supernatanten enligt beskrivningen i steg 2.1.3.
- Sänk ner djur i 10% resazurin lösning för 3 h vid 37 ° c eller tills samman supernatanterna tur lila. Inkludera 4 brunnar utan djur som bakgrundskontroller.
- Överför den konditionerade och bakgrundskoncentrerade resazurin-lösningen till en svart mikrotiterplatta och mät fluorescens vid 540 nm excitation/590 Nm emission.
- Tvätta grundligt 3 gånger i odlingsmedium eller PBS och dränera de djur i tvätt medium för 5-10 min så att resazurin att helt diffusa ut. Lägg till nytt odlingsmedium eller behandlingar om det används.
3. uppsägning, fixering och PROVFÖRVARING
- Avslutande av odlingsperioden
- Mät den metaboliska aktiviteten enligt beskrivningen i steg 2,2. Tillsätt 200 μL PBS per brunn.
- Fixering och förvaring
- Ta bort PBS, tillsätt 200 μL formaldehyd per brunn, och låt verka i 2 h vid rumstemperatur.
- Kassera formaldehyd och tillsätt 200 μL PBS per brunn. Täck plattan med tätningsband och förvara vid 4 ° c för histokemisk analys. Vi rekommenderar att du utför histokemisk analys inom 3 månader.
4. vävnads omsättning biomarkörer (ELISA)
- Indirekta konkurrenskraftiga ELISAs
- Täck en streptavidin-platta med den specifika biotinylerade assay Target-peptid utspädd 1:100 i analysbuffert (100 μL per brunn) i 30 min vid 20 ° c.
- Tvätta 5 gånger med standard tvättbuffert och tillsätt prov-supernatanten (20 μL per brunn) tillsammans med primär monoklonal antikropp mot analysens mål-peptid utspädd 1:93.3 för ProC2 och 1:100 i analysbuffert för AGNx1 (100 μL per brunn) och inkubera i 2 timmar vid 20 ° c med skakning för ProC2 och 3 h vid 20 ° c för AGNx1.
Obs: provvolymen tas direkt från de lagrade supernatanten plattorna. Om den uppmätta koncentrationen ligger utanför mätområdet för analys, späd supernatanten i en v-bottnad utspädnings platta i PBS-eller analysbufferten. - Tvätta 5 gånger med standard tvättbuffert och inkubera med peroxidasmärkt sekundär antikropp utspädd 1:100 i analysbuffert (100 μL per brunn) i 1 h vid 20 ° c.
- Tvätta 5 gånger med standard tvättbuffert och inkubera med skakning i 15 minuter i mörker vid 20 ° c med tetramethylbenzidin (TMB) som peroxidassubstrat (100 μL per brunn).
- Avsluta reaktionen med standard stopplösning, 0,1 M H2so4 (100 μl per brunn).
- Läs den kolorimetriska reaktionen vid 450 nm absorbans med en referens absorbans vid 650 Nm på en standard laboratorie skylt läsare.
- Direkta konkurrenskraftiga ELISAs för mätning av broskvävnadens omsättning i supernatanten
Anmärkning: detta kvantifierar C2M.- Täck en streptavidin-platta med specifik biotinylerad assay Target-peptid utspädd 1:100 i analysbuffert (100 μL per brunn) i 30 min vid 20 ° c.
- Tvätta 5 gånger med tvättbuffert och tillsätt provet-supernatant tillsammans med 100 μL peroxidasmärkt monoklonal antikropp mot analysens mål-peptid utspädd 1:100 i analysbufferten (20 μL per brunn). Inkubera i 20 timmar vid 2 – 8 ° c med skakning.
Obs: provvolymen tas direkt från de lagrade supernatanten plattorna. Om den uppmätta koncentrationen ligger utanför mätområdet för analys, späd supernatanten i en v-bottnad utspädnings platta i PBS-eller analysbufferten. - Tvätta 5 gånger med standard tvättbuffert och inkubera med skakning under 15 min i mörker vid 20 ° c med TMB som peroxidassubstrat (100 μL per brunn).
- Avsluta reaktionen med standard stopplösning, 0,1 M H2so4 (100 μl per brunn).
- Läs den kolorimetriska reaktionen vid 450 nm absorbans med en referens absorbans vid 650 Nm på en standard laboratorie skylt läsare.
