Summary
Ett protokoll presenteras med hjälp av syntetiska bio Logi tekniker för att syntetisera en uppsättning av bakteriella bio sensorer för analys av skott rester, och för att testa driften av enheterna för deras avsedda användning med fluorescensspektroskopi.
Abstract
MicRoboCop är en bio sensor som har utformats för en unik tillämpning inom kriminal teknisk kemi. MicRoboCop är ett system som består av tre enheter som, när de används tillsammans, kan indikera förekomsten av skott rester (GSR) genom att producera en fluorescenssignal i närvaro av tre nyckelanalyter (antimon, bly och organiska komponenter av GSR). Protokollet beskriver syntesen av bio sensorerna med Escherichia coli (E. coli), och de analytiska kemi metoder som används för att utvärdera sensorernas selektivitet och känslighet. Systemets funktion demonstreras med hjälp av GSR som samlats in från insidan av ett använt patron hölje. När de har förberetts kan bio sensorerna lagras tills de behövs och kan användas som ett test för dessa nyckelanalyter. Ett positivt svar från alla tre Analyterna ger ett presumtivt positivt test för GSR, medan varje enskild enhet har tillämpningar för detektering av Analyterna i andra prover (t. ex. en detektor för bly förorening i dricks vatten). Den huvudsakliga begränsningen av systemet är den tid som krävs för en positiv signal; framtida arbete kan innebära att studera olika organismer för att optimera responstiden.
Introduction
En bio sensor är en analytisk enhet som använder biologiska komponenter (t. ex. proteiner, nukleinsyror eller hela organismer) som ger ett svar som kan användas för detektion av ett kemiskt ämne eller en analyt. Som ett exempel, använde kol gruv industrin en bio sensor för mycket av 20-talet för att upptäcka förekomsten av giftiga gruv gaser: Kanarie fågeln i kol gruvan1. Den biologiska organismens (Kanarie öarnas) reaktion (död eller ångest) på en kemisk analyt (kolmonoxid) observerades av gruv arbetarna för att skydda arbetarna. I ett mer modernt och sofistikerat exempel kan bakterier ändras med hjälp av syntetiska bio Logi tekniker för att svara på närvaron av en viss kemisk analyt genom att ställa ut ett specifikt svar, såsom uttryck av ett fluorescerande protein.
Syntetisk biologi är ett brett begrepp som hänvisar till byggandet av biologiska anordningar och system som inte existerar naturligt, eller omkonstruktion av befintliga biologiska system för ett specifikt ändamål2. Syntetisk biologi skiljer sig från gen teknik genom en standard metodik och förekomsten av standardiserade delar (standard syntetiska biologi genetiska element) som kan användas för att syntetisera enheter och system. En del förs in i genomet av en anordning, en organism som en bakterie, att uttrycka en viss egenskap som kommer att fungera som en indikation på funktion. I många syntetiska produkter introduceras till exempel ett fluorescerande protein i en enda celledorganism som ett reporter protein. Flera enheter kan kombineras till ett system. Genom mikroorganismer som bakterier är lätta att manipulera på detta sätt. Många exempel på bio sensorer som är specifika för ett brett spektrum av kemiska analyter har rapporter ATS i litteraturen under det senaste decenniet3,4.
I detta arbete är MicRoboCop systemet presenteras som ett exempel på en bio sensor utformad med hjälp av syntetiska biologi tekniker med nya tillämpningar i kriminal teknisk och miljö kemi. MicRoboCop är ett system med tre separata enheter som, när de kombineras, kommer att göra det möjligt Escherichia coli att uttrycka rött fluorescerande protein (RFP) i närvaro av skott rester (GSR) som har samlats in från en persons händer eller en yta. Var och en av de tre enheterna reagerar på en specifik kemisk analyt som är känd för att vara en del av GSR5. De tre analyter som systemet svarar på är I. 2, 4, 6-trinitrotoluen (TNT) och besläktade föreningar, II. bly (i form av bly joner) och III. Antimon (även i form av joner).