- AGNx1
- Kvantifiera aggrekan nedbrytning genom att mäta frisläppandet av AGNx1 Neo-epitop. Denna indirekta, konkurrenskraftiga Elisa-analys riktar sig mot den aggrekan C-Terminal peptid (nitege373) som genereras av ADAMTS-4 och 5 klyvning. Den monoklonala antikroppen känner igen alla fragment med en exponerad NITEGE epitop. De experimentella detaljerna i analysen har publicerats på annat håll19.
- ProC2
- Kvantifiera typ II kollagenbildning genom att mäta frisläppandet av profragmentet av typ II kollagen. Denna indirekta konkurrerande ELISA-analys riktar sig till epitopen av PIIBNP propeptid (QDVRQPG) som genereras av N-propeptidaser under trimning av nyligen syntetiserade kollagen av typ II. De experimentella detaljerna i analysen har publicerats på andra ställen16.
- C2M
- Kvantifiera typ II kollagen nedbrytning genom att mäta frisättningen av C2M Neo-Epitope fragment. Denna direkt konkurrenskraftiga ELISA erkänner den MMP-klyvt C-terminalen peptid (KPPGRDGAAG1053). Denna analys skiljer sig från AGNx1 och ProC2 eftersom det är den primära antikroppen som är peroxidas-märkta och därmed, används som detektor. De experimentella detaljerna i analysen har publicerats på annat håll20.
5. histologisk analys
- Infiltration, inbäddning och kapning
- Placera de fixerade djur (se steg 3,2) i de individuellt märkta kassetterna. Inkludera både en etikett i kassetten och etikettkassetter för att säkerställa identifiering.
- Överför kassetterna som innehåller djur till en vävnads processor maskin. Sedan infiltrera djur med paraffin i en serie av uttorkning och paraffin infiltration steg.
- Dehydrera med 96% etanol för 90 min utan temperaturjustering. Upprepa detta steg 3 gånger.
- Rensa etanol med toluen för 90 min utan temperaturjustering. Upprepa detta steg 2 gånger.
- Töm etanol med toluen i 90 min vid 60 ° c.
- Infiltrera med paraffinvax i 30 min vid 60 ° c.
- Infiltrera med paraffinvax för 60 min vid 60 ° c.
- Infiltrera med paraffinvax för 90 min vid 60 ° c.
- För varje steg, tillsätt lösningarna i provkammaren med långsam pumpning och Pumpin flöden under 33 – 34 kPa. Kör infiltrations processen i en tryck/vakuum cykel med ett maximalt vakuum på − 65 till − 70 kPa.
- Efter infiltration, placera kassetterna på en värmeblock för att möjliggöra noggrann borttagning av djur från kassetten. Bädda försiktigt in de infiltrerade explantorna i enskilda paraffinblock. Med uppvärmda tång, placera djur med ytliga ledbrosk och subkondrala ben sidor vinkelrätt mot skär ytan, vilket garanterar visualisering av de olika brosk lagren inom varje prov sektion.
- Skär 5 μm sektioner av kylda paraffin-block med inbäddade djur på en mikrotom. Överför snitt sektionerna till ett kallt vattenbad. Vid behov kan sektioner separeras med antingen en skalpell eller ett täckglas.
- Med hjälp av en obestruket glas glida försiktigt, överföra sektionerna till ett varmt vattenbad (50 ° c), där sektionerna utvecklas. Lyft varje sektion på en märkt täckglas och placera den på en värmeplatta i 30 min.
- Placera bilderna i en korg och inkubera vid 60 ° c i 1 h och håll dem sedan över natten vid 37 ° c. I fortsättningen förvaras diabilder i slutna behållare vid 4 ° c till färgning.
- Safranin O/snabb grönfärgning och visualisering
- Placera bilderna som ska färgas i en korg och inkubera bilderna vid 60 ° c i 1 h.
- Förbered och filtrera alla reagenser med ett 0,45 mm filter.
- Som förberedelse för färgning, häll den filtrerade reagenser i bägare till en volym som gör att lösningarna för att helt täcka bilderna när dränka korgen. De bägare som användes krävde en volym på 250 mL för att täcka diabilderna.