GSR består av många olika kemiska ämnen, men de tre som vanligt vis används för att identifiera en rest som GSR är barium, bly, och antimon5. Det standardiserade bevis provet för identifiering av GSR är att använda scanning elektronmikroskopi (SEM) med energidispersiv röntgen fluorescens (EDX)5. SEM-EDX gör det möjligt för analytiker att identifiera den unika morfologin och elementär komponenterna i GSR. För närvarande finns det få utbredda binära presumtiva tester tillgängliga. En nyligen publicerad presumtiva test använder Jon-rörlighet spektroskopi (IMS), som är specialiserad utrustning som kanske inte finns i många Labs6. Det finns också några färg "spot"-tester som kan användas, även om de vanligt vis används för avstånds bestämning eller för GSR identifiering på kula hål och sår5. Dessutom har det förekommit viss begränsad uppmärksamhet i litteraturen till elektrokemiska tester för GSR som sysselsätter voltammetrisk analys, som har fördelen av att potentiellt vara fältet portabel, eller Anodisk strippning voltametri, vilket är en extremt känslig metod för metalliska element7. Det finns mycket lite omnämnande i litteraturen av bio sensorer som utformats speciellt för att upptäcka GSR, även om vissa bio sensorer för andra kriminal tekniska tillämpningar har publicerats8.
De biologiska elementen för varje enhet i MicRoboCop-systemet, och plasmidkonstruktionen, illustreras i figur 1. Den böjda pilen i figur 1b representerar den promotor region som aktive ras i närvaro av analyten, ovalen är den ribosomala bindnings platsen som tillåter översättning av reporterproteinet, den grå rutan märkt RFP är den gen som uttrycker röd fluorescerande protein, och den röda Oktagonen är transkriptionsterminerings platsen. Alla tre enheter kommer att användas tillsammans som ett system för att upptäcka GSR. Varje enhet med en specifik promotor (SbRFP, PbRFP och TNT-RFP) kommer att inkuberas med provet som testas och fluorescens av RFP kommer att mätas. RFP kommer endast att uttryckas om lämplig kemisk analyt finns och aktiverar Promotorns region. Tre enheter som reagerar på några av de kemiska ämnen som finns i GSR har utformats och presenteras i detta arbete.
De initiativtagare som används i de tre microbocop enheter är en arsenik och antimon känsliga Promotorn, sbrfp9,10, en ledande känslig promotor, pbrfp11,12 och en TNT känslig promotor, TNT-RFP 13. eftersom en sökning i litteraturen inte visade någon promotor som var avsedd att reagera på barium valdes TNT-Promotorn istället, eftersom denna promotor är känslig för ett antal strukturellt besläktade föreningar (i synnerhet 2, 4-dinitrotoluen och dinitrobensen) som är kända för att vara en del av de organiska föreningarna kvar i GSR. Denna promotor har framgångs rikt använts för att specifikt upptäcka minut mängder TNT och 2, 4-dinitrotoluen (2, 4-DNT) i begravda landminor13. Med hjälp av de tre enheterna tillsammans som ett system, ett positivt test för GSR kommer att producera fluorescens i alla tre enheter. En fluorescenssignal i endast en eller två enheter kommer att indikera en annan miljö källa av analyten (s) eller i fallet med TNT Promotorn, aktivering av en förening som inte är en organisk förening kvar i GSR. Genom att använda alla tre enheterna tillsammans minimeras möjligheten till ett falskt positivt resultat på grund av miljö källor. Blyfri ammunition, som ökar i popularitet, utgör fortfarande bara cirka 5% av ammunitions försäljningen i USA; Därför kan falskt negativa resultat på grund av avsaknad av bly vara en möjlighet, men det finns fortfarande nytta i en sensor som använder bly som en markör för GSR14. Utöver denna specifika kriminal tekniska applikation kan varje enhet användas separat för att upptäcka miljö föroreningar.