- Deparaffinize de smälta bilderna genom att dränka korgen i toluen för 10 min två gånger, 99% etanol för 2 min två gånger, 96% etanol för 2 min två gånger, och 70% etanol för 2 min två gånger. Sedan hydrera bilderna i vatten i 2 min.
- Fläcken deparaffinized och hydratiserade diabilder genom att dränka korgen i Weigert ' s Iron hematoxylin lösning (pH 1,5) för 10 min, doppa i 1% HCl en gång, och skölj med rinnande kranvatten i ca 5 min eller tills överflödig färg har spolats bort.
- Nästa, fläcken i 0,05% snabb grön lösning (pH: 5,75) för 5 min, dopp i 1% CH3COOH en gång, och fläcken i 0,1% safranin O (ph: 6,5) för 20 min.
- Dehydrera och rensa bilderna genom att doppa två gånger i 70% etanol, 96% etanol för 2 min två gånger, 99% etanol i 2 min två gånger, och toluen 2 min två gånger.
- Montera de obelagda glas glasen med resinous medium som täcker histologiska diabilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nötkreatur fulldjup djur isolerades, odlade och behandlades i 3 veckor (figur 1). Kultur mediet ändrades med tillägg av behandling 3 gånger per vecka. En gång i veckan mättes metabolisk aktivitet med resazurin-analysen. Biomarkörer för ECM-omsättningen mättes i supernatanten som skördats från kultur plattan 3 gånger per vecka. Explants delades upp i 4 grupper för behandling: 1) Onkostatin M och TNFα (O + T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) insulin som tillväxtfaktor-1 (IGF-1); och 4) en kontroll utan behandling (w/o).
Metabolisk aktivitet.
För alla fyra grupperna var den metaboliska aktiviteten relativt stabil under de tre veckorna (figur 2A). Det fanns en tendens för IGF-1 att öka den metaboliska aktiviteten något över w/o-gruppen och för O + T grupper att minska den. Den resazurin analysen användes för att enkelt bedöma aktiviteten av chondrocyter i varje explantat och att indirekt bedöma cellernas lönsamhet utan att extrahera djur från experimentet. Om en explantat uppvisar en kraftig minskning av metabolisk aktivitet under experimentet kan explanten uteslutas från ytterligare analys.
Katabol behandling.
O + T applicerades 3 gånger i veckan på kulturbrunnar för att undersöka O + T-medierad brosk nedbrytning (figur 3, figur 4). MMP-medierad kollagen nedbrytning av typ II och aggrecanase-medierad nedbrytning av aggrekan bedömdes av C2M och AGNx1 Elisas. O + T ökad typ II kollagen nedbrytning från dagar 7-21 (figur 3a) och aggrekan nedbrytning från dag 3-14 (figur 4a) jämfört med w/o-gruppen. När du lägger till GM6001 (en bred-spectrum MMP-hämmare) i kombination med O + T behandling, den O + T-medierad C2M release blockerades (figur 3a, B). En minskad AGNx1 release observerades när du lägger GM6001 på dagar 3-7, men AGNx1 release toppar på dag 10 på liknande nivåer till O + T-gruppen (figur 4A), vilket indikerar att GM6001 endast minskar aggrekan nedbrytning i begränsad omfattning. Detta mönster i AGNx1 och C2M release är den allmänna bilden observeras i nötkreatur brosk modell stimuleras med O + T. Först, AGNx1 släpps från cirka dag 3 och toppar på dagar 10-14, som representerar en tidig nedbrytning av aggrecan. Därefter, efter 2 veckors odling med O + T, typ II kollagen nedbrytning observeras mätt med C2M biomarker.
Anabola behandling.