De protokoll som presenteras inkluderar syntetisk biologi tekniker som används för att skapa enheter (sensor bakterier) och analys metoder för att kontrol lera funktionen av enheterna och analysera fluorescens signaler som erhållits. Protokollet innehåller också insamling av kriminal tekniska bevis i form av hand torka för att samla GSR från händerna på en misstänkt eller badda att samla GSR från en yta. Resultat från bly sensor enheten presenteras som exempel resultat, tillsammans med en demonstration av ett positivt test för GSR med hjälp av ett använt patron hölje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: syntes av E. coli som uttrycker RFP presenteras.
1. beredning av plasmid DNA från E. coli
- Tina e. coli innehåll Ande en Plasmid med en RFP-gen och ampicillin-resistens gen och odla e. coli på LURIA buljong (lb) agar plattor som innehåller 100 μg/ml ampicillin vid 37 ° c för 24 h. Till exempel använda J10060 Plasmid från registret av standard biologiska delar som används för syntetisk biologi (se tabell över material). J10060 Plasmid innehåller en gen för RFP (rött fluorescerande protein) under kontroll av en pBad promotor region och en ampicillin motstånds gen. Alternativt transformera E. coli (se steg 3,2) med Plasmid före tillväxt på lb-agarplattorna.
- Följ ett standard miniprep-protokoll (se material tabell) för att isolera DNA från 1 ml E. coli -kultur som innehåller J10060 plasmid. Syftet med följande protokoll är att ta bort den pBad Promotorn och ersätta den med den önskade Promotorn för enheten.
- Efter Plasmid miniprep, förvara DNA i frysen tills det är klart för mat smältningen.
2. begränsning av enzym nedbrytning
- Ställ in följande reaktion i ett mikrocentrifugerör för EcoRI-och NheI-nedbrytning: 10 μL J10060 plasmid-DNA (isolerat i steg 1), 8 μL vatten och 1 μL vardera av EcoRI-och NheI-enzymer förblandade med 1 μL buffert (se material tabell).
- För Promotorn DNA, Ställ in följande reaktion i ett mikrocentrifugerör för EcoRI-och NheI-nedbrytning: 10 μL glödgad promotionsdna-sekvenser (8 μL vatten och 1 μL vardera av EcoRI-och NheI-enzymer förblandade med 1 μL buffert.
- För SB-, PB-, eller TNT-RFP (se material tabell), lös upp oligonukleotiderna i buffert (30 mm Hepes, pH 7,5; 100 mm kaliumacetat), Inkubera i lika molarkoncentrationer, värm till 94 ° c i 2 min, och gradvis svalna vid rums temperatur).
- Blanda proverna genom att Pipettera försiktigt upp och ner med pipetten inställd på 10 μL.
- Inkubera i 30 min vid 37 ° c.
- Värm upp enzymerna vid 80 ° c i 5 min.
- Förvara den smälta DNA i frysen tills den är redo för nästa steg.
3. ligation och omvandling
-
Ligatur
- Med hjälp av DNA från Plasmid och promotorn som dubbelsmälts med EcoRI och NheI i steg 2, Ställ in reaktions blandningen som visas i tabell 1 i ett mikrocentrifugerör på is. Tillsätt T4 DNA-Ligase sist.
Anmärkning: tabell 1 visar en ligering med en molar förhållandet 1:3 vektor för att infoga för de angivna DNA-storlekar. - Blanda försiktigt reaktionen genom att Pipettera upp och ner och mikrocentrifugera en kort stund.
- Inkubera vid rums temperatur i 10 min.
- Värme inaktive ras vid 65 ° c i 10 min.
- Med hjälp av DNA från Plasmid och promotorn som dubbelsmälts med EcoRI och NheI i steg 2, Ställ in reaktions blandningen som visas i tabell 1 i ett mikrocentrifugerör på is. Tillsätt T4 DNA-Ligase sist.