För att undersöka hur anabola stimulering modulerar brosk ECM omsättningen, insulin som tillväxtfaktor-1 (IGF-1) tillämpades 3 gånger i veckan till nötkreatur full djup explants. Effekten av IGF-1 på brosk djur observerades främst på mätningar av typ II kollagen bildas, bedömas av ProC2, som förväntat för anabola stimuli (figur 5). Dag 0 i denna modell visar alltid höga ProC2 mätningar, kanske som en reaktion på utvinning av prover. Dessa höga nivåer minskar avsevärt och jämnar ut från dagar 7-21. Vid behandling med IGF-1, den ProC2 nivåer minska mindre än de som observerats i w/o-gruppen, vilket tyder på att IGF-1 stimulerar typ II kollagen bildas från dag 7 (figur 5B). De ProC2 diagrammen visar också den biologiska variationen av kor. Djur från två kor användes i dessa experiment med 6 djur per ko per grupp. Den första kon hade tjockare brosk och genererade större explants, vilket resulterade i högre ProC2 nivåer vid baseline, medan den andra kon var mindre med tunnare brosk, vilket resulterade i lägre ProC2 nivåer vid baseline. För w/o, IGF-1, och o + T grupper, de ProC2 nivåer som avbildas representerar medelvärdet av de djur från båda korna, men GM6001 mättes endast i den andra kon med tunnare djur. Således började GM6001 gruppen med lägre ProC2 nivåer på dag 0, vilket är tydligt i det ProC2 området under kurvan (AUC) (figur 5C). Normalisering av ProC2-värdena till dag 0-nivåerna tar hänsyn till den biologiska avvikelsen, vilket visar behandlingens effektivitet (figur 5B, D).
Safranin O och snabb grön histologisk infärgning utfördes för att visualisera proteoglykan innehåll och brosk struktur explantat hela experimentet (figur 6). På dag 0, 7, 14 och 21, djur från w/o, IGF-1, och o + T gruppen var fixerade för histologisk färgning (figur 6). W/o och IGF-1 gruppen verkade ha liknande safranin O färgning intensitet till dag 0 explantat hela experimentet, som korrelerar med biomarkörer resultat som visar att ingen av de två grupperna ökade AGNx1 release (figur 4). Behandling med O + T resulterade i betydande proteoglykan innehålls förlust på dag 7 och fullständig förlust på dag 21. Dessutom, den snabba gröna färgning intensitet minskar från dagar 14-21, vilket indikerar en kollagen förlust i linje med C2M resultat.
Figur 1: Schematisk översikt över bovint brosk metod.
På dag − 1, nötkreatur femorala kondyler isolerades från Hind hos gemensamma. Full-djup brosk djur släpptes från kondylerna med en skalpell och biopsi Puncher. De extraherade djur tvättades och överfördes till en steril 96 väl kultur tallrik. Dag 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 och 21, skördades supernatanten från odlingsplattan, överfördes till en lagrings skylt och hölls vid − 20 ° c, vilket illustreras i medel förändrings steg 1. Den lagrade supernatanten tinades senare för mätning av vävnads omsättningen biomarkörer av specifika ELISA-analyser. I medelstora förändringen steg 2, efter avlägsnande av supernatanten, nya odlingssubstrat som innehåller de olika behandlingarna eller ingen behandling för kontrolldjur tillämpades. På dag 0, 7, 14, och 21, var de djur inkuberades med 10% resazurin lösning för 3 h efter skörd av supernatanten. Den 10% resazurin supernatanten överfördes till en svart 96-brunn pläterar var den kolorimetric reaktionen mättes. Kulturbrunnarna tvättades 3 gånger innan nytt kultur medium med eller utan behandling lades till de djur som visas i medium Change steg 2. På dag 21, efter skörd av supernatanten och resazurin mätning, var de djur fixerade genom inkubation med formaldehyd för 2 h. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: metabolisk aktivitet mätt med resazurin.
Nötkreatur fulldjup brosk djur isolerades och odlade i 3 veckor. Kultur mediet ändrades med tillägg av ny behandling 3 gånger per vecka (n = 12 djur från 2 kor). Behandlingen bestod av IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], och O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrollgrupp utan behandling (w/o) ingick. För w/o, IGF-1 och O + T-gruppen visas medelvärdet och standardfelet av medelvärdet (SEM) på 12 replikat från 2 kor (6 replikat per ko). För GM6001-gruppen visas medelvärdet och SEM på 6 replikat från 1 ko. A) metabolisk aktivitet mätt med resazurin. (B) arean under KURVAN (AUC) för dagar 0-21 för grafer av metabolisk aktivitet som visas i (a). p > 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kollagen nedbrytning av typ II mätt med C2M.
Nötkreatur fulldjup brosk djur isolerades och odlade i 3 veckor. Kultur mediet ändrades med tillägg av ny behandling 3 gånger per vecka. Behandlingen bestod av IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], och O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrollgrupp utan behandling (w/o) ingick. För w/o, IGF-1, och O + T grupper, medelvärdet och SEM av 12 replikat från 2 kor (6 replikat per ko) visas. För GM6001-gruppen visas medelvärdet och SEM på 6 replikat från 1 ko. A) C2M mätningar. Statistisk signifikansnivå av w/o beräknades genom upprepade åtgärder (RM) tvåvägsanova med Sidaks multipla jämförelse test. B) AUC för dagar 0-21 för C2M diagram som visas i (a). Statistisk signifikans beräknades genom Kruskal-Wallis-testet med Dunns multipla jämförelse test. p > 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: nedbrytning av Aggrecan mätt med AGNx1.
Nötkreatur fulldjup brosk djur isolerades och odlade i 3 veckor. Kultur mediet ändrades med tillägg av ny behandling 3 gånger per vecka. Behandlingen bestod av IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], och O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrollgrupp utan behandling (w/o) ingick. För w/o, IGF-1, och O + T gruppen, medelvärdet och SEM av 12 replikat från 2 kor (6 replikat per ko) visas. För GM6001-gruppen visas medelvärdet och SEM på 6 replikat från 1 ko. A) AGNx1 mätningar. Statistisk signifikansnivå av w/o beräknades av RM tvåvägsanova med Sidaks multipla jämförelse test. B) AUC för dagar 0-21 för AGNx1 diagram som visas i (a). Statistisk signifikans beräknades genom Kruskal-Wallis-testet med Dunns multipla jämförelse test. * *p > 0,01, * * *p > 0,001, * * * *p > 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kollagenbildning av typ II mätt med ProC2.
Nötkreatur fulldjup brosk djur isolerades och odlade i 3 veckor. Kultur mediet ändrades med tillägg av ny behandling 3 gånger per vecka. Behandlingen bestod av IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], och O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrollgrupp utan behandling (w/o) ingick. För w/o, IGF-1, och O + T gruppen, medelvärdet och SEM av 12 replikat från 2 kor (6 replikat per ko) visas. För GM6001 gruppen replikerar medelvärdet och SEM på 6 från 1 ko re visas. A) ProC2 mätningar från dagar 0-21. (B) ProC2 värden normaliserade till dag 0 mätningar för varje enskild explant. De ProC2 resultaten gynnas ofta av dag 0 normalisering för att avslöja behandlingseffekt som kan vara förklädd av de höga biomarkör nivåerna på dag 0. I A och Bberäknades den statistiska SIGNIFIKANSNIVÅ av RM tvåvägsanova med sidaks multipla jämförelse test. C) AUC för dagar 0-21 för ProC2 diagram som visas i (a). (D) AUC för dagar 0-21 för dag 0 normaliserade ProC2 grafer som visas i (B). I C och Dberäknades den statistiska signifikansen av Kruskal-Wallis-provet med Dunns multipla jämförelse test. * *p > 0,01, * * *p > 0,001, * * * *p > 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: histologisk visualisering av proteoglykan innehåll av safranin O/snabb grönfärgning.
Nötkreatur fulldjup brosk djur isolerades och odlade i 3 veckor. Kultur mediet ändrades med tillägg av ny behandling 3 gånger per vecka. Behandling bestod av IGF-1 [100 ng/mL] och OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL]. En kontrollgrupp utan behandling (w/o) ingick. Dag 0, 7, 14 och 21, var djur fixerade, infiltrerade med paraffin, inbäddade i paraffin, skivade, placeras på täckglas, och färgas med hematoxylin, safranin O, och snabb grön. För varje behandlingsgrupp och varje timepoint visas ett representativt explantat. Scalebar som visas i baslinje provet (dag 0) motsvarar 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här för profilering av broskvävnad omsättning hos bovint brosk djur kan användas för att karakterisera Behandlingseffekterna av många typer av läkemedel, inklusive hämmare av inflammatoriska intracellulära vägar, hämmare av proteolytiska enzymer, eller anabola tillväxtfaktorer.