-
Omvandling
- Tina ett rör med 20 μL av DH5-alpha kompetenta E. coli -celler på isen tills de sista iskristallerna försvinner.
- Tillsätt 5 μL plasmid-DNA till cell blandningen. Försiktigt snärta röret 4-5 gånger för att blanda cellerna och DNA.
- Placera blandningen på is i 2 min.
- Värme chock vid exakt 42 ° c för exakt 30 s. Blanda inte.
- Plats på is i 2 min. Blanda inte.
- Pipettera 380 μL rums temperatur SOC i blandningen. Fördela omedelbart på en LB-agarplatta som innehåller ampicillin (100 μg/mL) och inkubera över natten vid 37 ° c.
- Kontrol lera plattorna inom 24 h för tillväxt.
- Försegla plattorna med tätnings film och förvara i kyl skåpet tills det är klart för nästa steg.
4. koloni PCR
- Tillsätt reaktions blandningarna som visas i tabell 2till ett PCR-rör (Ställ in 4 reaktions rör).
- Blanda försiktigt reaktionerna genom att Pipettera upp och ner.
- Använd en gul pipettspets och skrapa en koloni (eller mycket liten region) av den omvandlade E. coli. Överför ett svep av denna E. coli till en ny lb/ampicillin/agar-platta som har snittats bort, och sätt sedan in pipettspetsen i PCR-röret. Skaka pipettspetsen för att blanda E. coli med PCR-blandningen. Upprepa tre gånger för ytterligare kolonier. Överför PCR-rören till en PCR-maskin och påbörja termocykling med det program som visas i tabell 3.
- Kör gel elektrofores med hjälp av en 2% AGA ros gel i Tae att avgöra vilka kolonier har den bästa ligering i Plasmid och odla dessa kolonier på en ny tallrik.
- Förvara plattorna i kyl skåpet tills de är klara för provning. Förbered en flytande kultur i Luria buljong med 100 μg/mL ampicillin tillsätts för kemisk testning.
5. DNA-sekvensering
- Tillsätt 5 μL Plasmid, 4 μL av sekvenserings primern och 3 μL avjoniserat vatten för varje prov.
- Placera blandningen i ett rör och skicka den för DNA-sekvensering (se material tabell).
- Analysera DNA-sekvensdata för att jämföra de förväntade och observerade DNA-sekvenserna med hjälp av DNA-sekvensanalysprogramvara för att säkerställa att det inte finns någon mutation och att generna satts in korrekt.
Anmärkning: användning av E. coli som en kemisk sensor presenteras nedan.
6. beredning av E. coli -kulturer
- Förbered LB med 100 μg/mL ampicillin för flytande kulturer.
- Förbered flytande kulturer av sensorn bakterier, den positiva kontroll * bakterier och negativa kontroll * * bakterier.
Obs: * positiva kontroll bakterier: E. coli som innehåller en Plasmid med RFP-genen under kontroll av en konstitutiv promotor; Plasmid E1010 från registret av standard biologiska delar som används för syntetisk biologi (se tabell över material) användes i detta arbete.
* * Negativa kontroll bakterier: E. coli som innehåller en Plasmid med RFP-genen under kontroll av en annan promotor, såsom den pbad Promotorn (Plasmid J10060 från registret av standard biologiska delar som används för syntetisk biologi (se tabell över Material)) eller en Plasmid som inte har RFP-genen. - Placera kulturerna i en skakinkubator vid 37 ° c och 220 rpm i minst 8 timmar, högst 18 h. grumlig buljong indikerar bakterie tillväxt.
7. Titrating E. coli för att kontrol lera enhetens funktion
Obs: när sensorerna har titrerats för att kontrol lera funktion, behöver detta steg inte upprepas. En positiv kontroll i form av tillsats av bly, antimon, och 2, 4-DNT eller 1, 3-dinitrobensen (1, 3-DNB) kan kontrol lera funktionen av enheterna för varje användning utan att behöva full titrering.
- Bered en stam lösning av analyten (er) av intresse vid en koncentration av 10 ppm i vatten. Om löslighet är ett problem, Använd en 50/50 vatten/metanol blandning.
- Använd tabell 4 som vägledning och märk lämpligt antal sterila odlings rör och placera 2 ml av den odlade buljongen (från protokoll steg 6) i varje tub.
Anmärkning: för att fastställa ett allmänt analytiskt intervall, gör minst tre olika nivåer av en analyt med sensor bakterierna, en nivå med den negativa kontrollen, och en nivå med den positiva kontrollen. Det bör också finnas en tub av varje bakterie som inte har tillsatt metall (en annan typ av negativ kontroll). För att mer exakt bestämma analytiska omfång och detektions gränser, Använd ett större intervall av analytkoncentrationer. - Tillsätt analytlagerlösning till rören som innehåller 2 mL buljong enligt vad som anges i tabell 4, placera fästlocken på kultur röret så att de är lösa (för att möjliggöra luft flöde in i röret), och virvel kultur röret.
- Lämna snäpplocken löst på odlings rören, placera i en skakinkubator vid 220 rpm och 37 ° c i minst 24 timmar.
- Ta bort rören från inkubatorn, knäpp fast locken på rören tätt och förvara rören i kyl skåpet tills de är klara för fluorescensanalys.
8. använda E. coli som kemisk sensor för GSR
- Använd en etanol-baserad tork som utformats för att ta bort bly (se material tabell), torka av alla ytor på händerna, inklusive mellan fingrarna. Använd en separat servett för varje hand. Förvara våtservetter i ett lämpligt märkt förseglingsbart baggie tills analysen.
- För ytor som skall provas: Använd en alkoholbaserad tork för stora ytor eller en bomulls pinne fuktad med etanol för små ytor.
Anmärkning: för att demonstrera sensorernas respons på GSR, insidan av en tillbringade. 40 kaliber patron hölje var penslas med en etanol fuktad bomulls pinne. - Bära rena handskar och använda saxar som har rengjorts med alkohol, skär en ca 1 cm2 avsnitt ur mitten av torka.
- Placera den skurna biten av hand torkar eller bomulls pinnen direkt i ett kultur rör som innehåller 2 mL av sensorn bakterier, se till att det är nedsänkt i buljongen.
- Fortsätt enligt beskrivningen ovan i steg 7,4 – 7,5.
9. fluorescensanalys med hjälp av portabel spektrometer (se material tabell)
- Använd en vortexmixer för att skaka rören.
- Förbered spektrometern för att samla in fluorescensutsläpp vid lämplig våglängd för din RFP-variant med en exciteringvåglängd på 500 Nm.
- Använd Luria buljong för att spela in ett tomt spektrum.
- Överför försiktigt varje supernatanten till en låg volymkyvetten och samla in utsläppsintensiteten.
10. fluorescensanalys med hjälp av 96-Plattläsare (se material tabell)
- Använd en vortexmixer för att skaka rören.
- Överför 200 mL buljongen till en brunn i brunnen plattan. Spela in vilka prover som gick in i varje brunn av plattan.
- Ställ in fluor mätaren för att samla in utsläppsintensiteten vid lämplig våglängd för RFP-varianten.
11. data analys
- Med hjälp av den signal som erhålls från alla negativa kontroller (RFP negativa bakterier eller sensor bakterier utan analyten tillsätts), beräkna en genomsnittlig fluorescens signal för bakgrunden.
- Subtrahera den genomsnittliga bakgrunds signalen från varje fluorescenssignal som erhålls för sensor bakterierna för att få en bakgrundskorrigerad fluorescensintensitet.