Två olika uppställningar beskrevs i detta protokoll: en anabola inställning där djur stimulerades med insulin-liknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1), och en katabol inställning bestående av stimulering med TNF-alfa och onkostatin M, där vävnads omsättningen kan hämmade med ett brett spektrum MMP-hämmare. Den huvudsakliga produktionen i denna metod är kvantifieringen av Neo-epitop biomarkörer direkt i det konditionerade mediet, som skördas under hela kultur perioden. Flera biomarkörer kan mätas i supernatanten, vilket möjliggör samtidig profilering av olika katabola och anabola processer i samma prov. Histologisk färgning med safranin O/fast Green användes för att validera resultaten från biomarkör analysen. Onkostatin M, TNF-alfa, och IGF-1 användes för att beskriva protokollet; emellertid, metoden är inte begränsad till specifika cytokin stimulatorer och dessa kan lätt bytas ut mot andra beroende på hypotesen eller test behandling.
Tolkningen av biomarkörer produktionen är en timlig övning på grund av de dynamiska förändringarna i Chondrocyte funktion och uttrycks profiler med anabola eller katabol stimulering över tiden. I obehandlade explants minskar kollagenbildningen av typ II mätt med biomarkör ProC2 snabbt inom de första 7-10 dagarna. Stimulering med IGF-1 eller liknande tillväxtfaktorer upprätthåller ProC2 release i det konditionerade mediet på en nivå jämförbar med baslinjen; Sålunda, nedgången är mer gradvis, och frisättningen ökas i förhållande till obehandlade explants. I en katabol setup, pro-inflammatoriska cytokiner inducera ökat uttryck av proteaser av Chondrocyte i dagar 0-14; Detta består huvudsakligen av aggrecanases. Detta orsakar en initial stor ökning av aggrecanase-härledda proteinfragment, inklusive AGNx1. I de senare stadierna av kulturen, kondrocyter uttrycka mer MMPs, som driver frisläppandet av MMP-genererade markörer, såsom C2M, runt dag 14 och framåt. För att kunna profilera effekten av en behandling är det därför viktigt att mäta biomarkörer i rätt tidsintervall.
Som beskrivits, behandling med inflammatoriska cytokiner såsom O + T cocktail kommer att orsaka broskvävnad nedbrytning över tiden. Den totala poolen av ECM är begränsad av explantstorlek och bör övervägas vid analys av biomarkör profil. Följaktligen, efter den initiala ökningen av biomarkörer release, nivåerna kan minska med tiden helt enkelt på grund av minskningen av den återstående mängden explantat ECM.
Tidigare ansågs OA främst vara en sjukdom i ledbrosk. Emellertid, nyare studier tyder på att OA bör ses som en sjukdom i hela leden, där tidiga sjukdomsrelaterade förändringar i enskilda gemensamma utrymmen, synovium, ben, och brosk, förekommer parallellt, och med tiden resultera i led svikt12 ,21. Det är därför viktigt att erkänna att i denna modellsystem, brosk isoleras från resten av det gemensamma (och organism), begränsa påverkan av vävnad interaktions effekter och systemiska faktorer som kan reglera homeostas av vävnaden. I stället är det en förenklad enda vävnadsodling där experimentellt kontrollerade betingelser kan anpassas för att detektera patologiska eller interventionella förändringar i vävnaden med hjälp av biokemiska tekniker, biomarkörer eller histologisk visualisering. På grund av brosk struktur, variation i cell nummer, matris sammansättning, och mängd variation förväntas både mellan djur och mellan vävnads källor. Eftersom den relativa omfattningen av biomarkörer utdata kan vara olika mellan experiment, rekommenderas att normalisera datauppsättningar för bättre jämförelse.
För att säkerställa minsta möjliga variation och bästa resultat är det viktigt att använda brosk från knän som är så fräscha som möjligt, helst mellan 1 och 24 h efter styckning. Isolering av broskvävnad bör göras på ett homogent sätt med djur är ungefär samma tjocklek. Explants bör isoleras från områden av tjockt brosk, undvika de områden som är närmast mitten. Vävnaden bör alltid vara fuktig för att undvika celldöd och matris nedbrytning. Längden på experimentet3, tiden mellan medel förändringar, tidpunkten för cytokin stimulering, och behandlingsintervall kan justeras för att passa den hypotetiska verkningssätt av enskilda sammansatta eller mekanism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CST, ACBJ och MK är anställda i Nordic Bioscience. ACBJ och MK innehar aktier i Nordic Bioscience. De återstående författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar den tekniska personalen på Nordic Bioscience för laboratorie stöd, samt den danska forskningsstiftelsen för allmänt stöd för vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , Academic Press. New York. (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care? Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet? Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments? Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype? Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