- Uppskatta signal-till-brus-förhållandet (S/N) genom att dividera bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteten med den genomsnittliga bakgrunds signalen. Om S/N-kvoten är större än 3 är testet positivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescenspektra för RFP-varianten som används i detta arbete visas i figur 2. Dessa data kommer från PbRFP-enheten eftersom den svarar på bly och TNT-RFP-enheten eftersom den svarar på två analyter, 2, 4-DNT och 1, 3-DNB. Denna siffra visar ett spektrum av en negativ kontroll (ingen analyten tillsätts), och spektra vid två olika nivåer av analyt tillsätts. Den maximala fluorescenssignalen för den använda RFP-varianten observerades vid 575 nm (exciteringvåglängd 500 Nm). Uppgifterna i figur 3 är representativa för ett enda titreringsexperiment (därav finns inga felstaplar) av PbRFP-enheten, titrerade som i steg 7 i protokollet. Figur 3a visar data som samlats in från den bärbara spektrometern, medan figur 3b visar data som samlats in från fluorimetern (från samma uppsättning lösningar). Det finns en allmän tendens att öka fluorescens som koncentrationen av metall ökar. Det är värt att notera att vid höga koncentrationer, större än ca 800 ppb, svaret sjunker på grund av toxiciteten av metallen vid en sådan hög koncentration. Denna maximala responsnivå kan variera beroende på vilken analyt som används. Vårt tidigare arbete med SbRFP visade att bakterierna kunde tolerera högre nivåer (åtminstone upp till 1 000 ppb) av arsenik och antimon10. Litteratur om nivåer av dessa analyter som samlats in från handsvabb visar att dessa nivåer av bly och antimon är förenliga med vad som kan samlas in från en hand pinne15. Dessutom visar resultaten i figur 4 att bakterierna tål de mängder analyter som finns i en patron väska utan celldöd, som kommer att vara betydligt högre än vad som samlas in från en hand pinne.
Med hjälp av de beräknade S/N-värdena för dessa data var den lägsta detekterbara nivån av bly 12 ppb (detekterbar enligt definitionen av en S/N större än 3). S/N för bärbara spektrometerdata är däremot endast 2 på den högsta testade nivån. Trenden med ökande fluorescens med ökande analytkoncentration är dock fortfarande tydligt känd.
Figur 4a visar ett positivt test för GSR. För att få detta resultat, var etanol kompresser samlats in från insidan av en tillbringade. 40 kaliber patron hölje och läggas till de tre sensor bakterier, som i steg 8 i protokollet. Denna siffra visar också en positiv kontroll (bakterier som konstitutivt uttrycker RFP) och en negativ kontroll i form av SbRFP-enheten utan analyttillsats. Patron fodralet svabbar användes som bevis för princip resultat. I framtida arbete, hand kompresser kommer att samlas in från personer som är kända för att ha avfyrat en pistol för att visa att sensorerna är lyhörda för hand kompresser också.
| Komponent | 20 μL reaktion |
| DNA-Ligasbuffert 10X T4 | 2 μL |
| Plasmid-DNA (3 KB) | 3 μL |
| Främjare DNA (0,7 KB) | 10 μL |
| Nukleas fritt vatten | 4 μL |
| T4 DNA-Ligase | 1 μL |
I tabell 1. Reaktions blandning för ligation, protokoll steg 3.1.1.
| Komponent | 25 μL reaktion |
| 10 μM framåt primer | 0,5 μL |
| 10 μM omvänd primer | 0,5 μL |
| EnTaq 2X Master Mix | 12,5 μL |
| Nukleas fritt vatten | 11 μL |
I tabell 2. Reaktions blandningar för kolonin PCR, protokoll steg 4,1.
| Steg | Temp | Tid |
| Inledande denaturering | 94 ° c | 30 s |
| 30 cykler | 94 ° c | 30 s |
| 55 ° c | 45 s | |
| 68 ° c | 60 s | |
| Slutlig förlängning | 68 ° c | 5 minuter med |
| Hålla | 4 ° c |
I tabell 3. PCR-termocyklings parametrar för protokoll steg 4,3.
| Rör-ID | Bakterier | Koncentration av analytlösning tillsatt (ppm) | Metall tillsatt | Volym analytlösning tillsatt till 2 000 μL buljong | [analyte], ppb |
| 1 | Och PbRFP | 10 | Pb | 2,5 | 12 |
| 2 | Och PbRFP | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | Och PbRFP | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | Och PbRFP | 0 | Ingen | 0 | 0 |
| 5 | Mer från RFP neg | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | RFP-POS | 10 | Pb | 10 | 50 |
I tabell 4. Allmänt experiment inrättas för titrering av bio sensorer, protokoll steg 7,2.
I figur 1. Biologiska element av MicRoboCop enheter. adiagram över den allmänna anordningen för MicRoboCop i en Plasmid med en ampicillin-resistensgen. (b) diagram över varje enhet som kombineras för att skapa MicRoboCop systemet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 2. Fluorescensspektra av PbRFP-och TNT-RFP-bakterier i närvaro och frånvaro av analyt. Data som samlats in på Fluorimeter. afluorescensspektra av PbRFP-bakterier i närvaro och frånvaro av analyt (PB). b) fluorescenspektra av TNT-RFP-bakterier i närvaro och avsaknad av två analyter (2, 4-DNT och 1, 3-DNB). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 3. Jämförelse av det portabla spektrometersystemet och Fluorimeter för detektion av fluorescenspektrat av PbRFP-bakterier i närvaro och frånvaro av analyt (bly). (a) ledtitreringsdata för PbRFP-sensorbakterier som samlats in på bärbara spektrometersystem. (b) ledtitreringsdata (samma prover) för PbRFP-sensorbakterier som samlats in på Fluorimeter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 4. Etanol kompresser tagna från insidan av a. 40 kaliber tillbringade pistol patron för att Visa svaret från de tre enheterna till GSR. S/N för alla signaler var större än 3, vilket tyder på ett positivt test för GSR. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ändringar och fel sökning
Experimentet som beskrivs i tabell 4 kan på något sätt anpassas till de sensorer som har konstruerats. Den viktigaste aspekten av en kemisk sensor är att utvärdera dess känslighet och specificitet. Det är fördelaktigt att se till att en mängd olika koncentrationer av analyten analyseras för att bestämma det användbara analytiska omfånget av sensorn. Det är också värt att fastställa en maximal nivå av analyt för cellerna. Eftersom de analyter som används i denna studie är giftiga metaller (PB och SB) eller organiska föreningar i en metanollösning (för TNT-derivaten), finns det en övre nivå vid vilken celldöd på grund av analytets eller lösningens toxicitet kommer att inträffa (i allmänhet högre än 500 – 1,0 00 ppb för de experiment som genomförts hittills).
Begränsningar av tekniken
De resultat som presenteras i detta arbete är kvalitativa till sin natur men är tänkta att demonstrera de kvantitativa funktionerna i RFP modifierad E. coli. Känsligheten hos sensorn kan variera kraftigt mellan odlade partier beroende på densiteten av cellerna i buljongen. Om kvantitativa resultat krävs, bör cell koncentrationen uppskattas genom att mäta den optiska densiteten hos de flytande kulturerna före analys. Om den optiska tätheten av kulturerna bestäms, då cellerna kan spädas på lämpligt sätt för att minska variationen mellan experiment. Som ett presumtivt test för de önskade Analyterna är dock den kvalitativa "nuvarande/inte närvarande" svar acceptabel för de ansökningar som diskuteras här. Livs längden på cellerna på agarplattan bör också noteras-tidigare arbete har visat att plattorna kan förvaras i kyl skåpet i upp till 2 veckor, men enheterna inte fungerar mycket bra mot slutet av den tids ramen och därefter.
En annan faktor är valet av utrustning som används för att analysera fluorescenssignalen. Med hjälp av en spektrofotometer i forsknings klass med en 96-Plattläsare kan man välja exakt excitation och emissions våg längder, vilket kan öka känsligheten. Med hjälp av detta system kan resultaten av upp till 96 experiment samlas in samtidigt. RFP-fluorescens kan också analyseras med hjälp av ett bärbart spektrometersystem. Portabla instrument tillåter vanligt vis valda exciteringband, som kan eller inte kan sammanfalla med excitation maxima av RFP-varianten som används. Men så länge magnetiseringen våglängd är inom ett rimligt intervall av excitation maxima, det bärbara instrumentet kommer i allmänhet att vara funktions dugliga (men med en förlust i känslighet). Kostnaden för den bärbara system är betydligt mindre än den forskning grade spektrofotometer, och portabilitet kan säkert vara en fördel. Baserat på den potentiella tillämpningen av bakterierna, kan analytikern bestämma om den extra kostnaden och förlust av bärbarhet med spektrofotometersystemet är motiverat.
Betydelse med avseende på befintliga metoder
Det tredel MicRoboCop-system som beskrivs i detta arbete är avsett att användas som ett kvalitativt, presumtivt test för närvaron av GSR. För närvarande kräver "Gold Standard" bevis test för GSR expert analys av SEM-EDX. SEM-EDX utrustning är dyr och typiskt drivs av högt specialiserade analytiker. Dessutom är GSR bevis mycket varierande i kriminal tekniska ärenden och många variabler bidrar till avsättning av GSR på händer och ytor16. En presumtiv test för GSR kan vara till nytta för utredarna som ger sannolika orsaken till en sökning av person eller egendom. Jämfört med elektrokemiska tester eller tester som jonrörsspektroskopi erbjuder denna metod enkel, lättillgänglig instrumentering som de flesta analytiska laboratorier bör ha till gång till.
Andra applikationer
De anordningar som beskrivs i detta manuskript är utformade för att kombineras till ett tredelad system för presumtiv identifiering av GSR. Varje enhet i MicRoboCop-systemet (SbRFP, PbRFP och TNT-RFP) kan dock också användas var för sig för att upptäcka kemisk kontamination i livsmedel, vatten eller miljö prov. Tidigare arbete har visat att TNT-RFP-enheten kan användas som en in situ -sensor för landminor13,17. Resultat som presenteras här och i vårt tidigare arbete10 har visat att sbrfp och pbrfp enheter kan upptäcka koncentrationer tillräckligt låg för att konkurrera dyrare och sofistikerad utrustning såsom induktivt kopplad plasma atomär emission spektroskopi ( ICP-AES) och atomabsorptionsspektroskopi (AAS). SbRFP-sensorn är känslig för arsenik och antimon. Dessa enheter kan ge en låg kostnad alternativ för analys av giftiga tung metall förorening.
Den syntetiska biologi protokoll för beredning av e. coli presenteras här är tillämplig på alla system som använder standard syntetisk biologi genetiska delar för att syntetisera e. coli som uttrycker RFP. Den analytiska metoden är tillämplig på alla system som uttrycker RFP, och så kan användas för att analysera alla bakteriella bio sensor system som har skapats med hjälp av syntetiska biologiska metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intresse konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna studenterna vid Longwood University i BIOL 324 (genetik) och studenterna i CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory problemlösning) som var inblandade i den inledande beredning och testning av antimon och bly bio sensorer. Idén till MicRoboCop var tänkt på GCAT SynBIO workshop (sommar 2014), som finansieras av NSF och Howard Hughes Medical Institute och värd University of Maryland Baltimore County. Författarna erkänner också finansiering som erhållits från Longwood University ' s Cook-Cole College of Arts and Sciences och GCAT SynBio Alumni Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
- The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
